Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra.

Alejandra Musto

Curso: Herramientas s de laboratorio para el diagn diagnstico y seguimiento de la infecci infeccin por VIH
Dra. Alejandra Musto
PROECO Cursos a Distancia por Internet Programa de Educacin Continua Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar/

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

Estructura del virus El virin es una esfera icosahdrica con un dimetro aproximado de 100 nm. La envoltura externa contiene las glicoprotenas virales gp120 y gp41. Contactando con la envoltura viral se encuentra la protena p17, y por dentro la cpside en forma de pirmide truncada, formada por la p24. La cpside protege las dos hebras no complementarias del genoma viral, formadas por RNA positivo (no son complementarias), mltiples molculas de la transcriptasa reversa y protenas pequeas que podran tener un papel regulador.(Figura 1)

Figura 1

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

El genoma viral contiene al menos nueve genes virales (figura 2), de los cuales los tres principales son comunes a todos los retrovirus.

Figura 2

gag: La traduccin del gen gag da como resultado cuatro polipptidos que constituyen el core de la partcula del HIV. La protena precursora de 55 kilodaltons (kD) se asocia con la membrana celular despus de la traduccin y se ensambla con el RNA viral para formar cores virales inmaduros, que son clivados por la proteasa viral en cuatro protenas ms pequeas designadas p17 (o protena de matriz), p24 (protena de la cpside), p7 (nucleocpside) y p6.

pol: El gen pol codifica para una poliprotena que sirve como precursor para la proteasa, transcriptasa reversa e integrasa. Pol se sintetiza como una protena fusionada con Gag. La proteasa viral cliva al polipptido Pol y lo separa del Gag y lo sigue digiriendo para separar la proteasa (p10), transcriptasa reversa (p66/51) e integrasa (p32).

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

env: El gen env codifica para la poliprotena gp160, que por accin de la proteasa genera las glicoprotenas de la envoltura gp120 y 41. La gp41 est unida a la membrana por un segmento de transmembrana, mientras que gp120 se conecta a la envoltura a travs de uniones no covalentes con gp41. Este complejo media la unin con la protena CD4 en clulas blanco. La gp120 se pliega en 5 pequeas regiones hipervariables, designadas como V1 a V5, cuyas secuencias de aminocidos son ampliamente divergentes entre aislamientos de HIV. Una de estas regiones, el V3 "loop", se encuentra entre los aminocidos 296 a 331, unidos por un puente disulfuro .El V3 "loop" no est involucrado en la unin con el CD4, pero parece ser un determinante importante del tropismo hacia macrfago o linfocito en HIV-1 .Esta regin es el principal blanco para anticuerpos neutralizantes que bloquean la infectividad viral. Los otros productos genmicos del HIV: tat, rev, nef y vpr intervienen para regular el ciclo viral (nef tambin afecta la infectividad viral). Los productos virales vif y vpu tienen que ver con la infectividad viral y la maduracin de la partcula viral respectivamente. Los nueve genes del HIV pueden agruparse en categoras de acuerdo a la funcin de los productos para los que codifican. El genoma viral est flanqueado por secuencias repetitivas (LTRs). Los LTRs contienen sitios de unin para protenas celulares que pueden activar la transcripcin viral y que tambin estn bajo el control de seales virales. La compleja regulacin del HIV le permite al virus establecer latencia celular, responder rpidamente a varias seales y sintetizar altos niveles de protenas virales y viriones.

Ciclo de replicacin viral. El ciclo de replicacin del HIV comienza con la unin especfica del virin a la clula husped, esta unin est mediada por la interaccin de la glicoproteina gp120 con el receptor CD4 de la clula (figura 3 y video http://www.youtube.com/watch?v=N4p1gWb8tI ) .La fusin de las membranas se completa por la accin de los receptores de quimoquinas CCR5 y CXCR4 presentes en la clula que actan como co-receptores .Esta unin provoca un cambio conformacional en la glicoprotena gp 41 que permite la

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

exposicin e interaccin del pptido de fusin, presente en esta protena, con la membrana celular .Luego de la fusin, se produce la entrada de la cpside viral al citoplasma celular, una vez adentro, las protenas se mantendrn asociadas al ARN hasta que comience la transcripcin. La enzima transcriptasa reversa inicia la sntesis del ADN a partir del ARN viral dando lugar a un hbrido ADN/ARN. El ARN viral parental es degradado por la misma enzima. Posteriormente se genera una segunda cadena de ADN de polaridad positiva, como copia de la primera. Una vez sintetizado el ADN doble cadena puede circularizarse formando estructuras con 2 LTRs o 1 LTR, permanecer en forma lineal e integrarse al ADN. A partir del provirus (ADN viral integrado) se sintetizan ARN mensajeros que pueden ser traducidos a protenas o servir como genomas de la nueva progenie viral. Las protenas de la estructura se sintetizan como poliprotenas y una vez clivadas y glicosiladas se ubican en la membrana celular. Las protenas reguladoras se asocian al ARN y adquieren la envoltura durante el proceso de brotacin. La liberacin de los viriones puede producirse rpidamente causando la lisis celular o de forma ms lenta conservndose la integridad de la clula. Todo lo antedicho puede entenderse ms claramente observando el video adjunto (no incluye las estructuras con 1 y 2 LTR) y adems se podrn distinguir los sitios de accin de las drogas antirretrovirales.

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

Figura 3

Transmisin de HIV Estudios epidemiolgicos han demostrado que el HIV se transmite por: a) contacto sexual a travs de semen y secreciones crvicovaginales.

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

b) contacto con productos sanguneos infectados, ya sea por transfusiones, por compartir agujas entre los adictos a drogas inyectables, o tambin por contacto con algn elemento punzocortante contaminado. c) transmisin vertical, de la madre infectada al hijo. Puede ocurrir in tero, o ms frecuentemente en el perodo perinatal o en el perodo postnatal a travs de la leche materna. d) excepcionalmente se han demostrado formas de transmisin no sexual entre convivientes. Transmisin Sexual: La transmisin sexual puede ocurrir a travs de relaciones sexuales de mujeres con hombres, hombres con hombres y excepcionalmente casos de transmisin mujer a mujer. La transmisin heterosexual actualmente es el medio ms importante de adquirir el HIV especialmente en los pases en vas de desarrollo .Esta incidencia anual de los casos de transmisin heterosexual se ve reflejada en el aumento del nmero de mujeres infectadas. Se ha demostrado la presencia del HIV en el lquido seminal, tanto en estado libre como dentro de las clulas mononucleares infectadas. Tambin se ha encontrado el virus en los frotis de crvix en el lquido vaginal. Durante el coito vaginal es 20 veces ms probable la transmisin de varn a mujer que la de mujer a varn. Esta diferencia puede deberse al contacto prolongado del lquido seminal infectado con la mucosa de la vagina o del crvix y del endometrio. En cambio el pene y su orificio uretral quedan expuestos durante menos tiempo al contagio por parte del lquido vaginal infectado. Se han descripto casos de transmisin del HIV por sexo oral, aunque esta modalidad es mucho menos eficaz que el coito anal receptivo. Transmisin por la sangre y hemoderivados: El HIV puede transmitirse a travs de la sangre y hemoderivados en individuos que comparten un mismo instrumental contaminado para inyectarse drogas, y en quienes reciben transfusiones de sangre o derivados de la misma.

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

En los consumidores de drogas inyectables el riesgo de infeccin aumenta con el tiempo de consumo de drogas, la frecuencia con que se comparten las agujas y la participacin de varios individuos que comparten el mismo instrumental. Las transfusiones de sangre completa, de concentrados de hemates, plaquetas, leucocitos y de plasma son capaces de transmitir la infeccin. En cambio, la gammaglobulina hiperinmune, la inmunoglobulina de la Hepatitis B y la inmunoglubulina RHO no se han asociado a la transmisin del HIV. Las tcnicas que se utilizan para el procesamiento de estos productos inactivan o eliminan el virus. El riesgo de transmisin del HIV con sangre o hemoderivados es actualmente muy pequeo debido a la adopcin de las siguientes medidas: la bsqueda en las muestras de sangre del antgeno p24 y de anticuerpos anti HIV, la autoexclusin de los donantes en funcin de sus conductas de riesgo, la exclusin de los sujetos HIV negativos con parmetros de laboratorios subrrogantes de infeccin por el HIV, como la infeccin por los virus de hepatitis B y C y la realizacin de pruebas serolgicas de la sfilis(comparten vas de transmisin). Transmisin horizontal no-sexual: Aunque la infeccin por HIV en nios menores de 15 aos se debe principalmente a la transmisin de la madre al hijo, un pequeo porcentaje de nios es infectado por transfusiones sanguneas y por abuso sexual. Los accidentes con agujas infectadas han sido descriptos como una ruta de transmisin ineficiente del HIV.

Historia natural de la infeccin:

Cabe destacar que cuando se habla de historia natural de la infeccin se refiere al curso de la misma sin ninguna intervencin con medicaciones . En la infeccin por HIV se pueden diferenciar tres estadios: primoinfeccin, fase asintomtica (latencia clnica) y fase clnica de SIDA. En los primeros das despus de la infeccin, el virus es producido en grandes cantidades por los linfocitos activados en los ndulos linfticos y el virus es liberado a la sangre. Los ttulos encontrados en la sangre pueden ser superiores a 5.103 partculas infecciosas o 107 molculas de RNA viral por ml de plasma en esta fase aguda. Generalmente esta viremia

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

decae en unas pocas semanas, debido posiblemente a la respuesta inmune celular mediada por clulas, el nmero de clulas CD8 aumenta antes que los anticuerpos neutralizantes puedan ser detectados. Las clulas CD4 disminuyen durante esta fase pero luego recuperan niveles cercanos a los normales. Durante el perodo de la infeccin aguda, la poblacin viral es relativamente homognea. Los aislamientos virales en estos pacientes son generalmente variantes macrofagotrpicas que utilizan el correceptor celular CCR5. Luego de pocos meses, generalmente la viremia se reduce a niveles bajos, con pequeos picos oscilantes de virus. El grado de viremia en esta fase de la infeccin es un predictor directo de la rapidez de la progresin de la enfermedad. En este perodo el nmero de CD4 disminuye en un nmero promedio de 60 clulas/ml/ao. En esta fase asintomtica, que en promedio en una persona sin tratamiento antirretroviral dura 10 aos, los niveles de CD8 permanecen mnimamente elevados, pero la replicacin viral contina, principalmente en los ndulos linfticos. Durante este estado llamado latencia clnica, slo 1 de 300 400 clulas infectadas de los ndulos linfticos puede realmente liberar virus. Como en la fase aguda, en esta fase algunos autores observan que la propagacin viral es suprimida por la accin antiviral de los linfocitos T citotxicos. Luego, hacia el final de este perodo el nmero de estos linfocitos disminuye. Durante la fase asintomtica, la poblacin viral se vuelve ms heterognea, probablemente por la contina seleccin de mutaciones especficas debida a la presin de la respuesta inmune. Finalmente, en el ltimo estadio de la infeccin el individuo infectado desarrolla los sntomas del SIDA, que estn caracterizados por un bajo recuento de clulas CD4, debajo de 200/ml, y un aumento en la cantidad de virus. Tambin se observa una disminucin en el nmero total de linfocitos citotxicos CD8. En los ndulos linfticos, la replicacin viral aumenta con la consecuente destruccin de las clulas linfoides y la arquitectura normal del tejido linfoide. En este estado la poblacin viral se vuelve relativamente homognea y generalmente los aislamientos son linfotrpicos. Se han descripto adems, pacientes infectados que progresan al SIDA rpidamente y otros que permanecen asintomticos durante largos perodos, por ms de una dcada. Estos

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

ltimos son conocidos como LTS (long term survival) o no progresores y han sido motivo de numerosos estudios en la bsqueda de factores asociados a la no progresin. Los LTS pueden permanecer asintomticos a pesar de tener menos de 200 CD4+/ml. Tambin ha sido asociada la condicin de no progresor a la posesin de genes mutados de CCR2 y CCR5. Lo antedicho se puede resumir en el siguiente grfico:

Curso de la infeccin por HIV sin terapia antirretroviral

Fauci, A. S. et. al. Ann Intern Med 1996;124:654-663

Diagnstico de la infeccin por HIV: Se basa fundamentalmente en la deteccin de anticuerpos especficos contra el virus. Debemos recordar que toda tcnica serolgica es una forma de deteccin indirecta del virus, ya que los anticuerpos se producen como consecuencia de la infeccin. Las tcnicas de deteccin de cidos nuclecos del virus son tcnicas directas ya que se detecta, mediante tcnicas de amplificacin del material genmico, directamente el virus, y no ningn elemento producto de la infeccin (por ejemplo anticuerpos). Estos conceptos son aplicables para el diagnstico de cualquier otro microorganismo.

10

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

Diagnstico serolgico de HIV: El diagnstico serolgico de HIV, como se dijo, se basa en la deteccin de inmunoglobulinas, tanto del tipo IgG, IgM e Iga. Como tcnica de tamizaje o screening,se utilizan los ELISA (enzimoinmnoensayo) o la aglutinacin de partculas(AP) y Dot- blot. Estas tcnicas, son altamente sensibles, por lo tanto presentan falsos positivos, con lo que se hace necesaria la utilizacin posterior, de tcnicas suplementarias o confirmatorias (Western blot, IFI) , que contrariamente son altamente especficas sacrificando la sensibilidad. Otro concepto a tener en cuenta es el de perodo ventana, podemos decir, que es el tiempo que transcurre desde del momento del contagio, a la deteccin de los anticuerpos en sangre, este tiempo va a depender de la sensibilidad del mtodo que se disponga para la deteccin de los anticuerpos. ELISA Dentro de las tcnicas de tamizaje, la ms ampliamente utilizada es el ELISA. Los que se utilizan para deteccin de HIV se clasifican como indirectos, competitivos, sandwich o de captura. La mayora de estos tipos consisten en antgeno viral acoplado a una fase slida (soporte) e incorporan un conjugado y un substrato de deteccin. Los soportes slidos pueden ser los pocillos de una placa de microtitulacin, microperlas plsticas o bien papel de nitrocelulosa.

ELISA indirecto: la adicin de la muestra a pocillos con antgeno absorbido permitirn la unin del anticuerpo especfico (anti-HIV) si este se encuentra presente. Siguiendo un lavado para remover constituyentes del suero no unidos al antgeno, se agrega conjugado (anti-IgG humana conjugada con una enzima) que se unir al anticuerpo del paciente (si est presente), se elimina el exceso de conjugado mediante lavados. Se agrega substrato, y el conjugado, si presente, reaccionar con el substrato para producir un color, que se puede cuantificar por lectura espectofotomtrica. El ELISA indirecto produce ms color cuanto mayor sea la concentracin de anticuerpo en la muestra.

11

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto ELISA competitivo: Este difiere en que el anticuerpo anti-HIV de la muestra compite con el conjugado (que es un anticuerpo tambin dirigido contra el HIV) por sitios reactivos del antgeno unido al soporte. Entonces en este ELISA competitivo tanto la muestra como el conjugado se aaden juntos a la fase slida al mismo tiempo. Si la concentracin de anticuerpos en la muestra es alta se podr unir muy poca cantidad de conjugado al antgeno por la competencia de los otros anticuerpos. Habr menos presencia de color en este caso. Si la muestra contiene poco o ningn anticuerpo anti-HIV, se unir ms conjugado a la fase slida con mayor desarrollo de color. Por esto, la cantidad de anticuerpo presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de color producido y el valor de densidad ptica.

ELISA sndwich: El antgeno, unido a la fase slida, captura anticuerpo de la muestra. Puesto que las molculas de anticuerpo son bivalentes an pueden unirse a otra molcula. En el prximo paso se agrega antgeno marcado con una enzima y se une a la misma molcula de anticuerpo que est unida a la fase slida. Esto forma un complejo antgeno/anticuerpo/antgeno. El siguiente paso: adicin de sustrato con desarrollo de color es similar a los otros ELISAs. Una ventaja importante de esta tcnica es que detecta todas las clases de inmunoglobulinas, puesto que no se utiliza un conjugado especfico antiinmunoglobulina.

Cuando empez la epidemia los ELISAs que se utilizaban, usaban para la deteccin de los anticuerpos, lisados virales, que se obtenan de clulas infectadas con lo cual presentaban gran nmero de falsos positivos, por ser los primeros que aparecieron, se los denomin de primera generacin. Con el paso del tiempo se incorporaron antgenos provenientes de protenas recombinates (ELISAs de segunda generacin), con lo que se lograba aumentar la especificidad. Actualmente se dispone de equipos con distintas presentaciones, incluso incorporados a equipos automatizados, que utilizan como antgeno protenas recombinantes y ppticos sintticos (tercera generacin) con un diseo tipo sndwich que, adems de acortar el perodo de ventana a 20 das, debido a la capacidad de de detectar otras inmunoglobulinas

12

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

como IgM, IgA (que se encuentran presentes durante la seroconversin ) tiene una mayor sensibilidad analtica para IgG. Para disminuir el perodo ventana an ms (7-14 das), se han ido incorporando ELISAs que detectan, adems de anticuerpos, antgeno p24 (protena de la cpside viral) de manera simultnea (figura 4).

A n ti -p24 monoclonal

Anti -p24 monoclonal conjugada

Deteccin de Ag

p24

Muestra del paciente

Deteccin de Ab

Antgeno recombinante

Antgeno ntgeno conjugado

Figura 4.ELISA de cuarta generacin

13

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

Podramos resumir lo anteriomente dicho en el siguiente grfico:

Aglutinacin de partculas: Las pruebas adaptadas para HIV utilizan como vehculo glbulos rojos, partculas de gelatina o de latex. Los antgenos (lisado viral, protenas recombinantes o pptidos sintticos) se adsorben al vehculo, y estos reactivos estn listos para usar. Durante la reaccin de aglutinacin se forma una red entre las partculas con antgeno y el anticuerpo. Esta reaccin trae la formacin de grumos (aglutinacin) de las partculas. La aglutinacin es macroscpica y se lee visualmente. Estas pruebas son muy fciles de realizar y no requieren lavados. Lo nico que se requiere es la dilucin del suero, adicin de partculas, incubacin a temperatura ambiente. Las reacciones se leen macroscpicamente o con la ayuda de un espejo magnificador, o un lector adecuado provisto por el proveedor. Se deben utilizar controles de partculas no sensibilizadas para detectar aglutinacin inespecfica.

14

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto Dot-blot: La mayora de las llamadas pruebas rpidas estn basadas en este principio. Son muy sencillos de realizar, pero en general son bastante costosos. La mayora de ellos se pueden realizar entre 3 10 minutos. En estos ensayos el soporte es papel o nitrocelulosa. En general el antgeno se incorpora como un crculo (dot) y es un recombinante o pptido sinttico. En otros ensayos se incorporan micropartculas que pueden incorporar una gran cantidad de antgeno por el rea que tienen expuesta. En estas pruebas, el conjugado anti IgG humana se aaden al anticuerpo del paciente. La adicin de un substrato adecuado produce un color en el papel. Algunos fabricantes utilizan oro coloidal unido a Protena A (derivado de la pared del Staphylococcus) que se une a la mayora de las IgG humanas, entonces, se unir al anticuerpo del paciente. En general estas pruebas contienen un control general del procedimiento para indicar que est funcionando correctamente. Este control es una anti-inmunoglobulina humana en el soporte slido que se une a la IgG humana y da la reaccin correspondiente con la Protena A. Sobre los test rpidos hay distintos puntos importantes a tener en cuenta: Debido a que muy fcil de realizar, no necesitan de equipamiento,se realizan rpidamente y muchos de ellos no necesitan conservacin en heladera, resulta muy tentador su uso indiscriminado, justamente hecho que debe evitarse. Debe tenerse presente que no bebe utilizarse como un test de uso personal. Todo test de HIV debe ir acompaado por un aconsejamiento pre y post test, por personal entrenado. El resultado reactivo debe ser confirmado por WB y seguir el algoritmo diagnstico. Justifica su uso en embarazos a trmino no controlados para instaurar la profilaxis con antirretrovirales y evitar la transmisin vertical. Se adjunta el algoritmo diagnstico recomendado (obtenido de la pgina del Ministerio de Salud de la Provincia de Buenos Aires).

15

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar

Herramientas de laboratorio para el diagnstico y seguimiento de la infeccin por VIH Dra. Alejandra Musto

Algoritmo de trabajo para uso de TEST RPIDOS par serologa de V IH

TEST R PIDO NO REACTIVO REACTIVO

NO INICIAR TR ATAMIENTO INICIAR TRA TAM I E NT O CONFORM E AL ESQUE MA DE REDUCCIN DE DE TR AM SMICIN V ERT I CAL ( Suspender temporari amente l a la ctancia e i mplementar el esquema p reventivo al RN)

R ATIFICAR EL RE SULTADO DEL TES T R PIDO POR T CNICAS SEROLGICAS CONVENCIONALES

Ra t i ficar el di agnstico presuntivo del Test R pid o por tcnicas se rolg icas convencio nales (EIA/AP/ MEIA, Wester b lot)

16

PROECO - Fundacin Bioqumica Argentina http://campus.fba.org.ar