Lesin y Supervivencia de las Clulas Pancreticas Francisco Bedoya, Juan Tejedo y Gladys Cahuana Centro Andaluz de Biologa Molecular

r y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla La evidencia acumulada por un nmero considerable de artculos experimentales y clnicos indica que un descenso relativo absoluto de la masa de clulas pancreticas es el comn denominador de la diabetes tipo 1 y tipo 2. La reserva funcional del pncreas endocrino es considerable, por lo que los sntomas clnicos de comienzo de la enfermedad en el caso de la diabetes tipo 1 o de empeoramiento del cuadro metablico en el caso de la diabetes tipo 2 aparecen cuando la masa de clulas pancreticas es inferior al 10-20%. Una estrategia teraputica eficiente debera combinar el control de los factores causales de la enfermedad junto con la proteccin de la masa de clula residual y la atenuacin de los factores agravantes (control glucmico, control del sobrepeso, etc). No hay abordajes eficaces que combatan el proceso destructivo de la clula pancretica y tampoco hay tratamientos etiolgicos para esta enfermedad. Por ello, la proteccin frente al ataque inmunitario especfico (diabetes tipo 1) natural (diabetes tipo 2) pudiera constituir un objetivo de investigacin con buenas perspectivas de aplicacin en el tratamiento de ambas formas de diabetes. Los aspectos relacionados con la proliferacin, supervivencia y destruccin de la clula pancretica ha sido objeto de estudio por varios grupos de investigacin a lo largo de los 15 ltimos aos. Sus investigaciones y las de otros laboratorios estn generando un modelo patognico en el que la muerte celular por apoptosis de la clula junto con una capacidad limitada de regeneracin de la clula a partir de sus clulas progenitoras conducen a una

insuficiencia del pncreas endocrino para controlar el metabolismo energtico del organismo Los efectos colaterales de esta prdida de control conducen a complicaciones importantes que estn asociadas con una glucemia elevada. La muerte de la clula es el factor clave en la diabetes tipo 1, ya que cuando la masa celular disminuye por debajo de unos niveles crticos, aparecen los sntomas clnicos que a su vez son reflejo de la hiperglucemia grave y de las complicaciones metablicas resultantes. En cambio, este proceso destructivo tiene un papel ms insidioso en la diabetes tipo 2, ya que los estudios sobre la masa de clulas en la diabetes tipo 2 muestran resultados contradictorios. Ello sea debido probablemente a que la masa de clulas vara a lo largo de la historia natural de la enfermedad. Una evidencia clara del papel de la muerte celular en estados tardos de diabetes tipo 2 proviene de estudios realizados en modelos animales de diabetes tipo 2 como el roedor Psammomys obesus, que desarrolla la enfermedad durante el cautiverio y cuando es alimentado con una dieta rica en energa. Entonces, la enfermedad se inicia con hiperinsulinemia/normoglucemia y resistencia a la insulina y evoluciona a hiperglucemia y muerte de la clula . Una situacin parecida podra tener lugar en personas en las que la evolucin de su diabetes conduce a un estado en el que se necesita la administracin de insulina para controlar la glucemia. La evidencia experimental sugiere que la hiperglucemia y otros factores como una concentracin elevada de cidos grasos libres estn implicados en el proceso de muerte celular apopttica de la clula pancretica en estos casos de Diabetes tipo 2 insulinodependiente. La apoptosis es un proceso de muerte celular regulada que participa en el modelamiento del organismo durante el desarrollo embrionario y en el control de las poblaciones celulares en la vida adulta. Tanto el exceso de muerte apopttica como su defecto estn actualmente implicados en el desarrollo de numerosas enfermedades. Esta va de muerte programada est regulada de una manera compleja y bsicamente consiste en su control por seales

extracelulares de muerte que ponen en marcha un proceso autodestructivo en el que la mitocondria actuara como arsenal que libera factores apoptognicos que inician un proceso de destruccin de protenas claves para la supervivencia celular y del ADN. Estas seales extracelulares de muerte pueden ser protenas producidas por otras clulas que este caso actuaran como inductoras de muerte, pero tambin pueden ser molculas pequeas que pueden llegar a ser txicas para clulas con defensas disminuidas incluso factores ambientales como radiaciones, o sustancias presentes en los alimentos. Es importante resaltar que la muerte celular por apoptosis es consecuencia de una accin predominante de factores denominados pro-apoptticos y que las clulas tienen mecanismos de defensa que contrarrestan buena parte de las seales exgenas de muerte que est recibiendo. Por ello, el destino final de la clula resulta de la capacidad que tienen sus sistemas de defensa para contrarrestar el ataque. Dada la complejidad del proceso de muerte celular por apoptosis y de su regulacin, los estudios experimentales realizados en modelos animales y celulares de diabetes tipo 1 y 2 muestran un escenario diverso. Los estudios realizados con tejido pancretico pacientes diabticos fallecidos por otras causas, han sido poco reveladores ya que dado el carcter progresivo de este proceso destructivo, slo en algunos casos se ha encontrado evidencia clara que muestre un proceso apopttico activo, ya que sta es una muerte limpia, que no suele dejar huellas. Por todo ello, los modelos animales y celulares de diabetes tipo 1 fundamentalmente han sido muy tiles para perfilar el proceso apoptico en la clula . La naturaleza de los antgenos celulares, su mecanismo de presentacin al sistema inmune y la reaccin anmala de este sistema que subyacen a todo el proceso son expuestos en otro captulo de esta monografa. En lo que se refiere a los mecanismos de destruccin celular propiamente dichos, las citoquinas solubles del tipo interleuquina 1, interfern y factor de

necrosis tumoral alfa tienen una accin apopttica marcada sobre clulas y podran por tanto estar implicados en el proceso destructivo en la diabetes. Buena parte de las acciones deletreas de la interleuquina 1 dependen de la produccin de xido ntrico en el interior de la clula. Esta molcula tiene diversas acciones dependiendo de su concentracin en el interior de la clula y de su combinacin con otras molculas generadas en situaciones de estrs oxidativo. La interleuquina-1 induce la expresin de una forma muy activa de la enzima que cataliza la generacin de xido ntrico a partir del aminocido arginina la isoforma 2 de la sintasa del xido ntrico (NOS2). En estas condiciones, la produccin de altas concentraciones de xido ntrico desborda los mecanismos de neutralizacin que por otra parte son poco eficaces en la clula y por tanto se pone en marcha el proceso de destruccin celular por apoptosis.
Regulaci Regulacin de la Apoptosis en la C Clula
La generaci generacin de xido N Ntrico (NO) es una etapa clave en la puesta en marcha de la apoptosis
Citoquinas Inflamatorias

NOS2

Apoptosis

NOS 2 Arginina +2 NADPH +2 O2 Citrulina + NO + 2H2O NOS 1 / 3)

Acciones Fisiol Fisiolgicas

Hormonas, NT

El estrs oxidativo inducido por el xido ntrico conduce a una peroxidacin lipdica con generacin de productos derivados de la peroxidacin avanzada que inducen una alteracin oxidativa importante de protenas mitocondriales implicadas en la apoptosis. La mitocondria es un almacn de molculas

proapoptticas y alteraciones incluso transitorias de su permeabilidad conducen a la salida de factores como el citocromo c y otras molculas bien caracterizadas. El citocromo c as liberado en el citoplasma participa en la activacin de proteasas que degradarn sustratos proteicos especficos. Otros factores mitocondriales como el Factor Inductor de Apoptosis (AIF) y SMAC/DIABLO estimulan procesos apoptticos en el ncleo (fragmentacin del ADN en escalera) neutralizan inhibidores naturales de la apoptosis cuya funcin es la de bloquear activaciones espontneas de la cascada apopttica. Pues bien, la salida de factores apoptognicos est controlada por cambios transitorios en su permeabilidad inica. La estructura reponsable del trasiego de iones y agua y que est implicada en el proceso apopttico, es un complejo multiproteico denominado poro PT. Un componente clave de este poro PT es la protena transportadora de nucletidos de adenina (ANT). Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran que esta protena es una diana del dao oxidativo inducido por el xido ntrico; otra protena implicada en el control de la apoptosis es Bcl-2, que desempea mltiples funciones como las de formar dmeros y neutralizar las acciones proapoptticas de otras protenas de su familia, o actuar como antioxidante eficaz. Esta protena est incrustada en las membranas de organelas subcelulares como mitocondria y ncleo. Nuestro grupo ha observado que la degradacin de esta protena es un acontecimiento inicial en el proceso apopttico iniciado por el oxido ntrico en las clulas secretoras de insulina y degradacin. que su carbonilacin es un marcador para su Estos hallazgos proceden de estudios con inhibidores de la

carbonilacin, en los que se aprecia una inhibicin de la degradacin de la protena Bcl-2, as como un bloqueo de las acciones apoptticas del xido ntrico. Datos recientes sugieren que el proceso de apoptosis en clulas es dependiente de una sobreregulacin y subregulacin transcripcional paralela y/o secuencial de un considerable numero de genes Pero el xido ntrico desempea otras funciones relevantes para la fisiologa de la

clula . Cuando se produce en cantidades moderadas, juega un papel regulador de la respuesta secretora de esta clula. Adems, es un potente factor contra la apoptosis producida por la ausencia de factores trficos. Nuestro grupo ha descrito que la produccin de bajas concentraciones de NO -bien generado exgenamente o bien generado dentro de la clula por activacin de las isoformas constitutivas (NOS1 y NOS3)- protegen de la apoptosis. Esta accin protectora del NO depende de la activacin de la c-Src tirosina quinasa y del sistema de la sGC/PKG. Por ltimo, hemos descrito que la activacin de c-Src es un evento temprano en la sealizacin antiapopttica que conduce a la activacin del sistema PI3K/Akt/Bad. Nuestro grupo ha descrito tambin la implicacin de las protenas sustrato del receptor de la insulina (IRSs) en la sealizacin protectora del NO en la clula . En dicha respuesta protectora participa la fosforilacin de IRS-1, que tambin es dependiente de la activacin de c-Src. Se han descrito dianas adicionales del NO en otros sistemas celulares. As, la va Ras/Raf1/ Elk-1 se activa en linfocitos T en presencia de NO, lo que sugiere que este mensajero gaseoso puede participar en la regulacin de una importante ruta sealizadora de proliferacin. Por otro lado, se ha descrito en clulas endoteliales que la respuesta antiapopttica iniciada por factores de crecimiento est ligada a la activacin de Raf-1. Esta activacin de Raf-1 desencadenada por el factor de crecimiento vascular (VEGF) est asociada a la fosforilacin de sus residuos de tirosina 340 y 341 en un proceso dependiente de c-Src . Dado que el cultivo en ausencia de suero conduce a la muerte por apoptosis de la clula , es razonable proponer que la supervivencia y el crecimiento de la clula est modulado por factores trficos extracelulares. Se haba descrito previamente que el IGF-1 era capaz de bloquear la respuesta apopttica inducida por citoquinas inflamatorias en la clula . Por este motivo, nuestro grupo inici una serie de experimentos encaminados a estudiar el papel del NO en la sealizacin del sistema IGF-1/insulina. Nuestros resultados muestran que la

retirada de suero provoca la apoptosis celular que se acompaa de un descenso en los niveles de la protena eNOS/NOS3 y de la produccin de NO. Estos efectos se cancelan sustancialmente tras la exposicin de las clulas a insulina IGF-1. Adems, los efectos protectores de la insulina/IGF-1 se cancelan en buena proporcin con inhibidores de la NOS. La sealizacin por protenas IRS est involucrada en las acciones antiapotticas de estos factores y la activacin por fosforilacin de estas protenas es un proceso parcialmente dependiente de la activacin de Src y del NO. El perfil de protenas IRS de las clulas RIN muestra que ambas IRS-1 y 2 pueden estar involucradas en la transmisin de la seal antiapopttica . Queda por determinar el papel de las diferentes IRS en clulas diferenciadas murinas y humanas. Por una parte, se ha descrito que la protena IRS-2 juega un papel relevante en el control de la masa de clulas durante el desarrollo del pncreas en ratones . Por otro lado, los hallazgos de que la variante polimrfica Arg972 IRS-1 que es abundante en diabticos tipo 2 causa apoptosis en islotes humanos in vitro, indican que esta IRS puede jugar un papel relevante en humanos. En este sentido, tambin son relevantes los estudios con una insulina modificada [LysB3, GluB29], que posee una accin protectora sobre la clula asociada con una unin ms fuerte al receptor .

La figura resume la red de acciones antiapotticas del NO que hemos descrito

en la clula pancretica. Los procesos de apoptosis/supervivencia transcripcin de un cierto nmero de genes. En este contexto, parece razonable plantear la hiptesis de que la expresin de un conjunto de genes el contrario, disminuida. La funcin clsica de la acetilacin de las histonas es la de permitir la descompactacin de la cromatina como paso previo a la expresin de genes. Se ha mostrado recientemente que las histonas acetilasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC) actan como coactivadores y correpresores respectivamente en la expresin y silenciamiento gnico y que tambin juegan un papel importante en la acetilacin de factores de transcripcinn. As, la acetilacin de los grupos -amino de residuos especficos de lisina de las antiapoptticos estara incrementada en respuesta a seales de supervivencia celular; la expresin de genes proapotticos estara, por celular implican, adems de la modificacin de la activacin de vas de sealizacin intracelulares, la

histonas H3 y H4 estn asociados con su neutralizacin y con la exposicin de zonas promotoras de genes y el inicio de su transcripcin. El reclutamiento de HAT a genes especficos depende de la interaccin de factores de transcripcin con sus secuencias especficas en las zonas potenciadoras (enhancers). Si bien quedan por definir los factores que permiten la unin de estos factores a sus enhancers, la acetilacin de histonas forma parte de los procesos biolgicos implicados en la regulacin de la expresin de genes. Su relevancia biolgica queda reflejada en el hecho de que el patrn de acetilacin de las histonas est alterado en lneas tumorales y en cnceres en humanos. Por ltimo, frmacos inhibidores de las HDAC estn siendo evaluados en ensayos clnicos para el tratamiento del cncer. De hecho, hay una acetilacin incrementada de las histonas H3 y H4 en clulas cultivadas en medio carente de suero. Adems, la accin protectora del NO se asocia con un descenso la acetilacin de ambas histonas. Por otra parte, nuestro grupo ha encontrado que el incremento en la acetilacin de histonas provocado por la Tricostatina A (inhibidor de las HDACs) est asociado con la puesta marcha del programa apopttico en la clula pancretica y con la expresin incrementada de protenas proapoptticas. La regulacin epigentica de la expresin de genes involucrados en la supervivencia y muerte de la clula est siendo objeto de una creciente atencin por varios grupos de investigacin. Si bien queda por establecer el papel de la acetilacin de protenas histonas y no histonas en la sealizacin protectora de Insulina/IGF-1 en clulas secretoras de insulina, tiene relevancia el hallazgo de que el programa de supervivencia en el gusano C. Elegans dependiente la insulina/IGF-1 implica a una protena desacetilasa dependiente de NAD (Sir-2). La posible implicacin de las HATs/HDACs en el control de la expresin de diabetogenes durante la patognesis de la diabetes ha sido propuesta recientemente en una extensa revisin sobre el tema as como la

posible utilidad como diana terapetica en el tratamiento farmacolgico de la diabetes.

Papel de la Desacetilacin de Histonas en la Expresin de Genes de Supervivencia en la Clula
Insulina/IGF-1 Tricostatina A Desacetilacin Factores de transcripcin Regulacin de la expresin gnica

NO
PI3K / Akt PKG p-Bad

Supervivencia

Ya que el NO juega un papel relevante en la regulacin de la supervivencia y muerte de la clula pancretica, entendemos que puede formar parte de la sealizacin protectora desencadenada por factores del tipo de la insulina, el IGF-1, el GLP-1, y de su agonista la exendina, etc. Esta hiptesis se apoya adems en la accin estimuladora de la insulina sobre la produccin de NO en clulas endoteliales. El islote de Langerhans es una estructura muy vascularizada y el flujo sanguneo est controlado por nutrientes como la glucosa y por factores trficos. Es posible que el NO generado localmente por las clulas endoteliales ejerza efectos trficos sobre las clulas endocrinas del islote. Alternativamente, la especificidad de las acciones trficas del NO sobre la clula pancretica dependera de la sntesis de este mediador gaseoso en la propia clula en un proceso desencadenado por la interaccin de factores trficos con sus receptores especficos. Dado que la clula del pncreas tiene receptores para la insulina y responde al IGF-1, as como a incretinas como GLP-1 y al propio glucagn, es factible que alguno de estos factores participe en

la regulacin de la produccin endgena

de NO. Resulta especialmente

atractiva la idea de que la insulina tenga alguna accin sobre la propia clula que la produce. El posible papel autocrino de la insulina ha sido estudiado a lo largo de los aos con resultados conflictivos. La evidencia experimental indica que la insulina no regula de manera determinante su secrecin. Sin embargo, la anulacin del gen para la protena sustrato para el receptor de la insulina IRS-2 en este tipo celular conlleva a un desarrollo defectuoso del pncreas endocrino y a la diabetes en ratones. Este hallazgo muestra que esta va de sealizacin intracelular juega un papel relevante durante la organognesis del pncreas y que su puesta en marcha por factores como el IGF-1 pudiera ser relevante durante el perodo del desarrollo embrionario y fetal. Esta va de sealizacin pudiera jugar tambin un papel en la vida adulta, interviniendo en el control de la regeneracin de la masa celular y en la generacin de factores de supervivencia antiapoptticos que permiten al pncreas modular su masa en respuesta a demandas sostenidas del organismo y hacer frente a situaciones de ameneza como el estrs metablico/ oxidativo y el ataque de la inmunidad adquirida/natural. Un fallo en este sistema de proteccin pudiera estar involucrado en la gnesis de ambas formas de diabetes, bien por condicionamientos genticos, bien por su capacidad limitada para hacer frente a estmulos lesivos o bien por una disfuncin provocada por el propio proceso que destruye a la clula . En este sentido, es interesante pensar que las citoquinas inflamatorias bloqueen la sealizacin a travs de esta ruta de supervivencia en la patognesis de ambas formas de diabetes en humanos. Bibliografa
1. Mabley JG, Belin V, John N, Green IC. Insulin-Like Growth factor I reverses interleukin1 inhibition of insulin secretion, induction of nitric oxide synthase and cytokinemediated apoptosis in rat islet of Langerhans. FEBS Letters; 1997, 417:235-238 2. Kuboki K, Jiang ZY, Takahara N , Ha SW, Igarashi M Yamauchi T, Feener EP, Herbert TP, Rhodes CJ, King GL. Regulation of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene expression in endothelial cells and in vivo: a specific vascular action of insulin Circulation. 2000; 101: 676681

3. Federici M, Hribal ML, Ranalli M, Marselli L, Porzio O, Lauor D, Borboni P, Lauro R, Marchetti P, Melino G, Sesti G: The common Arg 972 polymorphism in insulin receptor substrate-1 causes apoptosis of human pancreatic islets. FASEB J. 2000; 15:22-24 4. Burks DJ, White MF. IRS proteins and beta-cell function. Diabetes 2001;50 Suppl 1:S140-5 5. Rakatzi I, Seipke G, Eckel J: [LysB3, GluB29] insulin: a novel insulin analog with enhanced -cell protective action. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310: 852-859 6. Tejedo JR, Cahuana GM, Ramrez R Esbert M, Jimnez J, Sobrino F, Bedoya FJ. Nitric Oxide Triggers the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Survival Pathway in InsulinProducing RINm5F cells by arousing Src to activate Insulin Receptor Substrate 1. Endocrinology 2004; 145: 2319-2327 7. Brubaker PL, Drucker DL. Minireview. Glucagon-like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas, gut, and the central nervous system. Endocrinology 2004; 145: 2653-2659 8. Dickson LM, Rhodes, CJ. Pancreatic -cell growth and survival in the onset of type 2 diabetes: a role for protein kinase B in the Akt? Am J Physiol Endocrinol Metab 2004; 287: E192E198 9. Katic M, Kahn C R. The role of insulin and IGF-1 signaling in longevity Cell. Mol. Life Sci. 2005; 62 : 320343 10. Gray SG, De Meyts, P. Role of histone and transcription factor acetylation in diabetes pathogenesis. Diabetes Metab Res Rev 2005; 21: 416433 11. Porcu M, Chiarugi, M. The emerging therapeutic potential of sirtuin-interacting drugs: from cell death to lifespan extension TIPS. 2005; 26: 94-103