INSTITUTO TECNOLGICO EL LLANO, AGUASCALIENTES MAESTRA EN BIOTECNOLOGA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR

PRACTICA No. 1

EXTRACCIN DE DNA DE TEJIDO VEGETAL Y ANIMAL ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

ALUMNA: L. A. Q. B. CLAUDIA REBECA GONZLEZ RUIZ

TITULAR: DRA. SILVIA FLORES BENTEZ

EL LLANO, AGS., 07 DE OCTUBRE DEL 2009.

OBJETIVOS:

Aprender una de las tcnicas ms utilizadas para la extraccin de ADN de diferentes muestras de tejido animal o vegetal. Aprender uno de los mtodos ms comunes de purificacin de ADN. Aprender la tcnica de separacin electrofortica de cidos nuclecos a travs de electroforesis en geles de agarosa.

INTRODUCCIN: Las caractersticas fisiolgicas y bioqumicas de todo ser vivo estn contenidas en sus respectivos genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus estn compuestos por molculas de cido desoxirribonucleico (comnmente llamado ADN). El ADN es una estructura qumica cuyos elementos fundamentales (nucletidos) se organizan de manera lineal generando enormes secuencias de informacin. La informacin que define y codifica un carcter determinado se denomina gen (Lewin 1995). La linealidad de la molcula de ADN y la consecuente disposicin de los genes en cromosomas hacen posible que genes vecinos se hereden juntos. Este hecho, junto con las herramientas experimentales y de anlisis, han permitido generar mapas, en los cuales cualquier fragmento de ADN (marcador molecular) puede ser utilizado como una va indirecta para seguir el patrn de herencia de una caracterstica. Los marcadores moleculares establecen relaciones de vecindad con genes de inters, determinando su localizacin dentro del genoma del organismo estudiado. En Arabidopsis thaliana, la primera planta cuyo genoma fue secuenciado completamente, existen alrededor de 25.500 genes (The Arabidopsis Genome Initative 2000). Cada uno de ellos vara en longitud, teniendo la mayora de ellos entre 500 hasta varios miles de nucletidos. Sin embargo, con base en la informacin obtenida para A. thaliana y las estimaciones para otras plantas, se calcula que slo del 15 al 30% del genoma contiene secuencias codificantes (genes). El restante 85 a 70% se distribuye en secuencias reguladoras indispensables para la expresin de los genes y en secuencias repetidas que varan entre una y miles de copias por clula (The Arabidopsis Genome Initative 2000). Estas secuencias repetidas se pueden encontrar agrupadas en regiones particulares del cromosoma (centrmeros y telmeros) o dispersas a lo largo del genoma (Flavell y Twell 1996). A la determinacin de la posicin de genes particulares, secuencias reguladoras y repetidas dentro del genoma se le denomina mapeo gentico. A continuacin se describen algunas de las tcnicas empleadas para manipular el ADN de plantas. En la actualidad, la aplicacin de esas tcnicas es de especial inters para la exitosa ejecucin de programas de mejoramiento gentico. AISLAMIENTO DEL ADN VEGETAL El primer paso para desarrollar experimentos con marcadores moleculares es la extraccin del material gentico de plantas que, por sus caractersticas fenotpicas, poseen caracteres agronmicos de inters. Para la extraccin del ADN vegetal es necesario tener en cuenta tres factores:

1. El tipo de planta y de tejido que se va a emplear como fuente. Por ejemplo, los tejidos jvenes contienen ms ADN que los tejidos viejos. Adems, es necesario considerar la composicin bioqumica de los tejidos. Por ejemplo, el mtodo de extraccin del material gentico proveniente de tejidos ricos en compuestos fenlicos es diferente al mtodo empleado con tejidos ricos en carbohidratos o aceites. 2. El tipo de ADN que se va a extraer. Las plantas poseen tres tipos de ADN: el nuclear, el mitocondrial y el cloroplstico. Reciben estos nombres dependiendo del tipo de organlo celular en el que el ADN se encuentre. Los distintos tipos de ADN tienen caractersticas bioqumicas semejantes. Sin embargo, el tipo de informacin biolgica que codifican es completamente diferente. 3. El tipo de anlisis a realizar (RFLP, RAPD, AFLP, secuenciacin, etc.). Con base en la cantidad y la calidad del ADN se pueden desarrollar diversas tcnicas de anlisis, algunas de las cuales sern explicadas con mayor detalle en prximos artculos. El objetivo principal en un experimento de extraccin de ADN es obtener una preparacin de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la posibilidad de almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su estructura y propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la reproducibilidad en experimentos posteriores. La cantidad, por su parte, es un concepto relativo que depende, entre otros, del nmero y estado de las clulas propias del tejido a estudiar. Por lo tanto, como regla general, un buen mtodo de extraccin debe mantener la integridad fsica y bioqumica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y concentracin (Sambrook et al. 2001). En plantas existen mltiples protocolos para extraer y purificar el ADN. Sin embargo, todos ellos incluyen cuatro pasos indispensables: 1. Ruptura de tejidos y paredes celulares. Este paso consiste en pulverizar el material vegetal a bajas temperaturas, generalmente empleando nitrgeno lquido o hielo seco (Rogers y Bendich 1988). Tambin existe la pulverizacin en seco, un proceso en el cual los tejidos se deshidratan por secado en un horno o con silicagel. Sin embargo, este procedimiento no es de aplicacin general y en palma de aceite, por ejemplo, el tratamiento de secado no permite recuperar ADN de buena calidad. Para degradar paredes celulares se pueden utilizar, adems, enzimas tipo celulasas. 2. Ruptura de membranas. Una vez el tejido es disgregado en clulas, se hace necesario romper las membranas celulares para liberar el ADN. Esto puede ser llevado a cabo qumicamente con detergentes (SDS, Triton o detergentes comerciales). Tambin se emplean mtodos fsicos, como aquellos basados en ultrasonido. 3. Inhibicin de enzimas que destruyen al ADN. Como un mecanismo de defensa natural, las clulas contienen enzimas que destruyen al ADN (ADNasas). Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad de las preparaciones de ADN. La inhibicin puede realizarse mediante mtodos fsicos, tales como desnaturalizacin por calor (a temperaturas de 65 C) o con mtodos qumicos. Estos ltimos incluyen tratamiento con solventes orgnicos (fenol y cloroformo), con antioxidantes (Ditiothreitol y -mercaptoetanol), con agentes quelantes (EDTA, EGTA) que capturan los iones magnesio necesarios para la funcionalidad de las ADNasas, o con agentes caotrpicos que actan removiendo el agua estructural de las protenas (Rogers y Bendich 1988). Por

lo general se utilizan mezclas de varios de estos reactivos para asegurar la inhibicin de tales enzimas. 4. Extraccin de contaminantes. El objetivo de extraer ADN es obtener preparaciones enriquecidas en esta molcula. Sin embargo, el ADN est asociado con protenas (histonas) e inmerso en PALMAS (Roche, S., 2002). EXTRACCIN DE ADN EN MUESTRAS DE SANGRE: Todas las clulas, a excepcin de las clulas anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus ncleos celulares. Tambin podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al ncleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequea; por este motivo no representa una fuente conveniente de extraccin, aislamiento y purificacin, para ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolcula en pequeos fragmentos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material gentico y poseer baja actividad de DNAasa. El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales biolgicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios. Despus de extrado el ADN suele ser rpidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remocin, aislamiento y purificacin con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la clula de la cual proviene. El estrs o tensin mecnica o fsico qumica, que acompaan los procesos de purificacin de las molculas de ADN deben ser evitadas al mximo y las nucleasas inhibidas. Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extraccin y purificacin del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la accin de las enzimas que digieren estas molculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remocin de las protenas deben ser llevadas a cabo tan rpido como sea posible y en fro. Las nucleoprotenas, son protenas que aparecen asociadas con los cidos nuclecos de las clulas eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza inica pero solubles en soluciones de alta fuerza inica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extraccin inicial (Leningher, 1994). MATERIALES: 2 Pipetas Pasteur EDTA). Bao Mara NaCl, Centrifuga Tubos Eppendorf 1.5mL REACTIVOS: Buffer TAE (tris-acetato de sodioBuffer de extraccin: Tris EDTA pH 8 SDS al 10% en NaOH 0.2N

Gradilla Micropipetas (0.2mL y 1mL) EDTA: 1mM . Papel Absorbente Vasos de Precipitado (Amortiguador Salino NaCl Picetas 0.15M), citrato de Sodio 0.15M pH 7 Probeta (200mL y 1000mL) Ajustar pH de Buffer Jeringa 5mL Isoamilico Torniquete Mortero y Pistilo Puntas para Pipeta Tubos con Anticoagulante Actico EDTA) Tubo Falcn Acido) Guantes de Ltex 1.4M, Tris Potencimetro Balanza Analtica Vortx Cmara de Electroforesis Congelador de 20C. Microcentrfuga. Fotodocumentador Peine Fuente de poder. PROCEDIMIENTO:

Acetato de sodio 0.2M Buffer TE 1X :Tris10mM: Etanol Absoluto Frio Buffer SSC NaOH Conc. 10N 1X para

Fenol/Cloroformo/Alcohol Relacin 3:3:2 Agua Destilada Proteinasa K (No se uso) Buffer TAE (Tris-Acido Relacin (EDTA: 2mM, Tris; 40mM, CTAB al 3% (EDTA 20mM, NaCl: 100mM) -mercaptoetanol al 0.2% Gel Agarosa 0.8% Cloroformo RNasa Buffer de Carga Bromuro de Etidio 1mg /mL Sangre Tejidos Vegetales

a) Extraccin de ADN genmico de Humano: 1. Tomar una muestra de 3 a 5mL de Sangre en un tubo Vacutainer con EDTA o Citrato. 2. Distribuir la muestra en tubos eppendorf de 1.5mL colocando 0.8mL de sangre y aadir 650L de buffer SSC 1X y mezclar. Centrifugar por 1 minuto a 12,000 rpm en microcentrfuga. 3. Remover 1mL de sobrenadante y desechar en solucin desinfectante. 4. Aadir 1mL de buffer SSC 1X, agitar en vrtex, centrifugar por un minuto a 12,000 rpm y remover todo el sobrenadante. 5. Aadir 375L de Acetato de Sodio 0.2M a cada pastilla y agitar rpidamente. Enseguida aadir 25L de SDS al 10% y 5 de proteinasa K (20mL/mL de H2O)1, agitar con vrtex brevemente e incubar por 1 hora a 55o C por una hora (solo 40 minutos). 6. Aadir 20L de Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamlico. Vrtex por 30 segundos. Centrifugar por 2 minutos a 12,000 rpm en tubo de microcentrifuga. 7. Remover cuidadosamente la fase acuosa a un tubo nuevo de 1.5mL. Aadir 1mL de Etanol Absoluto Fro, mezclar e incubar por 15 minutos a -20 o C.

Centrifugar por 2 minutos a 12,000 rpm. Decantar el sobrenadante y secar con sanitas (volteando el tubo sobre la sanita). 8. Aadir 180L de buffer TE 1X, vrtex, e incubar a 55 oC pero solo 5 minutos. 9. Aadir 20L de Acetato de Sodio 0.2M y mezclar. Aadir 500L de Etanol Absoluto Fro, mezclar y centrifugar por 2 minutos a 12,000 rpm. 10.Decantar el sobrenadante y dejar secar por 10 minutos (invertir los tubos sobre la sanita) 11.Resuspender la pastilla en 50L de buffer TE 1X o agua destilada estril. 12.Agitar hasta disolver el DNA genmico. Almacenar a -20 oC. b) Extraccin de ADN genmico de plantas (Mtodo CTAB). 1. Moler 1g de Tejido congelado en mortero. Transferir el material en 500L de buffer de extraccin [CTAB 3%, Tris 100mM, pH 8, NaCl 1.4M; EDTA 20mM, pH 8y 0.2% -mercaptoetanol (V/V)] precalentado a 60 o C y mezclar por inversin cuidadosamente. 2. Nota: Agregar -mercaptoetanol al buffer de extraccin justo antes de su uso. 3. Incubar la muestra a 60o C por 15 minutos con mezcla ocasional por inversin. 4. Aadir 500L de cloroformo y mezclar hasta que se forme una emulsin. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y repetir paso 3 y 4. 6. Transferir la fase acuosa a tubo nuevo y agregar 2L de RNasa, mezclar e incubar a 37oC por 30 minutos. 7. Aadir 0.6 volmenes de isopropanol. Mezclar por inversin para precipitar el ADN. 8. Colocar la muestra a -20oC por 10 minutos. Centrifugar a 12, 000 rpm por 5 minutos. Decantar el sobrenadante. 9. Lavar la pastilla con 500L de etanol fro al 70%. Agitar hasta despegar la pastilla, centrifugar a 12,000 rpm por 5 minutos. Decantar el sobrenadante. 10.Dejar secar la pastilla sobre papel absorbente a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos aproximadamente. 11.Resuspender en 30L de buffer TE 1X o agua destilada estril hasta disolver. Almacenar a -20oC. c) Electroforesis en Gel. Preparacin del gel. 1. 2. 3. 4. 5. Preparar una solucin de agarosa al 0.8% en buffer TAE 1X. Fundir la solucin en horno de microondas al 80% de poder. Preparacin del portageles. Sellar ambos extremos del portageles con cinta testigo. Colocar el peine a 1 cm. del extremo del portageles y a 1-2 mm de la base del mismo. 6. Vaciar la agarosa caliente y dejar solidificar a temperatura ambiente. 7. Sumergir el gel dentro de la cmara de electroforesis conteniendo buffer TAE 1X. 8. Preparacin de la muestra.

9. Cortar un pedazo delgado de papel parafilm. 10.Colocar 5l de la muestra previamente purificada. 11.Agregar 4 l del colorante del frente de corrida (buffer de carga). 12.Mezclar con la micropipeta. 13.Tomar los 9 l y colocarlos en el pozo del gel. 14.Corrimiento electrofortico. 15.Aplicar corriente al gel, 100V durante 30 min. Hasta que llego la lnea de corrida a la mitad. Nota la molcula de ADN tiene carga negativa. 16. Se apaga el aparato, se saca el gel como si se desmoldara una gelatina con sumo cuidado. Tincin 1. Despus de la separacin electrofortica, sumergir en una solucin de bromuro de etidio durante 15 min. Visualizacin en el fotodocumentador a) Se pone la memoria. b) Se enciende la luz blanca. c) Se coloca dentro el Gel en el centro y se cierra. d) Enfocar y se enciende la Luz UV. e) Se observa y se toman fotografas para compararlas con el testigo.

ACTIVIDADES Y RESULTADOS: 1. Realizar y un Diagrama de Flujo para la obtencin de ADN, indicando en cada paso el objetivo.
PASOS A SEGUIR Extraccin de Muestra con EDTA (Sangre) Hacer Alcuotas de 0.8mL en tubos eppendorff y aadir a las alcuotas 650L de Buffer SSC 1X Mezclar y Centrifugar 1 minuto a 12,000 rpm. Remover el Sobrenadante OBJETIVO DE CADA PASO El EDTA sirve atrapar iones magnesio en el medio y as evitar enzimas que degradan al ADN

El SSC 1X Sirve para Homogeneizar las Clulas y el aislamiento de lo s ncleos para la extraccin de DNA

Ir purificando la muestra y eliminar contaminacin.

Aadir a las alcuotas 1mL de Buffer SSC 1X Agitar en vortex y centrifugar 1 minuto a 12,000 rpm y remover sobrenadante

El SSC 1X Homogeniza las Clulas y asla los ncleos para la extraccin de DNA y se elimina el sobrenadante para purificar

Aadir 375L de Acetato de Sodio 0.2M a cada pastilla y agitar rpidamente. Aadir 25 L de SDS al 10% y 5L de proteinasa K. Agitar en vortex e incubar 1 hora a 55oC. Aadir 20L de Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamlico agitar en vortex y centrifugar a 12,000 rpm por 2 minuto.

El acetato de sodio es para precipitar ADN, el SDS es para destruir ncleos y liberar el DNA y la proteinasa K es para degradar las protenas de las membrana celulares. La temperatura ayuda a desnaturalizar la as protenas.

La mezcla de Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamlico es un desnaturalizante activo de las protenas que causa que las protenas pierdan su solubilidad y se precipiten en la solucin. Se centrifugan para que quede en solucin con la fase acuosa superior solo el DNA y el RNA

Remover la fase acuosa a un tubo nuevo, aadir 1mL de Etanol Absoluto Frio, mezclar e incubar 15 minutos a 20o C. Centrifugar a 12,000 rpm 2 minutos y decantar el sobrenadante y secar.

Se remueve la fase acuosa porque ah esta disuelto el ADN y el ARN, el etanol frio sirve para precipitar cidos nucleicos. La temperatura y la centrifugacin precipitan los cidos nucleicos. Al decantar se eliminan contaminantes y se deja solo el ADN en el inferior de ll tubo eppendorff

Aadir 180L de Buffer TE 1X, se agita en vortex, se incuba a 55o C por 5 minutos.

El buffer TE 10:1 es una solucin amortiguadora del pH comnmente empleada en biologa molecular, especialmente para procedimientos que buscan proteger al DNA o RNA. La capacidad amortiguadora del buffer depende del Tris, mientras que el EDTA es el responsable de proteger a los cidos nucleicos inactivando a las DNAsas o RNAsas. El EDTA logra esta inactivacin actuando como quelante de cationes divalentes como el Ca 2+ y el Mg2+ los cuales son indispensables para el funcionamiento de estas enzimas. El acetato de sodio es para precipitar ADN, lo mismo que el etanol fro.

Aadir 20L de Acetato de Sodio 0.2M y mezclar. Aadir 500L de etanol Absoluto Frio y centrifugar a 12,000 rpm por 2 minutos

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Decantar el sobrenadante y dejar secar por 10 minutos, invirtiendo los tubos.

Se decanta para eliminar los contaminantes ya que el DNA obtenido esta en forma de pastilla pegado en el fondo del tubo eppendorff

11 12

Resuspender la pastilla en 50L de TE 1X o agua destilada estril. Agitar hasta Disolver el DNA genmico

El Buffer TE protege el DNA, como ya lo mencionamos anteriormente.

Esto es para que quede como solucin ya que estaba en forma de pastilla.

2. Anotar observaciones y el aspecto del Material Obtenido. No corrieron todos solo los carriles en los nmeros 6 y 7. Solo se le vio al carril no. 2 una banda y en el carril 3 una banda muy difusa. En el control que se puso en el pocillo 1 se observa la escalera de pares de bases donde nos dice que tantas pares de bases tiene el ADN al hacer la comparacin. El marcador de ADN nos indica cuantos escalones deben tener la escalera del ADN observado y estn dados por el peso en pares de bases, por eso esos marcadores se usan como referencias para comparar los pares de bases. Se lleva a cabo la corrida de negativo a positivo debido a la

Acomodo de los Carriles

Carril No. 1
Marcador

Carril No. 2
Sangre Daro

Carril No. 3
Sangre Daniel

Carril No. 4
Sangre DaroEDTA

Carril No. 5
Hoja de Malva

Carril No. 6
Hoja de buganvilia

Carril No. 7
Hoja de Granado

Carril No. 8
Hoja de Malva

No 8 No 7 No 6 No 5 No 4 No3 No 2 No1

3. Explicar el Fundamento de la tcnica de electroforesis en gel de Agarosa. La electroforesis en gel es el procedimiento por el cual las molculas cargadas emigran diferentemente cuando se les somete a campo elctrico; la velocidad de migracin viene determinada por el tamao de las molculas y por su carga elctrica. La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. En la electroforesis en gel, el cido nucleco se incluye en el gel, normalmente agarosa o poliacrilamida. Las molculas pequeas de ADN y ARN casi siempre se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida (Karp, 2005). Las molculas ms grandes tienen problemas para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruzados y por lo general se fraccionan en un gel de agarosa que es ms poroso. Los cidos nuclecos migran a travs del gel dependiendo de su tamao y de su forma. Las molculas pequeas y compactas migran ms rpido que las grandes y relajadas. Despus de un tiempo definido de migracin, la ubicacin de las molculas de DNA en el gel son observables por iluminacin con luz ultravioleta. El gel se tie despus de la electroforesis, con bromuro de etidio y se observa en un transiluminador de luz ultravioleta. En los cidos nuclecos la direccin de migracin es del

electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato. DISCUSIN: Durante el transcurso de esta prctica realizamos varias maniobras para extraer y purificar ADN de tejido animal (sangre perifrica) y tejido vegetal (hojas de diversas plantas), as como tambin nos apoyamos en la electroforesis para la separacin de cidos nuclecos. La purificacin de tejido vegetal y tejido animal es bsicamente el mismo proceso; lavados, desnaturalizacin de protenas y precipitacin de molculas, pero se emplean diferentes buffers, en el caso de tejido vegetal se uso el CTAB, que es un buffer que solubiliza polisacridos, membranas y pared celular, depende de su concentracin de cloruro de sodio para hacerlo. Tambin la temperatura de incubacin fue mayor ya que la clula vegetal posee no solo membrana celular sino tambin pared celular, la cual tambin se requiere lisar para extraer el material gentico del interior de dicha clula. En el caso de tejido animal se uso el buffer SSC 1X que tambin tiene una alta concentracin de cloruro de sodio para romper la membrana celular y extraer el material gentico. Para purificar el ADN es necesario eliminar todas las sustancias que pudieran estar contaminndolo, tales como protenas, polisacridos, grasas y RNA. Para poder eliminar las protenas se utilizan cloroformo y fenol, as como enzimas proteolticas; aunque en este caso no se empleo la proteinasa K ya que no se contaba con ella, para eliminar el RNA se utiliza RNAasa, la cual degrada al RNA en componentes ms ligeros y ms fciles de separar. Es importante tener mucho cuidado al aadir todos los buffers de manera correcta y con la concentracin adecuada, es por esto que es importante realizar los clculos necesarios para no equivocarnos ya que esto puede interferir en los resultados. En el caso de nuestro equipo hicimos la determinacin en tejido animal, las muestras deben estar en tubos con anticoagulante con EDTA, ya que el EDTA atrapa los iones magnesio presentes en el medio para evitar la accin de enzimas que degradan al ADN. En esta prctica se agrego en el paso no. 6 solo a 3 muestras cloroformo y a las otras la mezcla de fenol/alcohol isoamlico, para eliminar las sustancias que nos contaminen la muestra, una vez que ya se han eliminado todos los contaminantes el ADN se precipita en etanol fro, ya que este todava aparte de precipitarlo lo separa de otros contaminantes como las grasas, tambin se puede cambiar el etanol frio por alcohol isoamlico ya que los dos tienen la misma funcin. Durante los procesos de extraccin y purificacin es necesario hacer uso de la centrifugacin ya que con esto las partculas de sustancias contaminantes se pueden ir eliminando, esto debido a que su peso hace que se vayan al fondo del tubo y as se pueden eliminar al pasar el sobrenadante a otro tubo donde solo va disuelto el DNA que nos interesa.

Para separar los cidos nuclecos se utiliz la electroforesis en gel de agarosa, que no es otra cosa sino el paso de la muestra de ADN a travs de un gel poroso, cuyas partculas e ADN van pasando por dichos poros en funcin de su carga elctrica y de su tamao o peso molecular. Para que las partculas de ADN tengan una carga estable es necesario aadir un buffer de corrida en la cmara electrofortica para que as estas partculas tengan las mismas cargas y entonces as migren al polo elctrico opuesto en base a su tamao, el buffer de corrida nos ayuda a que se deslice el ADN por el gel de agarosa. Tambin es necesario utilizar un colorante ya que sin el se pierde la muestra o revelar la corrida, se empleo el bromuro de etidio, que es cancergeno, por lo cual debe de emplearse con cuidado y en lugares bien ventilados y con las medidas de seguridad adecuadas (guantes de ltex, lentes de seguridad, etc.). El bromuro se intercala en los puentes de hidrogeno de la escalera de ADN. Debido a que el ADN tiene carga negativa la corrida del buffer se llevo a cabo de negativo a positivo, usando un voltaje de 100V. En la parte experimental observamos que el ADN se que se extrajo de las muestras no se observo muy bien ya que se desnaturalizo, no se extrajo de manera adecuada o estaba contaminado. Solo en los pozos dos y tres se observo presencia de ADN, mientras que en los carriles 6 y 7 se observaron bandas difusas, lo cual indica que el ADN se desnaturalizo. En este mtodo utilizado no se observa la escalera de ADN porque es genoma completo, por eso se observan bandas sencillas, cuando se logran observar. Es necesario realizar todos los pasos para la extraccin con sumo cuidado y con las medidas de seguridad necesarias, como guantes de ltex, ya que si no se hace as no se obtendr el resultado deseado. En general se pudo observar presencia de ADN en el gel, aunque no fue lo que se esperaba. CONCLUSIONES: Aprendimos una metodologa muy importante para extraer y purificar ADN de tejido animal o vegetal. Es necesario agregar todos los reactivos adecuados y seguir la metodologa paso por paso para que al final la muestra de ADN sea lo ms pura posible. Algunos de los contaminantes que pudieran estar presentes seran algunos aminocidos, fenol, cloroformo y principalmente ARN sino se dejo actuar apropiadamente la RNAasa, en el caso de tejido vegetal. La electroforesis es un mtodo muy til para el anlisis por separacin de macromolculas como protenas, cidos nuclecos, etc. Y observar as si el ADN o ARN que se extrajo estaba puro o no. La electroforesis ha sido utilizada para desarrollar otros trabajos como hibridaciones entre las molculas separadas de cidos nuclecos, con la finalidad de identificar su naturaleza.

BIBLIOGRAFA: Roche S. P., Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de aceite, PALMAS - Vol. 23 No. 3, Bogot Colombia, 2002. Leningher A.L., Bioqumica, 1994, 2 Edicin, Ediciones Omega, Barcelona, pp.325326, 880881. Karp G., Biologa Celular y Molecular, 4 Edicin, Mc Graw Hill Interamericana, EUA, 2005, pp. 817-818.

APNDICE: Preparacin de Soluciones 20 mL de Acetato de Sodio 0.2M Pesar 0.544 gr de Acetato de sodio y disolverlo en 20mL de agua destilada. Clculos:

50mL de Buffer SSC 1X (Buffer de Citrato de Sodio) Citrato de sodio 0.15M Cloruro de Sodio 0.15M Pesar 2.20575gr de Citrato de Sodio y pesar 0.43875gr de Cloruro de Sodio y disolver en 50mL de agua destilada. Clculos:

50mL de Buffer TE 1X 10mM de Tris Base EDTA 1mM Pesar 0.06055gr de Tris Base y tomar 100L de EDTA 0.5M y disolverlo en 50mL de agua destilada. Clculos:

1Lt de Buffer TAE 1X (buffer Tris-Acido Actico-EDTA) Tenemos TAE 10X: 40mM Tris Base se pesan 48.4g 1M - Acido Actico Glacial se toman 11.42mL 2M EDTA se pesan 7.44gr Se disuelven en 1L de agua destilada. Gel de Agarosa 0.8% Se pesan 0.8gr de Agarosa y se Disuelven en 100mL de TAE