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Demostracin de la influencia de los diferentes factores fisicoqumicos en la velocidad de las reacciones enzimaticas

INTRODUCCIN Las enzimas pueden realizar hasta varios millones de reacciones catalticas por segundo. La velocidad de una reaccin enzimtica se determina incrementando la concentracin de su sustrato hasta que la tasa de formacin de productos sea constante (Fig. 3). Esta se denomina la velocidad mxima de una enzima. En este estado, todos los sitios activos de todas las molculas se encuentran saturados con sustrato . Esto fue propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. En la figura 4 se ve un modelo de una reaccin enzimtica de sustrato nico que responde a la cintica de Michaelis. A bajas concentraciones de [S] la enzima existe tanto en forma libre ,E como unida a S , ES .la tasa de reaccin depende de la concentracin de [ES] y de la tasa K2, formalmente: v= K2 [ES]. Cundo la concentracin de S es muy alta la enzima se encuentra saturada, todas los molculas se encuentran formando parte del complejo ES, entonces la tasa de reaccin es insensible a las cambios en [S] y depende solo de k 2. Formalmente: v= K2 Esta velocidad de reaccin es mxima y se llama Vmax. A k2 se llama constante de catlisis o Kcat que indica el nmero de reacciones por unidad de tiempo que realiza un sitio activo. Las -1. unidades de Kcat son, usualmente, segundos A concentraciones de S debajo de la saturacin la tasa depende tanto de la unin del sustrato como la tasa del paso cataltico. Sustituyendo la ecuacin de equilibrio de la unin del sustrato en la ecuacin 1 se obtiene la ecuacin de Michaelis- Menten.

La velocidad V indica el nmero de reacciones por unidad de tiempo que son catalizadas por la encima. A medida que se incrementa la concentracin de sustrato [S], la reaccin se aproxima asintticamente a su velocidad mxima Vmax. Por ello no puede determinarse con precisin el valor de [S] para Vmax, en su lugar la constante caracterstica de una enzima se define como la concentracin de sustrato necesaria para obtener la mitad de la velocidad mxima (Vmax/2). Ese valor es llamado de la constante de Michaelis-Menten simbolizada con Km.

K1

K2

K1
Unin de sustrato Etapa cataltica

Existen varios factores que influencian la velocidad de reaccin, la actividad cataltica y la especificidad de una enzima. Los factores qumicos del ambiente donde se encuentra la enzima tales como el pH y la temperatura afectan la tasa de reaccin. Al adicionar ms cantidad de enzima a una reaccin, la velocidad de la misma se incrementa, es por ello que las clulas producen ms protena de una determinada enzima cuando es necesario incrementar la produccin de un cierto metabolito. Ms all de la sntesis de Novo de ms molculas de enzima para incrementar una reaccin, la clula utiliza mecanismos ms especficos para regular la actividad enzimtica mediante modificaciones post-traduccionales (por ejemplo: fosforilacin) de la enzima o adicionando cofactores tales como iones + metlicos, o molculas orgnicas (por ejemplo: NAD ,FAD, CoA, o vitaminas) que interactan con la protena. La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, as como los factores que en ella influyen y los mecanismos por las cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimticas se puede medir: Por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo. Por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo.

OBJETIVOS: Verificar los diversos factores fisicoqumicos que modifican las reacciones enzimticas. Demostrar la actividad cataltica de la amilasa salival, determinando: La presencia del almidn no transformado (sustrato residual) La presencia de carbohidratos reductores (productos de la reaccin)

MARCO TEORICO CATALISIS MOLECULAR Un catalizador modifica la velocidad de una reaccin qumica sin ser utilizado o aparecer como uno de los productos de la reaccin. Una reaccin qumica en la que un substrato(S) se transforma en un producto (P): S P, ocurre porque cierta fraccin de molculas de S, posee mucho ms energa que el resto de ellas, lo que es suficiente para que alcancen un estado activado, en el que pueda formarse o romperse un enlace qumico y se forme el producto (P). La energa de activacin es la cantidad de energa expresada en caloras, necesaria para que todas las molculas de un mol, a una temperatura dada alcancen el estado reactivo. Mientras que, el estado de transicin es el estado rico en energa de las molculas que interaccionan en la cima de la barrera de activacin. La velocidad de una reaccin qumica es proporcional a la concentracin del complejo en el estado de transicin. Una reaccin qumica se puede acelerar de la siguiente forma: 1) Al aumentar la temperatura se incrementa la energa cintica, por lo que es mayor el nmero de molculas que alcanzan el estado de transicin. Generalmente el Q 10 =2,, lo que indica que la velocidad 0 de una reaccin qumica se duplica al aumentar la temperatura en 10 C. 2) Aadiendo un catalizador, que disminuye la energa de activacin y aumenta la velocidad de reaccin. La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando el complejo de transicin, enzimasubstrato (E-S), mediante una reaccin reversible, cuya energa de activacin es menor que la de la reaccin no catalizada. Cuando se forma el producto de la reaccin (P), se regenera de nuevo la enzima (E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molcula de substrato (S).

Una enzima reduce ms eficientemente la energa de activacin (Ea) de una reaccin que un catalizador inorgnico, lo que permite que una reaccin se realice a menor temperatura. Una enzima no modifica la energa libre, ni la constante de equilibrio, sino que disminuye la energa de activacin de la reaccin.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUBSTRATO SOBRE LA CATALISIS ENZIMATICA La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones controladas aadindole una enzima a un substrato. S se trabaja con la condicin de que la concentracin del substrato sea saturante, variando entonces la concentracin de enzima, se observa que aumenta el producto de la reaccin, a pH y temperatura constantes.

Si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variando la concentracin de substrato se obtiene una curva hiperblica como la de la figura. Al principio un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir y a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (V) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato (S), a la semivelocidad mxima de reaccin (V/2) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de Km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.

La ecuacin de Michaelis describe la relacin cuantitativa entre la velocidad de reaccin y la concentracin de substrato [S], si se conoce Vmax o Km:

v=

En donde: v= es la velocidad de reaccin observada a una concentracin de substrato determinada [S] Km= constante de Michaelis en moles/ltro

Vmax= velocidad mxima a concentracin saturante de substrato. Si v= Vmax/2; entonces

Km+[S] = 2[S] Km =[S] EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Sabiendo que las enzimas son proteinas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. La fosfatasa cida es ms activa a pH 5,0, mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen mxima actividad cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8. El pH no afecta la actividad enzimtica, sino la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin.

ENZIMA Pepsina Tripsina Catalasa Arginasa Fumarasa Ribonucleasa

pH OPTIMO 1,5 7,7 7,6 9,7 7,8 7,8

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta 0 temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 45 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura 0 ptima de 37 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y 0 en el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 0 C.

CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Cules son las caractersticas estructurales del almidn?

Almidn. Es un polisacrido formado por molculas de -D-glucosa unidas por enlaces glucosdicos (14) y (16). En la molcula de almidn se distinguen dos tipos de polmero: Amilosa.- Es un polmero no ramificado formado por largas cadenas de unidades de -D-glucosa unidas por enlaces -(14). Estas cadenas adoptan una disposicin helicoidal con 6 molculas por vuelta, y tienen masas moleculares relativas que oscilan entre unos pocos miles y 500.000 daltons. Amilopectina.- Es un polmero muy ramificado (Figura 7.14) formado por molculas de -D-glucosa. Los sucesivos restos de glucosa a lo largo de las cadenas estn unidos por enlaces (14), y los puntos de ramificacin, que se encuentran espaciados por un nmero de restos de glucosa que oscila entre 24 y 30, consisten en enlaces (16) (Fig. 7.14). Su masa molecular relativa puede alcanzar hasta un milln de Dalton. El almidn acta como sustancia de reserva en las clulas vegetales. Una parte sustancial de los glcidos producidos en la fotosntesis se almacenan en forma de almidn, dando lugar a unos agregados insolubles de gran tamao, los granos de almidn, que se encuentran en todas las clulas vegetales, siendo especialmente abundantes en las de las semillas, frutos y tubrculos.

2. Qu tipo de enzima es la alfa amilasa salival?

Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa. Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2
3. Cules son los productos que origina la accin de esta enzima sobre la el almidn?

La digestin de los carbohidratos ocurre en la boca y en el intestino delgado. Las glndulas salivales secretan - amilasa, la cual inicia la hidrlisis del almidn .Esta enzima es una endoglucosidasa que hidroliza enlaces (1-4) glucosdicos internos, pero no ataca los enlaces (1-6). Da como productos finales maltosa, algo de glucosa y dextrinas lmites.
4. Explique cmo influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas una variacin en la concentracin de la enzima presente, en la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. Concentracin del sustrato

Velocidad mxima: la velocidad de una reaccin (v) es el nmero de molculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo y usualmente se expresa en moles de producto formadas por minuto. La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima, aumenta conforme se incrementa la concentracin de substrato hasta que se llega a una velocidad mxima ( Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reaccin, es independiente de la cantidad de substrato. El que la velocidad no pueda seguirse incrementando, refleja la saturacin del sitio activo con el substrato.

Vmax

0 Substrato
Figura: representacin de una cintica tpicamente michaeliana.

Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica.

Incremento de la velocidad con la temperatura: En general, la velocidad de la reaccin se incrementa con la temperatura hasta que un punto mximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el nmero de molculas ricas en energa que pueden pasar la barrera energtica de estado de transicin, para formar a los productos. Decremento de la velocidad con la temperatura: la elevacin excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como resultado de la desnaturalizacin, es decir, la prdida de la estructura tridimensional de las enzimas.

zona de reactivacin mximo de actividad Zona de inactivacin

Temperatura
Figura: dependencia de la actividad enzimtica con la temperatura

Efecto del pH en la reaccin qumica


+

Efecto del pH en la ionizacin del sitio activo : la concentracin de H afecta la velocidad de la reaccin en muchas formas. Primero el proceso cataltico usualmente requiere de que la enzima y el substrato tengan grupos qumicos en una forma inica particular para poder interactuar. Por ejemplo la actividad cataltica puede necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en estado protonado (+ + NH3 ) o no (-NH2 ), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la reaccin.

Efecto del pH para la desnaturalizacin de la enzima : pH extremos pueden ocasionar la desnaturalizacin de las enzimas, debido a que la estructura con estos cambios es posible modificar las interacciones inicas que intervienen en la estabilidad de la enzima en su estado nativo:

100 50 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pepsina tripsina fosfatasa alcalina pH

Figura: efecto de la variacin en el pH sobre la actividad enzimtica.

El pH ptimo vara para las diferentes enzimas: El pH al cual las enzimas adquieren su mxima actividad es diferente para cada una de ellas y depende de la secuencia de aminocidos que las conforman, por supuesto, tambin est relacionado con el microambiente celular en el cual desarrollan su catlisis. Por ejemplo la pepsina que es una enzima digestiva que acta en el estmago, posee un pH ptimo de alrededor de 2 unidades, por el contrario otras enzimas que actan a pH neutro, se desnaturalizan a pH alcalino o cido. MATERIALES Y METODOS Materiales Preparado enzimtico. Solucin de almidn al 0.5% Solucin de lugol Buffer fosfato pH 5,0 Buffer fosfato pH 6,8 Buffer fosfato pH 8,0 Tubos de ensayo Lingoteras Vasos de precipitacin Bao mara Cronmetro

Mtodos EXPERIMENTO 1. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA PROCEDIMIENTO: COMPONENTE Sol. Almidn 0.5% Agua destilada Preparado enzimtico Incubar a 40C SISTEMA/mL I 2.0 0.4 0.1

II 2.0 0.3 0.2

III 2.0 0.2 0.3

IV 2.0 0.1 0.4

1. Aadir primero el agua y luego la disolucin de enzima, pues de lo contrario la reaccin dar inicio y no se tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la solucin de enzima al ltimo tubo, poner en marcha el cronmetro y comenzar a medir el tiempo del experimento. 2. Control de la actividad enzimtica. Al cumplir 1min de la reaccin; en la lingotera, colocar pequeas cantidades de cada uno de los tubos en una excavadura, y agregar gotas de lugol. Continuar el control del sustrato a intervalos de 1 min hasta que el yodo no reaccione con el almidn. 3. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccin alguna con el reactivo del lugol, el que no mostrar cambio.

4. Control. Adicionar en una excavadura unas gotas de agua y lugol para tenerlo como solucin blanco. 5. Construya la tabla TUBOS Enzima (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de la reaccin(1/t) 1 2 3 4

6. Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje de ordenadas versus velocidad de reaccin (1/t) en el eje de abscisas.

EXPERIMENTO 2. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH PROCEDIMIENTO: COMPONENTE Buffer fosfato pH 5,0 Buffer fosfato pH 6.8 Buffer fosfato pH 8,0 Sol. Almidn 0.5% Sol. enzima 2-0 2.0 2.0 2.0 SISTEMA /mL I 2.0 II 2.0 2.0 2.0 2.0 III

Incubar a 40C y ensayar la reaccin con el lugol segn se indica en el trabajo experimental N1

EXPERIMENTO N 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE [S]. PROCEDIMIENTO: COMPONENTE Sol. Almidn Agua destilada Preparado enzimtico Incubar a 40C I 0,5 1,5 0,5
SISTEMA /mL

II 1,0 1,0 0,5

III 1,5 0,5 0,5

IV 2,0 -0,5

A intervalos de 1 min ensaye la presencia del almidn mediante la reaccin con lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental N1

Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

TUBOS Enzima (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de la reaccin(1/t)

Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen/tiempo) en el eje de ordenadas versus volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentracin de sustrato creciente en nuestro experimento)

EXPERIMENTO N4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA PROCEDIMIENTO COMPONENTE SISTEMA /mL I II

III IV V Sol. de almidn 0.5% Preparado enzimtico Hervir el tubo n 1 durante 5min y reponer el volumen de agua perdida por evaporacin Incubar los 40C 40C 50C 0 C Temperatura tubos a: ambiente

Ensayar en ellos la reaccin con lugol a intervalos de 1 min. Anotar el tiempo que demora en desaparecer la coloracin azul. 1 2 3 4 5

Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:

RESULTADOS En el sistema I la tripsina 0.25% no reacciono con el agua destilada, es por ello que mantiene su color natural es decir sigue siendo transparente, adems no hubo formacin de precipitados ni la formacin de dobles capas. La mezcla de NaOH 2.5% con la solucin de tripsina 0.25% tampoco hubo reaccin quimica, por lo que su color se mantiene y no hubo aparicin de precipitados en el sistema II. El sistema III nos muestra evidencias que hubo una reaccin qumica entre la tripsina y el H2SO4, porque hubo la presencia de un anillo interfsico de color blanco, que separ una capa superior de color transparente y una capa inferior amarillenta. El acetato de plomo 10% al reaccionar con la tripsina 0.25% hace aparecer en el fondo del tubo un precipitado de color blanco y en la parte superior la solucin de color blanco lechoso, lo cual afirma que la reaccin fue positiva. La reaccin qumica del alcohol etlico con la tripsina fue positiva porque se evidencio la presencio de un anillo interfsico que dividi a la solucin en dos capas de color transparente. El reactivo de biuret reaccion con la tripsina presentando un color lila tenue, lo que indica la presencia de protenas, pero no hubo precipitados. El sistema VII al ponerlo en bao mara mostr la formacin de precipitados, es decir la temperatura tubo efecto en la reaccin qumica, de lo contrario no se hubiera mostrado ninguna evidencia as como en el sistema I. CONCLUSIONES

Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin 0 hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 45 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.

La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando el complejo de transicin, enzima-substrato (E-S), mediante una reaccin reversible, cuya energa de activacin es menor que la de la reaccin no catalizada. Cuando se forma el producto de la reaccin (P), se regenera de nuevo la enzima (E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molcula de substrato (S).

BIBLIOGRAFIA Rodwel. et alli Bioquimica de Harper, 13 ed., s.d INFOGRAFIA http://genesis.uga.mx/edmedia/material/quimicaII/E enzimas.cfm http://www.slideshare.net/syriel/enzimas-2969137 http://www.slideshare.net/fmedin1/enzimas-presentation-776278 http://www.youtube.com/watch?v=uuvXv6b8ElU

http://laguna.fmedic.unam.mx/evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica. html
ANEXOS CUESTIONARIO EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DEL ENZIMA 1. Describa que caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn El lugol es una disolucin de yodo que tiene una reaccin especfica con el almidn. El reactivo de lugol se intercala por la molcula de almidn y esto se detecta por la coloracin violeta que toma la mezcla. Este polisacrido est formado por molculas de glucosa y es exclusivo de las clulas vegetales. Realmente est formado por dos tipos de polmeros ambos de glucosa: la amilosa que es la que realmente se tie con el yodo del lugol y la amilopectina. En la digestin qumica aparece la accin de la glndulas salivales. Estas secretan saliva (agua, electrolitos (Na, K), encimas (amilasa salival y lipasa salival)). La amilasa salival degrada el almidn, (h. De carbono complejo) hasta maltosa (h. De carbono con 2 glucosas). Pero no todo el almidn se degrada en la boca.
2. Anexe la tabla y el grfico de velocidad de reaccin versus [E], tomando como concentracin del enzima el volumen de la solucin utilizado en cada tubo. Por qu se puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo?

EXPERIMENTO 2: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH 1. Describa lo observado, al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de la enzima alfa- amilasa a qu conclusin llega acerca del pH ptimo de esta enzima?

Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2

2. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy cido o muy bsico en la realizacin de este ensayo?

El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.
EXPERIMENTO 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO 1. Anexe la tabla y el grfico elaborados segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccin es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?

2. Analice el grafico y plantee las conclusiones a que puede llegar en este caso.

3. Describa las dificultades presentadas en este ensayo.

EXPERIMENTO 4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA 1. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento segn las indicaciones del trabajo prctico. 2. Explique que le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40C 3. por qu no se puede emplear el trmino de temperatura optima ?

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