Gua de Prcticas de Microbiologa 201 3

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER

FACULTAD DE EDUCACIN
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS NATURALES Y AMBIENTALES

MANUAL

D EL DE

LABORATORIO

MICROBIOLOGA

GENERAL

CATEDRTICO:

McBLGO. FREDY BETALLELUZ VALENCIA.

HUANCAYO, PERU. 2013

McBlgo. FREDY BETALLELUZ VALENCIA.

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GUA No 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
I. PROPSITO. Aplica las normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa. Valora la importancia de las normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa. II. FUNDAMENTO. Las normas del laboratorio son indispensables para un adecuado trabajo experimental en el campo de la Biologa, ya que la parte prctica de esta ciencia necesita de personas diestras, lo que exige tener en cuenta una serie de detalles precisos para realizarlos, ya que en general las tcnicas deben aplicarse con cuidado, perfeccin y soltura. Nunca debe olvidar que gran parte del material biolgico con que se trabaja en el laboratorio es muy delicado (clulas, tejidos, embriones) o muy peligroso, as las bacterias resultan patgenas para el hombre y es necesario, por tanto, evitar contraer una infeccin y la del personal que trabaja en el laboratorio; causada ya sea por una defectuosa manipulacin, por descuido o por despreocupacin. Numerosos son los accidentes en el trabajo del laboratorio. Son frecuentes las quemaduras y lesiones causadas por los reactivos o la llama del mechero de Bunsen. Asimismo son peligrosas las infecciones con microorganismos. El Dr. Bruce muri con "brucelosis" cuando trabajaba con la bacteria Brucella melitensis; el Dr. Prowazeck muri cuando trabajaba con el "tifo exantemtico". III. PROCEDIMIENTO. Lea con atencin cada norma de laboratorio y a continuacin discuta su importancia con los compaeros de grupo. Anote las conclusiones. 01. En el laboratorio, los estudiantes deben vestir con guardapolvo blanco. Por qu el color de la prenda debe ser blanco? Cules deben ser las caractersticas de la confeccin? Cul es la importancia de utilizarlo?

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02. En cada sesin de laboratorio, los estudiantes trabajarn en grupos. Cul es la importancia de trabajar con la tcnica de la dinmica grupal? Con qu criterios se debe conformar un grupo de trabajo?

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Antes de iniciar el trabajo en el laboratorio el estudiante debe contar con la gua de prctica la cual debe ser estudiada. Tenga presente que una prctica bien realizada repercute en el buen aprendizaje de los contenidos conceptual, procedimental y actitudinal. Cul es la importancia de utilizar una gua de experiencias de aprendizaje? Cada sesin de laboratorio se iniciar con una corta explicacin y un periodo de instrucciones sobre el tema de aprendizaje. Un buen trabajo de laboratorio depende primordialmente en saber qu, cmo, con qu y para qu se aprender. Segn su criterio, qu momentos de la clase son los ms importantes? Desinfectar la mesa de trabajo con alguna sustancia o solucin germicida, al principio y al final de cada sesin de laboratorio. Antes de empezar el trabajo el estudiante se debe proveer de sustancias o soluciones desinfectantes como jabn carblico, detergente, alcohol yodado, fenol al 5 % o mezcla sulfocrmica, etc. Disponer y ubicar los materiales biolgicos y del laboratorio necesarios para ejecutar los experimentos. En el caso de que los materiales de vidrio estuvieran sucios, cmo procedera a limpiarlos? Retirar todo objeto extrao de la mesa de trabajo. V. gr. cuaderno, libro, comida, etc., No utilizar los materiales de laboratorio (vasos de precipitacin, matraces, beakers, etc.) como recipientes para ingerir sustancias lquidas. En el supuesto caso de ingerir una sustancia o solucin reactiva, cmo procedera? En el laboratorio est completamente prohibido: comer, beber o fumar, antes, durante y despus de los experimentos. Por qu es importante esta norma? Evite llevar la mano a la boca y la accin de humedecer etiquetas con la lengua. Efectuar las experiencias con una rigurosa planificacin y bastante atencin, en caso de no comprenderlas, consultar con el personal especializado (el docente o el laboratorista) a fin de que no quede ninguna clase de duda al respecto. Anote los datos, grficos o conclusiones en una libreta de apuntes. Despus de efectuar cualquier trabajo prctico que implique contaminacin, desinfecte sus manos con agua y jabn carblico, enseguida use alcohol yodado. Cualquier accidente durante los trabajos prcticos (ms an cuando se trata de reactivos corrosivos, inflamables o cultivo de microorganismos), se deber reportar inmediatamente al encargado del laboratorio, a fin de que se tomen las medidas concernientes. Tome todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes, especialmente en la seguridad de los reactivos.

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14. Si durante el trabajo en el laboratorio se producen heridas o escoriaciones en la piel, lavar con abundante agua a chorro continuo y luego aplicar desinfectante y venda. En los accidentes por aspiracin de gases txicos o la ingestin de sustancias lquidas txicas, beber leche en tarro en abundancia. Los materiales de laboratorio deben estar limpios antes y despus de su empleo. El material fungible de vidrio que se contamine durante los experimentos (lminas portaobjetos, cubreobjetos, pipetas Pasteur, etc.), debe ser introducido en un recipiente con mezcla sulfocrmica antes de su eliminacin. Los materiales de desperdicio como papel, algodn, pita, plstico, vidrio, plantas, animales muertos, etc. deben ser depositados en los recipientes o tachos para basura. Cmo clasificara la basura para su reciclaje? Antes de abandonar el laboratorio, tener cuidado de que todos los objetos empleados sean devueltos en buen estado y limpios al laboratorista.

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IV. EVALUACIN. Cada grupo consolida las conclusiones acerca de la importancia de las normas del laboratorio. Cada grupo presenta las conclusiones principales a la clase (grupo mayor) y se inicia la discusin dirigida. Se formula las conclusiones finales. Habr alguna norma importante de laboratorio que se omiti en la presente gua?

ACTIVIDAD 2. Adquiera en el comercio un guardapolvo blanco el cual debe tener el logotipo de su facultad, y un rtulo con su nombre y apellido. Implemente sus artculos protectores complementarios como cobertor de cabeza, sujetador de cabello (damas), tapaboca y guantes quirrgico. Implemente sus tiles de higiene personal, tales como: jabn germicida, toalla de manos, toalla de mesa.

V. CUESTIONARIO. Disee la estructura de un laboratorio para los experimentos de Biologa. Qu es un desinfectante? Cmo se prepara la mezcla sulfocrmica? A qu se refieren las normas de seguridad? Qu son los primeros auxilios?

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ANEXO PICTOGRAMAS DE SEGURIDAD
Un pictograma es un signo que representa esquemticamente un smbolo, objeto real o figura. Es el nombre con el que se denomina a los signos de los sistemas alfabticos basados en dibujos significativos. Un pictograma debera ser enteramente comprensible con slo tres miradas En el diseo de un pictograma deberan suprimirse todos los detalles superfluos En la actualidad es entendido como un signo claro y esquemtico que sintetiza un mensaje sobrepasando la barrera del lenguaje; con el objetivo de informar y/o sealizar.

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VI. BIBLIOGRAFIA (01) ICMSF. (02) JAY, J. (03) JAWETZ, B. E. 1991 Microorganismos de alimentos. Edit. Acribia. Espaa. (576/I4) 1988 Microbiologa moderna de alimentos. 2 edicin. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. (576/J28). 1995 Microbiologa mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico. (616.01/J26: FPH-BE).

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GUA No 2

NORMAS DE HIGIENE
EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
I. PROPSITO La presente experiencia de laboratorio es para desarrollar las siguientes habilidades del pensamiento de los estudiantes: Identifica y aplica las normas de higiene en el laboratorio de microbiologa. Valora la importancia de las normas de higiene en el laboratorio. II. FUNDAMENTO ALGUNAS REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LOS LABORATORIOS Las medidas de seguridad en los laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de prcticas realizadas en forma rutinaria. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la informacin que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja. 1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: extintor de fuego, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, etc. 2. Los laboratorios contarn con un botiqun de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 3. El aseo personal (higiene individual) es muy importante para no contaminar las muestras en experimentacin. Mantenga limpios sus odos (use torundas o hisopos), nariz (use pauelos o papel higinico), boca (use pasta dental y cepillo) y las manos (use jabn germicida y toallas limpias). 4. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 5. Se deber utilizar vestimenta apropiada (guardapolvo preferentemente de algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes) para realizar trabajos de laboratorio y tener el cabello recogido y protegido con un gorro especial. Tambin es necesario usar mascarilla y guantes. Se requerir el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias txicas o manipulacin de biopatgenos, apertura de recipientes con cultivos despus de agitacin, etc. Se debern utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumica o material biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deber tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono, lapiceros, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 6. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitar el uso de lentes de contacto. 7. No se permitir pipetear con la boca. 8. No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse. 9. No se debern guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas.

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10.Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 11.No se permitir correr en los laboratorios. 12.No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin. 13.Todo material corrosivo, txico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deber estar adecuadamente etiquetado. 14.No se permitirn instalaciones elctricas precarias o provisorias. Se dar aviso inmediato a la Secretara Tcnica en caso de filtraciones o goteras que puedan afectar las instalaciones o equipos y puedan provocar incendios por cortocircuitos. 15.Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana. 16.Se deber verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignicin. No se operar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca de las mismas. Para calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestar especial atencin al punto de inflamacin y de autoignicin del producto. 17.El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plsticas. 18.Ser necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces. 19.Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos o material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se debern seguir los procedimientos establecidos para la gestin de residuos. 20.Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (ms de 5 litros) deber tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestin. 21.Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente ms pequeo, realice una conexin con una cadena del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente de manera de igualar potenciales y eliminar la posible carga esttica. 22.Al almacenar sustancias qumicas considere que hay cierto nmero de ellas que son incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones peligrosas. Ante dudas consultar al Jefe de Laboratorio. 23.No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, hgalo en estantes bajo las mesas y en caso de cidos o lcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos dentro de lo posible en recipientes adecuados. 24.Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posicin vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulacin, protegidos de la humedad y fuentes de calor, de ser posible en el exterior. 25.Se informar al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten dejar equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio. 26.Se anotar en un lugar visible desde el exterior los telfonos de los responsables de cada laboratorio para que puedan ser consultados en caso de alguna anomala verificada por el personal de Seguridad y Control en su recorrido fuera de los horarios habituales de trabajo. Procedimientos ante emergencias: Emergencias mdicas Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de algn producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder del siguiente modo: 1. A los accidentados se les proveern los primeros auxilios. 2. Simultneamente se tomar contacto con el Servicio Mdico de la UNCP. 3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarn asistencia al Centro Mdico para que enven personal del Depto. de Mantenimiento, Seguridad y Control o Servicios Generales, segn corresponda. 4. El Jefe de Laboratorio notificar el accidente al Centro Mdico para su evaluacin e informe, donde se determinarn las causas y se elaborarn las propuestas para modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones.

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Incendios 1. Mantenga la calma. Lo ms importante es ponerse a salvo y dar aviso a los dems. 2. Si hay alarma, accinela. Si no, grite para alertar al resto. 3. Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control informando el lugar y las caractersticas del siniestro. 4. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan de evacuacin. 5. Si debe evacuar el sector apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas. 6. Evace la zona por la ruta asignada. 7. No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice ascensores. Descienda siempre que sea posible. 8. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida. 9. Si pudo salir, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. III. PROCEDIMIENTO Lea con atencin cada norma de laboratorio y luego identifique las caractersticas de cada una de ellas, enseguida orden las normas segn su prioridad y finalmente realice la prctica del aseo personal. PROTOCOLOS DEL ASEO PERSONAL 01. 02. 03. Limpieza de odos. Use los hisopos o torundas u otras tcnicas. Limpieza de la nariz. Use un pauelo limpio. Aseo de la boca. Use la pasta dental y el cepillo. Existen muchas tcnicas, pero cabe destacar que ms que la tcnica lo importante es la minuciosidad, el cuidado con el que se realiza el cepillado, consiguiendo as el mismo resultado con cualquiera de las tcnicas. Aunque est claro que existen casos en que debido a determinadas patologas o factores como la falta de cooperacin o falta de destreza manual se recomienda una tcnica determinada. Es importante en todas las tcnicas seguir un orden que deber ser siempre el mismo para no olvidar ninguna superficie dentaria.. Para ensear a la gente a cepillarse hay que ensearles una rutina: en primer lugar cepillar la mitad superior derecha por la parte externa, seguida de la mitad superior izquierda tambin por la parte externa, mitad inferior izquierda y mitad inferior derecha tambin por la parte externa. Seguiremos otra vez el mismo orden pero ahora por la parte interna. A continuacin las caras masticatorios u oclusales de los dientes y por ltimo cepillaremos la lengua. En total la tcnica de cepillado correcto debe durar entre 2-3 minutos. Cabe destacar las distintas tcnicas existentes aunque no todas ellas son utilizadas: Tcnica de fregado horizontal. Es una tcnica sencilla y la ms recomendada en nios. Consiste simplemente en "fregar" los dientes con movimientos horizontales. Tcnica circular o de Fones . Es la tcnica recomendada en nios ms pequeos, dada la menor destreza a la hora de realizar el cepillado dental. Consiste en movimientos circulares amplios con la boca del nio cerrada, abarcando desde el borde de la enca del diente superior al inferior. Con ella se consigue remocin de la placa y al mismo tiempo se masajean las encas. Tcnica vertical. Con los dientes contactando se van cepillando de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba.

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Tcnica del rojo al blanco. Se cepilla desde las encas hacia el diente. Los penachos se sitan en la enca y vamos haciendo movimientos de arriba hacia abajo en la arcada superior y de abajo hacia arriba en la arcada inferior. Tcnica de Bass. Es la ms efectiva. Situamos el cepillo con una inclinacin de 45. Se trata de realizar unos movimientos vibratorios ntero posteriores, pero sin desplazar el cepillo de su punto de apoyo. Deben ser movimientos muy cortos para que las cerdas se flexionen sobre sus propios ejes pero que las puntas no se desplacen de los puntos de apoyo. As conseguimos desmenuzar la placa bacteriana, que asciende por el penacho, por lo cual cada vez tenemos que lavar bien el cepillo porque los penachos se cargan de placa bacteriana. Es una tcnica muy recomendada en adultos. Se deben ir cepillando de dos o tres piezas, siguiendo la secuencia que hemos explicado antes. En la cara masticatoria de los dientes hacer movimientos de fregado rpido para eliminar todos los restos de alimentos. Lavado de manos. Use jabn germicida y toallas limpias para secarse.

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PROTOCOLOS DE LA LIMPIEZA DE LAS MESAS DE TRABAJO 01. Desinfectar la mesa de trabajo con alguna sustancia o solucin germicida, al principio y al final de cada sesin de laboratorio. Antes de empezar el trabajo el estudiante se debe proveer de sustancias o soluciones desinfectantes como jabn carblico, detergente, alcohol yodado, fenol al 5 % o mezcla sulfocrmica, etc. Disponer y ubicar los materiales biolgico y del laboratorio necesarios para ejecutar los experimentos. En el caso de que los materiales de vidrio estuvieran sucios, cmo procedera a limpiarlos? Retirar todo objeto extrao de la mesa de trabajo. V. gr. cuaderno, libro, comida, etc., No utilizar los materiales de laboratorio (vasos de precipitacin, matraces, beakers, etc.) como recipientes para ingerir sustancias lquidas. En el supuesto caso de ingerir una sustancia o solucin reactiva cmo procedera? En el laboratorio est completamente prohibido: comer, beber o fumar, antes, durante y despus de los experimentos. Por qu es importante esta norma? Evite llevar la mano a la boca y la accin de humedecer etiquetas con la lengua. Efectuar las experiencias con una rigurosa planificacin y bastante atencin, en caso de no comprenderlas, consultar con el personal especializado (el docente o el laboratorista) a fin de que no quede ninguna clase de duda al respecto. Anote los datos, grficos o conclusiones en una libreta de apuntes. Despus de efectuar cualquier trabajo prctico que implique contaminacin, desinfecte sus manos con agua y jabn carblico, enseguida use alcohol yodado. Cualquier accidente durante los trabajos prcticos (ms an cuando se trata de reactivos corrosivos, inflamables o cultivo de microorganismos), se deber reportar inmediatamente al encargado del laboratorio, a fin de que se tomen las medidas concernientes. Tome todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes, especialmente en la seguridad de los reactivos. Si durante el trabajo en el laboratorio se producen heridas o escoriaciones en la piel, lavar con abundante agua a chorro continuo y luego aplicar desinfectante y venda. En los accidentes por aspiracin de gases txicos o la ingestin de sustancias lquidas txicas, beber leche en tarro en abundancia. Los materiales de laboratorio deben estar limpios antes y despus de su empleo. El material fungible de vidrio que se contamine durante los experimentos (lminas portaobjetos, cubreobjetos, pipetas Pasteur, etc.), debe ser introducido en un recipiente con mezcla sulfocrmica antes de su eliminacin. Los materiales de desperdicio como papel, algodn, pita, plstico, vidrio, plantas, animales muertos, etc. deben ser depositados en los recipientes o tachos para basura. Cmo clasificara la basura para su reciclaje? Antes de abandonar el laboratorio, tener cuidado de que todos los objetos empleados sean devueltos en buen estado y limpios al laboratorista.

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IV. EVALUACIN Cada miembro del grupo consolida las conclusiones acerca de la importancia de las normas de higiene en el laboratorio. Cada grupo consolida las conclusiones principales a travs de la discusin dirigida. Se formulan las conclusiones finales. Habr alguna norma de higiene importante que se omiti en la presente gua? V. CUESTIONARIO Disee la estructura de un laboratorio para los experimentos de Microbiologa. Qu es un desinfectante? Cmo se prepara la mezcla sulfocrmica? A qu se refieren las normas de bioseguridad? Qu son los primeros auxilios? VI. BIBLIOGRAFIA (01) ICMSF. (1991).Microorganismos de alimentos. Edit. Acribia. Espaa. (576/I4) (02) JAY, J. (1988). Microbiologa moderna de alimentos. 2 edicin. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. (576/J28). (03) JAWETZ, B. E. (1995). Microbiologa mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico. (616.01/J26: FPH-BE).

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GUA No 3
ASEPSIA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA (ESTERILIZACIN) I. PROPSITO. Ejecuta correctamente la tcnica de la esterilizacin en autoclave.

II. FUNDAMENTO Se entiende por esterilizacin a la destruccin o muerte de toda forma de vida en una sustancia o material, empleando para ello agentes fsicos o qumicos. ESTERILIZACION MEDIANTE AGENTES FSICOS: A. Por calor seco, se mata a los microorganismos por oxidacin de sus protenas. Comprende las siguientes tcnicas: Flameado a la llama directa, consiste en exponer el material, especialmente metlico, por breves instantes a la llama de un mechero para eliminar rpidamente a los microorganismos. Esta tcnica se usa para esterilizar el asa de kolle. Incineracin, se realiza en un horno elctrico. Sirve para incinerar cadveres de animales, plantas u otros residuos orgnicos. B. Por calor hmedo, se mata a los microorganismos por coagulacin de sus protenas. Es ms rpido y efectivo que el calor seco. Comprende las siguientes tcnicas: Ebullicin, ocasiona la muerte de las formas vegetativas de los microorganismos ms no as de sus formas esporuladas o de resistencia, por lo que no es recomendable. Consiste en someter el material a esterilizar (pinzas, jeringas, cuchillos, esptulas, etc.) al agua hirviente a 100 C por espacio de 15 a 30 minutos. Pasteurizacin, tcnica ideada por Pasteur, que consiste en someter a tratamiento de calor controlado sustancias como la leche, vinos, cremas, con la finalidad de contrarrestar el desarrollo de microorganismos indeseables que alteran su naturaleza. Existen dos tipos de pasteurizacin: Pasteurizacin lenta o de retencin, consiste en someter los productos a una temperatura de 61,6 - 62 C durante 30 minutos. Pasteurizacin rpida, ocurre a alta temperatura y es de accin rpida (ATAR), consiste en el calentamiento a 71,6 - 72 C durante 15 a 30 segundos. Tyndalizacin, tcnica ideada por el fsico ingls Tyndall. Consiste en el calentamiento discontinuo e intermitente de una sustancia lquida hasta el punto de ebullicin durante unos cuantos minutos, esto permite destruir las clulas vegetativas pero no las esporas. Se conserva el medio en reposo hasta el da siguiente, en cuyo tiempo germinan las esporas y producen clulas vegetativas, las cuales se destruyen nuevamente por calentamiento similar; seguidamente se procede a un tercer calentamiento. Vapor a presin. El calor en forma de vapor a saturacin y a presin, es el agente ms prctico y confiable para esterilizar. El vapor a presin proporciona temperaturas superiores a los que se obtiene por ebullicin, adems de proveer de calentamiento rpido, penetracin y humedad en abundancia que faciliten la coagulacin de protenas. La tcnica corresponde al autoclave o autoclavado.

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III. MATERIALES. Autoclave u olla a presin. Mechero de Bunsen u hornillo elctrico. Placas de Petri (6), Matraz de 250 ml (2), Tubos de ensayo de 15 ml (10), Varilla de vidrio o bagueta. Pipetas de 1 ml y 10 ml. Pipeta de Pasteur. Esptula de Drigalsky. Focos usados (5) y un desarmador. Plumn indeleble. Papel Graf. Tijera y regla. Algodn (torundas) Pita (pabilo). Detergente. Cepillo lava botella. Toalla pequea o trapo.

IV. PROCEDIMIENTO Tcnica de la esterilizacin por vapor a presin en autoclave: Experiencia: 1. Reconocimiento del autoclave:

2. Cuidado y limpieza de autoclave : lave la olla a presin con agua y detergente. enjuguela y luego deje orear al ambiente. El orificio central de la vlvula reguladora de la tapa debe estar siempre limpio, antes y despus de usar la olla. Al limpiar la empaquetadura, evite estirarla con fuerza, puede perder su forma y originar fugas de vapor. No lavar ni enjuagar la empaquetadura cuando est caliente, porque puede perder su elasticidad. Guarde la olla destapada despus del uso.

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3. Lavado de los materiales a esterilizar: especialmente los materiales de vidrio a esterilizar se lavan con agua y detergente. Luego se deja orear al medio ambiente. 4. Torundado, los materiales con boca (matraz, tubo de ensayo, focos, pipetas, etc.) se tapan con almohadillas de algodn llamadas torundas. 5. Empaquetado y amarrado, se realiza con papel graff y se amarra con pita de tal manera que se desate con facilidad. El empaquetado de placas de Petri y pipetas es muy especial. Recorte papel y esterilice. Pida instrucciones al profesor. 6. Codificado, se realiza en la parte visible del material o del papel de empaque con plumn indeleble. 7. Autoclavado: a) Vierta agua al autoclave u olla a presin hasta el nivel de la rejilla vaporizadora (parrilla interna) y caliente a fuego fuerte sin tapar. Retire la olla del fuego al momento de la ebullicin. b) Coloque los materiales al interior de la olla sin sobrepasar los de su capacidad. c) Cierre la olla haciendo coincidir la V de la tapa con la V del mango de la olla y ajuste adecuadamente girando hacia la izquierda hasta conseguir el cierre hermtico. d) Caliente la olla a fuego fuerte hasta que la vlvula reguladora comience a sisear. El siseo de escape de vapor se seguir escuchando hasta que Ud. presione la vlvula reguladora. En este momento se controla el tiempo de coccin durante 15 minutos. e) Baje el fuego a temperatura media hasta que se cumpla el tiempo de esterilizacin. Luego apague el fuego, abra la vlvula reguladora (espita) para liberar el vapor, enseguida destape y deje evaporar. Retire el material estril y gurdelo hasta usarlo. Tenga presente lo siguiente: en el autoclave se puede esterilizar muchos instrumentos de laboratorio cuando se opera a 15 lb /pulg 2 de presin durante un tiempo aproximado de 15 minutos logrando una temperatura de 121 C. Si cuenta con autoclave que incluya manmetro puede controlar la temperatura en funcin a la presin alcanzada: Presin del vapor lb/pulg2 00 05 10 15 20 Temperatura C 100 109 115 121.5 126.5

V. EVALUACIN. 1. Cules son los criterios para la limpieza y cuidado de autoclave? a. b. c. d. 2. Resuma los principales pasos de la tcnica de esterilizacin por vapor a presin en autoclave: a. b. c. d. e. f.

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VI. CUESTIONARIO. 1. Grafique la estructura de autoclave de laboratorio (corte longitudinal). Nombre sus partes.

2. Explique el fundamento de la esterilizacin en pupinel y seale sus aplicaciones.

VII. BIBLIOGRAFA (01) COLLINS. (1989) Mtodos microbiolgicos. Acribia. Espaa. (576/C72). (02) GIRARD y ROUGIEUX. (1984) Tcnicas de microbiologa agrcola. Acribia. Espaa. (576/G53). Direcciones en Internet:

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GUA No 4A

MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVO. Prepara correctamente los medios de cultivo.

II. FUNDAMENTO. Los medios de cultivo, son sustancias nutritivas que proveen las condiciones ptimas para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Un medio de cultivo adecuado contiene factores como los nutrientes que sirven como donadores y aceptores de hidrgeno, fuente de carbono, fuente de nitrgeno y fuente de minerales (azufre, fsforo, magnesio, potasio, calcio, hierro, etc.). Asimismo proporciona factores de crecimiento (vitaminas, aminocidos), humedad, pH y condiciones de esterilidad. CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO: 1. Por su naturaleza: a. Medios naturales, son sustancias no elaboradas por el hombre y que pueden utilizarse como medios de cultivo, as se tiene que para los virus se usa la membrana corio-alantoidea de embrin vivo de pollo; la sangre o suero sanguneo estril se usa para cultivar bacterias patgenas. La leche es otra sustancia natural de uso corriente como medio de cultivo para las bacterias lactgenas. Las carnes, verduras y frutas tambin sirven como medios naturales de cultivo microbiano. b. Medios artificiales, son sustancias elaboradas por el hombre y contienen una gran variedad de componentes. Se subdividen en: b.1 Medios sintticos, son medios cuya composicin qumica est definida y determinada, p. e. los medios en cuya frmula contienen azcares, aminocidos, vitaminas, etc. b.2 Medios no sintticos, son medios cuya composicin qumica es indefinida, compleja y relativamente indeterminada, por ejemplo, los medios que contienen extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc. 2. Por su estado fsico (consistencia): a. Medio lquido, no lleva en su composicin un agente gelificante o solidificante. Ejm. caldo nutritivo, solucin azucarada, etc. b. Medio semislido, es aquel que en su composicin lleva un agente gelificante como el agar en una concentracin de 0,1 a 0,3 % . Ejm. medio de Hugh-Leifson. c. Medio slido, en su composicin lleva el agente gelificante agar agar en una concentracin de 1,5 a 2 %. Ejm. agar nutritivo, agar sangre, agar Sabouraud. Nota.Los agentes gelificantes o solidificantes: La gelatina, es una sustancia derivada de huesos, ligamentos y piel de animales. Se obtiene por ebullicin con HCl diluido. Se usa a una

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concentracin de 10 a 12 % en solucin. Se solidifica a 25 - 30 C. Se derrite a 32 C. Se desnaturaliza a 100 oC y es digerida por los microorganismos. El agar-agar, es un polisacrido que se extrae de algas de los gneros Gelidium, Gracillaria y Gigartina. Se obtiene por medio de hidrlisis cida con H 2SO4 diluido a una temperatura de 80 C. Solidifica en medios del cultivo en concentraciones de 1,5 a 2 % y a 35 - 50 C. Se derrite a 80 - 100 C. Se hidroliza a pH 2 y 9. Tolera altas temperaturas de esterilizacin sin desnaturalizarse. La digestin o hidrlisis por microorganismos ocurre en muy pocas casos. 3. Por la funcin que cumplen: a. Medios comunes o generales, son medios de cultivo que permiten el desarrollo indiscriminado de microorganismos. Ejm. agar nutritivo, caldo nutritivo, agar Plate Count, etc. b. Medios especiales, son los que permiten el desarrollo especfico de microorganismos pues incluyen en su formulacin, suplementos o aditivos especficos. A su vez, pueden ser: b.1 Medios enriquecidos, son aquellos medios de cultivo a los que se agregan sustancias nutritivas determinadas como sangre, suero sanguneo, etc. las cuales satisfacen las exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. Ejm. agar sangre, agar chocolate, Lowenstein Jenssen, etc. b.2 Medios selectivos, son aquellos medios que se caracterizan por poseer en su composicin sustancias que favorecen el desarrollo de determinados microorganismos inhibiendo el de otros. Ejm. Agar Baird Parker, Agar Manitol Salado, Agar Salmonella-Shigella, etc. b.3 Medios diferenciales, son aquellos medios que ponen de manifiesto ciertas propiedades bioqumicas de los microorganismos en estudio, como puede ser la formacin de gas, reacciones de xido-reduccin, cambios de pH, etc. Ejm. Agar TSI, Agar LIA, Agar gelatina, Medio nitratado, etc.

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III. MATERIALES. Material de vidrio esterilizado: - Placas de Petri (6), matraces (2) y focos (5) - Tubos de ensayo de 15 ml (10). - Varilla o bagueta. - Pipeta de 10 ml. Medios de cultivo: - Agar nutritivo (medio comn). - Agar Baird Parber (medio especial selectivo) - Agar Salmonella Shiguella (medio esp. sel.) - Agar agar (gelificante) Ingredientes de los medios de cultivo : - Sangre fresca de bovino*, 100 ml. - Colaps, sobrecito de 20 g. - Levadura, 2 sobrecitos. - Azcar de mesa, 20 g. - Sal de mesa 2 g. - Agua destilada 800 ml. . Autoclave u olla a presin. . Equipo de Bunsen. . Balanza digital. . Termmetro. . Asa de Kolle. - 10 tiras de papel Graf de 15 x 10 cm. - Algodn, pita, papel Graf en pliego.

Nota.- La toma de sangre fresca se realiza en un matraz o frasco estril a partir del chorro sanguneo del animal beneficiado. El uso de anticoagulantes es para impedir que el calcio acte en la coagulacin, sea precipitndolo como sal insoluble (oxalatos) o fijndolo en forma no ionizada (citrato, EDTA). La heparina acta como agente antitrmbico, es decir, neutraliza a la trombina. Los anticoagulantes se usan en las siguientes concentraciones: ANTICOAGULANTE . Heparina . Secuestrene (EDTA) . Oxalato de potasio al 30% mg / ml de sangre 0,1 0,2 1-2 0.01 ml mg / 100 ml de sangre 10 - 20 100 200 1 ml

IV. PROCEDIMIENTO:

A. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. FORMULACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS Consiste en determinar los tipos y cantidades de los ingredientes. Se realizan los clculos gravimtricos y volumtricos correspondientes. 1.1 Formulacin del medio COLAPIS SANGRE: Ingredientes: Colaps comercial en polvo 10 g. Concentrado de levadura 0,3 g. Cloruro de sodio (NaCI) 0,5 g. Agua destilada 100 ml. Sangre de bovino fresca y estril 30 ml. * El pesaje de los insumos se realiza en canastillas de papel de papel construido a base de rectngulos de 15 x 10 cm. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio especial enriquecido: hierva en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue 0,3 g de levadura y 0,5 g de sal de mesa, enfre hasta 50 C. Disuelva 10 g de colaps previamente pesado en canastilla de papel estril, evite la formacin de grumos agitando con una varilla de vidrio estril. Hierva

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la solucin durante 1 minuto. Tape con una torunda la boca del matraz y enfre hasta los 50 C. . En condiciones aspticas agregue sangre fresca desfibrinada u oxalatada, estril en una proporcin de 1/3 respecto al medio base de colaps. Vuelva a tapar con una torunda la boca del matraz. . Distribuya aspticamente el medio en placas de Petri, matraces o focos estriles. Grficos:

1.2 Formulacin del medio AGAR SANGRE: Ingredientes: Agar agar 1,5 g. Agua destilada 100 ml. Sangre de bovino fresca y estril 20 ml. * El pesaje del agar nutritivo se realiza en una canastilla estril de papel graff. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio especial enriquecido: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue 1,5 g de agar agar pesado en canastilla de papel estril, evite la formacin de grumos agitando con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz. . Esterilice el medio en autoclave a 121 C durante 15 minutos. . En condiciones aspticas agregue 20 ml de sangre desfibrinada u oxalatada, fresca estril. Vuelva a tapar con una torunda la boca del matraz. . Distribuya aspticamente el medio en placas de Petri, matraces o focos estriles. 1.3 Formulacin del medio AGAR NUTRITIVO: Ingredientes: Agar nutritivo 0,8 g. Agua destilada 100 ml. * El pesaje del agar nutritivo se realiza en una canastilla estril de papel graff. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio comn: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue 0,8 g de agar nutritivo pesado en canastilla de papel estril, evite la formacin de grumos agitando con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz. . Esterilice el medio en autoclave a 121 C durante 15 minutos. . Distribuya aspticamente el medio en placas de Petri, matraces o focos estriles.

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1.4 Formulacin del medio AGAR BAIRD PARKER: Ingredientes: Agar Baird Parker 5,8 g. Agua destilada 100 ml. * El pesaje del agar Baird Parker se realiza en una canastilla estril de papel Graf. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio especial selectivo: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue 5,8 g de agar Baird Parker pesado en canastilla de papel estril, evite la formacin de grumos agitando con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz y enfre hasta los 50 C. . Esterilice el medio en autoclave a 121 C durante 15 minutos. . En condiciones aspticas agregue 20 ml de sangre fresca estril. Vuelva a tapar con una torunda la boca del matraz. . Distribuya aspticamente el medio en placas de Petri, matraces o focos estriles.

1.5 Formulacin del medio AGAR SALMONELLA SHIGUELLA: Ingredientes: Agar Salmonella Shiguella 6 g. Agua destilada 100 ml. * El pesaje del agar Salmonella Shiguella se realiza en una canastilla estril de papel graff. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio especial slectivo: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue 6 g de agar Salmonella Shiguella pesado en canastilla de papel estril, evite la formacin de grumos agitando con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz. Hierva la solucin durante 5 minutos. . No esterilice el medio en autoclave. . Distribuya aspticamente el medio en placas de Petri, matraces o focos estriles.

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2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO LQUIDOS (CALDOS): 2.1 Formulacin del medio CALDO NUTRITIVO: Ingredientes: Peptona 1 g. Extracto de levadura o de carne 0,3 g. NaCl 0,5 g. Agua destilada 100 ml. * El pesaje de los ingredientes se realiza en una canastilla estril de papel graff. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio comn: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue los ingredientes en el orden sealado evitando la formacin de grumos por agitacin con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz. . Esterilice el medio en autoclave a 121 C durante 15 minutos. . Distribuya aspticamente el medio en tubos de ensayo estriles. 2.2 Formulacin del medio CALDO SACAROSA: Ingredientes: Sacarosa (azcar de mesa) 10 g. Extracto de levadura o de carne 0,3 g. NaCl 0,5 g. Agua destilada 100 ml. * El pesaje de los ingredientes se realiza en una canastilla estril de papel graff. Preparacin: . Disolucin de ingredientes del medio especial selectivo: caliente en un matraz 100 ml de agua destilada, agregue los ingredientes en el orden sealado evitando la formacin de grumos por agitacin con una varilla de vidrio estril. Tape con una torunda la boca del matraz. . Esterilice el medio en autoclave a 121 C durante 15 minutos. . Distribuya aspticamente el medio en tubos de ensayo estriles.

B. TCNICAS DE DISTRIBUCIN Y SOLIDIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.

1. PLAQUEADO, consiste en trasvasar el medio de cultivo esterilizado hacia las placas de Petri. Esta operacin requiere de mximas precauciones de asepsia, por ello se ejecuta frente a un mechero de Bunsen. Luego se deja enfriar hasta la solidificacin. 2. ENTUBADO, consiste en trasvasar el medio de cultivo esterilizado hacia los tubos de ensayo, focos o viales. Esta operacin requiere de mximas precauciones de asepsia, por ello se ejecuta frente a un mechero de Bunsen. Luego se deja enfriar hasta la solidificacin. IV. EVALUACIN. Por qu es importante el uso de medios de cultivo? Qu funcin cumple el colaps en los medios de cultivo? Por qu se utiliza sangre en la formulacin de medios de cultivo? V. CUESTIONARIO. . Cul es el fundamento (utilidad) y la composicin qumica de los medios de cultivo: Agar nutritivo, Agar Sabouraud, Agar Baird Parker, Agar Salmonella Shiguella? . Cul es la composicin qumica de la sangre de bovino? VI. BIBLIOGRAFIA DE CONSULTA. (01) COLLINS. 1989. Mtodos microbiolgicos. Editorial Acribia. Espaa. (576/C72). (02) CRISPN, V. 1981. Medios de cultivo e interpretacin bioqumica. 3a ed. UNMSM. (03) DIFCO. 1976. Manual of dehydrated medium and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures. 9na. edicin.

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(04) HORNA, E. y et. al. 1983 UNSCH. Ayacucho Per. Medios de cultivo para bacteriologa. Serie N 1. GUA No 4B

CULTIVO (SIEMBRA) DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVO. Realiza correctamente la siembra o cultivo de los microorganismos. II. FUNDAMENTO. La siembra es un procedimiento que consiste en acondicionar el microorganismo a un medio de cultivo frtil, de acuerdo a sus exigencias vitales para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollar y multiplicarse "in vitro". III. MATERIALES. Materiales biolgicos: Levadura en sobrecitos (2). Muestra sospechosa de contener bacterias de las especies: . Staphylococus aureus (presente en muestra de uas, pliegues de las manos). . Escherichia coli (presente en muestra fecal). . Salmonella tiphy (presente en muestra de huevo de ave). Placa con Agar Salmonella Shiguella. Placa con Agar Baird Parker. Foco con Agar Baird Parker inclinado. Tubo con Agar Baird Parker inclinado. Tubos con 9 ml de agar nutritivo, 4 unid. Tubo con agar nutritivo en posicin vertical. Tubos con agar nutritivo inclinado (2). Tubo con solucin de sacarosa. Tubo con solucin de levadura (cultivo madre) III. PROCEDIMIENTO. TCNICAS DE CULTIVO O SIEMBRA DE MICROORGANISMOS. Placas de Petri estriles, 4 unid. Pipeta Pasteur estril. Pipeta estril de 1 ml. Esptula de Drigalsky, estril. Asa de Kolle. Bao Mara (equipo de Bunsen y vaso de precipitado). Plumn indeleble o marcador de vidrio.

1. Tcnica del cultivo por transplante o repique.

Consiste en pasar una alcuota de muestra original llamada cultivo madre (que puede ser una cepa conservada o una muestra in vivo ) hacia un medio de cultivo comn o especial con el propsito de reactivar las clulas desde su estado latente y potenciarlas a su mxima actividad biolgica. Procedimiento . Esterilice la aguja o asa de kolle por flameo a la llama. . Tome con la mano izquierda, un tubo con cultivo madre (solucin de levadura) y otro conteniendo el medio estril de agar nutritivo gelificado en posicin vertical, de tal modo que se encuentren algo separados y con las bocas a la misma altura. Enseguida, con la mano derecha, destape los tubos sosteniendo los tapones de algodn entre los dedos. . Flamee la boca de los tubos a la llama del mechero.

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. Introduzca la aguja de kolle estril (flameada) en el tubo que contiene el cultivo madre, con la punta recoja muestra y luego trasplante por puncin profunda en el tubo que contiene el medio virgen. . Flamee nuevamente la boca de los tubos, coloque los tapones de algodn y esterilice la aguja de Kolle. . Anote sobre el tubo virgen (con un lpiz marcador) el cdigo numrico o el nombre del microorganismo, la fecha de la siembra y las iniciales del nombre de quin sembr. . Repita los pasos anteriores esta vez con los tubos de agar nutritivo inclinado, respectivamente. No olvide acondicionar la aguja de kolle a asa de kolle. En el primer tubo la siembra se realiza por estras con el asa de kolle y en el segundo tubo por incorporacin (coloque una gota con la pipeta normal o pipeta Pasteur). . Coloque los tubos sembrados en la estufa para su incubacin a 37 C durante 48 horas. . Despus del periodo de incubacin, examine los diferentes cultivos proporcionados y determine las caractersticas de crecimiento. Grficos:

Cultivo madre

Transplante por:

puncin

estras

incorporacin

2. Tcnica de cultivo para aislamiento:

Consiste en aislar microorganismos sobre un medio de cultivo de superficie slida. Se asume que el crecimiento microbiano va agotando los nutrientes del medio conforme se desarrolla. La tcnica permite ir descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del medio queden escasas clulas aisladas que irn multiplicndose de forma logartmica hasta formar colonias. A. Tcnica de siembra por estras. . Esterilice el asa de Kolle a la llama del mechero. Enfre el asa durante 5 segundos. . Toma de muestra: cargue el asa de Kolle con muestra de ua o pliegue de la mano y sobre la superficie del medio de cultivo slido contenido en una placa, trace imaginariamente 4 cuadrantes. En el primer cuadrante siembre con el asa cargada de muestra una lnea continua en zig zag empezando desde el exterior hacia el centro, acortando la longitud de la lnea en cada quiebre del zig zag. . Gire la placa y en el siguiente cuadrante y sin tocar nuevo inculo, trace una lnea continua en zig zag. La separacin de una lnea a otra debe ser de 1 a 3 mm. . Repita la operacin anterior en los dos cuadrantes que restan, haciendo solamente una estra la ltima vez. . Incube a la temperatura de 37 C durante 24 horas. Luego realice la lectura. Grfico:

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En placa En tubo En foco. B. Tcnica de siembra por diseminacin. . A partir de una muestra de lavado de huevo de gallina, tome un volumen de inculo con la pipeta de Pasteur y deposite en el interior de una placa con Agar Salmonella Shiguella. . Con la esptula de Drigalsky estril o con el asa de kolle acondicionada a esptula., disemine uniformemente la muestra. . Incube la placa a 37 C durante 48 horas. . Transcurrido el tiempo de incubacin, observe las caractersticas de las colonias, tal como la forma, color, tamao, distribucin, etc. Grficos:

Esptula de Drigalski.

C. Tcnica de siembra por diluciones sucesivas. Es utilizado de preferencia para obtener colonias bien aisladas y realizar un anlisis cuantitativo. Procedimiento: . Prepare 40 ml agar nutritivo y distribuya en cuatro tubos con. Deje enfriar hasta los 45 - 50 C. . Tome el primer tubo y vierta 1 ml de suspensin del cultivo microbiano mixto o madre. Agite bien mediante movimientos suaves. Esta es la dilucin 1/10. . Extraiga 1 ml de suspensin y vierta a un segundo tubo, agite bien. Esta es la dilucin 1/100. . Extraiga de este tubo 1 ml y vierta a un tercer tubo, agite. Esta es la dilucin 1/1000. . Extraiga del tercer tubo 1 ml de suspensin y vierta en el cuarto tubo, agite. Esta es la dilucin 1/ 10 000. . Inmediatamente y antes que el medio se solidifique, vierta por separado los 4 tubos en 4 placas, respectivamente. Grfico: alicuotas 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml agar nutritivo Cultivo madre Diluc. 1/10 1/100 1/1000 1/10 000

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. Deje enfriar las placas en posicin horizontal y sobre superficie plana, hasta la solidificacin. . Incube las placas en posicin invertida a 37 C durante 48 horas. . Observe caractersticas del cultivo. Anote. . Cuente las colonias en los 4 cuadrantes de cada placa. . Calcule el nmero de clulas desarrolladas por ml de muestra en cada placa con la siguiente frmula: N de microorganismos / ml = N colonias x inversa de la dilucin .

Ejemplo, suponiendo que parte de los siguientes datos: Placa : N 04 Colonias contadas : 23 Dilucin : 10-4 = 0,0001 = 1 / 10 000 Inversa de la dilucin: 10 000 N de microorganismos /ml = 23 x 10 000 = 230 000

Conclusin: existen 230 000 clulas por ml de muestra.

IV. EVALUACIN. Cul es la tcnica de siembra ms eficaz para los medios de cultivo slidos? Porqu? Qu es una dilucin? V. CUESTIONARIO. Qu es un cultivo madre? Cul es la importancia del cultivo para aislamiento? Cul es la importancia de la siembra por diluciones sucesivas?

VI. BIBLIOGRAFIA (01) COLLINS. (02) CRISPN, V. (03) DIFCO. (04) HORNA, E. y et. al. 1989 1981 1976 1983 Mtodos microbiolgicos. Editorial Acribia . Espaa. (576/C72). Medios de cultivo e interpretacin bioqumica. 3ra. edicin. UNMSM. Lima- Per. Manual of dehydrated medium and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures. 9na. edicin. Medios de cultivo para bacteriologa. Serie N 1. UNSCH. Ayacucho Per.

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