TCNICAS CITO-HISTOLGICAS Las clulas y tejidos son examinados por transparencia con casi todos los tipos de microscopio,

lo cual obliga a estudiar clulas o tejidos aplanados lo suficientemente delgados como para que puedan ser atravesados por la radiacin luminosa. Ello implica una serie de procedimientos que culminan con la obtencin de un corte transparente de tejido. Las tcnicas cito-histolgicas son todos los procedimientos desde la obtencin de la muestra hasta su transformacin en una preparacin adecuada para su estudio microscpico. Los mtodos convencionales para prepara muestras para el microscopio ptico comn son similares a las del microscopio electrnico de transmisin, diferencindose solo en el uso de reactivos y aparatos diferentes para realizar los cortes. La tcnica histolgica para obtener preparaciones ms comn es la siguiente: Obtencin de la muestra Para las muestras obtenidas a partir de un animal, este debe estar preferentemente vivo y anestesiado. Los fragmentos de muestra deben ser pequeos, no mayores a 5 mm de espesor. Se deben cortar con un instrumento muy afilado, como bistur o navaja, para evitar el desgarro de los tejidos. Luego de extrada, la muestra debe ser sumergida inmediatamente en fijador. Fijacin La fijacin es un mtodo que permite conservar la morfologa y composicin qumica de las clulas y los tejidos. Consiste en matar a las clulas para que mantengan la misma estructura que posean en vida y permitan analizarlas mediante microscopio. La fijacin se debe realizar inmediatamente despus de extraer las clulas o tejidos del organismo, para evitar el deterioro del material. Los fragmentos de tejido deben ser lo ms pequeo posible, para que el fijador penetre rpidamente. Debido a ello, una caractersticas que debe reunir un buen fijados es la velocidad de penetracin en las estructuras. La fijacin tiene adems la finalidad de endurecer los tejidos, volvindolos ms resistentes para las etapas siguientes de la tcnica histolgica. Los fijadores qumicos producen enlaces cruzados o desnaturalizacin de las protenas, al substituir el agua con la cual estn relacionados. La mayor parte de los fijadores adems inactivan las enzimas celulares. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos de post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.). 2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (cortes, coloracin, etc.). 5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella. 1

6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos. Mecanismo de accin de los fijadores Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: 1. coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor). 2. formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales) 3. reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). Tipos de Fijadores El fijador a utilizar depende del material que se desea analizar y las estructuras o clulas que se quieren estudiar. Sin embargo, a los fijadores se los puede agrupar en dos grandes categoras. Fijadores qumicos: son los ms utilizados. Existen dos tipos de fijadores qumicos, los simples y los compuestos. Simples: son los que estn constituidos por una sola sustancia qumica. a) Formol al 10%: es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos o patolgicos. b) Alcohol etlico absoluto o de 96%: se usa generalmente en microqumica. c) Alcohol metlico: se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.). d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%. Compuestos: se encuentran formados por un nmero variable de fijadores simples, que se eligen con la intencin de complementar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica. b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica. c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico. Fijadores Fsicos 1. 2. 3. 4. 5. Desecacin. Calor seco. Calor hmedo. Fro. Congelacin y desecacin. 2

Para el diagnstico histopatologico, lo ms utilizado es el formol. Para la observacin de cromosomas o ncleos celulares, generalmente se utiliza una mezcla de alcohol y cido actico (3:1). En el estudio de enzimas se pueden emplear la acetona, el glutaraldehido o el formaldehdo que se caracterizan por producir muy pocas modificaciones a los sistemas enzimticos. Para microscopa electrnica la fijacin se realiza casi siempre con glutaraldehido, cualquiera sea la clula o estructura que se quiera analizar, seguido por una refijacin con tetrxido de osmio. Deshidratacin Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos sin agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se utiliza una serie creciente de alcohol etlico. Inclusin Para poder obtener cortes finos de tejido es necesario que el tejido haya sido previamente endurecido, porque cuanto ms firme, ms delgado ser el corte histolgico. La tcnica mas empleada es la inclusin en parafina, que es una sustancia hidrfoba, slida a temperatura ambiente. Dado que el alcohol no es miscible en parafina, antes de incluir los tejidos es necesario tratarlos con benceno o tolueno. Para la inclusin en parafina se emplean moldes de papel o de metal. En los moldes se coloca la muestra de tejido y luego se vierte la parafina a 60C. A los 1530 minutos la parafina se solidifica completamente. Se recortan los bloques en forma de pirmide cuadrangular, se adhieren los bloques a un taquito de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y luego ya se pueden realizar los cortes. Para las preparaciones de microscopio electrnico se utiliza siempre resinas de epoxi, que poseen una gran dureza, por lo cual deben ser cortados mediante las cuchillas de diamante o vidrio del ultramicrtomo. Cortes histolgicos Para poder observar los tejidos en el MO, se deben obtener lminas delgadas para que la luz atraviese el material. En casi todos los casos el elemento utilizado para hacer los cortes es el micrtomo. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones. Los cortes de parafina se extienden en agua tibia, dentro de la cual se introduce el portaobjetos cubierto con una capa de adhesivo. Con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta. En algunas ocasiones se realiza el congelamiento del material (sin fijacin ni inclusin) y se realizan los cortes en un micrtomo de congelacin. En este caso se emplean micrtomos refrigerados con CO2 lquido y se realizan cortes de no muy 3

buena calidad. Sin embargo son empleados en la realizacin de biopsias para obtener un rpido diagnstico. Coloracin La coloracin se realiza para dos propsitos diferentes. El primero para obtener contraste en el MO y poder realizar observaciones morfolgicas o estructurales. En el otro caso se utilizan colorantes para identificar sustancias o molculas especficas. En este caso se habla de tcnicas citoqumicas o histoqumicas. Segn su origen se clasifican en: Colorantes Naturales - Animales (carmn) - Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn) Colorantes Artificiales o Sintticos - cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos. - Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata). Montaje Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo. La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaracin se realiza con xilol o con alcohol, dependiendo del tipo de medio de montaje que se utilice. Lo ms comn es efectuar la aclaracin con xilol y luego montar la preparacin en Blsamo de Canad. Tambin es frecuente la aclaracin en alcohol absoluto y el montaje en Euparal. Los medios de montaje permiten conservar las estructuras durante muchos aos y presentan un ndice de refraccin semejante al del vidrio.