PRCTICA DE LABORATORIO N1:

Material de laboratorio de microbiologa. Limpieza, desinfeccin y esterilizacin.

1. OBJETIVOS
Reconocimiento de las caractersticas y funciones de cada uno de los materiales que se utilizaran en el laboratorio de Microbiologa. Conocer los principios bsicos de descontaminacin como la limpieza, la desinfeccin y la esterilizacin.

2. FUNDAMENTO TERICO
MATERIALES DE LABORATORIO
a) Material de Vidrio Constituye una de las principales herramientas para los fines que se persigue en el laboratorio. Entre los ms conocidos se encuentran el vidrio PYREX y KYMAX Los requisitos para que un material sea un buen material son: Buena calidad, resistente a la accin mecnica Ser de color neutro Bajo coeficiente de dilatacin Resistente a altas temperaturas Bajo lcali

Tubo de Ensayo Consiste en un pequeo tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en el laboratorio para contener pequeas muestras. Entre las medidas ms conocidas estn: De 16x150 mm, 15x125 mm y 13x100m. Placas Petri La placa petri es un recipiente redondo, con una cubierta de la misma forma que la placa pero algo ms grande de dimetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente. Se utiliza en el laboratorio principalmente para el cultivo de bacterias y otros microorganismos, solindose cubrir el fondo con distintos medios de cultivo (por ejemplo agar) segn el microorganismo que se quiera cultivar. Si se quieren observar colonias, durante el tiempo de incubacin del microorganismo sembrado en la placa esta se mantiene boca abajo, es decir apoyada sobre la tapa, ya que esto favorece la exposicin al oxigeno. Pipetas La pipeta es un instrumento volumtrico de laboratorio que est formado por un tubo hueco

transparente que termina en una de sus puntas de forma cnica y que tiene una graduacin de distintos volmenes. *Pipetas volumtricas: Se reconocen por presentar una dilatacin bulbosa central. Entre las ms conocidas se encuentran las de 10, 25, 50 y 100ml. *Pipetas serolgicas: Son aquellas que sirven para transferencia de material. Entre las ms usadas se encuentran la de 1ml, 5ml, 10ml. Matraz o Erlemeyer Es un frasco transparente de forma cnica con una abertura en el extremo angosto, generalmente prolongado con un cuello cilndrico. Es muy utilizado para la preparacin de medios de cultivo. Kitasato Es un frasco muy parecido al Erlemeyer, y se caracteriza por que posee paredes gruesas y una tubuladura lateral en el cuello, la misma que se usa para filtracin de sustancias liquidas y tcnicas de esterilizacin en frio as como para hacer el vaco Probetas Es un instrumento volumtrico que permite medir volmenes superiores y mucho ms rpido que las pipetas pero con menor precisin. Muy utilizado en microbiologa para medir volmenes determinados para preparar medios de cultivo (500ml, 100ml, 1L). Vaso de precipitacin Es un simple contenedor de lquidos, usado muy comnmente en el laboratorio. Son cilndricos con un fondo plano; se les encuentra de varias capacidades, desde 1ml hasta de varios litros. Bagueta Es una varilla de vidrio utilizada para agitar soluciones o lquidos con el fin de homogenizar la mezcla. b) Material de otra naturaleza Asa de Siembra (Asa de Kolle) Es un material que posee un alambre de micrn muy utilizado en el laboratorio de microbiologa para transportar inculos y para el aislamiento de microorganismos. Se esteriliza por medio del calor seco. Balanza digital Es un instrumento de pesaje de funcionamiento no automtico que utiliza la accin de la gravedad para la determinacin de la masa. El resultado de esta medicin aparecer reflejado en el dispositivo con un grado de exactitud de 0.0001g por lo cual nos arrojan mejores resultados.

EQUIPOS DE LABORATORIO
Bao Mara Confiere temperatura uniforme a una sustancia liquida o solida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua que se lleva o ya est en ebullicin. El concepto de bao mara implica el calentamiento indirecto por conveccin trmica de agua. Incubadora Es un equipo con funciones especficas que permite controlar, segn su diseo, temperatura y humedad para crear un ambiente adecuado apto para la reproduccin y desarrollo de organismos vivos. Algunas de las aplicaciones ms comunes son los cultivos microbiolgicos y virales, entre otros. Esterilizador Especialmente para la destruccin de los microorganismos, sean cuales sean sus caractersticas. Se trabaja a una temperatura de 180C por un tiempo de dos horas con determinados materiales ya sean de vidrio, madera o metal. Horno Es un equipo metlico formado por doble pared y con bandejas ajustables en su interior. Suelen calentarse mediante resistencias elctricas, pudiendo regularse su temperatura. Externamente presenta un termmetro que indica en todo momento la temperatura que existe en el interior del horno (que deber coincidir con la temperatura elegida). Tambin incluye un selector de temperatura y en ocasiones un reloj. Es muy utilizado en la esterilizacin.

Autoclave Es un recipiente cilndrico grande o pequeo que se cierra hermticamente. Externamente lleva un manmetro que registra la presin que existe en el interior del autoclave cuando ste est en marcha. Existe un sistema que nos permite controlar la presin que deseamos. Adems presenta una vlvula de seguridad que se abrir espontneamente cuando la presin interna supere la elegida o resulte peligrosa, una llave de purga que permite la salida de vapor y un reloj que selecciona el tiempo deseado con una alarma que indica el final del proceso.

PRINCIPIOS BSICOS DE DESCONTAMINACIN

Todo material que va a ser utilizado en el laboratorio de microbiologa deber cumplir una serie de condiciones, entre ellas, y de forma esencial, una total asepsia del material que se va a utilizar. Esto depender de las prcticas que se realicen en cada momento. Limpieza Luego de destruir los grmenes ya sea por tcnicas de esterilizacin o desinfeccin se procede luego a limpiar, procediendo de la siguiente forma: Se separa el material de uso sptico del de uso asptico, procediendo inmediatamente a su limpieza. Se tendr precaucin de no dejar demasiado tiempo el material metlico en agua. Se limpiaran los instrumentos primero con agua fra, ya que el calor hace que muchos de los residuos, por ejemplo pus o sangre, se adhieran ms. Se lavara con agua caliente y jabn frotando especialmente en los sitios o lugares ms angulosos. Tras el lavado y enjuagado se volver a aclarar de nuevo en agua destilada. Se secar y se comprobar su estado. Se proteger si es necesario.

Desinfeccin Este metido en microbiologa se utilizara para la descontaminacin de materiales o superficies inertes y para la descontaminacin de manos, piel, mucosas, etc. Materiales o superficies inertes (suelo o cualquier superficie del laboratorio, incluido sus materiales). Se utilizan sobretodo los mtodos qumicos es decir, los desinfectantes (detergentes, hipocloritos, etc.), que van a producir la destruccin de todos os grmenes patgenos, no destruyendo los grmenes no patgenos Desinfeccin de manos, piel y mucosas, La desinfeccin sobre tejidos vivos corresponde a tcnicas de antisepsia y lo que se aplica sobre ellos no son desinfectantes sino antispticos. En el lugar donde se aplican producen una destruccin de los grmenes patgenos.

Esterilizacin Este mtodo es utilizado en microbiologa para la reutilizacin de cualquier material que pueda y

deba utilizarse como material asptico. Existen distintas tcnicas pero en cualquier caso van a producir la destruccin de cualquier forma de vida.

TCNICAS DE DESCONTAMINACIN FSICA

Tratamientos trmicos por calor seco y hmedo Consisten en la destruccin total (esterilizacin) o parcial (desinfeccin) de los grmenes por la aplicacin de calor. Este calor que se aplica puede ser seco o hmedo. a) Descontaminacin por calor seco Dependiendo de la temperatura yd el tiempo d aplicacin se consigue o no esterilizacin. Las tcnicas de esterilizacin por calor seco son: Flameado: Consiste en exponer un objeto o parte de un material a la llama de un mechero durante uno o varios minutos, segn sea el material a utilizar. Este mtodo es muy utilizado para esterilizar la punta del asa de siembra (hasta la incandescencia), las bocas de los tubos de ensayo o matraces cuando se abren por el motivo que sea y siempre antes de cerrarlos, puntas de pipeta, etc. Incineracin: Consiste en destruir en hornos crematorios el material. Es utilizado para destruir el material de un solo uso, por ejemplo jeringas, guantes, etc. Horno seco (Estufas Pasteur o Poupinel): Son hornos metlicos formados por doble pared y con bandejas ajustables en su interior. Suelen calentarse mediante resistencias elctricas, pudiendo regularse su temperatura. La esterilizacin se consigue a 180C durante dos horas o 160C durante 3 horas y media. Este tipo de esterilizacin acta sobre los materiales en profundidad. Los materiales que se pueden esterilizar por este mtodo son todo tipo de materiales, vidrio, porcelanas, metal, etc. No se utiliza para esterilizar medios de cultivo, productos lquidos, telas, plsticos, etc.

b) Descontaminacin por calor hmedo Ebullicin: Es un mtodo que en el laboratorio se utiliza poco, ya que no es muy fiable. En sentido estricto no es un mtodo de esterilizacin, ya que no destruye las esporas. Consiste en introducir el material en agua hirviendo (100 C) durante unos 10 minutos como mnimo. Autoclave: Es un aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras dependern de las condiciones de presin y tiempo elegidos, es decir, se conseguir esterilizacin si sometemos el autoclave a 0.8 atmosfera durante 30 minutos (118 C), 1 atmosfera durante 20 minutos (120 C), 2 atmosferas durante 10 minutos (134 C) o 3 atmosferas durante 5 minutos (144 C) Tcnica para utilizar el autoclave:

1. Con el autoclave apagado y abierto, aadimos agua destilada hasta la rejilla, cubrindola . 2. Se pondr algn soporte metlico para evitar que el material que desee esterilizar contacte directamente con el agua. Esto no es siempre necesario. Se colocaran adecuadamente (cestillos, cajas, etc.) los objetos que se van a esterilizar. Se cierra la tapa y se ajusta a presin. 3. Se abrir la llave de purga para que permita la salida de vapor y se ajustara la presin deseada para la esterilizacin, as como el tiempo. 4. Se pondr en marcha el aparato y se esperara hasta a que salga vapor por la llave de purga. 5. Se cerrara la llave de purga y la presin comenzara a subir hasta llegar al nivel programado. A partir de aqu comenzara a contar el tiempo de esterilizacin. 6. Una vez realizada la esterilizacin se apagar el interruptor del autoclave y se esperar a que el manmetro baje a cero. 7 Cuando la presin est a cero, abriremos la llave de purga para que salga gran parte del vapor que todava se encuentra contenido. Esto se realizara con cuidado para evitar descomprensiones briscas que podran originar la apertura de aquellos recipientes tapados con algodn graso. 8. Una vez comprobada la salida de vapor, se abre la tapa del autoclave y se extrae el material. El autoclave se puede utilizar para esterilizar material metlico, cristal, torundas, compresas, paos, batas, plsticos y gomas reutilizables. Tiene el inconveniente de que con el tiempo los objetos metlicos se oxidan. Tyndalizacion: Es un mtodo de esterilizaciones consecutivas. Se utiliza en microbiologa cuando existe un problema de contaminacin en algn material o en el propio autoclave. Consiste bsicamente en esterilizaciones repetidas a lo largo de 3 o 4 das, hasta que se elimina el germen contaminante. El objetivo de este mtodo es destruir las esporas cuando stas germinan, as como evitar contaminaciones por microorganismos resistentes. Vapor fluente: Consiste en utilizar el autoclave siguiendo la tcnica habitual pero con la llave de purga abierta, lo que impedir que se produzca presin y que la temperatura nunca sea superior a 100 C. Este mtodo es utilizado para materiales o medios que no deban soportar temperaturas superiores a 100 C. Por ejemplo, con medios muy azucarados, para evitar su caramelizacin. Es un mtodo poco utilizado en microbiologa.

Tratamientos a temperatura ambiente a) Radiaciones ionizantes Rayos ultravioletas: Ms que para esterilizar, se usan para mantener la esterilidad de superficies y/o recintos. Se caracterizan porque tienen poca penetracin. Actan impidiendo y alterando la duplicacin del ADN celular. Se debe evitar su presencia en la piel.

 Rayos gamma: Se utilizan para conseguir esterilizacin en fro. Son producidos por istopos radiactivos. Presentan un poder de penetracin muy alto, construyendo el mtodo de esterilizacin ms utilizado a nivel industrial. Se utiliza para esterilizar materiales de uso nico o desechable (guantes, jeringas, catteres, prtesis, vlvulas, etc.) y en general cualquier tipo de material que pudiera alterarse por calor. b) Sistemas de filtracin: Son dispositivos que separan del medio a filtrar todas aquellas estructuras que sobrepasen un determinado tamao, segn el tipo de filtro. La efectividad de un filtro va a ser proporcional al tamao del poro, pudiendo conseguirse la esterilizacin. Otra caracterstica es la presencia de presin, vaco e incluso la carga del filtro, que generalmente suele ser positiva, ya que las bacterias en medios neutros tienen carga negativa. Los ms utilizados son: Filtros de membrana: Son filtros de celulosa muy purificada y con un tamao de poro generalmente fino o muy fino. Estos sistemas pueden ser, desde muy sencillos a estar formados por sistemas de piezas desmontables que en muchas ocasiones llevan acoplada una bomba de vaco para ejercer succin sobre el medio a filtrar. Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio: Se utilizan en cayos especficos y tienen ms resistencia que los anteriores. Filtros de Chamberland: Son filtros de porcelana porosa, pero resultan ms caros que los anteriores y son menos utilizados. Ultrasonidos: Consiste en introducir en material en tanques de distintos tamaos que contienen un liquido generalmente desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad originando pequesimas burbujas que entran en todos los recodos del material consiguiendo eliminar los microorganismos. Es un mtodo poco utilizado, ya que resulta caro y poco prctico.

TCNICAS DE DESCONTAMINACIN QUMICA

En este caso hay que distinguir entre los mtodos qumicos de desinfeccin y los mtodos qumicos de esterilizacin. Mtodos qumicos de desinfeccin Producen la destruccin de todos los microorganismo patgenos. Son los desinfectantes y los antispticos. Los desinfectantes son sustancias qumicas aplicadas sobre objetos y superficies. Los antispticos son sustancias qumicas aplicadas sobre la piel y mucosas. Todo buen mtodo de desinfeccin deber cumplir con las siguientes condiciones: Matar el mayor nmero de grmenes o, al menos, todos los patgenos. Ser econmico No ser corrosivo, txico ni irritante para los tejidos

Se deber diluir al menos en agua Tener un olor agradable

Los desinfectantes ms utilizados son: Detergentes catinicos: Se pueden utilizar diluidos al 1% para la desinfeccin de manos. Su uso ms corriente es para la limpieza y desinfeccin de paredes, suelos, ropa y objetos en general. Cloro fenoles: Son muy eficaces y se suelen asociar con los detergentes catinicos para mejorar el grado de desinfeccin. Compuestos clorados: Son utilizados para la desinfeccin de superficies, ropa, urinarios, etc. Se suelen utilizar diluidos en agua y un ejemplo tpico lo constituyen las lejas (hipocloritos). cido fnico: Se utiliza diluido al 5% para la limpieza de objetos y superficies. Los antispticos ms utilizados son: Alcoholes: Se utilizan para limpiar y desinfectar la piel, las manos, el filo del instrumental y algunas superficies pequeas. Se utiliza el etanol para tejidos y el metanol para superficies que no vayan a estar en contacto con la piel. Mercuriocromo: En su composicin aparece el mercurio, que tiene un efecto desinfectante muy bueno. Es especialmente utilizado en heridas superficiales debido a que las desinfecta y las mantiene secas y protegidas. Mtodos qumicos de esterilizacin Los ms empleados son: xido de etileno: Se emplea en forma de gas (a 10 C es gas), mezclado con dixido de carbono, ya que el oxido de etileno puro es muy oxidante y al mezclarse con el oxigeno del aire podra explosionar. La esterilizacin se va a producir a temperaturas bajas (unos 40 C) con una humedad relativa alta (40-60%) durante un tiempo de 3 a 8 horas. El material estar disponible para ser utilizado a las 48 horas despus de la esterilizacin. El material deber conservarse estril en el interior de una bolsa de plstico cerrada procedimientos termoelctricos. La duracin de dicha esterilizacin es de unos 6 meses. Vapores de formol: Es utilizado en aparatos de anestesia, respiradores, incubadoras, etc., a temperaturas de esterilizacin que oscilan entre 17 C (durante 48 horas) y 50C (en torno a las 2 horas). Antes de su utilizacin es necesario eliminar el olor residual del formol.

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Se observa como es el uso que se le debe dar a la placa Petri al momento de cultivar medios de cultivo (como abrir y cerrarla as como los movimientos arriba-abajo, izquierdaderecha, horario y anti horario).

Se aprende el uso que se le debe dar al algodn, papel kraft y al pabilo para proteger los tubos de ensayo, las placas Petri y los matraces. Se hace una demostracin de esterilizacin a calor seco con el Asa de Kolle. Se realiza un reconocimiento de los instrumentos que se usaran en las prcticas de laboratorio as como de los equipos de laboratorio como incubadora, refrigeradora, horno y bao mara.

4. RESULTADOS/OBSERVACIONES
Se ha creado consciencia de la importancia que implica una buena asepsia en el laboratorio de microbiologa y se ha podido aprender a utilizar los instrumentos de laboratorio.

5. DISCUSIN
Si bien el laboratorio cuenta con el material y equipos bsicos, stos ltimos no muestran un estado 100% ptimo, sin embargo se espera que su funcionabilidad no afecte al trabajo a realizar.

6. CONCLUSIONES
Se logr reconocer las funciones y caractersticas de los materiales de laboratorio de microbiologa. Se logr entender el funcionamiento de los equipos de un laboratorio de microbiologa, lo que ayudar a poder realizar las prcticas con responsabilidad y las medidas de seguridad adecuadas. Todo material utilizado para la recogida de cualquier tipo de muestra que posteriormente ser procesada en el laboratorio deber estar totalmente esterilizado. Todo material utilizado para la realizacin de las pruebas oportunas (placas Petri, tubos de ensayo, pipetas, etc.) en un laboratorio de microbiologa deber estar estril.

7. RECOMENDACIONES
Conviene si es econmicamente viable, utilizar material desechable. La limpieza de residuos en el suelo, en la mesa de trabajo y en general cualquier superficie del laboratorio se realizar mediante desinfeccin y de forma peridica, para de esta forma reducir el riesgo de posible contaminacin ambiental

8. BIBLIOGRAFA
Raquel Granados Prez, Microbiologa. Bacteriologa, caractersticas y clasificacin bacteriana, Virologa, caractersticas y Tcnicas bioqumicas, Paraninfo, Madrid, 1996, pp. 43-52.

9. ANEXOS
Algunos usos del papel kraft y el pabilo en el laboratorio

Horno y Autoclave

Algunos instrumentos de laboratorio