Multiplex Real-Time PCR Method for Detection and Quantification of Mycotoxigenic Fungi Belonging to Three Different Genera Multiplex

Real-Time PCR mtodo para la deteccin y cuantificacin de hongos micotoxignicos pertenecientes a tres gneros diferentes
Anuradha Vegi, Charlene E. Wolf-Hall

Journal of Food Science Volume 78, Issue 1, pages M70M76, January 2013 Abstract Cereal crop plants are colonized by many fungal species such as Aspergillus ochraceus and Penicillium verrucosum, which produce ochratoxins, and Fusarium graminearum, which produces trichothecene mycotoxins. A multiplex real-time PCR method using TaqMan probes was developed to simultaneously detect and quantify these mycotoxigenic Fusarium, Penicillium and Aspergillus species in cereal grains. Primers and probes used in this method were designed targeting the trichothecene synthase ( Tri5) gene in trichotheceneproducing Fusarium, rRNA gene in Penicillium verrucosum, and polyketide synthase gene (Pks) in Aspergillus ochraceus.The method was highly specific in detecting fungal species containing these genes and was sensitive, detecting up to 3 pg of genomic DNA. These PCR products were detectable over five orders of magnitude (3 pg to 30 ng of genomic DNA). The method was validated by evaluating sixteen barley culture samples for the presence of deoxynivalenol (DON) and ochratoxin A (OTA) producing fungi. Among the barley culture samples tested, 9 were positive for Fusarium spp, 5 tested positive for Penicillium spp, and 2 tested positive for Aspergillusspp. Results were confirmed by traditional microbiological methods. These results indicate that DON- and OTA-producing fungi can be detected and quantified in a single reaction tube using this multiplex real-time PCR method.

Resumen Cultivos de cereales son colonizados por numerosas especies de hongos como Aspergillus ochraceus y Penicillium verrucosum, que producen ocratoxinas y Fusarium graminearum, que produce micotoxinas tricotecenos. Un mtodo de PCR multiplex en tiempo real utilizando sondas TaqMan fue desarrollado para detectar y cuantificar simultneamente estos micotoxignicos Fusarium, Penicillium y especies de Aspergillus en los granos de cereales. Primers y sondas utilizadas en este mtodo fueron diseados dirigidas a la sintasa tricotecenos (Tri5) de genes en Fusarium tricoteceno productora, rRNA genes en Penicillium verrucosum y gen de la sintasa polictido (Pks) en el mtodo ochraceus.The Aspergillus fue muy especfico en la deteccin de especies de hongos que contienen estos genes y fue sensible, detectando hasta 3 pg de ADN genmico. Estos productos de PCR fueron detectables ms de cinco rdenes de magnitud (3 pg a 30 ng de ADN genmico). El mtodo fue validado mediante la evaluacin de muestras de cultivo de cebada diecisis de la presencia de deoxinivalenol (DON) y ocratoxina A (OTA) los hongos productores. Entre las muestras de cultivo de cebada han sido evaluados, 9 fueron positivos para Fusarium spp, 5 resultaron positivos para Penicillium spp, y 2 resultaron positivos a Aspergillusspp. Los resultados fueron confirmados por mtodos microbiolgicos tradicionales. Estos resultados indican que el DON-y hongos productores de OTA pueden ser detectados y cuantificados en un nico tubo de reaccin utilizando este mtodo de PCR multiplex en tiempo real.