BIBLIOGRAFIA

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

AGENTES QUIMICOS
Silvana Tarlera

Hugo, W.B., and A.D Russell: Pharmaceutical Microbiology 6th , 1998, Ed. Blackwell Science. Captulos 10, 11, 12 y 13. Russell, AD., W. B. Hugo, and G.A.J. Ayliffe (eds) : Principles and practice of disinfection, preservation and sterilization, 1999. Ed. BIackweII Science.

TEMARIO

Clasificacin de agentes qumicos segn: estructura, m.o. blanco, uso, espectro de accin Mecanismos de accin Mecanismos de resistencia Factores que afectan la actividad: concentracin, temperatura, materia orgnica, etc. Mtodos de evaluacin de agentes qumicos
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CLASIFICACION SEGN USO

CLASIFICACION SEGN USO

Antisptico Agente qumico empleado para inhibir o destruir m.o. en la superficie de un tejido vivo Conservador Agente de amplio espectro agregado a un producto para prevenir la multiplicacin de m.o. y as evitar su deterioro o contaminacin (inadvertida) y minimizar el riesgo para la salud

Desinfectantes y sanitizantes Antispticos Conservadores: alimentos, medicamentos, cosmticos y otros (pinturas, detergentes, combustibles, etc)

Desinfectante Agente qumico empleado para reducir el nmero de m.o. (incluidos patgenos) a un nivel aceptable, en un ambiente inanimado. Sanitizante Agente qumico usado para desinfectar principalmente utensilios y equipos en industria alimentaria
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CLASIFICACION SEGN USO

DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS CONSERVADORES

CLASIFICACION SEGN MICROORGANISMO BLANCO

Antibacterianos Antifngicos Antituberculosos Antivirales

principalmente accin cida

principalmente accin stasis

CLASIFICACION SEGN ESPECTRO DE ACTIVIDAD GERMICIDA

CLASIFICACION SEGN ESTRUCTURA QUIMICA

BAJA

INTERMEDIA

ALTA

Bacterias (clulas vegetativas) Mycobacterium Endosporas Hongos Virus envueltos Virus desnudos

+ + + -

+ + + + +

+ + + + + +
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Alcoholes: etanol, isopropanol, bronopol Fenoles cidos y steres: benzoico, srbico, steres del cido p-aminobenzoico Halgenos: Cl2, I2, ClO-, iodforos, cloraminas Amonios cuaternarios Aldehdos: glutaraldehdo, formaldehdo
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CLASIFICACION SEGN ESTRUCTURA QUIMICA

Perxidos y peroxocidos Sales de metales pesados: sales de Hg, Ag Biguanidas: clorhexidina Epxidos: xido de etileno Colorantes: cristal violeta, acridina, verde de malaquita

ALCOHOLES

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ALCOHOLES
Etanol (e isopropanol)
Uso desinfeccin y antisepsia, en baja conc. conservador Elimina Mycobacterium. No es esporicida. Soluciones acuosas al 70% es bactericida. Al 90% virucida

FENOLES
Cresol, xilenol, clorocresol
Derivados de petrleo por destilacin Uso desinfeccin domstica No esporicidas Activos a pH cido. Actividad se reduce marcadamente por dilucin

Alcohol benclico, fenoxietanol, bronopol, clorobutanol

Uso conservadores en cosmticos y medicamentos Bronopol y fenoxietanol actividad elevada frente a Gram13

Hexaclorofeno y triclosan
antisepsia en manos (jabones medicinales). Triclosan conservador en cosmticos
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CIDOS Y STERES

CIDOS Y ESTERES
cido benzoico y srbico
Uso: conservadores en alimentos, medicamentos y cosmticos Uso limitado a pH 4 - 5 Otros: propinico, actico, lctico en alimentos

pKa: 4,8 pKa: 4,2

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CIDOS Y STERES
Esteres del cido p-hidroxibenzoico (parabenos)
Uso: conservadores en medicamentos y cosmticos Activos hasta pH 7 (mayor actividad a pH cido) Mayor actividad antifngica que antibacteriana Inactivados por tensoactivos no inicos (tween, span) A mayor num de C de R mayor activ. antibacteriana

HALGENOS
Cloro, hipoclorito
Uso desinfectante. Elimina virus y esporas Hipoclorito concentrado: 40 a 100 g/L (equiv. 40.000 a 100.000 ppm de Cl2 disponible). Inestable a pH cido (pero mejora actividad). Actividad ptima a pH 5 Compatible con detegentes (aninicos y catinicos) Desventajas: corrosivo, inactivado por materia orgnica, inestabilidad al almacenamiento

pKa: 8 a 8,5

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18

HALGENOS
Compuestos orgnicos clorados (cloramina T)
Liberan Cl2 Mas estables para almacenar. Activos a pH cido. Uso desinfeccin para agua potable

HALGENOS
Yodforos
Empleo de complejos del yodo (con polmeros de xido de etileno, amonio cuaternarios, tensoactivos no-inicos y polivinilpirrolidona) que liberan I2 lentamente Hay que dejar actuar algunos minutos Yodforos menos alergnicos que I2

Yodo (I2)
Uso desinfectante, antisepsia. Elimina virus y esporas Disponible en solucin con KI (soluc. de lugol) y tintura de yodo (con KI y etanol) Se afecta menos que cloro por pH y materia orgnica Desventaja: irritante
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METALES PESADOS
Sales orgnicas de mercurio
Usos: antispticos, conservadores en medicamentos y cosmticos Desv: irritantes, se adsorben en plstico y goma

METALES PESADOS
Sales de plata (nitrato, sulfadiazina)
Usos: antisepsia de ojos del recin nacido (por ley) Sulfadiazina: en quemaduras severas

Sales de zinc, cobre, estao (org. e inorgnicas)

Usos: conservacin de madera, pinturas, cuero, telas, etc.
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AMONIOS CUATERNARIOS
Cloruro de benzalconio y bencetonio, cetrimida
Usos: desinfectantes, antispticos, conservadores en cosmticos Son tensoactivos (sirven como detergentes), tienen carga positiva Efectivos a pH bsico (inactivos a pH 3,5) Incompatibles con aninicos y no-inicos, materia orgnica Actividad elevada frente a Gram+, poca frente a G(Pseudomonas) y hongos. No esporicidas.
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TENSOACTIVOS
Catinicos (Amonios cuaternarios)
9

COLORANTES
Buenos antimicrobianos Buenos detergentes Buenos detergentes Ambas propiedades

Actualmente uso limitado

Aninicos (laurilsulfato de sodio, bencenosulfonato de sodio)

9 9 No inicos (Polisorbato Tween)

Cristal violeta (violeta de genciana)

Antes usado como antisptico. Ahora ppalmente como antifngico. Uso antisptico en animales Verde de malaquita para peces en acuarios (txico para humanos)

Acriflavina (derivados de acridina)

Uso como antisptico bucal
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Anfolticos o anfotricos

PERXIDOS Y PEROXOCIDOS
Perxido de hidrgeno
Uso: antisptico para heridas abiertas, desinfeccin de lentes de contacto Concentracin de uso 3 al 6%. Al 30% y alta temperatura es esporicida Esterilizacin en fro por plasma de H2O2 (45 a 70 min)

ALDEHIDOS
Glutaraldehdo
Uso: esterilizacin de equipamiento mdico, desinfeccin Ventajas: rpida accin (formas vegetativas), poco afectado por materia orgnica A pH 8 actividad mxima pero es inestable (polimeriza) Concentracin de uso 2% en soluciones acuosas

cido peractico
Uso: desinfectante de equipos mdicos y de efluentes Concentracin de uso 0,3%. En fase vapor es esporicida
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ALDEHIDOS
Formaldehdo
Uso: como gas en esterilizacin de cabinas y salas de flujo laminar, desinfeccin de superficies En baja concentracin como conservador Uso en forma lquida o vapor Esterilizacin a baja temperatura con vapor de formaldehdo (LTSF) en condiciones controladas Se genera formaldehdo gas a partir de solucin al 37% y se agrega vapor a 70C (a presion inferior a la atmosfrica) Indicador biolgico del proceso: esporas de Bacillus subtilis
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BIGUANIDAS
Clorhexidina
Uso: antisptico bucal y para manos Actividad mxima a pH 7-8 Actividad baja con aniones, materia orgnica Gralmente usado en combinaciones con otros agentes

PHMB (polyhexamethylene biguanide)

Uso: antisptico piel, desinfectante lentes contacto, biocida piscinas

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OTROS
COMBINACIONES DE ANTIMICROBIANOS
No existe el desinfectante, antisptico o conservador ideal Formulaciones actuales pueden incluir una mezcla de agentes Ej. etanol y clorhexidina, clorhexidina y cetrimida, amonios cuaternarios y glutaraldehdo

SUSTANCIAS POTENCIADORAS DE AGENTES QUIMICOS

Sustancias que no tienen accin antimicrobiana pero potencian la accin de algunos agentes

EDTA, citrato
Quelantes que potencian la accin de cloroxilenol, amonios cuaternarios y otros Complejean cationes divalentes necesarios para estabilizar la membrana externa cidos en gral. Potencian accin de cidos orgnicos como conservadores
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XIDO DE ETILENO
Esterilizante gaseoso (CH2) 2O Uso: esterilizacin de equipos mdicos, implantes, material descartable (jeringas, tubuladuras, gasas) que no pueden esterilizarse por calor Ampliamente utilizado a nivel mundial Alternativa a la esterilizacin por radiacin Se utiliza al 10% combinado con CO2 u otro gas inerte en cmaras esterilizadoras a 45 70C y al 30 70% humedad Difunde a travs de plstico y papel Tiempo de esterilizacin: 1 a 4 horas
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XIDO DE ETILENO
Indicador biolgico del proceso: esporas de Bacillus subtilis Indicador qumico: papel impregnado con un reactivo que cambia de color Monitoreo del proceso: Concentracin del gas, humedad, temperatura y tiempo

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MTODOS PRIONES

DE

INACTIVACIN

DE

Los priones no se destruyen por:

Autoclave >134 C, 18 minutos Hipoclorito sdico (20C, 1hora) Hidrxido sdico 2N Fenol 90% ter Acetona Permanganato potsico 0.002 M Urea 6 M 2 Cloroetanol Cloroformo
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alcohol, xido de etileno formaldehdo glutaraldehdo perxido de hidrgeno yodo fenoles amonios cuaternarios esterilizacin por vapor a 121C radiacin ionizante
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MECANISMO DE ACCIN DE AGENTES QUMICOS

Reaccin qumica inespecfica con el sitio blanco (a diferencia de los antibiticos)
SITIOS BLANCOS Diferentes segn el tipo de microorganismo (incluidos los virus) Para clulas en gral.: pared, membrana citoplasmtica citoplasma
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MECANISMO DE ACCIN DE AG. QUMICOS

PARED CELULAR
A bajas conc. formaldehdo, fenol, hipoclorito causan lisis celular Muy importante en Gram+

MEMBRANA CITOPLASMATICA
Accin sobre: Potencial de membrana (fenoxietanol, pentaclorofenol) Enzimas de membrana (clorhexidina, Ag, Hg, bronopol) Permeabilidad (quelantes y cloroxilenol, amonios cuat.)
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MECANISMO DE ACCIN DE AG. QUMICOS

CITOPLASMA
Accin sobre: cidos nucleicos: acriflavina grupos tioles: bronopol, hipoclorito, I2, H2O2, Ag, Cu grupos amino: formaldehdo, glutaraldehdo general (coagulacin): fenoles, clorhexidina

MECANISMO DE RESISTENCIA

Intrnseca o natural
por ej. mycobacterias y esporas bacterianas resistentes a muchos agentes Staphylococcus y Streptococcus mas sensibles que G-

SITIOS MLTIPLES
Agentes alquilantes: xido de etileno Sulfitos y dixido de azufre
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Adquirida

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RESISTENCIA DE LOS M.O. A LOS AGENTES

PRIONES (encefalopata espongiforme: vaca loca) COCCIDIA (Criptosporidium) ESPORAS (Bacillus, Clostridium) MYCOBACTERIAS (Mycobacterium tuberculosis) CISTOS (Giardia) VIRUS PEQUEOS NO ENVUELTOS (Polio) TROFOZOITOS(Acanthamoeba) BACTERIAS GRAM NEGATIVAS (Pseudomonas) HONGOS (Candida, Aspergillus) VIRUS GRANDES NO ENVUELTOS (Adenovirus) BACTERIAS GRAM POSITIVAS (Staphylococcus aureus) VIRUS GRANDES ENVUELTOS (HIV)

+
R E S I S T E N C I A

MECANISMO DE RESISTENCIA Intrnseca

Composicin de la pared celular G+ tienen pared mas permeable G- poseen adems de la pared la membrana externa como barrera selectiva de permeabilidad Esporas tienen cubierta gruesa Los agentes penetran por: transporte a travs de porinas (hidroflicos) difusin (hidrofbicos)
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MECANISMO DE RESISTENCIA Intrnseca

Gram negativos Elevada resistencia en Pseudomonas aeruginosa, Providencia y Proteus sp Mycobacteria Elevada resistencia a clorhexidina, amonios cuat y mercuriales Presenta pared muy hidrofbica (ac. miclicos): reduce permeabilidad de sustancias hidroflicas
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MECANISMO DE RESISTENCIA Intrnseca

Biopelculas (biofilms) Elevada resistencia a biocidas Gralmente clulas planctnicas mas sensibles que en biofilm Limitacin de nutrientes Baja velocidad de crecimiento Limitado acceso del agente al interior del biofilm Produccin de enzimas que degradan el agente? Importancia en industria (corrosin, contaminacin) y medicinal (prtesis)
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Cuando los nutrientes escasean, aumenta la ventaja de estar asociado a superficies En el laboratorio, organismos estudiados como cultivos puros crecidos con abundancia de nutrientes a muy altas densidades (cultivo esttico o continuo) En la naturaleza - los microorganismos usualmente existen en biofilms - grupos de diferentes microorganismos organizados en capas sobre una superficie - cooperatividad, competencia.

Quimiotaxis

Produccin de exopolisacridos (Colonizadores 1arios)

Colonizadores 2darios

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Compleja comunicacin clula-clula Acumulacin de molculas seal que co-regulan la transcripcin Actan a nivel global afectando muchas funciones celulares

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MECANISMO DE RESISTENCIA: BACTERIAS Adquirida por mutacin

por exposicin gradual a conc. crecientes del agente Ej. clorhexidina y P. aeruginosa, amonio cuaternarios y Proteus

MECANISMO DE RESISTENCIA: BACTERIAS Adquirida por plsmidos o transposones

inactivacin
resistencia a Hg (II) y otros organomercuriales (hidrlisis seguida de reduccin enzimtica de Hg+2 a Hg metal) Resistencia a formaldehdo por Serratia

disminucin de la entrada
resistencia a Ag+
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MECANISMO DE RESISTENCIA: BACTERIAS por plsmidos o transposones

por eflujo
Resistencia a amonios cuat. y clorhexidina por S. aureus meticilino resistente

MECANISMO DE RESISTENCIA: VIRUS

alteracin de la pared
Resistencia a formaldehdo

49

50

FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS

9 9 9 9 9 9 9

FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES: DILUCIN

Resistencia natural Densidad microbiana Concentracin del desinfectante Tiempo de contacto Temperatura pH Presencia de sustancias que interfieren

Log del tiempo que lleva destruir un determinado nmero de m.o.

Coeficiente de concentracin o dilucin (eta)

=(log t de muerte a C2- log t de muerte a C1) log C1 - log C2

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FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES: DILUCIN

SIGNIFICADO PRACTICO DE

Para el fenol ( = 6) Si se diluye al 1/2 la actividad disminuye 26=64 veces Si se diluye al 1/3 la actividad disminuye 36=729 veces En cambio para amonios cuat. = 1, es decir hay poca reduccin de actividad por dilucin

Neutralizar??

53

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FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS

Temperatura
Coeficiente de temperatura por c/grado Donde: t1 tiempo para eliminar la poblacin a temp T1 t1 t2

Valores de coeficiente Q10

Q10 Reacciones qumicas y enzimticas Fenol Butanol Etanol Monoetil ter de etilenglicol
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2-3 4 28 45 ~300
56

(T2-T1) =

Coeficiente de temperatura por aumento 10

Q
10

= tiempo de muerte a T
tiempo de muerte a (T+10)

FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS

FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION DE LOS AGENTES: DILUCIN

pH
Afecta la potencia del agente (cidos vs. no ionizados o cationes) Afecta la superficie de la pared celular (adsorcin inicial del agente en algunos casos) a pH ms bsicos superfice celular mas negativa

SIGNIFICADO PRACTICO DE Q10

Para el fenol (Q10 = 4) el aumento de temperatura de 20 a 30C implica que la actividad aumentar cuatro veces

Sustancias que interfieren

Se combinan con el agente Forman cubierta protectora de los m.o.
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MTODOS DE EVALUACION AGENTES QUMICOS

DE

MTODOS DE EVALUACION DE AGENTES QUMICOS

Efecto cida y stasis Clasificacin de los mtodos Determinacin de actividad Bacteriosttica Determinacin de actividad Bactericida Normas en distintos pases

Segn el tipo de microorganismo Segn el tipo de accin Segn el diseo del ensayo In vitro: Test de suspensin Test con carrier Test de capacidad De uso
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EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BACTERIOSTTICA: CIM

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BACTERIOSTTICA: CONSERVADORES

EVALUACIN DE CONSERVADORES EN MEDICAMENTOS
Inoculacin del producto (challenge test) con una carga inicial 105-106/mL y recuento de viables a distintos tiempo (0, 2, 7, 14 y 28 das). En multidosis tambin 6 h Reduccin de 3 rdenes (3D) o ms para bacterias y 1 2D para hongos a los 14 das y no aumento al final
(Farmacopea Europea y USP)

m.o. empleados: S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans, A. niger (a veces E. coli) y posible flora alterante
61 62

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA

Mtodos in vitro: Test de suspensin Capacity test Carrier test Mtodos aplicados: ej. Desinfeccin de superficies Mtodos de uso (in situ)
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EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA Nivel de accin generalmente requerido

reduccin de 5 D (= 5-log = 99,999% de muerte) para bacterias reduccin de 4D para virus
EN 1276:1997: Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida de los antispticos y desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1)

EN 1276:1997 Eval. desinfectantes

Susp Mac Farland N1 1 mL 1 mL

Temperatura: 20 C
9 mL de agua destilada

ENSAYO
8 mL desinfectante + 1 mL agua (o sustancia interferente) 1 mL

INOCULO t=0

Cepas: E. coli,

5 min.

1 mL Diluciones en SF

P. aeruginosa, S. aureus Enterococcus hirae

9 mL neutralizante

1 mL Recuento en placa TSA Recuento en placa TSA

Sust. interferentes (condiciones sucias): albmina, leche, yema huevo, sangre, tierra.

65

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EN 1276:1997 Eval. desinfectantes

Ej. de resultados obtenidos con un desinfectante
Reduccin logartmica (Log10)
Microorganismo Log10 Condiciones limpias Condiciones sucias Recuento inicial (0,3% albmina) (challenge) 1 min 2 min 5 min 1 min 2 min 5 min

EN 1276:1997 Eval. desinfectantes

Validacin del neutralizante
1 mL agua

ENSAYO
8 mL desinf + 1 mL agua (o sust. interf.)
5 min.

Ps. aeruginosa E. coli Ent. hirae Staph. aureus

7,92 7,44 7,32 7,42

>6,92 >6,92 >6,92 >6,92 >6,92 >6,92 >6,44 >6,44 >6,44 >6,44 >6,44 >6,44 >6,32 >6,32 >6,32 >6,32 >6,32 >6,32 >6,42 >6,42 >6,42 >6,42 >6,42 >6,42
9 mL neutralizante 1 mL

0,1 mL de 104 ufc del m.o. (conc. final 100 ufc/mL)

1 mL

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Recuento en placa TSA

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EVALUACION DE LA ACTIVIDAD: NORMAS

Reglamentaciones en diferentes pases: normas y estndares Europa: European Norms EN Reino Unido: British Standards BS Alemania: DGHM Francia: AFNOR Estados Unidos: normas de la AOAC (Association of Analytical Communities antes Analytical Chemists), FDA (Food and Drug Administration) o EPA (Environmental Protection Agency) Internacional: normas ISO (International Standars Organization) o de cada pas
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