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Conceptos bsicos
La tecnologa de DNA recombinante es un conjunto de mtodos empleados para localizar, aislar, alterar, estudiar y recombinar secuencias de DNA. Cules son las aplicaciones de la tecnologa de DNA recombinante?: La investigacin de la estructura y la funcin de los genes a nivel molecular La creacin de nuevos productos comerciales (biotecnologa) El diagnstico y el tratamiento de enfermedades Cules son las principales tcnicas de DNA recombinante?: Tcnicas de corte del DNA en localizaciones especcas (enzimas de restriccin) Mtodos para obtener numerosas copias de un fragmento de DNA especco (clonacin gnica) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Mtodos para localizar secuencias de DNA (hibridacin de cidos nucleicos) Procedimientos para introducir secuencias de DNA en clulas receptoras Tcnicas para inducir mutaciones en secuencias de DNA especcas Mtodos de expresin de DNA recombinante
Endonucleasas de restriccin
La ingeniera gentica se desarroll gracias al descubrimiento de las enzimas de restriccin (o endonucleasas de restriccin) que son capaces de reconocer y cortar secuencias especcas de DNA de doble cadena.
Estas enzimas las producen de forma natural las bacterias y las utilizan como defensa contra los virus cortando su DNA. El DNA propio se protege frente a la digestin mediante metilacin de las dianas de corte. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son normalmente palndromos. Los productos de la digestin pueden ser extremos cohesivos o extremos romos.
Endonucleasas de restriccin
extremos cohesivos
extremos cohesivos
extremos cohesivos
extremos cohesivos
extremos romos.
extremos romos.
extremos romos.
extremos cohesivos
DIGESTIN
Solo pueden unirse fragmentos que tengan extremos complementarios (cohesivos) o extremos romos. LIGACIN
Mapas de restriccin
Partimos de una preparacin de DNA lineal de 7Kb Se somete a digestin con las enzimas HindIII y SalI
Se construyen dos modelos tericos que son consistentes con los resultados de las digestiones simples
La digestin doble HindIII - SalI descarta el modelo 2 Necesitamos ms datos para saber si los sitios de corte estn efectivamente en el extremo 5, o bien estn en el extremo 3
4 paso: autorradiografa Al nal del proceso podemos saber el tamao del fragmento que hibrida con nuestra sonda. Southern blot - DNA Northern blot - RNA Western blot - Protenas
Clonacin gnica
La clonacin gnica consiste en la obtencin de numerosas copias idnticas de una molcula de DNA. Para clonar un fragmento de DNA se emplean vectores de clonacin.
Vectores de clonacin
Un vector de clonacin es una molcula de DNA replicante y estable a la cual puede incorporarse un fragmento de DNA extrao (inserto) para la introduccin en una clula mediante tcnicas de transformacin o transfeccin.
Vectores de clonacin
Caractersticas esenciales de un vector de clonacin: Un origen de replicacin que asegure que el vector pueda replicase dentro de una clula Marcadores de seleccin Una regin con sitios de restriccin nicos donde poder insertar un fragmento de DNA
marcadores de seleccin
Vectores de clonacin
EcoRI EcoRI
Ligacin inserto
Religacin vector
Clonacin gnica
Una vez que el fragmento de DNA ha sido clonado en un vector es necesario amplicar el nmero de copias del plsmido recombinante.
E. coli
cultivo celular
Vectores lanzadera - permiten su replicacin en dos huspedes (bacterias/levaduras) Vectores epismicos - elevado nmero de copias por clula Vectores centromricos - una copia por clula Cromosomas articiales de levaduras - una copia por clula capaz de segregar como los cromosomas Vectores de expresin - permiten dirigir la expresin de un ORF clonado
Las Los
clula
igual que los cromosomas de levaduras telmeros garantizan la estabilidad de los YAC dentro de la
Vectores de expresin
Los vectores de expresin contienen promotor, secuencias de unin al ribosoma y terminador que dirigen la expresin de un ORF determinado
northern
western
MCS terminador
GS T
protena
GST
GS T
protena
GS T
protena
Un molde de DNA monocatenario Un cebador (primer) con un grupo 3-OH libre Dideoxinucletidos (dNTPs)
La PCR consta de tres pasos que se van repitiendo:
molde
Requiere
El DNA contaminante puede ser un problema El tamao de los productos de PCR no puede
10-20Kb Despus de 25 ciclos habr 225 molculas
ser mayor de
gen X
gen X