Atualmente

existem mais de
1.000 enzimas de
restri descritas.
Anlise de Framents de Restri
Apostila da Ocina Prtica de Gentica,
Genoma e Biotecnologia
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SEGUNDO MDULO
Contedo deste mdulo
Introduo a enzimas de restrio
Tcnica de eletroforese de DNA
Leitura de mapa de restrio
Endnucleases de restri, tambm chamadas enzimas de restri, s prtenas
bacterianas que crtam em framents a lna mlcula linear de DNA. As enzimas de restri
s as principais ferramentas da tecnlia d DNA recmbinante. Uma enzima de restri
recnhece uma seqncia especca de nucletdes, cm AGCT, crtand DNA ns lcais nde
esta cmbina de letras crrer. Essas enzimas s isladas de bactrias e nmeadas cm uma
seqncia de trs u quatr letras seuidas pr um nmer rman. Pr exempl, EcRI uma
enzima de restri islada da Escherichia cli.
Parece peculiar que uma enzima cm EcRI pssa existir.
Pr que uma bactria prduziria uma enzima que cliva DNA
numa seqncia especca de nucletdes? A fun destas
enzimas, descberta ns ans 0 e 70, de destruir vrus que
invadem a bactria, s chamads bacterifas, u simplesmente
fas. Uma vez crtads, s fas se trnam infensivs. As
bactrias se prteem de suas prprias enzimas de restri
atravs da mdica qumica de seu DNA aps a sntese.
Esta mdica cnsiste na adi de um radical metil em
nucletdes especcs a ln da ta de DNA. Esse prcess
chamad de metila. Uma vez metilads, s nucletdes est
prteids de serem dierids pela enzima de restri. Send
assim, as enzimas de restri s capazes de distinuir DNA
exen (d fa) de seu prpri DNA. A enzima respnsvel
pel prcess de metila, a metilase, tambm pde adicinar
radicais metil n DNA d fa pr enan. N entant, a metilase
uma enzima de a lenta, e antes que ela realize a metila
d DNA d fa, a enzima de restri j eliminu. Na bactria
prcess de metila crre l n inci da frma de
um nv indivdu. Este sistema, pel qual as endnucleases
de restri recnhecem DNA exen, pde ser cnsiderad um sistema imune primitiv da
bactria. Cm a enzima evluiu at bter este rau de especicidade, ainda descnhecid. Em
ranisms mais evluds, incluind humans, a metila est assciada capacidade da clula
de liar e desliar enes.
Cada ranism prduz uma enzima de restri caracterstica. Pr iss, as enzimas s
nmeadas de acrd cm ranism d qual fram isladas. O nme da enzima eralmente
pssui trs u quatr letras. A primeira letra desina ner d qual a enzima fi islada, enquant
as utras letras fazem referncia espcie. Pr exempl, EcRI uma enzima de restri islada
da Escherichia cli, enquant HindIII islada d Haemphilus infuenzae. Os nmers indicam a
rdem na qual a enzima fi islada. HindIII, pr exempl, fi a terceira enzima de restri islada
A metila de DNA
uma mdica
qumica mediada
pr uma enzima
que adicina um
radical metil (CH3)
em lcais espec-
cs d DNA. Ns
seres humans
e na mairia ds
mamfers, a
metila de DNA
crre apenas nas
bases citsina e
smente quand as
mesmas s seui-
das pr uma base
uanina. A fun
da metila ainda
n est ttalmente
cmpreendida.
Todos os direitos reservados ao DNA Goes to School, Inc. 2007
de Haemphilus infuenzae.
A diest de DNA pr enzimas de restri um prcess simples. Basta clcar
DNA em cntat cm a enzima a uma temperatura ideal (eralmente 37

C) e a enzima inicia
prcess de diest imediatamente, crtand DNA em diverss pedacinhs. O nmer
de pedacinhs prduzid estabelecid pel nmer de stis de restri recnhecid pela
enzima utilizada. A enzima EcRI, pr exempl, crta DNA tda vez que encntra a seqncia
G/AATTC, enquant a enzima HINDIII crta na seqncia A/AGCTT.
As enzimas de restri cnstituem a principal ferramenta da tecnlia d DNA
recmbinante. Graas a elas pdems islar um ene especc que ns interessa para clc-l
dentr de utr ranism. Ou seja, pdems recmbinar, u seja, pdems criar ranisms
transnics.
Imaine, pr exempl, uma prtena t necessria cm a insulina. A insulina permite
que acar penetre nas clulas, pdend ent ser utilizad cm fnte de eneria. As pessas
que apresentam decincia de insulina pssuem Diabete e precisam intrduzir, atravs de
injees dirias, a insulina necessria para que seu ranism pssa desenvlver as funes
nrmais. Ara imaine se crtarms ene da insulina cm enzimas de restri de md
que pssams separar este ene d rest. A prxima etapa seria
cln-l em utr ranism, de md que esse ranism pssa
prduzir a t necessria insulina. Imaine ent que este ene
seja clnad em uma bactria, em escala industrial. Esta linhaem
de bactria ir prduzir insulina e atravs da purifica das
prtenas prduzidas pr esta linhaem de bactria pde-se islar
a insulina. Esta insulina fi prduzida num ranism transnic
(que qualquer ranism, animal u veetal, que teve um ene
de utr ranism transferid para seu enma, fazend, deste
md, parte de seu material entic) e pder ser utilizada pel
ser human. Este tambm princpi ds animais transnics,
que s animais que tiveram um ene intrduzid em suas clulas
embrinrias. Iss tambm inclui s veetais, que muitas vezes s
chamads de veetais melhrads u simplesmente aliments
transnics.
A primeira enzi-
ma de restri
fi islada em
198 pr erner
Arber, Hamiltn
O. Smith, e Daniel
Nathans quand
trabalhavam na
Jhns Hpkins
University, ns
Estads Unids.
Em 1978 s trs
receberam junts
prmi Nbel.
Para saber mais
sbre essa impr-
tante descberta,
visite Nbel e-
museum n link
http://www.n-
bel.se/medicine/
laureates/1978/
D. Nat hans
W. Ar ber
H. O. Smi t h
Di f erent es enzi mas recnhecem di f erent es s t i s de rest r i
BamHI HaeIII PstI
Tcnica de eletrfrese de DNA
Os framents erads atravs da diest pr enzimas de restri pdem ser
analisads atravs da tcnica de eletrfrese de aarse. Eletrfrese a tcnica pela qual
framents de DNA de diferentes tamanhs s separads. O DNA carread em um p d
el (que tem aspect de elatina) e este submetid a um camp eltric. O DNA ir se mver
na dire d pl psitiv, uma vez que a mlcula de DNA neativa devid presena de
rupaments de fsfat.
A separa ds framents crre de acrd cm as prpriedades de cada frament
que determina qu rpid camp eltric ser capaz de mver frament de DNA a
ln d el. Quant mair frament, mais lent ser e, deste md, framents menres
cheam a nal d el em mens temp. A mairia ds is se faz cm aarse. Aarse
puricada frnecida em frma de p e permanece inslvel at que seja fervida. Para disslver
a aarse precis que a ela seja fervida, que feit junt cm um tamp especial para
eletrfrese. Depis de fervida, quand a aarse cmea a esfriar, se d inci a prcess
de plimeriza e el frmad. Quant mais aarse se adicina a el, mais rme ele
ser.
Ainda quente, a aarse deve ser clcada numa frma e l em seuida deve-se
adicinar um pente que frmar pequens ps na aarse quand esta endurecer. Estes
ps ser utilizads para a aplica das amstras de DNA. Quand el slidica,
pente remvid cautelsamente (para n furar el). O el ent clcad na cuba
de eletrfrese e cbert cm tamp de eletrfrese. As amstras de DNA s misturadas
cm um crante de crrida que faz cm que as mesmas afundem n p, cas cntrri
cariam futuand na slu. A cuba fechada e a crrente eltrica aplicada.
Depis que el crreu temp suciente para separar s framents de DNA (iss vai
depender d tamanh d el e das bandas que se pretende ver n el, varia de 15 minuts
at 48 hras.), DNA deve ser crad para que pssa ser visualizad n el. O crante mais
usad ns labratris brmet de etdi. O brmet de etdi se intercala cm DNA,
emitind uma luz avermelhada quand expst luz ultravileta. Mas se essa capacidade
de se intercalar cm DNA trna um pders crante, faz tambm d mesm um
pders carcinen. Nesta aula usarems azul de metilen para verms as bandas
de DNA. O azul de metilen n t sensvel cm brmet, que tem a capacidade de
detectar quantidades mnimas de
DNA n el, mas aumentand-se
a quantidade de DNA aplicada n
el, azul de metilene funcina t
bem quant brmet.
O prcess de
plimeriza de
el de aarse
semelhante quele
que crre quand
fazems elatina.
Diferentes tampes
tm sid recmen-
dads para a ele-
trfrese de DNA.
Os mais usads
s TAE (Tris-ac-
etat-EDTA) eTBE
(Tris-brat-EDTA).
Os framents
de DNA miram
lieiramente dife-
rentes nestes dis
tampes devid a
diferenas na fra
inica ds dis
tampes.
Gel de
aarse
crad cm
brmet de
etdi
Atividade Prtica
Nesta atividade vc ir carrear 4 amstras diferentes de DNA n el de
aarse e ir bservar cm s diferentes framents de restri crrem
n el. Primeir vc dever preparar um el de aarse de acrd cm as
instrues frnecidas pr seu instrutr.
Prtcl 1: Prepara d el de aarse
1) Pese ___________ de aarse.
2) Clque a aarse pesada num erlemeyer.
3) Adicine _____________ml de tamp de eletrfrese.
4) Usand micrndas, u utr dispsitiv cm bic de Bunssen, deixe
a mistura ferver. Quand a slu estiver ttalmente em ebuli e
j n fr mais pssvel bservar a aarse, remva erlemeyer d
micrndas.
5) Deixe a slu esfriar pr aprximadamente 10 minuts.
) Enquant a aarse estiver esfriand, prepare a frma para el. Se
necessri, use ta adesiva para selar as extremidades da frma. Adicine
pente a uma das extremidades d el.
7) Quand a slu chear a aprximadamente 0 raus, derrame el
na frma.
8) Deixe- slidicar pr uns 15 minuts.
9) Quand el car dur, remva a ta adesiva e tambm pente, cm
cuidad para n furar el.
10) Clque el na cuba de eletrfrese.
11) Adicine tamp de eletrfrese at que cubra el ttalmente.
Em seuida, adicine as amstras de DNA n el. Vc dever adicinar uma
amstra pr p n el de aarse. Vc ir trabalhar cm as seuintes
amstras:
Amstra #1-Lambda DNA n dierid pr enzima de restri
Amstra #2- Lambda DNA dierid pr EcRI
Amstra #3- Lambda DNA dierid pr HindIII
Amstra #4- Lambda DNA dierid pr EcRI E HindIII
Prtcl 2- Carreand as amstras
1) Adicine ___ul de tamp de crrida a cada amstra.
2) Adicine___ul de cada amstra em cada p d el.

S t i s de Rest r i
EcRI G/ AATTC
Hi ndI I I A/ AGCTT
Prtcl 3- Crrend el
1) Feche a tampa da cuba de eletrfrese.
2) Liue a fnte de eletrfrese e clque na vltaem de ____vlts.
3) Verique se el est realmente crrend atravs da bserva das blhas que se frmam n tamp de eletrfrese.
Se n frem bservadas blhas sinica que el n est crrend. Neste cas vc deve (a) certicar-se de que
tamp de eletrfrese est cbrind el; (b) certicar-se de que a ta fi remvida da frma; (c) certicar-se
que a cuba de eletrfrese est liada e que s eletrds est rmemente cnectads; (d) vericar se n h s
slts dentr da cuba de eletrfrese.
4) Deixe el crrer pr _____minuts.
Mapa de Retri d Lambda cm duas enzimas diferentes, EcRI e HindIII

Enquant el crre, bserve mapa de restri d lambda e cmplete rc cm s respectivs tamanhs
para cada um ds framents de DNA que vc espera bservar n el.
Prtcl 4- Crand el
1) Clque el numa cuba plstica e adicine alumas tas d tamp de eletrfrese.
2) Clque lad azul d papelte vltad para a face d el.
3) Passe s deds sbre el de md rme, mas sem esmaar el, vrias vezes.
4) Clque a frma d el cm erlemeyer vazi sbre papelte azul.
5) Auarde 15 minuts.
) Remva papelte azul e clque el em ua distilada, de preferncia mrna.
7) Trque a ua at que as bandas estejam visveis.

Peruntas
1) Pr que s framents erads pr cada uma das enzimas apresentam tamanhs diferentes?
2) Pr que DNA dierid cm duas enzimas a mesm temp pssui um nmer mair de framents?
3) Observe mapa entic d DNA d lambda. Vc cnseuiu estabelecer tamanh ds framents prduzids pelas
enzimas?
SeqnciadefragmentodeDNA
Ara que vc j aprendeu cm funcinam as enzimas de restri, vams analisar uma seqncia de DNA
de dis alels diferentes. A diferena entre estes dis alels est apntada na seqncia de DNA.
Mapa de restri nme que se d a um frament de DNA nde tds s stis de restri para tdas as
enzimas descritas at hje fram estabelecids. Vc ntar que devid trca de um nucletde na seqncia de DNA
h a cria u destrui de um sti de restri para uma determinada enzima. A diest pr enzimas de restri
uma tcnica muit utilizada para se identicarem alteraes na seqncia de DNA, e esta tcnica deve ser utilizada
quand n se desejar u n huver recurss para a realiza d seqenciament de DNA.
Atividade 2
Anlise as seqncias de DNA dos alelos a seguir. Encontre o local onde a seqncia destes dois alelos
difere.
a a a c t t a g t c a c a t t t a g g c c a t t t a t g g t t g a t a t t a g g c t t a g g
t t t g a a t c a g t g t a a a t c c g g t a a a t a c c a a c t a t a a c c g a a t c c
DNA dupla hta do alelo A
a a a c t t a g t c a c a t t t a g t c c a t t t a t g g t t g a t a t t a g g c t t a g g
t t t g a a t c a g t g t a a a t c a g g t a a a t a c c a a c t a t a a c c g a a t c c
DNA dupla hta do alelo B
Exercci

Vams supr que esta altera n DNA que vc acabu de identicar n alel mutad seja respnsvel pr
uma dena entica recessiva que chamarems de dena Z. Ns chamarems alel nrmal de A (az) e alel
mutad de a (azinh). Se vc fsse realizar um estud numa famlia para saber quem tem alel A e quem tem alel a,
que enzima de restri vc usaria (veja abaix a lista ds stis de restri de 3 enzimas)? Cm vc pderia analisar
s resultads num el de aarse? Indique s tamanhs ds framents de restri que vc esperaria encntrar nas
amstras analisadas ds seuintes indivdus
Tamanh ds framents de restri d indivdu AA (indivdu nrmal)
Tamanh ds framents de restri d indivdu Aa (indivdu nrmal )
Tamanh ds framents de restri d indivdu aa (indivdu afetad)
Enzi mas de Rest r i Di spn vei s n seu Labr at r i
EcRI G/ AATTC
Hi ndI I I A/ AGCTT
Hae I I I G/ C