UNIVERSIDAD CATLICA DE SANTA MARIA

Facultad de Ciencias e Ingenieras Biolgicas y Qumicas Programa profesional de Ingeniera de Industria Alimentaria

Secado y vida en anaquel de alimentos Practica 2

Pertenece a: Beatriz Saldaa Bolaos

Docente: Edilberto Flores aguilar

Semestre: VII

AREQUIPA-PER 2013

Practica 2 Test de la peroxidasa Introduccin La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de hidrgeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromticas (o-fenilendiamina) por medio de perxidos ( ). El substrato oxidable ms usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa:

La velocidad de formacin del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimtica por lecturas espectrofotomtricas de las absorbancias en relacin con el tiempo. La peroxidasa presenta como grupo prosttico un grupo Hem, cuyo tomo central de hierro forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibindose su actividad enzimtica. La actividad enzimtica depende del vegetal (los rbanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja. Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisa mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, producindose luego una reversin de la protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos. Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy, importante en la industria de alimentos y la regeneracin enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolpticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimtica puede detenerse totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneracin es muy dbil generalmente. La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y tambin en el control de pasteurizacin de la leche. As, a la temperatura de pasteurizacin, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (ms de 80-85C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva. b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de al 0,9% y 4,7 ml de agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotmetro colocar 1 ml de jugo de

expresin de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y agua oxigenada (a) al tubo del espectrofotmetro y tomar el tiempo con cronmetro. Vaciar rpidamente la mezcla al tubo vaco y luego nuevamente al tubo del espectrofotmetro. Colocar el tubo en el espectrofotmetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas de absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 5 puntos. Graficar las lecturas de absorbancia contra los tiempos para obtener as la graduacin de la reaccin. c) Regeneracin: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de ensayo. Colocarlos en un bao hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo despus, de 30 segundos, el 20 despus de 1 minuto y el 39 despus de 2 minutos. Enfriarlos rpidamente en un bao de agua y determinar de inmediato la actividad peroxidsica, como Se ha descrito anteriormente. Despus de 1 hora repetir la determinacin de la actividad en los tres tubos calentados. Objetivos Determinar el blanqueo adecuado de un producto vegetal por el test de la peroxidasa. Materiales Tubos de ensayo Embudo Filtro de algodn Licuadora o mortero Probeta de 50 ml. Pipetas Cronometro Balanza Agua destilada Solucin de guayacol al 0.5 % en una solucin al 50% de alcohol etlico. Dol. De 0.08-5 de perxido de hidrogeno al 30% por litro. Guardar el frasco en lugar oscuro e n el refrigerador y renovar la solucin cada semana o 2. Arena limpia Muestra: papa. Parte experimental Pesar una muestra representativa de 100 a 200 gr. Colocar en la licuadora con 3 ml. Agua destilada por cada gramo de muestra. Licuar por un minuto a velocidad moderada. Filtrar a travs de un filtro de algodn. Agregar 2 ml. De filtrado de 20 ml. De agua destilada en un tubo de ensayo. Preparar un blanco aadiendo 2 ml. De filtrado a 20 ml. De agua destilada en un segundo tubo de ensayo, mezclar utilizando como tubo de comparacin. Agregar 1 ml. De la solucin al 0.5 % de guayacol al primer tubo de ensayo sin mezclarlo. Aada 1 ml. De la solucin al 0.08% de perxido de hidrogeno al mismo tubo sin mezclarlo. Mezcle el contenido del tubo enteramente y observe el desarrollo de algn color diferente del blanco, el desarrollo del color indica un inadecuado blanqueo. Si el color no se desarrolla dentro de los 3 a 5 minutos se considera el resultado del test como negativo y el producto

adecuadamente blanqueado. Si se desarrolla algn color despus de los 3 a 5 minutos se sigue considerando negativo. Efecto de la temperatura: 5 tubos a temperaturas de: 1) 52 por 3 minutos. 2) 62 por 3 minutos. 3) 72 por 3 minutos. 4) 82 por 3 minutos. 5) 92 por 3 minutos. Resultados y discusin

Las imgenes muestran los tubos de ensayos trabajados con las temperaturas. Los primeros tubos de coloracin (1, 2, 3) fueron los que tuvieron reaccione en el primer minuto del test, los dems tuvieron reaccin pasados los 3 minutos. Conclusiones A mayor efecto de temperatura se desactiva ms rpido la peroxidasa. Las pruebas en blanco no reaccionaron porque haca falta las soluciones. Bibliografa

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/par te08/02.html https://es.vwr.com/app/Header?tmpl=/food_and_beverage/merck_test_strips.htm http://www.buenastareas.com/ensayos/Peroxidasa/3287138.html Cuestionario De los productos sometidos a diferentes tratamientos de blanqueo indique cuales dieron negativo al test de la peroxidasa. Los tubos sometidos a la temperatura de 52, 62 y 72 C. Como se determina la peroxidasa espectrofotomtricamente? DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN ALIMENTOS QUE LA CONTIENEN EN PEQUEAS CANTIDADES (por ejemplo, en maz dulce) (75). Fundamento: Este mtodo de valoracin de la enzima peroxidasa se basa en medir el color desarrollado al reaccionar la enzima sobre la o-fenilendiamina, en presencia de perxido de hidrgeno, leyndose la absorbancia a 430 nm. Reactivos: a) Solucin tampn de pH 6,5 (fosfato-citrato). b) Se prepara mezclando 14,2 partes de fosfato disdico 0,2 M y 5,8 partes de cido ctrico 0,1 M. c) Orto-fenilendiamina al 1 % (en alcohol al 95%; se debe preparar fresca cada 4 horas). d) Agua oxigenada al 0,3%. e) Solucin saturada de bisulfito de sodio. Procedimiento: Se pesan aproximadamente 4 g de material fresco y se lleva a 250 ml con tampn fosfato-citrato (a) de pH 6,5 y se somete a homogeneizacin en mezcladora elctrica por 3 minutos; 10 ml de este extracto se llevan a 250 ml con el mismo tampn. Una alcuota de 25 ml de la muestra homogeneizada y diluida se transfiere a una botella centrfuga de 250 ml. Por otra parte, 25 ml de alcuota de cada muestra se usan para preparar los blancos. Debe mezclarse bien antes de tomar las alcuotas, pues parte de la enzima se localiza en las partculas slidas que tienden a sedimentar. Las muestras se mantienen en bao a t constante de 25C por 30 min. A continuacin, a la muestra problema se le agrega 1 ml de solucin de o-fenilendiamina al 1 % y 1 ml de al 0,3%, dejndose la mezcla reaccionar por 5 minutos. A este tiempo debe detenerse la reaccin agregando 2 ml de la solucin saturada de bisulfito de sodio. A los blancos se les agrega la fenilendiamina, luego el bisulfito y, por ltimo, el agua oxigenada. La enzima es inhibida por el bisulfito de modo que ella est inactivada cuando se agrega el perxido de hidrgeno. Cuando se trata de productos ricos en almidn, es aconsejable precipitarlo, agregando para ello 25 ml de alcohol de 95%; se agita mientras se agrega el alcohol para lograr una buena floculacin. Las muestras se centrifugan a 3.000 rpm por 5 minutos. El supernadante se presenta como una solucin clara y se transfiere a un tubo del colormetro. Se lee la absorbancia a 430 nm. El colormetro se lleva a 100% de transmitancia con el correspondiente blanco de cada muestra. Si se pesan 4 g de material fresco y se obtiene una lectura de 0,5, el resultado se calcula de acuerdo a la siguiente frmula:

Cuando se toman cantidades mayores y se hacen diluciones menores, los valores de U/g se pueden calcular de la misma manera. Revisin bibliogrfica PEROXIDASA Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas en toda la escala filogentica. Pertenecen a la categora de lasoxidorreductasas y segn el Comit de Nomenclatura de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular se clasifican con los nmeros EC 1.11. Grupo de las peroxidasas Catalizan reacciones bisustrato de carcter redox, utilizando un perxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de caractersticas reductoras que es oxidado por el perxido. En vegetales, es de destacar a la peroxidasa del rbano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes aplicaciones en tcnicas inmunoqumicas y de diagnstico clnico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugacin con las inmunoglobulinas y sencillez para detectarla por mtodos colorimtricos utilizando un gran nmero de reactivos. En animales, existen peroxidasas con una funcin predominantemente defensiva en la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carcter oxidante con fines germicidas y bactericidas del perxido que se genera de forma endgena mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino cido oxidasa etc.). No todas las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa (yoduro peroxidasa) es tambin la responsable de la sntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en este caso el yoduro a yodo para que ste se adicione a algunos de los anillos fenlicos de los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Otras peroxidasas, como la glutationa peroxidasa, est ampliamente distribuida en diversos tejidos con fines diferentes, pero relacionados con una funcin antioxidante. Prcticamente todas las peroxidasas son hemoprotenas (excepcin notable es la glutationa peroxidasa, que es unaselenoprotena) y tienen como sustrato comn el H2O2 o perxido de hidrgeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el inferior, dando lugar a una inhibicin por exceso de sustrato ya que cuando ambas posiciones estn ocupadas por el perxido de hidrgeno no es posible la unin del otro sustrato. Respecto a ese otro sustrato, su naturaleza y estructura qumica puede ser muy distinta, tanto si nos referimos a los oxidados "in vivo" como si lo hacemos a los que se emplean "in vitro" con objeto de detectar esta actividad enzimtica. Entre ellos se incluyenfenoles, aminas aromticas, molculas orgnicas complejas como el ABTS (ver prctica de Reflotrn para determinacin de parmetros sanguneos en tiras secas), o el ioduro y la glutationa antes citados. Esta pobre especificidad para el sustrato reductor hace que la afinidad sea tambin pequea. Enzima peroxidasa La peroxidasa, EC 1.11.1.7, es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno.

Donante + H2O2 Donante oxidado + H2O Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo. Es utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin de metabolitos comoglucosa, cido rico, colesterol o triglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza en inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del sida o elherpesvirus. La peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y protectores de radiacin magntica, colorantesalimentarios y componentes bioactivos de detergentes. Los genes de las peroxidasas humanas expresan una cadena ligera y una cadena larga. La enzimas activas son un h El ser humano tambin sintetiza la mieloperoxidasa. Esta enzima se utiliza en el sistema inmunitario con funciones bactericidas.