CENTRO UNIVERSITRIO UNA Gabriela Arajo Gabriela Macieira Lucas Neves Luiza Wronsky Thas Cristine

TESTE DE ESTERILIDADE

Belo Horizonte 2013

1 INTRODUO
A exigncia quanto a nveis de qualidade microbiolgica de um produto farmacutico depende de sua via de administrao. O limite microbiano de medicamentos e seus insumos, cosmticos e seus adjuvantes, assim como correlatos pode se constituir em ausncia absoluta de formas viveis ou sua presena em grandezas definidas, restritas ou no a determinadas cepas microbianas (GRIMME et al., 1999). Devido ao risco associado, a caracterstica de esterilidade foi inicialmente requerida em produtos para uso parenteral e mais recentemente a produtos oftlmicos, sendo o conceito de esterilidade definido como a total ausncia de formas viveis capazes de reproduo (MENDES et al., 1985). A afirmao sobre a esterilidade absoluta de um produto exigiria que todas as unidades fossem submetidas a teste de esterilidade, o que no aplicvel. Segundo as farmacopias, a condio de esterilidade de um produto deve ser considerada baseada no conhecimento de que o mesmo tenha sido submetido a condies ideais de processamento e que o resultado do teste de uma amostra representativa, indique a ausncia de microrganismos viveis (MENDES et al., 1985). O conceito de esterilidade definido como a completa ausncia de microrganismos viveis, que apresentem capacidade de desenvolvimento e multiplicao quando em condies favorveis. Segundo as farmacopias, a esterilidade de um produto depende das condies do processo produtivo e deve ser confirmada submetendo ao teste de esterilidade uma amostra representativa do produto, que indique a ausncia de microrganismos viveis (AKERS et al., 1991). O teste de esterilidade tem por finalidade o contato do produto com o meio de cultura, de forma a permitir deteco da presena de microrganismos viveis em produtos que tenham sido submetidos a algum processo de esterilizao, durante o ciclo de fabricao. A incubao do produto em meios de cultura nutriente, dever permitir o crescimento de bactrias, bolores e leveduras. Generaliza-se como ausncia de vrus no produto quando aqueles microrganismos esto ausentes, apesar da metodologia empregada no ser abrangente para sua constatao (GRIMME et al., 1999).

O primeiro mtodo foi oficializado em farmacopias em 1932, na Inglaterra, pela British Pharmacopoeia . Em 1936, a United States Pharmacopeia XI (USP XI), adotou a mesma metodologia, a qual sofreu inovaes posteriores, sendo que no fim da dcada de 60 ocorreu a introduo do mtodo indireto. A evoluo da metodologia resultado de uma preocupao inerente melhoria do teste de esterilidade, visando verificar com mais segurana a qualidade do processo de esterilizao empregado durante a fabricao de produtos farmacuticos estreis, bem como manipulaes asspticas ( USP, 1936). Os meios de cultura empregados devem fornecer nutrientes necessrios para o desenvolvimento de microrganismos eventualmente presentes, condies apropriadas de pH e substncias que neutralizem produtos de metabolismo, que quando acumulados podem limitar o desenvolvimento microbiano. A concentrao de cada componente do meio de cultura deve ser adequadamente balanceada, no sendo to baixa que limite o desenvolvimento populacional e nem to alta que possa inibir o crescimento microbiano (TRABULSI, 1991). Atualmente, as diversas farmacopias preconizam a utilizao de meios de cultura lquidos, que permitam o desenvolvimento de bactrias e fungos, sendo que a recomendao mnima o emprego de pelo menos dois tipos de meios de cultura (BRASIL, 1988). Em 1942, com a exigncia da constatao da presena de bactrias anaerbias, a USP XII, adotou a utilizao de caldo peptonado adicionado de gelatina a 2%, para dificultar a difuso do oxignio no interior do meio de cultura e possibilitar condies de anaerobiose e soluo de Litmus, como indicador de oxi-reduo. A partir de 1947, a USP XIII, adotou o caldo de tioglicolato, tambm denominado de meio Brewer modificado, recomendado por permitir obter condies de aerobiose e anaerobiose em um mesmo tubo, apresentando em sua constituio gar bacteriolgico, na concentrao de 0,05 a 0,075% para dificultar a difuso do oxignio; cistena e tioglicolato como agentes redutores, que reagem com o oxignio, retirando-o do meio; e a resazurina como indicador de oxi-reduo, que forma um anel de cor caracterstica na superfcie do meio, indicando a regio em contato com o oxignio (USP, 1947). Alm de permitir a

pesquisa de contaminantes anaerbios, o meio de tioglicolato tem a capacidade de neutralizar a ao bacteriosttica de conservantes mercuriais ( MENDES, 1985). A USP XVIII, introduziu, em substituio, o caldo de casena de soja, que permite crescimento de bactrias aerbias, bolores e leveduras. Porm, no que diz respeito a seletividade para com bolores e leveduras o uso do meio de casena de soja questionvel, visto que valores de pH timos para crescimento de fungos so da ordem de 5 a 7 ou ainda mais baixos, enquanto que o pH deste meio de aproximadamente 7,3 (USP, 1970). Os meios de cultura utilizados no teste de esterilidade devem ser controlados quanto sua esterilidade de forma a conferir segurana quanto ausncia de resultados falso-positivos no teste e sua capacidade em promover o crescimento da maior variedade microbiana, mesmo que em nmero muito pequeno, e evitar a ocorrncia de resultados falso-negativos. Estas caractersticas dos meios de cultura devem ser verificadas para cada lote do mesmo (AKERS et al., 1991).

2 OBJETIVO
O objetivo deste experimento foi avaliar a condio de esterilidade em ampolas de gua injetveis atravs do mtodo de inoculao direta.

3 DEFINIO
O teste de esterilidade realizado para avaliar se o lote de um produto apresenta contaminao por bactrias ou fungos. O Ensaio de Esterilidade Bacteriana e Fngica tm como finalidade verificar a ausncia de bactrias e fungos em materiais slidos estreis (equipos, medicamentos slidos, etc.) e lquidos estreis (solues fisiolgicas, medicamentos lquidos, etc.). O ensaio deve ser realizado em total assepsia e ter um controle do nvel de contaminao ambiental, para evitar a contaminao dos materiais em anlise. De acordo com a definio de esterilidade, uma amostra deve ser considerada estril s quando h ausncia completa de microrganismos viveis nela.

4 MATERIAS E REAGENTES
4.1 Materiais Tubos de ensaios; Agulha; Seringa estril; Suporte para tubos de ensaio; Bico de gs

4.2 Reagentes Meio lquido de tioglicolato de sdio; Meio lquido de casena-soja; Ampolas de gua injetveis.

5 PROCEDIMENTOS
5.1 Mtodo de Inoculao direta Este mtodo consiste na transferncia assptica do material teste para os meios tioglicolato fludo e casena-soja seguida de incubao a 30-35 C e 20-25 C, respectivamente, e incubados durante 14 dias. Utilizou-se 5 ampolas de gua contendo ?? mL, com validade at ??, pertencente ao lote ??, do laboratrio ??.

A alquota do produto e a quantidade de meio utilizados a especificada na Farmacopeia Brasileira V edio. A amostra em questo contm 10 mL do produto e o mtodo de anlise utilizado foi a inoculao direta. Mediu-se 1 mL como alquota do produto e 15 mL de cada meio de cultura. Transferiu 1 mL da amostra em dois tubos de ensaio, com 15 mL de cada meio. No 1 tubo utilizou-se o meio tioglicolato de sdio, que ideal para crescimento de bactrias aerbias e anaerbicas. Foi deixado em contato com a amostra por 14 dias em temperatura de 32,5 +/- 2,5 C. No segundo tubo utilizou-se o meio casena-soja, que ideal para crescimento de bactrias aerbias e fungos. Foi deixado em contato com a amostra por 14 dias em temperatura de 22,0 +/- 2,5 C. Cada integrante do grupo recebeu uma ampola de gua, seringa e agulha estreis. Retirou-se 1 mL do produto e transferiu-se para os respectivos meios (tioglicolato e casena-soja). A transferncia foi realizada prximo ao bico de Bunsen, a fim de se evitar a contaminao externa. 5. 2 Controle Negativo Para a validao do teste, recolheu-se 15mL de cada meio (tioglicolato de sdio e casena-soja), que foram adicionados aos tubos de ensaio e armazenados por 14 dias, com a finalidade de se verificar a esterilidade do meio.

6 RESULTADO E DISCUSSO
Aps 14 dias de inoculao, realizou-se a leitura dos tubos de cada componente do grupo. Observou-se que nos tubos do meio casena-soja e tioglicolato estavam lmpidos e no apresentaram turvao, indicando que no houve crescimento de microrganismo no meio. No controle negativo, observou-se que o tubo permaneceu lmpido, caracterizando esterilidade dos meios utilizados

7 CONCLUSO
Conclui-se que as ampolas de gua injetvel analisadas estavam em conformidade com o preconizado na literatura, pois no apresentaram crescimento nos tubos com os meios tioglicolato e de casena-soja, em comparao ao controle negativo. O controle negativo apresentava-se estril por no haver crescimento de microorganismos nos meios utilizados. Portanto, estavam prprios para realizao dos testes de esterilidade.

REFERCIAS BIBLIOGRFICAS
AKERS, M. J. ; WRIGHT, G. E. ; CARLSON, K. A. Sterility Testing of AntimicrobialContaining Injectable Solutions Prepared in the Pharmacy. American Journal of Hospital Pharmacy, Washington, v. 48, n. 11, p. 2414-2418, 1991. BRASIL. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Farmacopeia Brasileira. 5 Edio, v. 1. Braslia, 2010. FARMACOPIA BRASILEIRA. 4. ed. So Paulo: Atheneu, 1988. Parte I. p. V.5.1.1-V.5.1.1.6. GRIMME, R. ; KLBLIN, R. ; SCHLE, A. ; TRICK, I. Deteco de Contaminao Biolgica. Revista da Sociedade Brasileira de Controle de Contaminao, So Paulo, v. 9, p. 2831, 1999. MENDES,I.F.;PRAL,E.M.F.;TAKATA,C.S.;RIZZO,E.; SAITO, T. Estudo Comparativo de Meios de Cultura Recomendados para Testes de Esterilidade de Produtos Biolgicos. Rev. Farm. Bioqum. Univ. S. Paulo, So Paulo, v. 21, n. 1, p. 62-70, 1985. TRABULSI, L. R. Microbiologia. 2. ed. So Paulo: Atheneu Editora, 1991. UNITED STATES PHARMACOPEIA. 11. ed. Easton, Mack Printing Company, 1936. p.469. UNITED STATES PHARMACOPEIA. 13. ed. Easton, Mack Printing Company, 1947. p. 689692 UNITED STATES PHARMACOPEIA. 18. ed. Rockville, United States Pharmacopeial Convention, 1970. p. 851-857.