Separacin de organelos

En la dcada de 1950 y 1960, los cientficos usaron dos tcnicas para estudiar los organelo celulares: microscopa y fraccionamiento. Christian de Duve estaba a la vanguardia del fraccionamiento celular. A principios de 1950, l us la centrifugacin para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, de fracciones previamente caracterizadas: el ncleo, la fraccin mitocondrial y los microsomas. Luego de eso, utiliz el equilibrio de densidad de la centrifugacin para descubrir otro organelo.

Trasfondo
Las clulas eucariontes son altamente organizadas y compuesta por estructuras celulares conocidas como organelos que realizan funciones especficas. Mientras que la microscopa ha permitido a los bilogos describir la localizacin y apariencia de varios organelos, esto es de uso limitado en el descubrimiento de la funcin de los organelos. Para hacer esto, los bilogos celulares han confiado en una tcnica conocida como fraccionamiento celular. Aqu, las clulas se abren, y los componentes celulares son separados en base a tamao, masa y densidad usando variadas tcnicas de centrifugacin. Los cientficos pudieron entonces aislar y analizar los componentes celulares de diferentes densidades, llamados fracciones. Usando este mtodo, los bilogos dividieron la clula en cuatro fracciones: ncleo, fraccin mitocondrial, microcosmos, y savia de la clula. De Duve fue un bioqumico interesado en las localizaciones subcelulares de enzimas metablicas. l ya haba terminado un gran trabajo sobre el fraccionamiento de las clulas del hgado, en el cual determin la localizacin subcelular de numerosas enzimas. Localizando estas enzimas en fracciones celulares especficas, pudo notar que su trabajo fue guiado por dos hiptesis: el postulado de homogeneidad bioqumica y el postulado de la nica localizacin. En fin, estas hiptesis propusieron que la composicin de la poblacin subcelular contendran las mismas enzimas, y cada enzima est localizada en un sitio discreto junto a la clula. Armado con estas hiptesis y la poderosa herramienta de centrifugacin, de Duve luego subdividi la fraccin mitocondrial. Primero, identific la fraccin mitocondrial liviana, que est hecha de enzimas hidrolticas que ahora se sabe que componen el lisosoma. Luego, en una serie de experimentos descritos aqu, identific otra fraccin celular discreta, llamada peroxisoma, junto a la fraccin mitocondrial.

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El experimento
De Duve estudi la distribucin de las enzimas en clulas de hgado de rata. Altamente activo en energa metablica, el hgado contiene un nmero til de enzimas para estudiar. Para ver la presencia de varias enzimas durante el fraccionamiento, confi en conocidas pruebas, llamadas anlisis de enzima, para actividad enzimtica. Para conservar la mxima actividad enzimtica, tuvo que tomar precauciones, las cuales incluyen la ejecucin de todos los pasos a 0C porque el calor denatura las protenas que podran estar comprometidas en la actividad enzimtica. De Duve us la centrifugacin tasa-zonal para separar los componentes celulares por paso de centrifugacin sucesivos. Removi el hgado de rata y lo separ por homogenizacin. La preparacin cruda de clulas homogenizadas fue entonces sujetada a la centrifugacin de relativamente poca velocidad. Este paso inicial separ el ncleo celular, el cual se recoge como sedimento en la parte superior del tubo, desde el extracto citoplasmtico que sigue habiendo en el sobrenadante. Luego, de Duve subdividi el extracto de citoplasma en fraccin mitocondrial pesada, fraccin mitocondrial liviana y fraccin microsomal. Separ el citoplasma empleando pasos sucesivos de centrifugacin aumentando la fuerza. A cada paso, l recolect y almacen las fracciones por anlisis enzimtico subsecuente. Una vez el fraccionamiento fue completado, de Duve realiz ensayos enzimticos para determinar la distribucin subcelular de cada enzima. Luego traz grficamente la distribucin de la enzima a travs de la clula. Como se demostr previamente, la actividad de oxidasis del citocromo, una importante enzima en el sistema de transferencia de
electrones, fue encontrada por sobretodo en las fracciones mitocondriales pesadas. La fraccin microsomal demostr contener otra enzima previamente caracterizada glucosa-6-fosfatasa. La fraccin mitocondrial liviana, la cual est hecha por el lisosoma, demostr la actividad cida caracterstica de la fosfatasa. Inesperadamente, de Duve observ un cuarto patrn cuando prob la actividad de la uricasa. Algo que siguiendo el patrn de referencia de las enzimas, la actividad de la uricasa fue agudamente concentrada dentro de la fraccin mitocondrial liviana. Eta concentracin aguda, en contraste con la amplia distribucin, sugiri a de Duve que la uricasa pudo ser recluida en otra poblacin subcelular separada de las enzimas lisosomales. Para comprobar esta teora, de Duve emple una tcnica conocida como centrifugacin de la densidad-gradiente del equilibrio, la cual separa macromolculas en base a la densidad. La centrifugacin de densidad-gradiente del equilibrio puede ser realizada usando un nmero de diferentes gradientes incluyendo sucrosa y glicgeno. Adems, el gradiente puede ser compuesto en cualquier agua o agua dura que contiene isotopos deuterio de hidrgeno en lugar de hidrgeno. En este experimento, de Duve separ la fraccin mitocondrial preparada por centrifugacin tasa-zonal en cada una de estos diferentes gradientes (ver la figura 5.1). Si la uricasa era parte de un compartimento subcelular separado, podra separar las enzimas Javiera Muoz S.

lisosomales en cada gradiente probado. De Duve realiz el fraccionamiento en estas series de gradientes, luego realiz un ensayo enzimtico como anteriormente. En cada caso, encontr uricasa en una poblacin separada de la fosfatasa cida de la enzima lisosomal y la oxidasis enzima mitocondrial del citocromo (ver figura 5.2). Por observaciones repetidas de la actividad de la uricasa en una fraccin distinta de la actividad de la enzima lisosomal y enzima mitocondrial, de Duve concluy que la uricasa fue parte de un organelo separado. El experimento tambin demostr que otras dos enzimas, catalasa y D-aminocido oxidasa, se segregaron en las mismas fracciones que la uricasa. Porque cada una de estas enzimas produjo o utiliz el perxido de hidrgeno, de Duve propuso que esta fraccin representa un organelo responsable del metabolismo del perxido y doblado en el peroxisoma. FIGURA 5.1 esquema de la separacin de lisosomas, mitocondrias, y peroxisomas por centrifugacin de equilibriodensidad. La fraccin mitocondrial de centrifugacin tasa-zonal fue separada en un gradiente de sucrosa, y lo organelos son separado en base a la densidad. [De Lodish et al., 3ra edicin, pgina 166]

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FIGURA 5.2 Representacin grfica de los productos del anlisis de la enzima de un gradiente de sucrosa. La fraccin mitocondrial fue separada como se muestra en la figura 5.1, y luego el ensayo enzimtico fue realizado. La concentracin relativa de una enzima activa es trazada in el eje Y; la altura en el tubo es trazada en el eje X. El punto mximo de actividades de oxidasis del citocromo y cido fosfatasa son observados cerca de el borde del tubo. El punto mximo de la actividad de la uricasa migra hacia la parte inferior del tubo. [Adaptado de Beaufay et al., 1964, Biochem J. 92:191.]

Discusin
El trabajo de De Duve en el fraccionamiento celular proporcion una revelacin en la funcin de las estructuras celulares, pues l intent trazar la localizacin de las enzimas conocidas. El examen del inventario de enzimas en una fraccin determinada le dio pistas sobre su funcin. Su cuidadoso trabajo dio lugar al descubrimiento de dos organelos: el lisosoma y el peroxisoma. Su trabajo tambin proporcion importantes pitas sobre la funcin de los organelos. El lisosoma, donde de Duve encontr muchas enzimas potencialmente destructivas, es ahora conocido como un importante sitio para la degradacin de biomolculas. El peroxisoma se conoce como el itio de la oxidacin del cido grado y del aminocido, reacciones que producen una gran cantidad de perxido de hidrgeno. En 1974, de Duve recibi el Premio Nobel para la fisiologa y la medicina en reconocimiento a su trabajo pionero.

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