Guía de Estudio para Trabajos Prácticos de Parasitología y Micología

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA
LICENCIATURA EN BIOQUMICA
GUA DE ESTUDIO PARA TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA AO 2011
Serie Didctica de la Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia Diseador: Julio Carlos RIVADA
Comit Editor Coordinadora: Liliana BOZZOLO Editores (Departamento de Bioqumica y Ciencias Biolgicas) Mirta CARRASCO Andrea ARCUCCI
Revisin Editorial: Nidia GOMEZ Nora ESCUDERO
Revisin Disciplinar: Alba Vega Ana Cecilia Anzulovich Ethel Larregle Myriam Forneris
1 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011
EXAMEN PARASITOLOGICO DE MATERIA FECAL Trabajo Prctico de laboratorio N 1
Diagnostico de parasitosis intestinales
OBJETIVOS DEL TRABAJO PRCTICO: Al finalizar el trabajo prctico el alumno estar en condiciones de: Realizar correctamente la toma de muestra para lograr un adecuado diagnstico parasitolgico. Conocer las diferentes soluciones conservadoras-fijadoras y su utilidad. Aplicar las principales tcnicas de laboratorio para el diagnstico de parasitosis intestinales. Manejar adecuadamente el microscopio para realizar una correcta observacin de las muestras. Aplicar las medidas de bioseguridad en la manipulacin de materiales infecciosos.
INTRODUCCIN TERICA Las parasitosis intestinales se pueden clasificar teniendo en cuenta que tipo de organismo les da origen. Pueden estar originadas por PROTOZOOS (amebiasis, giardiosis, etc.) o por HELMINTOS (Oxyuriosis, ascariosis, etc.). De acuerdo a esto es que existen actualmente distintas tcnicas para realizar un diagnstico certero y saber cul es el parsito responsable del cuadro que posee el paciente. Para realizar un buen diagnstico los procedimientos y tcnicas de laboratorio utilizadas deben abarcar la deteccin de posibles infecciones mixtas por helmintos y protozoarios. Toma de muestra Para la realizacin del estudio de las parasitosis intestinales se deben recolectar heces para el examen macroscpico y microscpico. El recipiente debe ser de boca ancha, no necesariamente estril y con tapa que cierre hermticamente para evitar el derrame de la muestra. Tipos de Muestra La muestra puede ser FRESCA o encontrarse en SOLUCIONES CONSERVADORAS. Si es FRESCA deber observarse, si se trata de heces diarreicas, dentro de los 30 min., si son heces cremosas dentro de la hora y si son formes dentro de las 24 hs.
Para la visualizacin de trofozotos el material debe ser examinado en forma inmediata ya que pueden destruirse o deformarse; no sucede lo mismo con quistes y huevos ya que estos se conservan intactos y pueden visualizarse das u horas despus de su recoleccin. Soluciones conservadoras Para la preservacin de las muestras que no van a ser procesadas de forma inmediata las soluciones conservadoras-fijadoras que pueden utilizarse son: Formalina: (formol al 5% para heces compactas, al 10% para heces pastosas y al 15% para heces lquidas) Preserva la morfologa de quistes, huevos y larvas. PVA (alcohol polivinilico): fija trofozotos, quistes y es este el mejor sustrato para la aplicacin de la coloracin tricrmica de Wheatley para identificacin y tipificacin de amebas. SAF (solucin actica formolada): fija trofozotos, quistes, huevos y larvas. En preparados hmedos se observa con buenos detalles la cromatina de trofozotos de amebas. MIF (merthiolate, iodo, formol) tiene la ventaja de no solo fijar como el anterior, sino que tie simultneamente grandes cantidades de heces en una dilucin 1/3 (una parte de heces/dos partes de conservante). PAF (fenol, alcohol, formol) La sugerencia es recolectar la muestra ya sea nica o seriada en soluciones fijadoras que conserven la morfologa de todas las estructuras parasitarias incluidos los trofozotos. Actualmente el ms usado es la formalina. Frecuencia de la Recoleccin: Muestra nica: fresca o preservada (generalmente en pacientes hospitalizados). Muestra seriada: El paciente debe recoger aproximadamente media cucharada de heces lquidas o una cantidad del tamao de un grano de uva de heces formes de cada deposicin obtenida en forma espontnea, durante 6-7 das, mezclndola bien con la solucin conservadora. Una ventaja de esta tcnica de recoleccin seriada es que facilita el diagnstico por ser la muestra ms representativa y evita las fases negativas de las parasitosis. (Las fases negativas son los perodos en los que el parsito no es eliminado por la materia fecal del hospedador) Se debe evitar tomar la muestra del inodoro para no contaminar con orina u otras formas parasitarias, Se interrogar al paciente si est tomando alguna medicacin (bismuto, antidiarreicos no absorbibles, aceites minerales) o si ha ingerido alguna sustancia para la realizacin de radiografas como sulfato de bario ya que stas interfieren en la deteccin de protozoos intestinales.
Recordar que un buen diagnstico de laboratorio comienza con una buena muestra y una buena muestra comienza con una buena explicacin y una buena explicacin termina cuando nos hemos asegurado que el paciente nos comprendi. 1. Diagnstico de protozoos intestinales El diagnstico de protozoarios intestinales plantea mayores dificultades que el de helmintos intestinales ya que se trata de elementos ms pequeos que pueden pasar inadvertidos ante ojos menos entrenados. Sabemos que existen dos tipos de estados que presentan diferencias: Trofozotos: formas vegetativas frgiles y suelen ser eliminados en heces diarreicas. Identificacin en heces frescas y observacin inmediata. Quistes: formas de resistencia y constituyen el estado infectante. Su reconocimiento es ms difcil y se conservan bien en cualquier solucin preservadora.
TCNICA DE LABORATORIO Examen directo: gota de material entre porta y cubre, observacin directa con o sin contraste. Mtodos de enriquecimiento: Se utilizan para la recuperacin de quistes de protozoarios que pueden estar en nmero escaso y no observarse en el examen directo. Se trata entonces de reunir estos en un volumen menor, facilitando de esta manera su hallazgo. Existen tres clases: Sedimentacin Flotacin Flotacin Centrifugacin
SEDIMENTACIN
Simple: mtodo lento que concentra poco. Sedimentacin por centrifugacin: til para aumentar la concentracin de quistes de protozoarios. De estos mtodos realizaremos en el laboratorio el de CARLES BARTHELEMY, que utiliza para diluir las heces una solucin isotnica formolada (solucin A), con el objeto de fijar y preservar los elementos parasitarios; luego de una centrifugacin se recupera el sedimento y se lo trata con una solucin ctrica formolada (solucin B) de densidad 1,047 para que los quistes de protozoarios y si existieran huevos de helmintos que poseen una densidad de 1,050-1,150, se vayan al fondo del tubo, separndose de otros componentes.
La tcnica tambin agrega unos mililitros de ter que se utiliza para extraer (solubilizar) grasas y restos fecaloides y vegetales que posee la muestra. Como son muy livianos se ubican en la superficie y forman un tapn luego de la centrifugacin el cual se desecha. Existen otros mtodos que utilizan otras soluciones como son: Mtodo de TELEMANN- modificado que utiliza solucin de formol-sal (densidad 1,010). Mtodo de RICHTIE que tambin utiliza una solucin con una densidad de 1,010.
FLOTACIN
Estas tcnicas utilizan un medio lquido de suspensin ms pesados que los quistes y larvas, de esta manera los quistes de protozoarios y huevos de helmintos si existieran suben a la superficie y pueden ser recogidos para su posterior visualizacin. Las soluciones utilizadas tienen una densidad que vara entre 1,180 a 1,210; teniendo en cuenta siempre que los quistes y huevos tiene una densidad de 1,050 1,150. Principalmente se emplean soluciones de azcar, ClNa, Cloruro de Calcio y Sulfato de Cinc. FLOTACIN CENTRIFUGACIN
Similar al de flotacin ya mencionado, tiene la ventaja de abreviar el tiempo de flotacin con la centrifugacin.
Mtodo de Faust: Emplea una solucin de Sulfato de Cinc al 33% que posee una densidad de 1,180 y una baja presin osmtica. Una alcuota de la muestra en primer trmino se suspende en agua, se cuela a travs de una gasa, se recoge en un tubo y se centrifuga desechando el sobrenadante y volviendo a agregar agua hasta que el lquido salga claro. Luego es tratada con el lquido de flotacin, se mezcla bien y nuevamente se centrifuga; la pelcula superficial se recoge con un ansa bacteriolgica y se observa entre porta y cubre con o sin lugol. Los quistes de protozoarios se detectan sin deformaciones, en cambio los trofozotos son destruidos. Los grandes huevos de trematodes, algunos huevos de tenia y huevos de scaris lumbricoides infrtiles no se concentran por este mtodo; para detectar estas infecciones, se recomienda emplear una tcnica de sedimentacin. El xito depende fundamentalmente de la densidad del sulfato de cinc y de la pronta observacin de las muestras, ya que el contacto prolongado con el sulfato de cinc deforma las formas
parasitarias y por otro lado si no se procede a la inmediata observacin del concentrado los parsitos sedimentan nuevamente.
2. Diagnstico de Helmintiasis intestinales En la helmintiasis intestinal, el EXAMEN MACROSCPICO tiene gran importancia, ya que podemos observar a simple vista parsitos o restos de ellos: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, segmentos de tenias, etc. Para recoger los parsitos hallados macroscpicamente se deslen las materias fecales en solucin fisiolgica dentro de un recipiente de tamao adecuado, se dejan sedimentar durante un rato y se vuelca el sobrenadante que tiene en suspensin elementos ms ligeros. Esta operacin se realiza varias veces hasta que el lquido salga claro. As podremos reunir todos los parsitos que han sido eliminados. Como seguramente estn sucios, se los limpia colocndolos en pequeos tubos llenos hasta la tercera parte con solucin fisiolgica, que se tapan y agitan vigorosamente. En la prctica clnica, para la realizacin de un EXAMEN MICROSCPICO la investigacin de helmintos la podemos realizar orientando nuestra bsqueda a la presencia de huevos en la regin perianal o bien a la presencia de huevos en las heces. En la Oxyuriosis por ejemplo, encontramos huevos en la regin perianal, debido a que las hembras que son las encargadas de la ovipostura, ponen los mismos en el mucus anal luego de realizar migraciones hasta ese sitio. Por esta razn es que los huevos no aparecen en las heces como en otras helmintiasis. Para el diagnstico de estas parasitosis se recurre a un procedimiento especial para poder visualizar estos huevos. Estos procedimientos son: Mtodo de Graham modificado por Garaguso o Mtodo de la cinta engomada: que consiste en utilizar una cinta adhesiva de celulosa que se adhiere a un portaobjeto luego de la toma de muestra en la regin perianal. Luego se observa al microscopio. Este procedimiento se realiza en forma seriada durante 3 a 5 das. Hay que indicarle al paciente que debe realizar esta operacin por la maana, antes de defecar y previo a la higiene diaria, para obtener as mejores resultados. Hisopado o Escobillado perianal: se realiza dndole al paciente las mismas indicaciones que en el caso anterior. La diferencia en este mtodo consiste en proveerle al paciente unas tiras de gasa y un frasco con formalina. El paciente deber pasar las gasas o hisopos humedecidos con un poco de agua, por la regin perianal y las pondr en el frasco con la solucin conservadora. As nos traer el frasco con las gasas/hisopos, que nosotros procederemos a centrifugar y luego observar entre porta y cubre la presencia de huevos de Enterobius vermicularis, si existieran.
Estas tcnicas son muy simples y muy tiles para la deteccin de esta parasitosis, pero tambin sirven para la investigacin de huevos de Tenia, ya que estas no liberan los huevos en las heces, sino que se evacuan al exterior cuando los progltides enteros del parsito se rompen al forzar activamente el esfnter anal.
Para revelar la presencia de huevos de helmintos en las heces se utilizan las tcnicas de enriquecimiento que estudiamos en el diagnstico de protozoos como es el mtodo de Sedimentacin de CARLES BARTHELEMY, de flotacin de WILLIS (que utiliza solucin saturada de cloruro de sodio con una densidad de 1,200) o el Mtodo de Teleman entre otros. Los helmintos eliminan una cantidad de huevos proporcional al nmero de parsitos, por esto se puede realizar el recuento de huevos utilizando diferentes mtodos, como por ejemplo el frotis grueso o mtodo de Kato-Katz, que consiste en colocar una muestra de heces en un porta limpio, se tapa con un cubreobjetos de vidrio de 22 x 30 mm., se invierte sobre un papel absorbente y se presiona para diseminar regularmente las heces y eliminar el exceso. Se deja secar a T ambiente una hora. Al secarse la pelcula el contenido se aclara. Los huevos se cuentan utilizando el objetivo de 10x recorriendo toda la preparacin.
Este procedimiento se realiza en forma seriada durante tres das, realizando cinco determinaciones por cada da y sacando la media, luego de contabilizar el nmero de huevos. Es til en el caso de gusanos adultos de scaris lumbricoides, Trichuris trichiura y las uncinarias (Necator americanus y Ancylostoma duodenale) Para la investigacin de larvas de uncinarias se utiliza el coprocultivo de HARADA-MORI que permite la diferenciacin de especies de uncinarias entre Ancylostoma duodenale y Necator americanus, cuyos huevos son idnticos. Consiste en la realizacin de un cultivo en el cual a los quince das las larvas estn bien diferenciadas.
MATERIALES Y MTODOS - ACTIVIDADES A DESARROLLAR: Para la obtencin de las muestras: Frascos o recipientes plsticos de boca ancha de diferente tamao: 250-300 ml y 50-100ml. Solucin de formol al 10% Solucin fisiolgica. Gasas cortadas de 10cm x 10 cm. Papel para envolver. Rtulos. Planilla de registro. Para el procesamiento de las muestras: Pinzas. Esptulas. Colador. Cajas de Petri. Tubos de centrfuga. Gradillas Embudos Varilla de vidrio. Pipetas Pasteur. Ansa de parasitologa. Centrfuga. Soluciones para las tcnicas de concentracin. Portaobjetos y cubreobjetos. Personal capacitado para procesar muestras.
Para la observacin microscpica: Microscopio ptico binocular, con ocular 10X con regla micromtrica para medicin de elementos parasitarios. Los objetivos utilizados son 10 y 40 X. Lugol.
-Mtodo de Carles Barthelemy Reactivos: - Liquido A Sol. Fisiolgica Formol 900 cc. 100 cc.
- Lquido B
cido ctrico Formol Agua destilada Densidad
12 g. 2 cc. 86 cc. 1.047
- ter sulfrico Tcnica: 1- Se diluye la materia fecal en Liq. A convenientemente, hasta que el material tenga la suficiente liquidez que permita una fcil colacin a travs de gasa doble. 2- Esta suspensin de materia fecal se debe colar a travs de gasa doblada, recogiendo el colado en un tubo. Se necesitan 8 cc. aproximadamente. 3- Centrifugar de 2 a 3 min. a 2000 rpm. 4- Despus de la centrifugacin se vuelca el sobrenadante y el sedimento se disuelve en lquido B en el mismo tubo por agitacin suave o con ayuda de una varilla de vidrio. No se debe llenar el tubo con el lquido B, sino dejar un espacio que permita adicionar de 2 a 3 cc. de ter sulfrico. .Una vez agregado este, se agita fuertemente, tapando el tubo con tapn hasta obtener una suspensin homognea. Luego de agitar se deja reposar hasta que la capa etrea vuelva a ocupar la parte superior. 5- Se centrifuga de nuevo el tubo por espacio de un minuto a 1.000 rpm. 6- Con una varilla de vidrio (puede ser de otro material) se rompe el anillo formado en la capa de ter, (por si algn quiste, huevo etc., hubiera quedado retenido). pero evitando que se mezcle con el sedimento que est en el fondo del tubo. 7- Se centrifuga nuevamente a 1.000 rpm un minuto y medio. 8- Se vuelca todo el lquido sobrenadante. A veces el anillo formado en la capa de ter no permite volcar el sobrenadante por ser muy abundante y adherente. En este caso se procede a romperlo nuevamente con precaucin y se procede a volcar el lquido.
9- Se agita el sedimento. Se toma un poco del mismo y se coloca una gota pequea sobre un portaobjeto. Puede adicionrsele primero una gota de lugol u otro colorante. Cubrir con un cubreobjetos. Se procede a la observacin al microscopio ptico con objetivos de 10x y 40x.
-Mtodo de Teleman: Tcnica: 1.- Homogeneizar las heces en solucin fisiolgica formolada. 2.- Colar a travs de un embudo con gasa doble en tubo de centrfuga. 3.- Agregar aproximadamente 2 ml de ter. 4.- Centrifugar a 1000- 1500 rpm durante 3 a 5 minutos. 5.- Eliminar con un golpe seco el sobrenadante. 6.- Tomar una pequea cantidad de sedimento y colocar en portaobjeto. 7.- Colocar cubreobjetos. Si es necesario se agrega colorante de fondo (lugol).
-Mtodo de Faust Reactivo: Solucin de Sulfato de Zinc al 33 % (densidad 1.180)
Tcnica: 1- Mezclar una parte de materia fecal con diez partes de agua destilada. 2- Colar esta suspensin a travs de una sola capa de gasa recibiendo el lquido en un tubo. 3- Centrifugar durante 30-40 segundos a 2.000 rpm. 4- Volcar el lquido sobrenadante. 5- El sedimento que queda se disuelve nuevamente en agua destilada. 6- Se centrifuga igual que en 3- repitiendo hasta que el sobrenadante quede lmpido. 7- Se vuelca por ltima vez el sobrenadante y al sedimento se agrega 3-4 cc. de la sol. de sulfato de cinc al 33 % 8- Se disuelve bien el sedimento y se centrifuga por lo menos 2 min. a 2.000 rpm. 9- Se toma con una ansa varias gotas del material que flota, con mucho cuidado y se monta entre porta y cubre, colorendose si se estima necesario.
Los alumnos reconocern el material utilizado para el examen parasitolgico de materia fecal, lo prepararn y luego ejecutarn dos tcnicas de concentracin. Observacin microscpica del material concentrado
BIBLIOGRAFA Tcnicas de Diagnostico en Parasitologa- Inst Fatala Chaben 1999 Parasitosis humanas Botero/ Restrepo - Corporacin para investigaciones Biolgicas 2003 Microbiologa Mdica Murray - Elsevier 2006
PROTOZOARIOS QUE PARASITAN INTESTINO Y VAGINA Trabajo Prctico de Laboratorio N 2
OBJETIVOS DEL TRABAJO PRCTICO: Al finalizar el trabajo prctico el alumno estar en condiciones de: Diferenciar correctamente los protozoos parsitos intestinales ms comunes del hombre Manejar adecuadamente el microscopio para realizar una correcta observacin de las distintas formas morfolgicas. Aplicar las medidas de bioseguridad en la manipulacin de materiales infecciosos.
INTRODUCCIN TERICA:
De proto (primero) y zoario (animal); son animales unicelulares, cuyas funciones de crecimiento, metabolismo, reproduccin y traslacin, son comparables a la de los animales pluricelulares, algunos de los cuales son de vida libre y otros parsitos de animales y vegetales. Son microscpicos y se localizan en diferentes tejidos presentando distintas virulencia y patogenicidad. En general presentan dos estados o formas parasitarias en sus ciclos evolutivos. La forma vegetativa, denominada trofozotos, es metablicamente activa, mvil y generalmente patognica. Algunos presentan otra forma, de resistencia y normalmente infectiva, conocida como quiste. Frecuentemente se los ha clasificado segn los mecanismos de motilidad en los siguientes phyla:
Phylum Sarcomastigophora Ciliophora (ciliados) Apicomplexa Microspora
Subphylum Sarcodina (amebas) Mastigophora (flagelados)
AMEBAS Las amebas se caracterizan por poseer un citoplasma donde se distinguen fcilmente dos zonas definidas: un ectoplasma hialino y un endoplasma granuloso. El ncleo presenta diferentes morfologas segn cada especie. Se desplazan mediante pseudopodios que son extensiones de uno o varios puntos del ectoplasma hacia donde luego se desplaza el resto de la clula. La reproduccin es asexuada mediante fisin binaria y el mecanismo de transmisin es generalmente por fecalismo. Dentro de las intestinales encontraremos algunas patgenas como Entamoeba histolytica y otras comensales a las que debemos reconocer y diferenciar de las patgenas y que adems son indicacin de fecalismo o contaminacin fecal. Amebiosis por Entamoeba histolytica: Agente etiolgico: Entamoeba histolytica fue descripta por primera vez por Lsch en 1875 en la estacin Arcngel (Rusia). Durante muchos aos se observ que a pesar del alto nmero de personas aparentemente infectadas con E. histolytica, slo un 10% aproximadamente presentaban un cuadro clnico disentrico o invasor. Esto fue motivo de discusin ya que algunos planteaban que la patogenicidad del parsito se deba a la susceptibilidad del husped u hospedador o incluso que dependa de la flora intestinal que podra transmitir el factor de patogenicidad. Otros consideraban la existencia de dos especies diferentes, una patgena y otra comensal. Brumpt en 1925 abon esta teora, que debi esperar muchos aos hasta que fuera comprobada por diferentes abordajes. As cuando se efectuaron los primeros cultivos axnicos (libres de bacterias) del parsito, se determinaron patrones especficos de zimodemos, es decir patrones isoenzimticos de 4 enzimas amebianas: glucosafosfatoisomerasa, malatodeshidrogenasa, hexoquinasa y fosfoglucomutasa. Se encontr que de 22 patrones, 9 correspondan a cepas patgenas. Estas mismas se correspondan con un mismo patrn de DNA y de pruebas con anticuerpos monoclonales. El anlisis de la secuencia del rRNA y del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) tambin pueden diferenciar las dos especies. As, mediante mtodos bioqumicos, genticos e inmunolgicos se lleg a la conclusin de la existencia de dos especies diferentes, pero morfolgicamente indistinguibles. E. histolytica, patgena y E. dispar, comensal, no patgena. Morfologa: E. histolytica/dispar presenta tres formas parasitarias: trofozotos, quistes y prequistes. La
estructura nuclear, que se mantiene en todas las formas parasitarias, presenta un cariosoma central y la cromatina se dispone delicada y regularmente sobre la membrana nuclear. A veces se pueden apreciar pequeos filamentos que unen la cromatina as dispuesta con el cariosoma, lo que le a un aspecto de rueda de carro. (Figura 1)
Figura 1. Trofozoto de E histolytica/dispar
El trofozoto mide entre 20 y 40. Cuando se desplaza emite un pseudopodio unidireccional, amplio, hialino y transparente que se distingue del resto del citoplasma granuloso. En el citoplasma se encuentran vacuolas digestivas y en el caso de E. histolytica, eritrocitos fagocitados, lo que no ocurre con E. dispar. El ncleo, de 4 a 7 , es de difcil visualizacin sin tincin. Es un organismo anaerobio. (Fotos 1)
Foto 1. Trofozoto de E. histolytica. El prequiste o forma de transmisin, es redondeado u ovoide, mide entre 10 y 20 . de dimetro, es inmvil y presenta una membrana qustica en vas de formacin, sin inclusiones citoplasmticas, pero en ocasiones con una vacuola iodfila de glucgeno y cuerpos cromatoidales. Estos ltimos son cilndricos, de bordes redondeados y estn asociados al rRNA (agregacin de ribosomas) y van desapareciendo a medida que se produce la maduracin del organismo. En esta etapa la diferenciacin morfolgica con E. coli (comensal no patgena) se basa en las caractersticas nucleares diferenciales, puestas de manifiesto mediante tinciones. El quiste es redondeado y mide de 10 a 18 y posee una gruesa cubierta qustica quitinosa. En su interior se observan de 1 a 4 ncleos como mximo. A veces pueden observarse los cuerpos o barras cromatoidales con las caractersticas antes descriptas. Los quistes maduros tetranucleados son infectivos ni bien son eliminados con las heces y permanecen viables por semanas o meses segn las condiciones ambientales. La vacuola de glucgeno va desapareciendo a medida que se produce la maduracin ya que provee la energa para ese proceso. (Figura 2)
Figura 2. Quiste de E. histolytica/dispar DIFERENCIAS ENTRE LA ENTAMOEBA HISTOLYTICA Y LA ENTAMOEBA COLI Entamoeba histolytica Movilidad Ms activa, Entamoeba coli
movimientos Menos activa, movimientos
rpidos. Se realizan emitiendo lentos. Se realiza emitiendo varios seudpodos a la vez. Se en seudpodo a la vez. desplaza Ncleo Invisible en preparados frescos. Visible en preparados
En los trofozotos coloreados; la frescos. En los trofozotos cromatina perifrica se dispone coloreados la cromatina
sobre la cara interna de la perifrica se dispone sobre membrana nuclear en forma de la trofozotos cara interna de la
grnulos pequeos. El cariosoma membrana nuclear en forma es central. Entre la cromatina de grnulos gruesos. El perifrica y el cariosoma queda cariosoma es excntrico.
una zona clara sin grnulos de Entre la cromatina perifrica cromatina. y el cariosoma queda una zona ocupada por algunos grnulos de cromatina
prximos al cariosoma. Vacuolas Contienen hemates, leucocitos, Contienen restos de tejidos. bacterias,
esporas, quistes de otros protozoarios. hemates. Nunca
Quistes
Los maduros contienen cuatro Poseen ocho ncleos. A ncleos. veces ms.
Accin patgena
Posee accin patgena, ulceras, No posee accin patgena. abscesos.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Ciclo biolgico:
El contagio es por va oral mediante la ingesta de quistes maduros tetranucleados a travs de agua o de alimentos contaminados con heces humanas. Una vez ingeridos, la fuerte variacin de pH
producida por el paso de estmago al duodeno ligeramente alcalino y por la accin de enzimas lticas, se provoca la ruptura de la pared qustica. As se libera un trofozoto que conserva los 4 ncleos del quiste y que evoluciona producindose dos divisiones nucleares que dan por resultado un trofozoto metacclico que presenta 8 ncleos. En la luz del colon cada ncleo se rodea de una porcin de citoplasma y resultan 8 pequeos trofozotos que crecen y se multiplican por fisin binaria. Los trofozotos se ubican en la luz del intestino grueso sobre la superficie de las glndulas de Lieberkhn o invaden la mucosa. En el lumen intestinal, los trofozotos van eliminando vacuolas alimenticias y dems inclusiones citoplasmticas, se redondean, se inmovilizan y forman prequistes; stos adquieren una cubierta y dan origen a quistes inmaduros con un ncleo, que van madurando hasta el estado de quiste tetranucleado infectivo. La formacin de quistes ocurre siempre en la luz del colon y nunca en el medio exterior o en los tejidos.Se desconocen los factores que inducen el proceso de enquistamiento, pero podran estar relacionados con el pH, variacin del potencial redox, etc. (Figura 3)
Figura 3. Ciclo evolutivo de E. histolytica
En las materias fecales humanas pueden encontrarse trofozotos, prequistes y quistes en diferentes etapas de evolucin. El perodo prepatente vara entre 2 y 4 das. Patogenia: Entre las caractersticas ms importantes de E. histolytica que intervienen en su relacin con el husped humano, as como en los aspectos fisiopatognicos de la amebiasis como enfermedad, las adhesinas, lectinas o glicoprotenas que colaboran en la adherencia de los trofozotos a las clulas intestinales juegan un rol determinante, probablemente participando en la activacin de fenmenos que finalmente desembocan en la lisis celular. Toda la secuencia o cadena de eventos posteriores precisamente se desencadenan por la adherencia o primer contacto entre parsito y clula. Esta est seguida por una elevacin importante de la concentracin de Ca++ libre intracelular. Una vez producido el contacto, entra tambin en accin un pptido de 77 aminocidos, denominado amebaporo, o ionforo que se encuentra dentro de las vesculas citoplasmticas del trofozoto. Luego del contacto, esas vesculas se transportan a la membrana citoplasmtica del
trofozoto y atacan la superficie de la clula husped en el punto de contacto entre ambas y donde comienza la formacin de poros y canales que provocan la difusin rpida de iones, con la consecuente alteracin en los sistemas de transporte normales de la clula, que se traduce en cambios en los procesos energticos. La falta de ATP intracelular origina una prdida de de K + con retencin de Na+ y de agua celulares que inducen finalmente a la citlisis. El contacto de los trofozotos con los tejidos tambin provoca destruccin de tejido conectivo por la liberacin de enzimas lticas como colagenasa, glucuronidasa, neuraminidasa y otras, almacenadas en los denominados cuerpos electrodensos del trofozoto. Entre las proteasas, las ms importantes son las cistein-proteasas, potentes disolventes de la matriz extracelular de los tejidos. Es probable que las alteraciones de la consistencia de las heces, producidas durante la amebiasis intestinal aguda estn relacionadas con trastornos en el transporte electroltico. Algunos componentes amebianos participan en la sntesis y liberacin de prostaglandinas, potentes estimulantes de las paredes intestinales al actuar sobre el AMP cclico, lo que conduce a alteraciones en el metabolismo del calcio y liberacin de sodio y agua a la luz intestinal. Otro producto de los trofozotos que producen dao sobre la clulas blanco son las fosfolipasas que desdoblan los componentes fosfolipdicos de la membrana celular. Cuando se observan microscpicamente a los trofozotos de E. histolytica, un aspecto diferencial de patogenicidad es la presencia en sus citoplasmas de eritrocitos fagocitados. Para la fagocitosis, los eritrocitos, bacterias, clulas y otras estructuras son adheridos a la superficie de la membrana citoplasmtica del trofozoto, y luego son desplazados a un punto de la misma en que son introducidos en el interior celular para ser luego digeridos. Las vacuolas fagocticas se fusionan en el citoplasma con los lisosomas que estn cargados de enzimas lticas necesarias para la digestin del material fagocitado. Cuando la digestin concluye, las vacuolas regresan a la membrana citoplasmtica, se fusionan con ella y dan salida a los productos que no son utilizados por la ameba y adems dejan expuestas hacia el exterior las adhesinas, reciclando las molculas de superficie para reiniciar el proceso. Para que la ameba se adhiera, debe encontrar sobre la clula blanco un receptor adecuado, que generalmente es tambin una glicoprotena. En el proceso fagoctico interviene activamente el citoesqueleto del trofozoto, la actina se polimeriza y forma microfilamentos por debajo de la membrana y alrededor de todo el canal fagoctico. Las adhesinas juegan un rol importante tambin en el proceso de colonizacin en el intestino grueso, ya que tienen una muy alta afinidad por las mucinas colnicas, ricas en galactosa, lo que determina su fijacin y evitan que las amebas sean arrastradas por los movimientos peristlticos intestinales. Una vez instaladas en el colon, pueden degradar ese mucus, llegar al epitelio e intervenir en los procesos de adhesin celular. De todas formas este mucus jugara un rol ambivalente pues impide la llegada directa de los trofozotos al epitelio intestinal.
En el colon, la presencia de bacterias disminuye el potencial redox de hbitat lo que favorece al desarrollo de la ameba. Anteriormente se supona que las bacterias estaban involucradas directamente en los procesos patognicos, hoy se sabe que favorecen la presencia de E. histolytica al crear condiciones microambientales ms adecuadas. Dentro de los factores del husped relacionados con la facilitacin la invasin amebiana, hay numerosos trabajos que indican la importancia del estado nutricional del mismo. As los individuos con dietas hipoproteicas presentan mayor susceptibilidad a la infeccin y al desarrollo de cuadros ms severos. El husped desarrolla algunos mecanismos de defensa como la accin de las proteasas pancreticas y de las sales biliares que bloquean la adhesin amebiana; actan en combinacin con glucosidasas bacterianas disminuyendo la adherencia de la lectina. Otro mecanismo es la produccin de IgA secretoria contra las protenas de adherencia. Cuando la ameba establece contacto, los neutrfilos son destruidos al igual que las clulas del epitelio, liberando citoquinas proinflamatorias preformadas, enzimas lticas e intermediarios reactivos de oxgeno, que llevaran a exacerbar la respuesta inflamatoria del husped facilitando, de esa manera la penetracin parasitaria. Se ha encontrado que los individuos con antgenos de histocompatibilidad HLA-DR3 tienen mayor probabilidad de desarrollar absceso heptico. Patologa: Inicialmente por la accin amebiana en el intestino grueso se forman lceras superficiales y la necrosis y el infiltrado celular son mnimos. Al multiplicarse activamente, las amebas pasan a la muscularis mucosa y llegan hasta la submucosa, donde encuentran un medio ptimo para la reproduccin y formacin de verdaderas colonias. Progresivamente se van destruyendo los tejidos en forma horizontal y se producen ulceraciones mayores. Estas lesiones son amplias en el fondo, con pequeo orificio de entrada, constituyendo lo que se denomina habitualmente la lcera en botn de camisa (Foto 2) Generalmente las amebas se detienen en la capa muscular, pero en ocasiones pueden penetrarla, extenderse hasta la serosa y an perforarla.
Foto 2. Ulcera en botn
Las lesiones iniciales se presentan en cualquier zona del intestino grueso; a partir de ellas se disemina la infeccin y aparecen lesiones en otras reas del colon. Predominan en la regin leocecal, sigmoides y recto. La lesin inicial es microscpica, cuando crece llega a ser visible como un pequeo ndulo de pocos milmetros con un orificio central y rodeado de hiperemia y edema, con material necrtico y abundantes trofozotos en su interior. Las lesiones crecen y confluyen por la base, se unen y dan lugar a ulceraciones excavadas, de bordes ntidos y prominentes que llegan a medir varios centmetros, ovaladas o redondeadas, rodeadas de una zona hipermica. Al progresar la invasin, las lceras crecen tanto en forma horizontal como en profundidad y causan necrosis de grandes reas de mucosa, frecuentemente asociadas a hemorragias y desprendimiento de fragmentos de mucosa, lo que constituye la forma ulcerativa generalizada, denominada tambin colitis amebiana fulminante. Microscpicamente el proceso inflamatorio es mnimo en las lesiones iniciales y la mucosa vecina a las lceras, presenta un aspecto normal, con escasa infiltracin leucocitaria. El aflujo de neutrfilos contribuye al proceso de necrosis local. Los neutrfilos son atrados por sustancias quimiotcticas de los trofozotos, son lisados y provocan dao tisular. Las lesiones amebianas pueden ser invadidas por bacterias del intestino con produccin de infecciones sobre agregadas y microabscesos. En el fondo de las lceras se observa vascularizacin y trombosis de los pequeos capilares. Una caracterstica de las lesiones amebianas es la escasa proliferacin de tejido conectivo con ausencia de cicatrices. En el caso de perforacin, especialmente en el colon transverso, sigmoides y ciego, el contenido intestinal pasa a la cavidad peritoneal y puede originarse peritonitis sptica y qumica. La perforacin es generalmente mltiple y casi siempre las lesiones son microscpicas o de pequeo tamao, tal que pasan desapercibidas en el examen macroscpico, pudiendo en ocasiones alcanzar uno ms centmetros de dimetro. La perforacin es la principal causa de muerte en los casos fatales de amebiasis intestinal, especialmente asociada a desnutricin o mal estado general del paciente. En algunos casos se produce una pseudotumoracin en el colon denominada ameboma, no siempre asociado a amebiasis intestinal sintomtica. Se localiza preferentemente en recto, sigmoides y ciego y consiste en un engrosamiento marcado de la pared intestinal tendiente a obstruir la luz, simulando un adenocarcinoma. El tamao es variable, pudiendo llegar a medir hasta 30cm de dimetro y puede coexistir con lesiones ulcerosas. Una vez que los trofozotos alcanzan los vasos sanguneos, la complicacin ms frecuente es el absceso heptico amebiano, sin embargo en ocasiones la primera lesin extraintestinal puede ser cutnea o cutneo-genital. Otros sitios donde se desarrollan lesiones amebianas, aunque menos frecuentemente, y en la mayora de los casos por diseminacin hematgena o por contigidad, son pulmn, cerebro, rin, vescula biliar, pericardio y piel.
Diagnstico: Se basa fundamentalmente en los exmenes de laboratorio. Amebiasis Intestinal: en heces formadas se investiga el parsito en forma de quiste; slo excepcionalmente se encontrarn trofozotos. Es necesario recurrir a tcnicas de enriquecimiento por ejemplo la de centrifugacin- flotacin de Faust. En heces lquidas se puede observar el trofozoto; para ello es necesario examinar las heces recin emitidas. A veces es necesario, por el cuadro clnico realizar rectosigmoideoscopia o colonofibroscopia, obtenindose material por aspirado o raspado de las lesiones. El examen debe hacerse de inmediato. Amebiasis Heptica: Se puede realizar: a) Puncin diagnstica b) radiologa c) centellografa d) laparoscopia. Inmunodiagnstico: Hemaglutinacin indirecta. Inmunoelectroforesis. Prueba del ltex. Distribucin geogrfica: cosmopolita. Profilaxis: Saneamiento del medio ambiente: potabilidad del agua, adecuada eliminacin de excretas desperdicios. Cultivos de verduras frutas evitando la contaminacin fecal; combatir la presencia de vectores (moscas, cucarachas). Entamoeba coli Morfologa: Los trofozotos o formas vegetativas miden entre 20 y 40 micras de dimetro, se distingue una zona externa o ectoplasma y una zona interna o endoplasma; un ncleo y vacuolas digestivas. CITOPLASMA: El ectoplasma se presenta en forma de una delgada banda. El endoplasma es granuloso, existen numerosas vacuolas digestivas y el ncleo. NUCLEO: Es visible en los trofozotos observados en materia fecal fresca; esfrico y de ubicacin excntrica, la cromatina se distribuye en grnulos gruesos sobre la cara interna de la membrana nuclear, el cariosoma es excntrico. VACUOLAS: Contienen bacterias, restos alimentarios, grnulos de almidn, etc. Los
prequistes son redondeados, hialinos y sin vacuolas. Los quistes son esfricos, miden de 10 a 30 micras y encierran 8 ncleos, pudiendo llegar a tener 32, por sucesivas divisiones nucleares. Contienen glucgeno y cromidias, o sea sustancias de reserva, que se disponen en forma de barras y grnulos. Reproduccin: Se realiza por fisin binaria. Accin patgena: Carece de ella, comportndose generalmente como un comensal del intestino grueso del hombre y de ciertos animales. Diagnstico: Al igual que Entamoeba histolytica, se realiza por el exmen microscpico directo para los trofozotos; por mtodos de enriquecimiento para los quistes, y tambin utilizando los mtodos de coloracin. En los preparados en fresco, el ncleo es siempre visible.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Distribucin geogrfica: cosmopolita.
Profilaxis: se efecta en forma similar a la de la Entamoeba histolytica.
Endolimax nana Morfologa: Los trofozotos, que miden de 6 a 12 u de dimetro, presentan un ectoplasma claro, de aspecto hialino, y un endoplasma vacuolado y granuloso en donde el ncleo se halla ubicado excntricamente. Este muestra una masa central, formado por un conglomerado de grnulos de cromatina, llamado cariosoma, el que a veces es algo excntrico. Sobre la cara interna de la membrana nuclear, que es bien neta, se observan aislados, pequeos grnulos cromticos. Los quistes, cuando son recientes, poseen un solo ncleo. Este presenta un cariosoma, casi siempre excntrico, unido por medio de un delgado filamento a otra masa cromtica ms pequea, que se encuentra sobre la membrana nuclear. Este ncleo termina por dividirse originando dos, los cuales, a su vez, al dividirse forman otros dos. Por lo tanto, los quistes maduros son tetranucleados. Accin patgena: Carece de ella. Es un parsito comn del intestino. Diagnstico: Se realiza en forma similar al de las otras amebas intestinales. Distribucin geogrfica: Cosmopolita. Profilaxis: Como en la Entamoeba histolytica.
Iodamoeba butschlii Morfologa: Los trofozotos, que miden de 9 a 13 u de dimetro, presentan un aspecto muy parecido a los de Entamoeba coli. Sus vacuolas digestivas contienen, como esta, bacterias, pero en cambio, el ncleo es invisible en los preparados frescos. Con los mtodos de coloracin se aprecia el ncleo, el cual
presenta un cariosoma grande, en cuya periferia las granulaciones cromticas adoptan una disposicin tal que le dan un aspecto festoneado. En el centro el cariosoma se observa ms claro. Entre el ncleo y la membrana nuclear se observa un espacio claro. Los prequistes tienen iguales dimensiones que los trofozotos, no existiendo entre ellos inclusiones alimenticias. El espacio comprendido entre la membrana nuclear y el cariosoma se carga de granulaciones. Los quistes pueden ser esfricos, ovalados o irregulares, contiene una vacuola yodfila formada por una masa de glucgeno que desaparece con el tiempo. El ncleo generalmente es nico, presenta un cariosoma excntrico de contorno irregular y en contacto con la membrana nuclear. Las granulaciones de cromatina perifrica se disponen adoptando la forma de una media luna que abarca el cariosoma. Accin patgena: No es bien conocida, siendo posible que sea comensal del colon.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Diagnostico: En forma similar al de otras amebas. Distribucin geogrfica: Cosmopolita
Dientamoeba fragilis Morfologa: Los trofozotos, que miden de 9 a 13 u, presentan neta diferenciacin entre ectoplasma y endoplasma; mientras que el primero emite seudpodos aplanados, el ltimo es granuloso y con vacuolas digestivas. En el endoplasma se advierten dos ncleos de idntica estructura y dimensiones. Estos muestran su cromatina en la regin central, en forma de cariosoma constituido por grnulos independientes. Entre este y la membrana nuclear queda un espacio claro. Los quistes son muy poco conocidos. Accin patgena: Carece de ella, siendo un simple comensal del colon. Diagnostico: Se efecta por examen microscpico y coloraciones en extendidos de materia fecal. Distribucin geogrfica: Cosmopolita.
FLAGELADOS Los flagelados que parasitan al intestino del hombre estn comprendidos en los gneros: Enteromonas: Flagelado que carece de citostoma; membrana ondulante y axostilo. Especie: Enteromonas hominis. Embadomonas: Posee citostoma. Carece de membrana ondulante y axostilo. Especie: Embadomonas intestinalis. Chilomastix: Posee citostoma con un labio grueso. Carece de membrana ondulante y axostilo. Especie: Chilomastix mesnilii. Trichomonas: Flagelado con citostoma, axostilo y membrana ondulante. Especie: Trichomonas hominis. En los rganos genitales parasita la especie Trichomonas vaginalis. Giardia: Flagelado con simetra bilateral. Posee dos ncleos, ocho flagelos, ocho blefaroplastos, dos axostilos y un disco chupador. Especie: Giardia lamblia. Enteromonas hominis Morfologa: Los trofozotos, cuyo dimetro oscila entre los 4 y 10 , son ovalados o piriformes y poseen un ncleo situado en la parte anterior. Este tiene un cariosoma grande y central. El citoplasma es vacuolado e incluye bacterias. Se desplaza por medio de sus flagelos, orientados tres hacia delante y uno hacia atrs. Los quistes, ovalados, de 8 um de longitud por 4 um de anchotienen un doble contorno y encierran un ncleo que termina por dividirse, hasta formar, en los quistes maduros, cuatro nuevos ncleos. Estos se ubican de a pares, en ambos polos del quiste (Figura 2 D).
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Accin patgena: No es bien conocida. Se localiza en el colon. Diagnstico: Examen de heces. Distribucin geogrfica: Cosmopolita.
Embadomonas intestinalis Morfologa: Los trofozotos, de forma ovalada y con dimensiones de 8 micras de largo por 4 micras de ancho, muestran en su parte anterior un ncleo que encierra un pequeo cariosoma central. Este es sustituido a veces por grnulos de cromatina. De la membrana nuclear parten dos flagelos que se originan en sus respectivos blefaroplastos. Por detrs del ncleo se halla una pequea boca o citostoma. Incluyen bacterias. Los quistes son piriformes, miden unos 5 micras y encierran un ncleo tambin piriforme con su respectivo cariosoma. Accin patgena: Es desconocida. El parsito se localiza en el colon. Diagnstico: Se efecta por el examen de heces. Distribucin geogrfica: Cosmopolita. En nuestro pas existe en muy escaso porcentaje.
Chilomastix mesnilii Morfologa: Los trofozotos, piriformes y asimtricos, con dimensiones de 10 a 20 micras de largo, presentan la parte anterior ms ancha que la posterior. Esta termina en una corta prolongacin caudal. Observados en preparaciones teidas, aparece el ncleo, situado en la zona anterior, esfrico, vesicular y con un pequeo cariosoma excntrico. Sobre la membrana nuclear, en la parte anterior, estn ubicados tres blefaroplastos, de los cuales parten los respectivos flagelos. El parsito est cubierto con una pelcula delgada y al movilizarse puede adquirir forma esfrica. Los quistes de unas 8 micras y ovalados, presentan una protuberancia en uno de sus extremos. Poseen una delgada membrana de envoltura y un ncleo voluminoso con una cromatina condensada en uno de sus polos. Accin patgena: Ocasionalmente puede provocar un cuadro dispptico, con meteorismo y diarreas. El parsito se localiza en el colon. Diagnstico: Se realiza por el examen microscpico directo de las heces o por el examen microscpico previo enriquecimiento. Distribucin geogrfica: Cosmopolita. Frecuente en la argentina. Profilaxis: Igual que para Entamoeba histolytica.
Trichomonas hominis
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Morfologa:
Los trofozotos, que pueden adoptar diferentes formas (esfricas, piriformes, ovaladas, etc.), tienen un dimetro aproximadamente de 14 m. Estn dotados de activos movimientos y muestran una parte anterior redondeada y una posterior prolongada por una cola aguda y breve. El ncleo, que ocupa la parte anterior, es ovalado y posee un cariosoma y algunos grnulos cromticos. Sobre la porcin anterior de la membrana nuclear se hallan los blefaroplastos, en un nmero aproximado de cuatro. De ellos parten hacia adelante los respectivos flagelos, el axostilo y la membrana ondulante. El axostilo se proyecta hacia atrs y sale por el extremo posterior. Sobre la cara ventral existe un citostoma o boca. Su citoplasma contiene vacuolas ocupadas por bacterias, las que constituyen el alimento del parsito. Hasta la actualidad no se conoce la forma de quiste. Accin patgena: Cuando el nmero de parsitos es elevado, se produce la tricomonosis intestinal, con sntomas digestivos inespecficos comunes a otros parasitismos, pero que en algunas ocasiones puede dar un cuadro disentrico. El parsito se localiza en el colon. Diagnstico: Se efecta por el examen microscpico directo de la materia fecal, el cual debe ser realizado apenas evacuada sta, para evitar la degeneracin y ulterior desaparicin del flagelado. El hallazgo de la membrana ondulante es de capital importancia, ya que permite diferenciar al parsito de otros flagelados que carecen de ella. Distribucin geogrfica: Cosmopolita.
Trichomonas vaginalis Morfologa: Los trofozotos, de dimetro aproximadamente a los 15, son alargados y presentan un ncleo situado en la parte anterior y provisto de un cariosoma central. Sobre la parte anterior de la membrana nuclear se insertan alrededor de cuatro blefaroplastos, de los cuales parten los respectivos flagelos, un axostilo que se proyecta hacia atrs y una membrana ondulante. Posee tambin un citostoma. Los quistes no existen. Se multiplica por divisin binaria; es un parsito con gran resistencia al agua y secreciones vaginales, lo que explicara la facilidad de las infecciones y reinfecciones en las enfermas. Mecanismo de transmisin: El mecanismo principal es venreo. Existe una transmisin extragenital de menor importancia. Se ha demostrado que la Trichomonas vaginalis, al sobrevivir en los tejidos hmedos durante 6 horas, puede transmitirse a travs de aguas termales, utensilios higinicos (lavatorios, bidets, lavabos, etc.) toallas o ropa interior. La mujer es el principal reservorio de la infeccin y el hombre el que la propaga. Accin patgena: halla en el moco vaginal cido, siendo el agente de la tricomoniasis vaginal la que se caracteriza por leucorrea y prurito intenso a nivel de la vulva. Aunque con menor frecuencia, se lo ha encontrado en la vejiga y uretra masculina.
Diagnstico: Se realiza examen en fresco de material proveniente de los fondos de saco vaginales; de la uretra se puede tomar muestra del meato urinario. Para investigar T. vaginalis de la vejiga se extrae orina por medio de sonda, se centrifuga, y se buscan Trichomonas en el sedimento. En el hombre se hace diagnstico en muestras de orina, secrecin uretral, lquido prosttico o espermtico. El simple examen en fresco del material sospechoso entre porta y cubreobjetos revela la presencia de Trichomonas, fcilmente demostrables por su morfologa y movimientos caractersticos. Puede tambin coexistir otra infeccin por Cndida albicans, Gardnerella vaginalis u otro microorganismo. El cultivo de Trichomonas se puede realizar pero no es una prctica de rutina por el costo y el tiempo. Las pruebas inmunolgicas son experimentales y no se utilizan en el diagnstico rutinario. Profilaxis: Debido a que el principal mecanismo de transmisin de la tricomoniasis es venreo, se debe instruir a la pareja y recomendar un buen aseo genital despus del acto sexual. Adems se recomienda la miccin post coital, la cual disminuye la frecuencia de la infeccin. Distribucin geogrfica: cosmopolita. Giardia lamblia Este protozoario, productor de la giardiosis, tambin denominado G. intestinales y G. duodenalis, pertenece al grupo de los arquezoarios, organismos primitivos que carecen de organoides tpicos de los eucariotas como mitocondrias, aparato de Golgi y peroxisomas, obtienen su energa mediante la gluclisis anaerbica; sus rRNA y ribosomas se parecen ms a los de un procariote que a los de un eucariote. Algunos lo consideran como el eslabn perdido ente ambos tipos de organismos. Dentro del gnero Giardia existen varias especies, como G. muris que parasita a pequeos roedores y aves, G. agilis, que se halla en los anfibios y G. lamblia que infecta a diferentes mamferos, incluido el hombre, animales domsticos y otros vertebrados, G.psittaci encontrada en garzas y G. ardeae en hurones. Algunos mencionan la especie G. microti, que parasita a lobos y ratas de campo, mientras que otros consideran que G. lamblia es una especie compleja dentro de la cual estara comprendida G. microti. G. lamblia es un parsito potencialmente zoontico. Morfologa: G. lamblia presenta dos estados parasitarios: el trofozoto, forma vegetativa o trfica, responsable de la accin patgena y el quiste, que es la estructura de resistencia y de transmisin. El trofozoto tiene aspecto piriforme, mide 12 a 15 micras de longitud, 5 a 9 micras de ancho y 1 a 2 micras de espesor. Es aplanado dorsoventralmente y en la superficie ventral, anterosuperior se localiza el disco suctorio o de adherencia, que ocupa la mitad del cuerpo, es cncavo, de 0,4 micras de profundidad y le permite adherirse o fijarse a la mucosa intestinal (Figura 4). Este disco est compuesto por protenas contrctiles como tubulina, giardinas, -actinina, tropomiosina, vinculina y miosina. Se cierra hacia los extremos formando una cresta lateral, que es la nica zona del disco que realmente tiene interaccin fsica con las clulas blanco del husped.
Figura 4. Trofozotos y quiste de G. lamblia
Foto 3. Trofozotos de G. lamblia (Giemsa)
Foto 4. Trofozotos de G. lamblia. Coloracin tricrmica
Foto 5. Trofozotos de G. lamblia en fresco
Foto 6.Trofozotos de G. lamblia (m. electrnico)
Foto7. Quistes de G.lamblia en fresco
Foto 8. Quistes de G.lamblia con lugol
El trofozoto posee un par de ncleos, cuerpos basales, cuatro pares de flagelos, cuerpos medios y vacuolas perifricas. Los dos ncleos tienen la misma cantidad de DNA, son activos desde el punto de vista trnascripcional y presentan algunos grumos de heterocromatina en contacto con la membrana nuclear. Estn ubicados en posicin anterior en forma simtrica respecto al eje longitudinal. Los flagelos son responsables de la motilidad del parsito, le confieren un movimiento lento, vibratorio y a la vez rotatorio y no jugaran un rol importante en la adhesin. Cada uno de ellos se origina en un cuerpo basal, y los axonemas flagelares tienen la estructura tpica de los microtbulos de 9 (2) +2 (9 pares de microtbulos que rodean a dos microtbulos internos). Los cuerpos medianos de G. lamblia se localizan en la lnea media y dorsal a los flagelos y estn formados por un grupo de microtbulos en un paquete compacto que podra ser un sitio de ensamble de microtbulos que se incorporan al disco suctorio y le confieren soporte al trofozoto. El cuerpo est recorrido
longitudinalmente por el axostilo. Las vacuolas perifricas se encuentran por debajo del plasmalema ventral y dorsal, y entre los lbulos del disco suctorio; algunas contienen proteinasas de cisterna (tal vez con funcin lisosomal). Los trofozotos absorben los nutrientes del lumen intestinal por pinocitosis. En el citoplasma se reconocen ribosomas, microtbulos, endomembranas y depsitos de glucgeno. El quiste tiene forma ovoide, mide 8 a 12 micras de longitud por 7 a10 micras de ancho. (Fotos 7,8) La pared es de 0,3 a 0,5 micras de espesor y est compuesta de una capa filamentosa externa constituida por una red de filamentos de 7 a 29 nm de dimetro y otra membranosa interna formada por dos membranas. Se han observado al menos cuatro protenas diferentes de 29, 75,88 y 192 kDa, embebidas en la red filamentosa, donde el componente mayoritario es un homopolmero de N-acetilgalactosamina. Se observan 2 a 4 ncleos, en las formas qusticas inmadura y madura
respectivamente. Presentan todas las estructuras del trofozoto, aunque los componentes del citoesqueleto del disco ventral se encuentran fragmentados en el citosol. (Fotos 3, 4, 5, 6) Entre la pared qustica y la membrana plasmtica se encuentra un espacio lacunar, que en algunos casos es bien manifiesto por retraccin del quistozoto. Los quistes de tipo I tienen la estructura clsica y los de tipo II, con el citoplasma retrado, son no infectivos y presentan una tasa de desenquistamiento del orden
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA de 0 a 15%. trofozoto.
Los quistes son estables en el ambiente y su tasa metablica es del 20% de la del
Figura 5. Ciclo evolutivo de G. lamblia
Foto 9. Trofozoto en intestino delgado
Foto 10. Trofozoto adherido al enterocito (m. electrnica)
Foto 11. Quistes de G. lamblia Ciclo evolutivo: La infeccin se produce por va oral mediante la ingestin de quistes, siendo
suficientes tan slo 10 a 100 quistes para adquirirla. El desenquistamiento se inicia despus de que los quistes se degluten, pasan por el pH cido del estmago y se activan con el pH alcalino del duodeno. El proceso es rpido y los trofozotos se dividen por fisin binaria longitudinal despus de salir del quiste, e incluso antes de su salida. Por cada quiste se liberan 2 trofozotos. Las sales biliares y el colesterol favorecen su crecimiento, lo que promueve la colonizacin, principalmente en duodeno y yeyuno (Foto 12). La duracin de este proceso vara entre 6 y 20 horas. Los trofozotos se adhieren a las microvellosidades a travs del disco suctorio (Fotos 9,10). El mecanismo de adaptacin de Giardia conocido como enquistamiento es esencial para que el parsito pueda sobrevivir fuera del intestino del hospedador, ya que los trofozotos son sumamente sensibles a los cambios de temperatura, humedad y a la presencia de agentes qumicos. En este proceso, los trofozotos descienden por el intestino del hospedador, y al encontrar un ambiente pobre en colesterol, se induce su diferenciacin a quiste, los cuales al ser eliminados con las heces ya son infectantes. La forma qustica con su rgida pared glicoproteica externa protege al parsito en condiciones ambientales muy hostiles, inclusive a la accin de desinfectantes. En los ltimos aos, utilizando mtodos bioqumicos, inmunolgicos y de biologa molecular, se ha identificado el estmulo que inicia el enquistamiento de Giardia y caracterizado molculas cuya expresin es inducida especficamente en este proceso. Adems, se han dilucidado varios eventos moleculares comprometidos en el transporte, secrecin y ensamblado de la pared qustica extracelular.
Foto12. Trofozotos en intestino delgado
En el medio exterior los quistes sobreviven hasta un mes en suelo hmedo y sombreado, y tienen la capacidad de infectar al mismo individuo que los elimin y/o contaminar a nuevos hospedadores, cuando son ingeridos con alimentos y agua contaminados. Patogenia y patologa: La explicacin de la patogenia de la giardiosis, especialmente la diarrea y la malabsorcin, involucra numerosos aspectos, por lo que se considera un proceso multifactorial que puede incluir los siguientes aspectos: Capacidad del trofozoto de adherirse con su disco suctorio ventral. Para que los trofozotos
colonicen el intestino delgado es necesario que se adhieran a los enterocitos de las microvellosidades, y en esa interaccin intervienen factores fsicos y bioqumicos. En cuanto a los primeros, la adherencia al epitelio intestinal se produce por presin negativa del disco suctorio (como en una ventosa). Este mecanismo explica tambin la adherencia de los trofozotos al plstico y al vidrio en los medios de cultivo cuando crecen in vitro. En la adhesin mediada por mecanismos bioqumicos participan las protenas contrctiles del disco ventral. Adems se ha sugerido que las lectinas podran tambin estar relacionadas con estos procesos de adhesin mediante receptores especficos localizados en las superficies celulares. Estas interacciones celulares producen exfoliacin, lisis celular, aumento del ndice mittico y aplanamiento de las microvellosidades con hiperplasia de las criptas. Los trofozotos de Giardia poseen una lectina (taglina) de 28 a 30 kDa que se une a un receptor de membrana de la clula blanco que contiene residuos de manosa-6-fosfato. Accin enzimtica: Algunas enzimas de los trofozotos como las sulfatasas, hidrolasa, fosfatasa cida, proteinasas de cistena y tioproteinasas, pueden favorecer la adherencia parasitaria al epitelio intestinal debido a que atacan a las glucoprotenas de los enterocitos y alteran la integridad de las microvellosidades. Reduccin de actividad de las disascaridasas: La atrofia vellositaria y el alto
recambio celular debido al elevado ndice mittico, hacen que los enterocitos lleguen inamaduros a la superficie de las microvellosidades, siendo su produccin enzimtica defectuosa o disminuida. Se ha
demostrado que hay una reduccin en la actividad de disacaridasas como la maltasa, isomaltasa, sacarasa, lactasa, isoamilasa, entre otras. Adems se detect una disminucin en la produccin de enzimas producidas en las microvellosidades como la ATPasa de la bomba Na +/K+. Inhibicin de enzimas pancreticas: Se han encontrado inhibidores parasitarios de la quimotripsina , tripsina y lipasa pancreticas. La disminucin de la actividad de esta ltima contribuira a la disminucin de la liplisis y al aumento de la esteatorrea, as como tambin disminuira la concentracin de cidos grasos libres que pueden daar al trofozoto.
Barrera mecnica: La extensa superficie de absorcin que proporcionan las microvellosidades hace poco probable que el tapizamiento con los trofozotos establezca una barrera mecnica que impida la absorcin de nutrientes. Competencia por los nutrientes del husped: Los trofozotos compiten por las sales biliares y tambin por colesterol y fosfolpidos, que no pueden sintetizar a novo. Tampoco sintetiza anminocidos ni nucletidos, por lo que cuando los necesita, los adquiere del medio. Para la produccin de energa, adems de glucosa, puede emplear aspartato, alanita y arginina. A la cistena la toma del medio para proteger a las membranas del ataque de los radicales libres. Adems compite por micronutrientes como cinc, hierro y otros metales. Alteracin de la barrera de moco: El parsito se protege de los ataques de las enzimas del husped en el moco intestinal. Para ello estimula su produccin por parte de las clulas caliciformes intestinales. Estimulacin y evasin de la respuesta inmune del husped: Esta estimulacin produce la liberacin de citoquinas e inflamacin de la mucosa. Es posible que las diferencias genotpicas observadas en los aislados de G. lamblia le confieran distinta virulencia. Por otro lado, para sobrevivir dentro del hospedador y evadir la respuesta inmune, Giardia manifiesta lo que se conoce como variacin antignica. Los trofozotos se encuentran recubiertos de una determinada protena de superficie que forma una verdadera interfase entre el parsito y el medio, y que pertenece a una familia de protenas denominadas protenas variables de superficie (VariantSpecific Surface Protein, VSPs). Giardia contiene en su genoma un repertorio de entre 150 a 200 genes que codifican estas protenas, pero solamente una VSP se expresa en la superficie de los trofozotos en un momento dado. Las protenas de superficie tienen adems una estructura particular que les confiere resistencia a las proteasas intestinales, haciendo posible que el parsito se establezca en la luz y el epitelio intestinales. Estas protenas, a pesar de ser antignicamente diferentes entre s y ser heterogneas en lo que respecta a su tamao molecular, poseen un dominio transmembrana altamente conservado y una porcin carboxilo-terminal citoslica compuesta por slo cinco aminocidos (CRGKA = cistena, arginina, glicina, lisina, alanina). Su regin N-terminal es altamente variable (dndole a cada una de estas protenas la caracterstica de ser antignicamente diferente), pero todas son ricas en cistena (~12%), incluyendo una alta incidencia del motivo CXXC (donde X representa cualquier aminocido). La purificacin y anlisis de una de estas protenas, la VSP GS/H7, demostr que la misma no est glicosilada y que une Zn2+ y Fe2+ por coordinacin a los dominios CXXC. Esa sera la razn de la deficiencia de esos minerales observada en pacientes con giardiosis crnica. Giardia cambia espontneamente la expresin de sus VSPs ya sea en cultivo o en respuesta al ataque inmunolgico que estos antgenos inducen tanto en humanos como en animales de experimentacin. La variacin antignica se acompaa de la prdida del mRNA del gen que codifica
para una determinada VSP con la concomitante aparicin de los transcriptos derivados de la expresin de una nueva VSP. El mecanismo por el cual los trofozotos cambian su cubierta de superficie no se conoce, pero se cree que la variacin antignica le permite a Giardia evadir la respuesta inmune del hospedador y por ello producir infecciones crnicas y recurrentes. La utilizacin de estas VSPs como antgenos en la formulacin de una vacuna permitir al hospedador generar anticuerpos y clulas reactivas contra todo el repertorio de VSPs, que contrarresten la infeccin y/o las manifestaciones clnicas de la enfermedad. Debido a que Giardia estimula la va alterna del complemento, las IgG3 e IgM lisan a los trofozotos en presencia de complemento. La eliminacin del parsito se ha correlacionado con la IgA secretoria. Por otro lado, los macrfagos de las placas de Peyer en presencia de anticuerpos antiGiardia fagocitan grandes cantidades de trofozotos que mueren mediante mecanismos oxidativos. Los macrfagos activados por IFN- fagocitan a los trofozotos, aunque en ese proceso se daan tambin los enterocitos. Los enterocitos producen xido ntrico (NO) a partir de arginina mediante la sintetasa de xido ntrico y lo liberan al lumen intestinal. El NO, aunque no afecta a la viabilidad del parsito, inhibe tanto la formacin como la eclosin de los quistes de Giardia.
Cuadro Clnico: La presentacin clnica de la giardiosis vara desde un cuadro asintomtico hasta cuadros de diarrea grave con mal absorcin. La presentacin sintomtica tiene un perodo de incubacin que vara entre 1 a 3 semanas despus de la ingesta de quistes e incluye diarrea, nuseas, flatulencia, esteatorrea y dolores abdominales. Tambin puede presentarse con prdida ponderal, vmitos, anorexia e inflamacin abdominal. En ausencia de tratamiento, la enfermedad puede durar varios meses, pudiendo entrar en cronicidad, con perodos de diarrea y constipacin alternados. En fase crnica es comn la mal absorcin de grasas, de lactosa y de vitaminas liposolubles A y B 12. Es probable que en los casos asintomticos crnicos, el portador tenga una absorcin intestinal deficiente subclnica. Las heces son blandas, estatorreicas y lientricas (con restos macroscpicos de alimentos), malolientes. Algunos pacientes pueden presentar intolerancia a la lactosa durante la giardiosis activa, que puede persistir an despus de la resolucin de la misma. En pacientes inmunocomprometidos, especialmente hipogammaglobulinmicos o con inmunodeficiencias adquiridas, los cuadros son ms floridos y de mayor duracin. Se han descrito manifestaciones extraintestinales de la giardiosis como sndromes alrgicos, urticaria crnica, pancreatitis, colecistitis, cefalea postprandial, artralgias e inflamaciones oculares entre otras.
Diagnstico: Despus del examen clnico epidemiolgico orientador en el que se considera la diarrea de larga evolucin, mal absorcin, y condiciones higinicas y hbitos que puedan conducir a la infeccin por G. lamblia, se presenta para el laboratorio el desafo de efectuar un diagnstico de esta parasitosis. En el laboratorio se pueden buscar quistes y trofozotos en materia fecal, trofozotos en lquido duodenal o biopsias de intestino delgado, y coproantgenos y secuencias de DNA especficas mediante PCR. Estudios coproparasitolgicos: Cuando las heces son blandas o diarreicas es ms probable el hallazgo de trofozotos, en cambio si son formadas o semi formadass, se identifican ms quistes que trofozotos. Adems los elementos parasitarios se eliminan en forma discontinua o irregular con las materias fecales. Estas consideraciones hacen que se deba encarar el examen coproparasitolgico contemplando ms de un tipo de muestra. Debido a que la sensibilidad se incrementa con el nmero de muestras analizadas (con una muestra la sensibilidad es de 76 a 86%, con dos de 90% y con tres hasta un 96,7%), se sugiere recolectar un muestra seriada durante tres das alternados o 5 das consecutivos (especialmente en casos crnicos) recogiendo las heces sobre un conservador. Adems por la falta de eliminacin de quistes en casos de diarrea franca, se sugiere sumar a la anterior, una muestra en fresco recin emitida conservada en un recipiente limpio y seco. En sta se puede ver la motilidad caracterstica del trofozoto (como hoja que cae) en una preparacin hmeda, tomando de las zonas ms mucosas y pudiendo diluir la muestra con solucin fisiolgica (Foto 3). En el caso de las muestras seriadas deben efectuarse sobre ellas mtodos de enriquecimiento para aumentar la sensibilidad en la deteccin parasitaria. Pueden efectuarse tinciones permanentes y emplear lugol para las preparaciones hmedas a fin de resaltar estructuras. (Fotos 3, 4 y 8) Un examen coproparasitolgico donde no se hallen elementos parasitarios, no autoriza a descartar una giardiosis. Sondeo duodenal: Si los estudios coproparasitolgico mencionados no detectaron la presencia de Giardia, puede recurrirse a un mtodo ms invasivo como el sondeo o aspirado duodenal con biopsia, si el cuadro clnico lo impone. En el primer caso se buscan trofozotos en el lquido duodenal y en el segundo pueden efectuarse coloraciones del material de biopsia encontrndose tambin trofozotos. Mtodos inmunolgicos: Permiten detectar pequeas concentraciones de antgenos parasitarios en las heces. La prueba de ELISA, que reconoce al antgeno GSA-65 tiene una sensibilidad del 98% y especificidad del 100%.Adems del ELISA, comercialmente existen equipos que detectan otras protenas de superficie mediante tcnicas de inmunofluorescencia, empleando anticuerpos monoclonales.
Estudios moleculares: El diagnstico basado en la deteccin del DNA de G. lamblia en materia fecal mediante PCR est en proceso. Se han usado varios genes, por ejemplo con la amplificacin del gen de la triosa fosfatoisomerasa, se obtuvo una sensibilidad del 94%. Otros han empleado diferentes iniciadores y genes de amplificacin con una sensibilidad analtica de 1 a 10 quistes por mezcla de reaccin. Cultivos: G. lamblia se ha cultivado en medios axnicos, especialmente en el TYI-S-33, no tanto con fines diagnsticos como para poder estudiar su biologa, los mecanismos de accin y para la obtencin de antgenos a fin de ser empleados con diferentes propsitos. Asimismo se han reproducido in vitro los procesos de enquistamiento adicionando sales biliares a esos medios o bajando la concentracin de colesterol. Epidemiologa y prevencin: Debido a las diferencias en las condiciones sanitarias, en los pases subdesarrollados es mayor la prevalencia que en los pases avanzados. No obstante, en estos ltimos las infecciones humanas se hallan en turistas, homosexuales y personas en asilos o guarderas. En algunos pases pobres, la giardiosis en nios afecta a cerca del 100% de la poblacin. Grandes epidemias han ocurrido por contaminacin fecal de alimentos y reservorios de agua, infectando en algunos casos a miles de personas. Este parsito constituye un importante problema de salud pblica global, adems, en los EE.UU. se considera a Giardia un posible agente de bioterrorismo por su capacidad de ser transmitido por el agua, por su potencial de ser genticamente manipulado, y por la posibilidad de reproducir totalmente su ciclo vital en el laboratorio. En el mundo hay 280 millones de infecciones anuales por G. lamblia. En los pases desarrollados su prevalencia vara entre 2 y 5% y en los que estn en vas de desarrollo oscila entre 20 y 70% siendo una parasitosis endmica. Aunque en la Argentina no existen estudios sistematizados sobre la prevalencia de este parsito, de acuerdo a relevamientos realizados en diferentes partes del pas la infeccin con Giardia sera la causa de numerosos casos de diarrea y mala absorcin y/o de contaminacin fecal de productos para el consumo humano. Ms del 50% de los nios argentinos estaran infectados con G. lamblia, y sera una causa de desnutricin infantil. El mecanismo de infeccin es por fecalismo y la transmisin hdrica es la causante de la mayora de los casos. Los alimentos pueden contaminarse a travs de sus manipuladores. En las guarderas y jardines de infantes la infeccin sigue generalmente la ruta fecaloral directa, especialmente en nios que no controlan esfnteres. Los animales domsticos y balnearios tursticos son tambin fuentes de transmisin del parsito. Por otro lado, un factor a considerar es que la infeccin de animales de produccin (especialmente chinchillas y conejos) y domsticos (perros y gatos) produce prdidas econmicas de importancia. Adems, la inmensa mayora de los bioterios del pas que mantienen animales para experimentacin y que fueron analizados durante los ltimos aos mantenan ratas, ratones y conejos infectados con Giardia. Para prevenir la giardiosis es necesario dotar a las comunidades de saneamiento ambiental, suministro de agua potable, as como promover los hbitos de higiene personal mediante programas educacionales. Hay que verificar la buena higiene de
frutas y verduras que sern consumidas sin coccin. Tambin debe evitarse el riego y abono de cultivos de hortalizas con aguas negras. Hasta el presente, la nica posibilidad de tratar la giardiosis
es utilizando medicamentos cuyos principios activos no son altamente eficaces, pueden presentar un gran nmero de efectos secundarios y ya se han registrado cepas de Giardia resistentes a los mismos. Adems, es frecuente la re-infeccin luego del tratamiento debido a que estos individuos no generan mecanismos de defensas eficaces para eliminar el parsito. Los quistes, formas de diseminacin son
muy resistentes y se mantienen viables durante meses en agua fra y limpia. Son sensibles a la desecacin y se destruyen por calentamiento a temperaturas superiores a 50C y por fenol al 2,5%. Resisten la accin del formol, HgCl2 y permanganato de potasio. Las concentraciones de cloro empleadas en el clorinado del agua potable no alcanzan a destruirlos, por lo que un agua bacteriolgicamente segura, puede no serlo parasitolgicamente. La forma segura de consumir agua
es mediante previa ebullicin durante al menos 10 minutos para destruir los quistes. Algunos filtros tambin son adecuados para su eliminacin.
ACTIVIDADES A DESARROLLAR Los alumnos efectuarn preparaciones frescas de materia fecal enriquecida, para ello se debe colocar en portaobjetos limpios y desengrasados una gota de colorante de fondo como lugol o eosina, y posteriormente una gota de las heces a estudiar, colocar el cubreobjetos y llevar al microscopio utilizando los objetivos de bajo aumento, 10x y luego 40x procurando el reconocimiento de las formas qusticas de los protozoarios. Se observarn quistes de Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica y coli. Adems el alumno procurar observar en frotis de materia fecal, previamente fijados con APV y teidos con May Grunwald - Giemsa (objetivo de inmersin, 100 x), la presencia de trofozotos de Giardia intestinalis. En frotis teidos con las coloraciones de: Gram y May Grunwald- Giemsa, el alumno tratar de observar los trofozotos de Trichomonas vaginalis, con el objetivo de inmersin (100 x). IMPORTANTE Se recomienda dejar los microscopios en ptimas condiciones de limpieza ya que luego sern utilizados por otros alumnos, y las ltimas comisiones de cada da deben desenchufarlos y taparlos convenientemente. Muchas gracias.-
BIBLIOGRAFA Curso Protozoarios Intestinales Federacin Bioqumica Argentina 2009 Parasitologa De las molculas a la enfermedad Romero Cabello Mc Graw Hill 2004 Atlas de Parasitologa Mdica Rodrguez Prez - Mc Graw Hill 2004
PARASITOSIS HEMATICAS Y TISULARES Trabajo Prctico de Laboratorio N 3
Mtodos de diagnstico OBJETIVOS DEL TRABAJO PRCTICO: Conocer la importancia de estas parasitosis en nuestro medio. Identificar la morfologa de los distintos estadios de desarrollo de los protozoos que originan estas parasitosis. Conocer las metodologas adecuadas para realizar el diagnstico parasitolgico. Interpretar y evaluar las diferentes tcnicas de diagnstico para utilizarlas criteriosamente en la prctica profesional.
INTRODUCCIN TERICA MALARIA O PALUDISMO: Enfermedad parasitaria de enorme importancia, que ltimamente ha venido en aumento por el gran nmero de casos que se estn presentando en varios pases. Pertenece al grupo de las protozoosis transmitidas por artrpodos, porque en forma natural se transmite con la picadura de la hembra del gnero Anopheles y su agente etiolgico es un protozoario que carece de rganos de locomocin, Plasmodium, con cuatro especies Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum y Plasmodium ovale. El ciclo biolgico de Plasmodium (Figura 1) es complejo y se compone de varios subciclos, en forma muy resumida podemos describir el eritroctrico: que se lleva a cabo en los eritrocitos; y el esporognico: que se efecta en el artrpodo trasmisor. Los mecanismos de dao son varios y complejos entre los que se destacan la destruccin de eritrocitos, pigmentacin de tejidos y alteraciones vasculares. Se producen mltiples fenmenos en el husped vertebrado, como anemia, hipoxemia, interferencia en el funcionamiento pulmonar, alteraciones en la permeabilidad vascular y en la circulacin, cambios hsticos desde reversibles hasta necrticos, hiperpigmentacin tisular, hipertrofias e hiperplasias y fenmenos inflamatorios. A consecuencia de las mltiples alteraciones del organismo, el hombre con paludismo puede presentar un cuadro clnico variable en intensidad pero con un componente mas o menos constante: el acceso paldico, que se caracteriza por escalofros, fiebre y sudoracin. Estos accesos se presentan con regularidad cada tres das para las especies vivax y falciparum y cada cuatro das para malariae. De acuerdo con las condiciones del paciente y la especie de Plasmodium de que se trate ser la severidad del caso, pudindose presentar anemia, esplenomegalia, hepatomegalia, trastornos cardiacos,
pulmonares, renales, digestivos, de sistema nervioso central y hemorrgicos. El dao puede llevar al paciente a la muerte, sobre todo en casos de infeccin por Plasmodium falciparum, y en nios. Para establecer el diagnstico de paludismo se deben estudiar los aspectos epidemiolgicos, clnicos y de laboratorio. En estos ltimos, se hace por demostracin del parsito en alguna de sus fases de desarrollo, o en su defecto, la cuantificacin de anticuerpos especficos para el parsito. Para lo primero se recurre al examen de frotis y gota gruesa de sangre, y para la demostracin de anticuerpos a las pruebas de hemaglutinacin indirecta, inmunoensayo fluorescente y ELISA. El tratamiento
del paludismo se realiza con drogas supresivas, que suprimen la sintomatologa del acceso paldico, y drogas de erradicacin, para evitar las recadas: cloroquina y primaquina, respectivamente.
Figura 1 - Ciclo biolgico de Plasmodium LEISHMANIOSIS La familia Trypanosomatidae incluye dos gneros Leishmania y el gnero Trypanosoma. Leishmania tiene 20 especies y dos subgneros: Leishmania y Viannia. El gnero Leishmania produce enfermedades en piel, mucosas y vsceras, en Amrica produce enfermedad Leishmania mexicana mexicana y Leishmania viannia bransiliensis, Leishmania donovani chagasi y Leishmania donovani donovani. Entre las leishmaniasis existen las visceral, la cutnea de Oriente, la mucocutnea y la cutnea. Leishmania tiene dos formas: el amastigote ovalado, con membrana, ncleo, quinetoplasto, flagelo y tamao de 2,5 a 3,5 micras; y el promastigote, que es alargado, de 18 a 20 micras, ncleo, blefaroplasto y flagelo corto. Un individuo parasitado tiene amastigotes en sus clulas del sistema fagoctico mononuclear. Dentro de estas clulas se multiplican los amastigotes, rompen las clulas, quedan libres e invaden otras clulas. Llega un mosquito, pica y succiona clulas parasitadas, en el intestino del mosco quedan libres los amastigotes, el parasito en el intestino madura y evoluciona a promastigotes procclicos, se transforma en promastigote metacclico y migra a probscide. Cuando el
mosquito pica a otro husped, le inocula los premastigotes, los cuales son fagocitados; dentro de los fagolisosomas se diferencian a amastigotes, proliferan por fisin binaria, rompen la clula y penetran a otras clulas. Leishmania donovani donovani origina el Kala-azar en la India, su transmisor es Phlebotomus sergenti. Leishmania mexicana mexicana causa la lcera de los chicleros y su transmisor es Lutzomya olmeca olmeca. Leishmania brasiliensis brasiliensis genera la espundia. En la infeccin con este parsito pueden destruirse cientos de miles de clulas del sistema fagoctico mononuclear. En la leishmaniasis visceral hay ataque al estado general, fiebre en agujas, esplenomegalia, hepatomegalia, prdida de peso, anemia, caquexia y cambios en la pigmentacin de la piel. La mortalidad puede ser del 100% si no es tratada y hasta el 15% con tratamiento. Es posible que se desarrolle leishmaniasis cutnea post Kala-azar, con ndulos cutneos. La leishmaniasis cutnea se presenta con dos formas clnicas: leishmaniasis cutnea localizada y la leishmaniasis cutnea difusa. En la lcera de los chicleros, las lceras crnicas no curan, son sangrantes y deforman los odos. En la leishmaniasis mucocutnea, despus de la piel, invade mucosas y produce destruccin de la nariz. Leishmania tropica genera botn de Oriente. El diagnstico se hace al demostrar la presencia del parsito en clulas del sistema fagoctico mononuclear, en hgado, bazo o ganglios, en improntas de las lceras. Tambin se hace por xenodiagnstico, cultivos en medios NNN o RPMI-1640, y por pruebas inmunolgicas: intradermorreaccin de Montenegro, inmunofluorescencia, ELISA, Inmunofluorescencia indirecta, inmunoelectrotranferencia, inmunohistopatologa y por PCR. El tratamiento se realiza con glucantime, pentostam, anfotericina B. La prevencin se lleva a cabo con el uso de mosquiteros, fumigacin y repelentes. Se estn evaluando vacunas con lisado de Leishmania y BCG y una vacuna recombinante Noticias Nacionales: Corrientes: Leishmaniasis Cutanea Humana La enfermedad est radicada desde hace aos en la ciudad de Corrientes. Los pacientes tuvieron un largo peregrinar para diagnosticarla por que los mdicos la desconocan. La gestin sanitaria anterior, provincial, fue advertida de lo que podia ocurrir en Capital. En 15 barrios de la ciudad de Corrientes hay pacientes que tienen leishmaniasis asegur ayer el director del Centro Nacional de Parasitologa y Enfermedades Tropicales (CENPETROP) de la Facultad de Medicina de la UNNE, Carlos Borda. El cientfico de amplia experiencia en la regin adems dijo que se localiz la leishmaniasis tegumentaria americana (LTA) en 19 departamentos, o sea un 76% del total de la provincia, esto nos lleva a concluir que la enfermedad es endmica en Corrientes. Estos estudios fueron realizados por un equipo interdisciplinario integrado por bilogos, zologos, farmacuticos y mdicos, desde el ao 1987.
Segn indic Borda un 56 por ciento de los pacientes viven en zonas urbanas. Toda esta informacin fue suministrada al Ministerio de Salud Pblica de la Provincia durante la gestin anterior y las autoridades municipales estn en conocimiento debido a que trabajan en conjunto con el CENPETROP, es por esto que llama la atencin que no se hayan tomado medidas de prevencin para el avance de la leishmaniasis. El director del CENPETROP adems recomend la educacin como la principal herramienta para combatir esta y otras enfermedades tropicales y parasitolgicas, pero no slo en las escuelas sino tambin en las universidades y a los profesionales. Hay que profundizar en la formacin de los profesionales acerca de la leishmaniasis porque muchos pacientes tuvieron un largo peregrinar hasta que obtuvieron un adecuado diagnstico dijo y agreg hace falta humildad para volver a aprender. Adems de la informacin y formacin de los profesionales mdicos, Borda inst a las autoridades en avanzar en un registro y censo de perros y gatos que determine la cantidad que existen en la ciudad. Fuente: PromedMail.org 02/03/2011
Figura 2 - Ciclo evolutivo de Leishmania
TRIPANOSOMIASIS AMERICANA O ENFERMEDAD DE CHAGAS Trypanosoma cruzi, familia Trypanosomatidae, produce la enfermedad de Chagas, de mayor trascendencia en Latinoamrica (Figura 3). Requiere de un transmisor el triatoma- que fabrica sus nidos dentro de las viviendas y es peridomstico: sus reservorios son el armadillo, el tejn, el perro, las ratas y los roedores. Los estadios del parsito son: amastigote, estructura esfrica de 2 a 3 micras de dimetro, tiene ncleo, quinetoplasto, flagelo corto; epimastigote, mide 20 a 25 micras, es fusiforme, con ncleo, quinetoplasto, flagelo, membrana ondulante y 25 a 27 micras. Hay dos tripomastigotes: metacclico y sanguneo. Un mamfero parasitado contiene amastigotes que rompen la clula, quedan libres en circulacin, se transforman en tripomastigotes y circulan o parasitan otra clula. Llega el triatomneo y succiona, se lleva los tripomastigotes, en el intestino medio se transforman en epimastigotes, se reproducen por fisin binaria; en el intestino posterior se convierten en tripomastigotes metacclicos. Cuando el triatomneo defeca, deja el tripomastigote metacclico, que despus penetra a los macrfagos, donde se transforma en amastigote; se reproduce en la clula, la rompe, queda libre y se transforma en tripomastigote, el cual puede invadir nuevas clulas. Otro mecanismo de infeccin puede ser por contacto en conjuntiva con tripomastigotes. En el sitio de
inoculacin se genera un fenmeno inflamatorio, el signo de Romaa o chagoma de inoculacin, y despus viene la diseminacin en el organismo. Tripanosoma cruzi produce dao por invasin de clulas y muerte celular, ocasiona daos irreversibles en corazn, aparato digestivo, sistema nervioso perifrico. En la fase aguda de las parasitosis, los microorganismos se replican en clulas epiteliales, macrfagos y fibroblastos, y se genera un proceso inflamatorio agudo. En las formas crnicas hay destruccin de clulas musculares y de clulas nerviosas, en las paredes del corazn se destruyen fibras musculares, en esfago y colon hay destruccin de fibras nerviosas. Se produce IgM en la fase aguda, mas tarde IgG e IgA. En la tripanosomiasis aguda el cuadro presenta malestar general,
fiebre, adenopatas, mialgias, epistaxis, escalofros, hepatomegalia, esplenomegalia, astenia, adinamia, y alteraciones electrocardiogrficas. En las tripanosomiasis crnicas se presentan bloqueos completos del nodo auriculoventricular, crecimiento ventricular, crecimiento auricular, valvulopatas, cardiomegalia, alteraciones del complejo QRS y de las ondas P y T; megaesfago, megacolon, hepatomegalia y esplenomegalia. El diagnstico se hace por medio de frotis sanguneo, gota gruesa, gota fresca, Strout, micro Strout, en cultivos en medio de NNN, inocular animales de laboratorio (xenodiagnstico). En la etapa crnica se utilizan mtodos serolgicos: HAI, IFI, ELISA y Western Blot y mtodos moleculares de hibridacin y reaccin en cadena de polimerasa. Para el tratamiento se usan nifurtimox, alopurinol, benzonidazol; la prevencin es por fumigacin, evitar la permanencia del insecto en las casas y control de la sangre para uso transfusional.
Figura 3 Ciclo evolutivo de Tripanosomiasis americana TOXOPLASMOSIS La toxoplasmosis es una de las parasitosis ms extendidas en el mundo; prueba de ello es que en las encuestas serolgicas demuestran que un alto porcentaje de la poblacin general tiene anticuerpos circulantes especficos contra Toxoplasma gondii, lo que manifiesta que ya se ha tenido contacto con este parsito. Toxoplasma gondii es un protozoo de gran complejidad en su ciclo biolgico (Figura 4) y muy difundido en la naturaleza, siendo mltiples especies las que pueden servirle como husped. En funcin de su transmisin, se le considera un protozoo transmitido por mecanismos diversos, ya que lo puede hacer a travs de la placenta, la leche, el calostro, con la ingestin de carne insuficientemente cocida, por contaminacin con heces de gato, gotitas de Pflgge, contacto de mucosas y por artrpodos. El dao que produce al husped humano es variable, y en general, se considera severo en el nio y leve o moderado en el adulto. En este ltimo, frecuentemente la toxoplasmosis es asintomtica, en cambio en el nio, y particularmente en el recin nacido, es muy patgena, invalidante y mortal. Toxoplasma invade y destruye clulas del sistema fagoctico mononuclear y del endotelio vascular, y produce en los tejidos fenmenos exudativos granulomatosos, de consolidacin y de calcificacin, adems de zonas de necrosis. Todo esto se da en diferentes rganos, aparaos y sistemas, siendo ms evidente el hgado, bazo, pulmn, ojo y sistema nervioso central.
Clnicamente, la toxoplasmosis se manifiesta con diversos cuadros clnicos que pueden ser congnitos o adquiridos despus del nacimiento. Los datos clnicos dependen de del rgano afectado o ms daado, de tal forma que hay evidencias neurolgicas, cardiacas, pulmonares, hepticas, esplnicas, digestivas, renales, cutneas, ganglionares y oculares. El diagnostico es difcil y se completa con la demostracin de formas parasitarias de Toxoplasma gondii, por medio de biopsia de ganglio, o con estudios inmunoserolgicos de reaccin de fijacin del complemento, hemaglutinacin indirecta HAI, inmunofluorescencia indirecta IFI o inmunoensayo ELISA. Para el tratamiento se debe valorar cada caso, para establecer un esquema teraputico a base de pirimetamina, espiramicina, sulfas y macrlidos.
Figura 4 Ciclo de toxoplasmosis MATERIALES Y METODOS: - Pruebas de laboratorio de Fase Aguda Mtodos directos Extendido Gota fresca Gota gruesa Microstrout o microhematocrito Strout
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Extendido:
Prueba gold standard para el diagnostico de Malaria junto con la gota gruesa, til para el diagnstico de Enfermedad de Chagas y otras parasitosis hemticas. Se realiza con sangre capilar o venosa en forma Manual se utilizan 2 portaobjetos de vidrio de 75 x 25 mm limpios, bordes biselados y esquinas romas. Se coloca una gota de sangre de 2 a 3 mm de dimetro en el extremo del portaobjeto. El tamao de la gota es importante. Demasiado grueso, resulta un extendido muy largo o muy grueso. Demasiado pequea el extendido ser corto o delgado. El portaobjeto extensor se sostiene con firmeza con la mano dominante a un ngulo de 30 a 45 grados, se lleva hacia atrs hasta tocar la gota de sangre, dejando que se esparza en todo lo ancho del portaobjetos. Entonces se empuja con rapidez y suavidad hacia delante, hasta el final del portaobjetos Toda la gota debe incluirse en el extendido. Un movimiento lento produce mala distribucin de los leucocitos, porque desplaza las clulas ms grandes hacia el final y los lados del extendido. En Htos. (Hematocritos) altos ngulo de 25 grados. En Hto bajos aumentar el ngulo
-Caractersticas de un extendido bien preparado

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Debe cubrir de dos tercios a tres cuartas partes de la longitud del extendido. Tiene forma de dedo, ligeramente redondeado en el borde ms fino Los bordes laterales deben ser visibles. Extendido parejo, sin agujeros ni estras. Toda la gota debe ser incluida y extendida Al colocar contra la luz la porcin delgada debe tener aspecto en arco iris La preparacin y tincin de extendidos puede ser automatizada; Despus que el equipo analiz una muestra, el portador desplaza el tubo y lee el cdigo de barras. De acuerdo con el Hto el sistema ajusta el tamao de la gota a usar, y el ngulo y la velocidad del portaobjetos extensor. Luego de preparar el extendido, el portaobjetos extensor se limpia en forma automtica. El nombre, nmero y fecha de la muestra se imprime en el portaobjetos. Luego se seca, se carga un cassette y se va al sitio de tincin, cuando la tincin est terminada, el portaobjetos se desplaza a un sitio de secado, luego a una zona de almacenamiento, para ser ledo. Deben secarse tan rpido como sea posible. Los dispositivos de tincin automatizados son tiles en laboratorios con alto volumen de muestras. Se necesita 5 a 10 min. para teir un lote de portaobjetos. Los portaobjetos se sumergen automticamente en el colorante, luego en el buffer y en una serie de lavados. Una vez que el proceso de tincin inicio no pueden agregarse portaobjetos al lote. Las soluciones de tincin son estables de 3 a 6 horas. Examen microscpico
o
El microscopio debe calibrase

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REA DE ANLISIS CLNICOS
2011

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La luz debe centrarse de manera adecuada El condensador debe estar elevado casi por completo Calibrar correctamente el aumento Diafragma abrir una cantidad de luz cmoda para el ojo. Uso de filtro.
Con el objetivo de 10x

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Puede evaluarse la calidad del extendido, el color y la distribucin de las clulas. Cantidad desproporcionada de monocitos en el borde indica mala extensin. Presencia de filamentos de fibrina, distribucin de los eritrocitos, formacin de rodillos o aglutinacin.
Con el lente de 100x

o o o
Se utiliza aceite de inmersin Un rea demasiado delgada, no es aceptable. Un rea demasiado espesa distorsiona los eritrocitos al amontonarlos uno encima de otro. Debe quitarse el aceite.
Gota fresca: Prueba utilizada en el diagnstico de la Enfermedad de Chagas. Se realiza obteniendo sangre capilar por puncin digital o venosa recogida con heparina, se coloca una gota entre portaobjetos y cubreobjetos, realizando la observacin en 40X de aumento y contraste de fases si es posible. Debe realizarse por lo menos 3 portas con 2 preparados cada uno y recorrer minuciosamente todos los campos. Tiene una sensibilidad aproximada del 50% comparada con el Xenodiagnstico. La identificacin del parsito es clara debido al movimiento ondulante tpico del parsito entre los elementos de la sangre. Se recomienda realizarla en forma seriada por lo menos una semana antes de darla como negativa, lo mismo para las dems pruebas de bsqueda del parsito. Materiales: Lanceta Algodn Portaobjetos Cubreobjetos Sol. Fisiolgica o heparina Etanol Guantes
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Procedimiento:
1 - Sujetar el dedo anular izquierdo. Nunca debe hacerse la toma de muestra en el pulgar, ni en adultos ni en nios. 2 - Limpiar la zona con algodn empapado en alcohol, frotando para eliminar la suciedad y la grasa. 3 - Con una lanceta estril hacer la puncin en la cara lateral del dedo (nunca en la yema), presionando el extremo del mismo y con golpe seco se punza hasta suficiente profundidad de la lanceta (tope de la misma) para que la sangre vierta libremente con suave presin. 4 - Presionar ligeramente el dedo y descartar la primera gota de sangre limpiando la zona con papel de filtro o pauelo de papel. Presionar nuevamente el dedo y recoger la gota de sangre en el centro del portaobjetos. 5 - Agregar una gota de igual tamao de Sol. fisiolgica o si se prefiere de heparina (mediante esta solucin se impide la coagulacin, tenindose ms tiempo para estudiar el preparado). 6 - Mezclar las gotas usando una esquina del cubreobjetos. Cubrir con ste la preparacin. 7 - Examinar todo el preparado con 10X y 40X.
Gota gruesa: Esta prueba se utiliza para diagnosticar Enfermedad de Chagas y Malaria. Se depositan varias gotas de sangre capilar superpuestas en un portaobjeto. Las mismas se extienden en forma circular con un palillo o bien girndola sobre el dedo. Esto se hace para que los parsitos no queden atrapados en las redes de fibrina (desfibrinar).Se deja secar al aire libre. Se hace una dilucin de la solucin de Giemsa, que se vuelca sobre el preparado y se deja actuar por espacio de media hora. De esta manera se hace la deshemoglobinizacin (lisis de hemates) y la coloracin en forma simultnea. Se lava suavemente con agua destilada. Se deja secar al aire libre o con una estufa, colocando los portaobjetos en posicin inclinada para que el agua escurra con facilidad. Una vez seco, se examina al microscopio. Se observan teidos los ncleos y granulaciones de neutrfilos, eosinfilos, basfilos. Los citoplasmas de los parsitos se colorean de azul celeste y las sustancias cromticas de color prpura o rojo violceo. Tiene como ventaja que el preparado puede guardarse para posteriores observaciones. Materiales: Lanceta Algodn Portaobjetos Cubreobjetos Etanol Guantes Colorante Giemsa
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Procedimiento:
1 - Realizar una puncin con lanceta, teniendo en cuenta las mismas consideraciones que para la toma de muestra anterior. 2 - En el centro de un portaobjetos, colocar una gota de sangre de mayor volumen. 3 - Sin retirar el portaobjetos de la superficie del dedo del paciente realizar movimientos circulares y en espiral agrandando el dimetro de la muestra (aprox. 2 cm) durante 3 a 5 minutos para desfibrinar. Si la cantidad de sangre no es suficiente, se puede colocar una segunda gota cerca de la primera. Debe tratarse que el dedo del paciente no toque el portaobjetos, sino que el contacto se realice entre ste y la gota de sangre. 4 - Una vez que se ha obtenido la cantidad necesaria de sangre, se limpia el dedo del paciente con algodn humedecido en alcohol. 5 - Dejar secar la gota gruesa manteniendo el preparado boca arriba. 6 - Una vez seca la muestra se procede a su identificacin con lpiz de grafito. 7 Luego se procede a la coloracin con GIEMSA en la proporcin de una gota del colorante por 20 gotas de agua destilada, que se vuelca sobre el preparado y se deja actuar por espacio de media hora. 8- Se lava, se deja secar a T ambiente y se procede a la observacin microscpica a 100X. No utilizar bolgrafo, ni tinta ni marcador de fibra sobre la parte gruesa del preparado. Se aconseja dejar secar perfectamente bien la muestra, para evitar que se desprenda durante la coloracin.
Imagen al microscopio de extendido sanguneo Micro hematocrito (o Micro Strout)
Gota gruesa y extendido
Es un mtodo de concentracin de parsitos, que se basa en la centrifugacin controlada de sangre entera heparinizada, cuyo objetivo es que se ubiquen los parsitos entre la capa de glbulos blancos (GB) y por encima de los rojos.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Este mtodo cuenta con varias ventajas: -
su sencillez es semejante al de la gota fresca, pero es ms rpido y ms sensible, se ha probado que posee igual sensibilidad que Strout y Xenodiagnstico en la fase aguda, emplea poco volumen por lo que es ideal para estudio de Chagas congnito y el agudo especialmente en nios. Se cargan 6 capilares de microhematocrito con sangre heparinizada, en caso de sacar sangre
directamente del paciente, usar microhematocritos heparinizados. Centrifugar a 5000rpm durante 45 segundos, luego se cortan inmediatamente por debajo de la capa de GB. Los preparados se realizan sobre portaobjetos, depositando la capa de GB, se aplica un cubreobjetos y se examina al microscopio con un aumento de 40X si es posible en contraste de fases, por lo menos 15 minutos antes de darlo por negativo, se buscan parsitos que se distinguen por su tpico movimiento y su morfologa. Materiales: Capilares heparinizados para microhematocrito Portaobjetos Cubreobjetos Lancetas Etanol Algodn Papel de filtro o pauelos de papel Procedimiento: 1 - Realizar una puncin con lanceta de la misma forma que en los casos anteriores. 2 - Recoger la sangre en los capilares para microhematocrito. 3 - Tapar el extremo inferior del capilar con masilla, plastilina o jabn. 4 - Centrifugar a 5000 r.p.m. durante 45 segundos. 5 - Fracturar el capilar en el lmite de la capa leucocitaria. 6 - Depositar sobre un portaobjetos la capa de leucocitos y plasma y cubrir con un cubreobjetos. 7 - Examinar al microscopio con 10x y 40x recorriendo ntegramente la preparacin.
Tcnica de STROUT Es un mtodo de concentracin donde el suero exudado de la sangre coagulada se centrifuga selectivamente, la primera vez a muy bajas revoluciones para eliminar los glbulos rojos (GR) que arrastra el suero y la segunda centrifugacin a velocidad mxima para que sedimenten los parsitos y con el sedimento realizar los preparados para su bsqueda. Muy til para la Enfermedad de Chagas. La ventaja que posee este mtodo es que hace una gran concentracin de parsitos de la sangre total y adems la observacin microscpica es ms limpia, pues se eliminan en gran parte los GR, adems de obtener suero para realizar la serologa si fuese necesario. Es de fcil preparacin y de mayor sensibilidad, estimada en un 95 %.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Materiales: Tubos de centrfuga Jeringa con aguja para puncin venosa Lazo Portaobjetos Cubreobjetos Pipetas Pasteur Etanol Algodn Procedimiento:
1 - Extraer 5 a 10 ml. de sangre por puncin venosa, sin anticoagulante, colocar en un tubo de centrfuga, dejar coagular y retirar el cogulo. 2 - Recoger el sobrenadante y centrifugar a muy bajas r.p.m. (punto que deber ser calibrado por cada laboratorio con cada centrfuga) durante 1 a 2 minutos para separar los GR. El suero deber observarse opalescente debido a la presencia de GR en suspensin. Si se saca el suero translcido los parsitos se van al fondo del tubo y se corre el riesgo de un falso negativo. 3 Trasvasar el sobrenadante y volver a centrifugar ahora con la mxima velocidad de la centrfuga, durante 5 minutos. Se busca con esto que los parsitos sedimenten junto con el resto de GR que quedaron anteriormente. 3 Volcar el sobrenadante (suero), el cual se puede guardar para diagnstico serolgico. 4 - Realizar un preparado entre portaobjetos y cubreobjetos con el sedimento. Se observa con lentes de 10x y 40x en busca de formas mviles de parsitos.
Mtodos indirectos Xenodiagnstico Hemocultivo
Tienen mayor sensibilidad que los anteriores, pero slo se realizan en laboratorios especializados. En la etapa indeterminada y crnica la sensibilidad es variable, oscila entre el 10 y el 90%.
Xenodiagnstico: Para la Enfermedad de Chagas el mtodo consiste en el empleo de los vectores, los que se alimentan sobre los pacientes sospechosos. Luego de un cierto tiempo se examina el contenido intestinal y heces de los insectos en busca del parsito.
Actualmente se ha estandarizado utilizando cuatro cajas que contienen 10 ninfas cada una de tercer o cuarto estadio (total 40). Estas ninfas deben ser obtenidas de criaderos de laboratorio, alimentadas solo con sangre de ave y con ayuno previo de dos semanas antes de su aplicacin.Las zonas recomendadas para su aplicacin son: antebrazo y pantorrilla. En caso de lactantes o nios pequeos el nmero de cajas se reduce a dos o menos. El tiempo de alimentacin de las ninfas debe ser de 30 minutos. Las cajas retiradas deben ser incubadas en lugar oscuro a una temperatura entre 25 y 30 C y la lectura se realiza entre los 30 y 60 das por observacin de las heces obtenidas por explecin del contenido intestinal entre porta y cubreobjetos al microscopio. Su sensibilidad en etapa aguda es del 100%. Para la investigacin de Leshmaniasis el Xenodiagnstico consiste en la inoculacin de material de la lesin en animales, lo que permite recuperar e identificar al parsito, adems de observar la lesin en el animal. Hemocultivo: Es un mtodo de aislamiento in vitro de Trypanosoma cruzi. Es sencillo aplicable a cualquier laboratorio que maneje la bacteriologa de rutina, ya que sigue sus mismos principios. Para su realizacin se emplea 1 ml. de sangre del paciente extrada con anticoagulante (que puede ser heparina o EDTA) que se agrega a los tubos con el medio de cultivo adecuado. El Instituto Fatala Chaben recomienda la utilizacin del medio de Warren. Para sembrar estos tubos tambin puede utilizarse el sedimento obtenido de la centrifugacin de 5 ml. de sangre luego de su centrifugacin a 5000 rpm durante 15 minutos. Se incuban a 28-30 con agitacin cada 24 hs. La lectura se realiza entre los 10 y 60 das, por toma del material recolectado en la superficie de los cultivos.
-Pruebas de laboratorio de Fase Crnica En relacin al laboratorio de fase crnica de la Enfermedad de Chagas observamos que pasando la primera etapa donde hay una alta parasitemia, el sistema inmunolgico del husped comienza a responder por lo que podemos detectar anticuerpos contra el T.cruzi. Dada la importancia que tiene el diagnstico, la serologa de la infeccin chagsica debe basarse en pruebas de alta confiabilidad. Estas pruebas son tiles para el diagnstico durante los estados indeterminado y crnico y para evaluar la respuesta teraputica. Segn el criterio de la OMS, el diagnstico serolgico de la enfermedad de Chagas debe basarse en el diagnstico concordante de por lo menos dos reacciones practicadas simultneamente (par serolgico).
En Paludismo y Leshmaniasis tambin se utilizan pruebas serolgicas para la determinacin de anticuerpos especficos.
Estas tcnicas son: HAI Hemaglutinacin Indirecta IFI Inmunofluorescencia Indirecta ELISA Enzyme linked inmunosorbent assay FC- Fijacin de Complemento o MACHADO GUERREIRO
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA - HAI Fundamentos: Esta reaccin se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (Anti T. cruzi ,Anti T.gondii, etc.) de producir aglutinacin en presencia de glbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antgenos. En el suero existen anticuerpos inespecficos (heterfilos) que son capaces de aglutinar glbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol. Reactivos: -Antgeno: La tcnica de sensibilizacin de GR se basa en obtener un cultivo en medio artificial de T. cruzi o T. gondii los que se destruyen por congelamientos y descongelamientos sucesivos o bien por mtodos ultrasnicos. De esta manera se obtienen antgenos citoplasmticos y de superficie cuyo ttulo se debe investigar y estandarizar, para lo cual se debe disponer de un antgeno previamente titulado o patrn y sueros positivos y negativos. -Sensibilizacin de los GR: Se pueden usar GR de carnero extrados por puncin venosa en forma estril y conservada en solucin de Alsever a 4C Estos GR son lavados y resuspendidos en buffer de fosfatos de pH 7,2 y luego tratados con una solucin diluida de cido tnico (GR tanados). Luego se ponen en contacto con el antgeno anteriormente obtenido, se incuban y se lavan. -GR no sensibilizados: Suspensin al 1% de eritrocitos de carnero no sensibilizados, para control de heterofilia. -Buffer de fosfatos a pH 7,2. -2-mercaptoetanol-2-ME al 1%: Con cada lote de reacciones preparar una dilucin suficiente. -Control negativo: Suero humano no reactivo, inactivado.
1/100 con solucin fisiolgica en cantidad
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Materiales: Frascos Policubetas de 96 pocillos con fondo en U. Pipetas plsticas descartables Microdiluidores (25 l) Microgoteros (25 l) Tubos de ensayo y material volumtrico Cinta adhesiva transparente Papel de filtro. Tcnica de la reaccin
I- Titulacin sin 2-ME 1- Con microgotero, colocar una gota de buffer de fosfatos (25 l) en todos los pocillos a usar de la
policubeta.
2- Tomar una alcuota de cada suero con microdiluidores de 25 l (uno para cada muestra). Colocar cada
microdiluidor en el primer pocillo y rotarlo al menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra.
3- Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin ), pasando los microdiluidores al
pocillo siguiente hasta la dilucin que se desea investigar rotando en cada paso.
4- Colocar en los pocillos de las diluciones y una gota (25 l) de GR no sensibilizados para control
de heterofilia.
5- En el resto de los pocillos agregar una gota de GR sensiblizados. 6- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta. 7- Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones durante 90 minutos 8- Leer II- Titulacin con 2-ME 1- Colocar una gota de suero en el primer pocillo empleando pipetas descartables. 2- Diluir al agregando una gota de 2-ME al 1% a los mismos pocillos usando pipeta descartable. 3- Sellar estos pocillos con cinta adhesiva y mezclar aplicado suaves golpes laterales a la policubeta. 4- Incubar 30-60 minutos a 37C o 90 minutos a temperatura ambiente. 5- Retirar la cinta adhesiva y con microgotero de 25 l colocar una gota de buffer de fosfatos en los
restantes pocillos hasta la dilucin deseada.
6- Realizar los pasos 3 a 8 descriptos en la titulacin anterior.

Lectura de los resultados: No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn o pequeo anillo de bordes regulares.
Reactivo: formacin de una pelcula o manto que cubre el 50% o mas del fondo de los pocillos.
Imagen positiva (manto)
Imagen negativa (botn) Placa de HAI
IFI INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Fundamento: Se ponen en contacto, en un portaobjetos, el antgeno y el suero humano a investigar. En este caso vamos a describir para T. cruzi, pero sabemos que modificando el antgeno fijado, la tcnica es aplicable a otras determinaciones como Malaria, Leishmaniosis, Toxoplasmosis, etc. Despus se evidencian los anticuerpos fijados sobre ste antgeno por medio de una globulina antihumana marcada con fluorescena. Reactivos:
1- Antgeno
Se utiliza Tripanosoma cruzi de cultivo obtenido en medio bifsico o mejor an de medio monofsico. Se recoge el sobrenadante que contiene los parsitos despus de 3 a 4 das de incubacin a 27C. Se centrifuga durante 15 minutos a 400 r.p.m. y despus de decantar el sobrenadante, se resuspenden los tripanosomas en una solucin de NaCl 0,15 M ms 0,1 % de formol, se centrifuga nuevamente y se lava varias veces con solucin de NaCl 0,15 M. Se lleva luego la suspensin a una concentracin determinada de 15 a 20 tripanosomas por campo microscpico a 400 aumentos. Para ello se colocan 10 l de la suspensin sobre un portaobjetos limpio y se cubre con un cubreobjeto 22 x 22 mm, examinando el preparado a 400 aumentos para ajustar el nmero de parsitos por campo al nmero antedicho. Con sta suspensin se realizan las improntas en portaobjetos adecuados a tal fin en los distintos crculos, se dejan secar a temperatura ambiente y se fijan por calor en la misma forma que una preparacin bacteriolgica. Las improntas as obtenidas se guardan congeladas a -20C.
Improntas para IFI
2- Globulina antihumana marcada con fluorescena.

Se utiliza un conjugado comercial de calidad segura. El ttulo de cada lote de conjugado debe determinarse utilizando el equipo de microscopa de fluorescencia del laboratorio antes de utilizarlo en un anlisis de rutina. Para ello, preparar las siguientes diluciones del conjugado desconocido en solucin salina-buffer, incluyendo el ttulo indicado por el proveedor.
a) 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 b) 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400
si es necesario se pueden preparar diluciones mayores. Cada dilucin debe probarse con un suero control de ttulo conocido. El ttulo del conjugado que se debe elegir es la dilucin anterior a la mayor dilucin que da adecuada fluorescencia. Un conjugado satisfactorio no debe colorear directa o inespecficamente el antgeno en una dilucin 3 veces menor al ttulo hallado.
3- Solucin salina buffer (SSB)

ClNa................................... Na2HPO4........................... KH2PO4............................. AD c.s.p............................... El pH de sta solucin es de 7,2 7,65 grs. 0,724 grs. 0,21 grs. 1 litro
0,1. Puede guardarse en frasco de polietileno.
4- Medio de montar
Se prepara mezclando una parte de solucin salina-buffer de pH 8 con 9 partes de glicerina p.a.
5- Solucin de Azul de Evans

Solucin madre: Azul de Evans.............. AD...............................
1 gr 100 ml.
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En el momento de usar, preparar una dilucin que debe ser determinada para cada lote de solucin madre, frente a sueros y antgenos de reactividad conocida ( aprox. 1/500 a 1/1000)
6- Controles de coloracin inespecfica

Tratar un crculo de antgeno con solucin salina-buffer y realizar toda la tcnica. No debe haber fluorescencia. Tcnica de la reaccin En cada partida de reacciones, deben incluirse los siguientes controles: Control reactivo: Suero control de ttulo conocido. Control no reactivo: Suero control negativo. Control de coloracin inespecfica: Como se indic. Sobre el portaobjetos con Antgeno se colocan 30 l de suero del paciente diluido 1/30 (o bien las diluciones elegidas para semicuantificar la prueba) en SSB de pH 7,2. Se incuban los portaobjetos en cmara hmeda a 37C por media hora. Se lava con SSB durante 10 minutos, 2 veces y finalmente con AD, secndose con papel de filtro los bordes del portaobjetos. Se tratan ahora con la dilucin determinada de la globulina antihumana marcada, colocando en cada crculo del antgeno 30 l de sta dilucin. Se incuba, se lava y se seca igual que lo descripto anteriormente. Para realizar una coloracin de fondo, se cubren los preparados con solucin de Azul de Evans diluido a la concentracin apropiada durante 5 minutos y se repite el lavado y secado anterior. Los preparados se montan con glicerina tamponada pH 8 y se conservan en la oscuridad a 4C hasta el momento de la lectura (no ms de 2 horas). Lectura de las reacciones En el caso de los sueros positivos, los tripanosomas se observan con tpica fluorescencia amarillo-verdosa y los sueros negativos y los controles negativos y de coloracin inespecfica, de color rojizo sin fluorescencia. Para el ttulo de cada muestra reactiva se informa la inversa de la mayor dilucin que produce fluorescencia. ELISA Enzyme linked inmunosorbent assay Estas tcnicas se basan en la posibilidad de inmovilizar el antgeno a una fase slida, sobre la cual se permite en una primera etapa la unin del anticuerpo, reaccin no evidente. En una segunda etapa de la reaccin, el agregado de un segundo anticuerpo (anti-inmunoglobulina de la especie en estudio) acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa) se pone en contacto con la dupla antgeno-anticuerpo, permitindose la reaccin de esta cuando se agrega el sustrato correspondiente. La reaccin luego de ser detenida con los reactivos adecuados, se puede leer en forma directa, aunque lo aconsejable es la lectura por los valores de densidad ptica.
Esquema ELISA
FC Fijacin de complemento Machado Guerreiro Un anticuerpo especfico en presencia de antgenos de T. cruzi es capaz de unirse formando la unin Ag-Ac, la cual es capaz de fijar el complemento, por la fraccin Fc de la inmunoglobulina. Esta unin no visible se pone de manifiesto por un sistema indicador que permite que el complemento libre (esto es en ausencia de Ac.) produzca la hemlisis del sistema hemoltico formado por hemates de carnero y hemolisina (antisuero antihemates de carnero preparado en conejo). Esta tcnica es rigurosa y compleja en su preparacin y es de difcil estandarizacin por lo que ha dejado de ser una tcnica de eleccin.
ACTIVIDADES A DESARROLLAR:
1) OBSERVACIN MICROSCOPICA 1.1) Observacin de un preparado permanente con tripomastigotes. Morfologa que podemos encontrar en preparados sanguneos de laboratorio de fase aguda. 1.2) Observacin de un preparado permanente con epimastigotes.
Morfologa que podemos encontrar en cultivos, Hemocultivo y deyecciones del Triatoma. (Enfermedad de Chagas)
2) MOSTRACIN DEL MATERIAL UTILIZADO PARA LA REALIZACIN DE LA TCNICA DE XENODIAGNOSTICO. (Enfermedad de Chagas) Discusin acerca de la tcnica. 3) LABORATORIO de FASE AGUDA Se proceder a la realizacin de las tcnicas de: Extendido Gota fresca Gota gruesa Se proceder a la realizacin de los preparados con sangre entera provisto por el equipo docente siempre aplicando normas de Bioseguridad. Coloracin May Grunwald - Giemsa de los preparados (ver anexo) 4) LABORATORIO de FASE CRONICA Se proceder a la realizacin de la tcnica de HAI HEMAGLUTINACION INDIRECTA sin 2-ME. Respetando normas de bioseguridad correspondientes ya que utilizaremos muestra biolgicas potencialmente infectivas. Se recomienda dejar los microscopios en ptimas condiciones de limpieza ya que luego sern utilizados por otros alumnos, y las ltimas comisiones de cada da deben desenchufarlos y taparlos convenientemente. BIBLIOGRAFA Parasitologa De las molculas a la enfermedad Romero Cabello Mc Graw Hill 2004 Atlas de Parasitologa Mdica Rodrguez Prez - Mc Graw Hill 2004 Aprendizaje de la Parasitologa Basado en Problemas Flisser Editores de Textos Mexicanos
HELMINTOS Trabajo Prctico de laboratorio N 4
OBJETIVOS: Conocer los aspectos epidemiolgicos, morfolgicos, ciclos biolgicos, caractersticas clnicas de la enfermedad parasitaria, diagnstico, medidas de profilaxis, inmunologa e impacto ambiental de helmintos de inters mdico.
INTRODUCCIN TERICA PARASITOSIS INTESTINALES POR CESTODOS Y TREMATODES
Cestodos: generalidades Los cestodos son parsitos aplanados, formados por un rgano de fijacin llamado esclex y un cuerpo o estrbilo constituido por segmentos, llamados progltides, los cuales poseen independencia morfolgica y fisiolgica. El esclex, que es ms pequeo que el resto del cuerpo, es frecuentemente denominado cabeza, solamente es un rgano fijador que posee una prominencia denominada rostelo, ventosas o ganchos, en su extremo posterior o cuello se forman los progltides nuevos. La presencia o no de los ganchos y el nmero y forma de las ventosas, son caractersticas diferenciales de cada especie. Los progltides son ms jvenes en cuanto ms cerca estn del esclex. Los ms inmaduros no tienen caractersticas morfolgicas definidas, los maduros poseen rganos sexuales masculinos y femeninos, aparato excretor y sistema nervioso rudimentario. El nmero de progltides es muy variable, lo mismo ocurre con la longitud de los parsitos, que puede ser de escasos centmetros a 10 metros. Los ltimos progltides son grvidos, con gran cantidad de huevos. En algunas especies estos progltides se desprenden en el intestino y salen al exterior, son musculados y pueden poseer movimiento propio; al desintegrarse en el medio externo liberan gran cantidad de huevos infectantes. En otros esto no ocurre, sino que los huevos salen por un poro genital al intestino y se mezclan con la materia fecal. A travs de la forma, tamao y caractersticas morfolgicas de los progltides se pueden diferenciar las distintas especies. Los cestodos no poseen sistemas digestivo ni circulatorio, su nutricin es por absorcin directa de los materiales digeridos que se encuentran en el intestino del husped. Viven adheridos a la pared intestinal por el esclex, de manera que se consigue una eliminacin completa del parsito
cuando este esclex se ha desprendido y ha sido eliminado del organismo, sino continuar el crecimiento a partir de nuevos progltides formados en la parte delgada o cuello. Algunos tienen ciclos de vida relativamente complejos, en los que intervienen huspedes intermediarios, mientras que ingestin de huevos. Los principales cestodos que afectan al hombre son: otros pueden transmitirse directamente de persona a persona por
a) Cestodos grandes: Taenia solium, Taenia saginata y Diphyllobothrium latum. b) Cestodos medianos y pequeos: Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta. c) Larvas de cestodos: el hombre sufre invasin por formas larvarias de algunos cestodos, en cuyo
caso es husped intermediario, por ejemplo la cisticercosis causada por larvas de Taenia solium y la hidatidosis, por larvas de Echinococcus granulosus.
Taenia saginata Morfologa: Cestodo de 4 a 10 m de longitud, forma acintada y color amarillento. Constituido por: 1.- Esclex o cabeza con 4 ventosas musculares (elementos de fijacin a la mucosa intestinal) sin ganchos. 2.- Cuello corto, estrecho e indiviso. 3.- Estrbilo o cuerpo: formado por segmentos o progltides, en los anteriores predomina el dimetro transversal; en los intermedios, ambos dimetros son iguales, y en los posteriores predomina el longitudinal. 4.- Aparato reproductor: parsito hermafrodita, cada progltide posee rganos masculinos y femeninos. Poseen: testculos, conducto deferente, pene o cirro, ovarios, tero y vagina. 5.- Aparato excretor: formado por dos conductos que terminan en un orificio comn (foramen caudale). Ciclo biolgico: La evolucin es indirecta: Husped definitivo: hombre. Husped intermediario: ganado vacuno. Los huevos llegan al exterior transportados por los progltides maduros que se desprenden del parsito adulto ubicado en el intestino humano. Al salir con la materia fecal, caen sobre los pastos, contaminndolos, al ser ingeridos por el ganado vacuno, los huevos sufren la disolucin de sus envolturas por accin del medio intestinal del animal, liberndose el embrin hexacanto, el cual a travs de sus ganchos atraviesa el intestino, entrando en la circulacin y llegando al tejido conjuntivo interfascicular de los msculos del vacuno, y donde se localiza y enquista, convirtindose en larva Cysticercus bovis con su esclex invaginado. Al comer una persona carne vacuna mal cocida y que contenga la larva, por accin del jugo gstrico sta pierde la envoltura qustica, desenvagina el esclex y se fija por sus ventosas al intestino delgado, desarrollndose por brotacin el parsito adulto. Los
ltimos progltides cargados de huevos se desprenden, atraviesan espontneamente o con la defecacin el esfnter anal y contaminan los pastos, cerrndose as el ciclo. Accin patgena: La patologa que causa la Tenia en su estado adulto es muy escasa; pueden presentarse sntomas digestivos: dolor abdominal y nuseas, en ocasiones apendicitis aguda por obstruccin de la luz apendicular; sntomas alrgicos: urticaria y pruritos cutneos: sntomas generales: alteraciones en el carcter y en el sueo, cefaleas e inapetencia. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo carne vacuna mal cocida que contenga la larva. Diagnstico: Es macroscpico y microscpico. Macroscpico: Tiene como finalidad la identificacin del parsito completo o una de sus partes. La orientacin principal para el diagnstico se basa en la observacin por parte del paciente, de los fragmentos (progltides), que salen espontneamente o con la materia fecal. Se recomienda recogerlos y mantenerlos en agua hasta que puedan examinarse. Para esto se agrega un poco de cido actico para aclararlos. Si los segmentos se colocan entre dos portaobjetos y stos se comprimen con los dedos, pueden observarse al trasluz las ramificaciones uterinas, siendo ste un mtodo para diferenciar las especies (saginata de solium). En la primera las ramificaciones son dicotmicas, delgadas y numerosas. En la segunda son gruesas y escasas. Para buscar segmentos de tenia en materia fecal, se depositan las heces en un colador grande debajo de una canilla de agua, y lo que queda en el colador se vuelca sobre una bandeja de fondo oscuro para facilitar su visualizacin. Microscpico: Es muy difcil demostrar la presencia de huevos en materia fecal en ausencia de desprendimiento de segmentos. El parsito no posee orificio de postura como los Nematodes ( no pone huevos), por lo que los huevos se liberan en el intestino si los segmentos se desprenden. Los huevos pueden observarse microscpicamente por el mtodo de la cinta engomada de Graham, usado en el diagnstico de oxiuros, tambin por examen directo de heces y previo enriquecimiento por centrifugacin. Un importante avance inmunolgico en el diagnstico de teniosis es la deteccin de coproantgenos por el mtodo de ELISA, presenta 85% de sensibilidad y 95% de especificidad para T. saginata y da reaccin cruzada con T. solium. Los huevos de ambas especies son indiferenciables entre s, salvo que se utilice hibridizacin del DNA. Distribucin geogrfica: Cosmopolita. Profilaxis: Cocer bien la carne vacuna que puede contener la larva o Cysticercus bovis.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Taenia solium Morfologa: Semejante a la T. saginata. Las diferencias con aquella son:
1) el esclex en la T. solium es armado (doble corona de ganchos), posee rostro y es globulosa. 2) es ms corta que la T. saginata (dos a cinco metros). 3) tiene tres ovarios, de los cuales el tercero est orientado hacia el poro genital. 4) la vagina carece de esfnter.
Ciclo Biolgico: La evolucin es indirecta: Husped definitivo: hombre. Husped intermediario: ganado porcino. Los huevos eliminados sobre los pastos con las deposiciones del hombre parasitado, son ingeridos por el ganado porcino. Una vez en su aparato digestivo se disuelven las membranas por accin de los jugos intestinales, liberndose el embrin hexacanto, que merced a sus ganchos atraviesa la pared intestinal del cerdo, gana la circulacin sangunea o linftica y se localiza en los msculos, enquistndose (cisticerco), y desarrollando la larva (Cysticercus cellulosae). Cuando una persona se alimenta con esta carne mal cocida, entra en su organismo la larva, la cual, desenvaginndo su esclex, se fija por sus ventosas y ganchos al intestino humano. Por brotacin se genera el parsito adulto. Accin Patgena: Similar a la de T. saginata.
Ciclo biolgico de la teniosis por T. solium y T. saginata
Cisticercosis humana: es producida cuando el organismo humano alberga la larva de la T solium. El hombre se comporta como husped intermediario, pero con el ciclo biolgico de parsito se interrumpe. La presencia de metacestodos en el cerebro recibe el nombre de neurocisticercosis. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo carne de cerdo cruda o mal cocida, que contenga la larva. Diagnstico: Se utilizan los mismos mtodos y con el mismo criterio que para la teniasis por T. saginata. En esta enfermedad los segmentos generalmente se expulsan en pequeas cadenas. Distribucin Geogrfica: En Amrica se sealan dos zonas de mayor endemicidad: Centroamrica (Mxico, Guatemala y El Salvador), Estados Unidos y Chile. Profilaxis: Se realiza cociendo debidamente la carne porcina que se consume.
DIFERENCIAS FUNDAMENTALES ENTRE T. saginata y T. solium TENIA SAGINATA Carece ESCOLEX LONGITUD VAGINA OVARIOS POROS GENITALES N DE PROGLOTIDES RAMIFICACIONES UTERINAS 4 a 10 m. posee esfnter dos muy irregularmente alternados Ms de 1000. dicotmicas, numerosas delgadas 2 a 5 m. carece de esfnter tres mas regularmente alternados Menos de 1000 y Ms gruesas, escasas y de rostro. TENIA SOLIUM Inerme, Tiene rostro, armado (doble corona de ganchos), globulosa.
piriforme.
dendrticas. con la defecacin,
Con las materias fecales y Salen EXPULSION PROGLTIDES DE
espontneamente a travs del formando cadenas de cuatro, esfnter anal y a un elemento cinco o ms elementos. por vez. Ingiriendo carne vacuna mal Ingiriendo carne porcina mal cocida. cocida.
INFESTACION
a- Taenia solium b- Taenia saginata
c- Huevo de Taenia spp.
Hymenolepis nana Morfologa: Cestodo piriforme, blanquecino y de 15 a 25 mm de longitud. Est constituido por :
1- Esclex: Globuloso, con cuatro ventosas y un rostro provisto de una corona de ganchos (armado). 2- Cuello: Largo y no segmentado. 3- Estrbilo: Formado por progltides trapezoidales, los cuales presentan su respectivo poro genital.
Aumentan sus dimensiones del extremo anterior al posterior.
4- Aparato Reproductor: Parsito hermafrodita. Cada progltide posee rganos genitales masculinos y
femeninos.
Ciclo Biolgico. La evolucin es:
1) DIRECTA: sin huspedes intermediarios. Los huevos, eliminados con las deposiciones del sujeto que
alberga el parsito en su intestino delgado, contaminan las verduras y el agua. Cuando stas son ingeridas por una persona, los huevos entran en su organismo, sufriendo por accin del jugo digestivo la disolucin de ambas membranas, quedando en libertad el embrin hexacanto, el que por accin de los ganchos penetra en una vellosidad intestinal y se enquista, dando lugar a la larva ( Cisticercoide). Esta crece, determinando la ruptura de la vellosidad. La larva ya libre en la luz intestinal, desenvagina su esclex y se fija a la mucosa, desarrollndose por brotacin el parsito adulto. Es posible la autoinfestacin endgena y exgena: Autoinfestacin endgena: Los huevecillos liberados por los parsitos en la luz intestinal son embrionados y por lo tanto, infectantes. Unos son arrastrados con las deposiciones hacia el exterior y contaminan el medio para infectar a otros individuos. Otros cumplen el mismo ciclo que los huevecillos que provienen del exterior. Liberan los embriones en el intestino, los cuales se alojan en
las vellosidades formando los cisticercoides; stos caen luego en la luz intestinal transformndose en nuevos vermes adultos. Autoinfestacin exgena: Algunos huevecillos quedan adheridos a la regin perianal y, por el rascado, fundamentalmente y en los nios, se pueden contaminar las manos y uas, y vehiculizarlos hacia la boca y deglutirlos.
2) INDIRECTA: los huevos ingeridos por el artrpodo (Tenebrio molitor) dejan en libertad en su
intestino al embrin hexacanto, el que por sus ganchos, atraviesa la pared intestinal, llegando a su cavidad general, donde se convierte en larva (Cisticercoide). El hombre, al ingerir el artrpodo incorpora la larva al organismo, la cual, desenvaginado su esclex, se fija a la pared intestinal y desarrolla el parsito adulto. Este tipo de evolucin es experimental.
Huevo de H .nana Accin Patgena: Anorexia. Diarrea aguda. Diarrea persistente. Dolor abdominal recurrente. Cambios en el carcter sobre todo en los nios. Prurito anonasal. Urticarias (cuadro txico alrgico). Mecanismo de transmisin: Ingiriendo huevos que se pueden encontrar en el agua y verduras crudas. Diagnstico: Se efecta mediante el exmen microscpico directo y con enriquecimiento de la materia fecal, que permite la visualizacin de los huevos. Se puede realizar recuento de huevos y correlacionarlos con los sntomas clnicos. Distribucin Geogrfica: Cosmopolita Profilaxis: Hervir bien el agua y verduras. Higiene de las manos. Eliminacin de artrpodos. Disposicin adecuada de las excretas.
Hymenolepis diminuta Morfologa: Semejante a la de H. nana. Mide de 30 a 60 cm. y el esclex carece de ganchos. Presenta cuatro ventosas para su fijacin (inerme). Ciclo Biolgico. Evolucin indirecta Husped definitivo: habitual: rata accidental: hombre Husped intermediario: Artrpodos (gorgojo) Los huevos provenientes del parsito adulto localizado en las primeras porciones del intestino delgado son eliminados con las deposiciones del husped definitivo. Al ser ingeridos por el artrpodo intermediario, queda en libertad el embrin hexacanto, el cual atraviesa el intestino del artrpodo y llega a su cavidad general, donde se convierte en larva (cisticercoide). Cuando estos intermediarios son ingeridos accidentalmente con los alimentos, la larva entra en el organismo del husped definitivo, donde desenvaginado su esclex se fija a la mucosa intestinal dando lugar posteriormente al parsito adulto.
Huevo de H. diminuta
Ciclo biolgico de Hymenolepis nana
Ciclo biolgico de Hymenolepis diminuta
Accin Patgena: Provoca fenmenos similares a los ocasionados por la H. nana. Los nios suelen ser los ms frecuentemente afectados por este parsito, esta parasitosis es rara en adultos. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo accidentalmente uno de los artrpodos que pueda contener la larva. Se considera que la ingestin de harinas o granos viejos agorgojados constituyen la fuente ms propicia de infecciones. Distribucin Geogrfica: Cosmopolita Profilaxis: Proteger los alimentos, sobre todo el pan y harinas de los artrpodos transmisores. Cocer los alimentos debidamente.
Dipylidium caninum Morfologa: Cestodo de 20 a 40 cm. de longitud. Est constituido por: esclex romboidal, con cuatro ventosas y un rostro claviforme que posee de tres a cuatro corona de ganchos en forma de espina de rosal. cuello corto. estrbilo formado por progltides de bordes convexos, ms largos que anchos y rosado.(forma tpica de semilla de meln). Atraviesa espontneamente el esfnter anal. Ciclo Biolgico: La evolucin es indirecta: Husped definitivo habitual: perro Husped accidental : hombre Husped intermediario: artrpodos. (pulgas y piojos de perro) Los huevos eliminados con las deposiciones del husped definitivo son ingeridos por intermediarios, donde queda en libertad el embrin hexacanto, que se convierte en la cavidad general en larva (cisticercoide). Esta es ingerida por el perro o accidentalmente por el hombre, cuando ingieren una pulga o piojo. El parsito adulto se localiza en el intestino delgado de husped definitivo.
Cpsula ovgera de D. caninum
Ciclo biolgico de Dipylidium caninum
Accin Patgena: Determina fenmenos nerviosos y alteraciones digestivas. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo accidentalmente el artrpodo intermediario. Diagnstico: Debido a que los progltides ms maduros atraviesan espontneamente el esfnter anal, se pueden encontrar en las ropas de los enfermos los tpicos segmentos. Distribucin Geogrfica: Cosmopolita Profilaxis: Evitar la contaminacin de alimentos con los artrpodos transmisores. Desparasitar los animales domsticos infectados.
Diphyllobothrium latum Morfologa: Cestodo de una longitud de tres a nueve metros que a veces llega hasta los veinte metros. Est constituido por: esclex: alargado, de forma elptica, con dos hendiduras longitudinales (btrides) ubicadas una en la cara dorsal y otra en la ventral (aparato de fijacin). cuello: largo y estrecho. estrbilo: formado por progltides trapezoidales.
Ciclo biolgico de Diphyllobothrium spp
Ciclo Biolgico: Se cumple en el agua. La evolucin es indirecta: Husped definitivo: hombre, perro, felinos y otros mamferos Husped intermediario: crustceo coppodo, salmn, trucha, etc. Los huevos, operculados y no embrionados del parsito son eliminados con las deposiciones, desarrollndose en ellos a una temperatura adecuada (25C) y en un plazo de unos quince das el embrin hexacanto, llamado coracidium. Este presenta en su contorno un manto de cilias que utiliza para desplazarse en el agua. Saliendo el embrin del huevo a travs del oprculo se desplaza en el agua hasta encontrar al primer husped intermediario, que es un crustceo, el cual lo ingiere. En su interior el coracidium crece, pierde sus cilias y se convierte en larva procercoide. Cuando el crustceo es ingerido por el segundo husped intermediario (trucha, salmn) ingresa en el tubo digestivo del pez las larvas procercoide y estas, luego de atravesar la pared digestiva, se localizan en los msculos del pez donde se convierten en larvas plerocercoides. Al ser ingeridos los peces mal cocidos o crudos estas larvas siguen su desarrollo en el intestino humano hasta formar el parsito adulto.
Huevo de D. latum (la flecha marca el oprculo)
Accin Patgena: Da lugar a una enfermedad llamada botriocefalosis, diphyllobotriasis o difilobotriosis con una sintomatologa similar a la provocada por T. saginata. Algunos pacientes desarrollan una anemia macroctica indistinguible de la anemia perniciosa. El parsito necesita grandes cantidades de Vitamina B12 y se ha observado que la anemia solo surge si el verme est localizado en la parte proximal del intestino delgado. Infecciones masivas pueden producir obstruccin intestinal. La migracin de progltides puede causar colecistitis o colangitis. Mecanismo de transmisin: A travs de la carne mal cocida del salmn, trucha, etc., que contengan la larva plerocercoide. Diagnstico: El examen microscpico de materia fecal permite hallar los tpicos huevos, estos son usualmente numerosos y pueden ser demostrados sin tcnicas de concentracin. El exmen de progltides que pasan en heces es tambin un diagnstico de valor. Distribucin Geogrfica en Argentina: Los casos observados en nuestro pas han sido contrados en otras regiones, se han encontrado salmones parasitados en los lagos del sur del pas. Profilaxis: Evitar que las heces de los enfermos contaminen las aguas donde habitan los huspedes intermediarios. Cocer bien la carne de pescado. Echinococcus granulosus (Hidatidosis) Morfologa: Cestodo de forma acintada, color blanco amarillento, mide de 2 a 5 mm. Esclex: Globuloso, con cuatro ventosas y rostro con doble corona de ganchos (armado). Cuello: Corto y sin segmentar. Estrbilo: formado por tres o cuatro anillos rectangulares, salvo el ltimo que es ovoide. Slo este llega a madurar y se desprende. Ciclo biolgico. Evolucin indirecta: Husped definitivo: perro Husped intermediario habitual: ganado vacuno, lanar y porcino Husped accidental: hombre
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA La evolucin puede ser:
1) normal o progresiva: El perro con sus deposiciones elimina el ltimo anillo cargado de huevos, contaminando los pastos, el agua y las verduras. Cualquiera de los intermediarios nombrados al ingerir los alimentos infectados, pasto y agua en el caso del ganado, verduras, agua o contacto con el perro en el caso del hombre, incorpora a su organismo los huevos. Estos en el interior, por accin de los jugos digestivos sufren la disolucin de sus membranas, liberando el embrin hexacanto, el cual, por medio de sus ganchos atraviesa la pared intestinal y por el sistema porta llega al hgado, sitio de localizacin electiva. All se desarrolla la larva, hidtide o quiste hidatdico, la cual es rodeada y enquistada por una membrana reaccional conjuntiva, que es ajena a la estructura de la larva. A veces, los embriones logran llegar a travs de la circulacin general a otros rganos como: pulmn, cerebro, bazo, rin, huesos, etc. (equinococosis primaria). El perro se contamina comiendo rganos de ganado vacuno, lanar o porcino que posean los quistes o larvas ya desarrollados. Los esclex contenidos en estos quistes pasan a su intestino delgado, fijndose por medio de sus ventosas y ganchos a la pared intestinal. Por brotacin se desarrolla el parsito adulto.
2) Regresiva: Cuando por accin de una puncin, traumatismo, etc., se rompe el quiste, los esclex
contenidos en l se diseminan, fijndose en otros tejidos, especialmente serosas. Como no encuentran el medio propicio para seguir su evolucin normal y formar el parsito adulto, ya que aqul lo constituye el intestino del perro, se vesiculizan y originan ms quistes.
Ciclo evolutivo de Echinococcus granulosus

Los nmeros de la figura de la derecha indican las formas parasitarias del ciclo de la Izquierda. Estructura de la hidtide: La larva del E. granulosus est representada por un quiste lleno de lquido, en el que es necesario considerar un contenido y un continente. La hidtide tiene forma esfrica y su nmero es variable. Continente: formado por dos membranas adosadas
a) Membrana cuticular (externa) b) Membrana prolgera o germinativa (se encuentra por dentro de la cuticular).
Contenido: representado por lquido y elementos figurados que se generan a partir de la membrana prolgera.
a) Lquido hidatdico: lmpido y transparente como el agua de roca. Tiene propiedades antignicas pero
no txicas.
b) Vesculas prolgeras: en su interior se desarrollan los esclices o cabezas de las futuras tenias, los
cuales podran quedar en libertad, al romperse dichas vesculas.
c) Esclices: cuyo tamao es de 190 micras (dimetro mayor). d) Vesculas hijas: presentan la misma estructura del quiste madre. e) Vesculas nietas: se forman en el interior de las vesculas hijas.
Quiste hidatdico: El diagrama muestra tejido conectivo del husped (tch) en el exterior del quiste, al que sigue la capa laminar (cl) formada por el parsito, Dentro de la cl se encuentra la capa basal (cb) sobre la que descansa la germinal (cg) o capa de clulas proliferativas (ccp). Se forman capas de cra (cp) por engrosamiento y profusin de la ccp hacia la cavidad qustica para formar gemas. Estas
ltimas se desarrollan, adquieren un tallo y se vacuolizan (1, 2 ,3). Un proceso de gemacin similar conduce a la formacin de protoesclices (pe). La cp puede separarse del quiste principal si el tallo (t) se rompe. En este caso nada libremente en el lquido en la cavidad o romperse para liberar los protoesclices. Estos asientan en el fondo formando la arenilla hidatdica (ah). La cp puede desarrollar una capa laminar y transformarse en un quiste hijo (qh). Accin patgena: Se denomina hidatidosis o equinococosis a la parasitosis causada por la larva del Echinococcus granulosus. Puede ser primitiva o secundaria. Hidatidosis primitiva: el quiste hidatdico se origina en el embrin hexacanto que ha llegado al organismo humano con el huevo del parsito introducido en su tubo digestivo y que ha cumplido la evolucin normal o progresiva. Se pueden localizar en hgado (son las ms frecuentes), en pulmn, bazo, rin, sistema nervioso, huesos, ojo, corazn, piel y msculos. Las manifestaciones del quiste son debidas a fenmenos de compresin por el desarrollo expansivo de la larva y las complicaciones que resulten del sufrimiento y muerte de esta larva o al pasaje hacia el organismo parasitado de sustancias elaboradas por la misma. Hidatidosis secundaria: Se origina a partir de los esclices de un quiste primitivo que al romperse caen en alguna cavidad serosa o en la luz de algn vaso o conducto que los llevar a una nueva implantacin donde generarn nuevos quistes hidatdicos. Se cumple as la evolucin regresiva. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo huevos eliminados por el perro con sus deposiciones que pueden contaminar el agua, verduras o al hombre que est en contacto con l y se lleve las manos a la boca. Diagnstico: Se realiza por estudios clnicos, radiolgicos, centellogrficos, ecogrficos, tomogrficos e inmunolgicos. Puede haber eosinofilia pero no es constante. El diagnstico parasitolgico se har por mtodos directos e indirectos. Mtodos directos. En el caso de un quiste abierto en bronquios y expulsado al exterior por una vmica o por la expectoracin se pueden observar algunos de los elementos constitutivos del quiste como vesculas hijas o trozos de cuticular (macroscpicamente) y vesculas prolgeras, esclices, ganchos (ver figura) y trozos de membrana (microscpicamente).
Gancho de E. granulosus
Mtodos indirectos o inmunodiagnstico. Existen varias pruebas, el antgeno del E. granulosus que generalmente se emplea es el lquido hidatdico.
1) Inmunoelectroforesis y doble difusin. Ambas pruebas se basan en la deteccin del arco 5 de Capron,
que es una banda de precipitacin caracterstica que se forma a partir de una de las fracciones antignicas del lquido hidatdico. La presencia de este arco en la inmunoelectroforesis o en la doble difusin 5, confirma la hidatidosis (100% de especificidad) ya que hasta el momento no se observ en pacientes sin hidatidosis o en otras parasitosis. La ausencia del arco 5 no descarta enfermedad hidatdica.(baja sensibilidad)
2) Prueba del ltex. Consiste en sensibilizar partculas de ltex con lquido hidatdico, que al ser
enfrentadas con un suero que contiene anticuerpos, stos reaccionan con los antgenos fijados a las partculas y las aglutina. La prueba positiva sospecha una hidatidosis, la que se tratar de confirmar con inmunoelectroforsis o con doble difusin 5. No es muy recomendada
3) Hemaglutinacin indirecta. Consiste en recubrir con antgeno hidatdico la superficie de hemates

tratados previamente con cido tnico. Cuando estos hemates se enfrentan con sueros que contienen anticuerpos, stos reaccionan con el antgeno y se produce la aglutinacin de los hemates. Se pueden producir reacciones cruzadas e inespecficas. Estas se observan en ttulos bajos y desaparecen cuando se aumenta la dilucin del suero. No es muy recomendada
4) ELISA-IgG: sensible y especfica 5) IFI: es sensible y especfica 6) Intradermoreaccin de Casoni: se debe realizar con antgenos estandarizados, pueden dar falsos
positivos con triquinosis y fasciolosis por lo que se debe interpretar con la clnica y otros exmenes.
Distribucin geogrfica: Cosmopolita. En nuestro pas es muy frecuente en las provincias de Buenos Aires, Entre Ros, La Pampa, Santa Cruz y Chubut, debido a la gran cantidad de ganado lanar. No olvidar: oveja + perro = hidatidosis. Tambin en la Provincia de San Luis se dan numerosos casos de esta enfermedad. Profilaxis: Desparasitar a los perros e impedir la proximidad de ellos a los mataderos. Evitar que coman vsceras que pueden ser portadoras de quistes. Educacin para la salud (higiene personal, aseo de manos antes de comer y despus de jugar con los perros). Hervir las verduras.
TREMATODOS: GENERALIDADES Los trematodos son platelmintos que tienen dos ventosas por lo cual se les ha denominado tambin distomas. La mayora son aplanados en forma de hoja y hermafroditas, de lo cual se exceptan los esquistosomas. Fasciola heptica Morfologa: Este parsito aplanado y en forma de hoja, mide unos tres centmetros de largo. Presenta en la parte anterior dos ventosas, ambas constituyen el aparato de fijacin y entre ellas se halla sobre la cara ventral el poro genital. El aparato digestivo consiste en: faringe, esfago y el ciego dividido en dos tubos ramificados. Son hermafroditas y los rganos genitales masculinos y femeninos estn muy desarrollados, ramificados y poseen un orificio o poro genital cercano a la ventosa ventral. Ciclo Biolgico: La evolucin es indirecta: Husped definitivo: habitual: ganado vacuno Husped accidental: hombre Husped intermediario: moluscos Los huevos (150 micras) que son ovalados y con un oprculo o tapa en uno de sus extremos, son eliminados con las deposiciones; los mismos provienen del parsito adulto, localizado en los canalculos biliares. Los huevos llegan al agua donde en el plazo de unas tres semanas desarrollan el embrin o miracidio que se encuentra cubierto de cilias, las que utiliza para desplazarse en el agua luego de salir del huevo. El miracidio invade el molusco intermediario en el cual se reproduce y forma esporoquistes, redias y cercarias. Estas ltimas tienen cuerpo redondeado y cola no bifurcada, estas abandonan el caracol, nadan en el agua para buscar plantas a las que se adhieren y se transforman en metacercarias de aproximadamente 0,5 mm, redondeadas y cubiertas de una membrana gruesa. Estas metacercarias se encuentran dentro del tejido vegetal de modo que no son eliminadas con el lavado de las plantas parasitadas. Los huspedes definitivos se infectan al consumir estas plantas contaminadas (berro). En el intestino delgado se libera el parsito inmaduro, que atraviesa la pared intestinal, el peritoneo y la cpsula heptica para luego buscar los canalculos biliares donde se desarrolla a adulto en tres a cuatro meses.
Ciclo de Fasciola heptia Accin Patgena: Provoca distomatosis, sea heptica determinada por la accin del distoma sobre la glndula o bucofarngea la cual se produce cuando una persona se alimenta de hgado crudo que posee distomas, los que determinan congestin y edema de la mucosa.
Las principales acciones de la fasciola son:
1- Mecnica : produce obstruccin de los canalculos biliares y origina ictericia de tipo obstructiva 2- Txica : lleva a la anemia 3- Inflamatoria: sobre los canalculos biliares (colangitis).
Mecanismo de transmisin: Ingiriendo agua o plantas acuticas (berro) que contengan metacercarias. Diagnstico: Se efecta por el examen microscpico directo o con mtodos de enriquecimiento de la materia fecal, se utilizan los de sedimentacin; los de flotacin no se recomiendan por el tamao y el peso de los huevos del parsito. La bsqueda de huevos tpicos se efecta con el objetivo panormico (4x). Un mtodo ms seguro es el sondeo duodenal (Enterotest) pero en los ltimos aos ha cado en desuso. En ambos casos se encontrarn huevos.
El diagnstico inmunolgico se puede realizar con la bsqueda de anticuerpos y antgenos a travs de pruebas serolgicas como: Inmunofluorescencia (IF), Fijacin del complemento (FC), Antgenos circulantes, Coproantgenos, Complejos Inmunitarios Circulantes y ELISA. El diagnstico patolgico se establece por biopsia, donde se pueden observar ocasionalmente granulomas con huevos. Es necesario considerar los aspectos epidemiolgicos para poder pensar en la fasciolosis; segn algunos criterios, cualquier problema de vas biliares en individuos que
acostumbren a comer ensaladas de berros u otras plantas acuticas debe ser considerado una fasciolosis hasta no demostrar lo contrario. Distribucin Geogrfica en Argentina: Litoral, provincia de Buenos Aires y SAN LUIS y en general en zonas donde abunda el ganado ovino y bovino. Profilaxis: Hervir el berro y las aguas que puedan estar contaminadas con las metacercarias ; estn son tambin destruidas por la accin de la salmuera y la accin del vinagre.
ESQUISTOSOMIASIS Esta parasitosis presenta una distribucin geogrfica bien definida y en algunos pases es causa importante de enfermedad. En algunos pases recibe el nombre de bilharziosis en honor quien lo describiera por primera vez (Bilharz, 1891 en Egipto). Las 3 especies principales de Schistosoma parsitos del hombre son: S. mansoni, S. haematobium y S. japonicum. Schistosoma haematobium Morfologa: Como todos los esquistosomas presenta sexos separados. El macho mide 15 mm de longitud por 1 mm de ancho. Aparato digestivo: constituido por boca, faringe, esfago e intestinos. Aparato genital: formado por 5 testculos, conducto deferente, vescula seminal y poro genital. La hembra mide 20 mm, su aparato genital est constituido por: un ovario, oviducto, tero y vagina. Ciclo biolgico Evolucin indirecta Husped definitivo: hombre Husped intermediario: molusco del gnero Bullinus o Planorbis. Los huevos presentan en uno de sus polos un espoln (figura), son eliminados con la orina, ya que la hembra fecundada se aloja en los pequeos vasos de la vejiga. Estos, ya embrionados, al eliminarse, llegan al agua, dejando salir al embrin, el que lo hace por un pequeo desgarro de la cscara. El miracidio penetra en el molusco, donde se forma el esporoquiste, el cual da esporoquistes hijos que llegan al hepatopncreas del molusco, atrofindolo. De stos se generan las cercarias, que pasan al agua y presentan el aspecto de renacuajos (alargadas, 800 micras de longitud, cola bfida y
cubiertas de espinas). Se llaman furcocercarias penetran a travs de la piel (generalmente de los pies de las personas que al andar descalzas se ponen en contacto con el agua). Cuando se introducen, pierden su cola, ganan la circulacin, llegan al estado adulto, se efecta la fecundacin y las hembras fecundadas emigran a los vasos vesicales donde depositan los huevos.
Huevo de Schistosoma mansoni
Huevo de Schistosoma haematobium
Huevo de Schistosoma japonicum
Accin patgena: Es el productor de la Bilharziasis vesical, cuyo sntoma ms caracterstico es la hematuria, que puede ser dolorosa. Mecanismo de transmisin: Por las furcocercarias que penetran a travs de la piel de las personas que andan descalzas en aguas contaminadas. Diagnstico: Se realiza por el examen de orina, en la que se encuentra hematuria y huevos en el sedimento. Este mtodo no siempre es suficiente para comprobar el diagnstico, ya que la cantidad de huevos que salen al exterior es escasa, por ello se recomiendan los mtodos de concentracin Distribucin geogrfica: Regiones de Asia y frica, no existe en Argentina. Profilaxis: Evitar el bao en aguas sospechosas, destruir los intermediarios. Evitar la contaminacin del agua con orina.
Schistosoma mansoni Morfologa: Similar a la de Schistosoma haematobium, mide 12 mm. Ciclo biolgico Evolucin indirecta Husped definitivo. Hombre Husped intermediario: Molusco del gnero Planorbis. Los huevos, que presentan un espoln lateralizado en uno de sus polos, son eliminados con las deposiciones, pues las hembras fecundadas depositan sus huevos en las venas intestinales, Estos, que ya en el momento de la eliminacin son embrionados, al llegar al agua dejan en libertad la miracidio, el que sale por un desgarro del huevo y penetra en el molusco, donde se forma el esporoquiste. Este genera esporoquistes hijos que se sitan en el hepatopncreas, atrofindolo.De ellos se forman las cercarias, que pasan al agua (furcocercarias) e infectan al hombre, penetrando a travs de su piel al ponerse en contacto con agua o barro contaminados, entrando finalmente en el torrente circulatorio. Accin patgena El huevo sera el principal factor patognico en la esquistosomiasis. De los huevos depositados en la pared intestinal solo un pequeo porcentaje se elimina por las heces, la mayor parte queda retenida en los tejidos bajo la formas maduras e inmaduras. Muchas permanecen en la pared intestinal, otros son conducidos por la corriente sangunea y se localizan en el hgado, a veces en los pulmones y ms raramente en otros rganos. Mecanismo de transmisin Por las furcocercarias que penetran por la piel de personas que andan descalzas donde hay agua o barro contaminados.
Diagnstico: Hallazgo de huevos en las heces. Biopsia rectal. Mtodos indirectos: Intradermoreaccin: para encuestas epidemiolgicas, el antgeno se prepara con vermes adultos o con hepatopncreas de caracoles con cercarias. Reaccin de fijacin del complemento: especificidad superior al 90%. Inmunofluorescencia indirecta: se utilizan cercarias como antgeno. Da positiva a los 2 o 3 meses de la infeccin. Distribucin geogrfica Muy frecuente en Brasil. No existe en Argentina. Existe en Africa y Asia. Profilaxis Evitar la contaminacin del agua por las materias fecales.
Schistosoma japonicum Morfologa: Semejante a Schistosoma haematobium, mide 10 mm. Ciclo biolgico Evolucin: Indirecta: Husped definitivo: hombre Husped intermediario: molusco Los huevos (ver figura) que presentan un diminuto espoln en uno de sus polos y son ya embrionados al eliminarse, llegan al exterior con las deposiciones, pues las hembras los depositan en el sistema porta. En el agua, por un desgarro de su cscara sale el miracidio, el que penetra en el molusco y se convierte en esporoquiste, donde se generan esporoquistes hijos que, situados en el hepatopncreas del molusco, lo atrofian. Se forman luego las cercarias (furcocercarias), que pasan al agua y contaminan al sujeto al ponerse en contacto con ella. Las furcocercarias al penetrar en el husped definitivo pierden su cola y ganan la circulacin.
Accin patgena: Causa la bilharziasis arteriovenosa, fiebre, dolores y edemas, hepatomegalia, esplenomegalia, alteraciones intestinales y anemia acentuada. Mecanismo de transmisin: Igual que el anterior. Diagnstico: Examen microscpico de las heces, para visualizar los huevos.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Distribucin geogrfica: En Asia, no existe en Argentina
Ciclo de Schistosoma PARASITOSIS INTESTINALES POR NEMATODOS GENERALIDADES: Las parasitosis producidas por nematodos son de amplia distribucin y muy frecuentes en pases tropicales, los nematodos que afectan a las plantas y animales domsticos son muy comunes y afectan de manera indirecta al hombre. Las parasitosis humanas por estos helmintos se reconocen desde la antigedad, debido a que muchos de estos nematodos son macroscpicos. Los nematodos parsitos del hombre son gusanos alargados de forma cilndrica, simtricos y con los extremos de menor dimetro. Poseen sistema digestivo completo, aparato reproductor muy desarrollado y sexos separados; los rganos internos estn contenidos en un cavidad corporal o pseudocele, rodeado por la pared, que est formada por cutcula, hipodermis y capa muscular. Se reproducen por medio de huevos que dan origen a larvas. Se pueden transmitir a travs de la tierra, la cual se contamina con huevos o larvas que salen en las materas fecales; a este grupo de parasitosis s les denomina geohelmintosis. Las principales son: ascariosis, tricocefalosis y uncinariosis.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA ASCARIOSIS
Esta parasitosis es la ms frecuente y cosmopolita de todas las helmintiosis humanas. Agente etiolgico: Es el Ascaris lumbricoides o lombriz intestinal, es el nematodo de mayor tamao. Morfologa: es un parsito cilndrico, con sus extremos aguzados, de color blanco amarillento a veces algo rosado, la hembra mide 20 a 30 cm, el macho 15 a 20 cm, los sexos se pueden diferenciar macroscpicamente por la forma del extremo posterior, que en la hembra termina en forma recta, mientras que en el macho presenta una curva donde hay dos espculas que le sirven para la copulacin. Es parsito del intestino delgado en el hombre. Aparato digestivo: consta de una boca trilabiada, esfago, un intestino y un recto que desemboca en la cloaca sexual, en el macho, y en el ano en la hembra, hacia el extremo posterior. Aparato reproductor : en el macho est formado por un testculo filiforme que circunda al intestino, un conducto deferente que se abre en la vescula seminal y un conducto eyaculador que nace en sta y termina en la cloaca sexual, donde se hallan las espculas, en el extremo posterior del parsito. En la hembra consta de dos ovarios filiformes que circundan al intestino, dos oviductos y dos teros que al reunirse, se continan con la vagina, la cual desemboca en la vulva. Los huevos frtiles provienen de las hembras fecundadas, tienen forma oval o redondeada y miden aproximadamente 60 micras de dimetro mayor. Tienen 3 membranas, una externa
mamelonada y 2 internas lisas, inmediatamente debajo de la anterior. Estos huevos al ser examinados en las materias fecales se observan de color caf por estar coloreados por la bilis y en su interior presentan un material granuloso que luego dar origen a las larvas. Tambin es posible observar huevos infrtiles (menos frecuente), no son infectantes pero tienen importancia en el diagnstico, ya que indican presencia de hembras de Ascaris en el intestino, se ven con una sola membrana. Ciclo biolgico: La evolucin es directa el husped definitivo es el hombre. Los huevos procedentes de las hembras localizadas en el intestino delgado, carecen en el momento de su eliminacin de embrin (no existiendo por lo tanto posibilidad de autoinfeccin) y llegan al exterior con las deposiciones del parasitado, contaminando el suelo. Al cabo de un mes se desarrolla el embrin, el cual sufre dentro del huevo su transformacin en larva. Los huevos ingeridos con el agua, las verduras u otros alimentos contaminados, llegan al intestino, arribando por la circulacin al hgado, donde se estacionan unos 4 das. Luego pasan al pulmn, capilares y caen en los alvolos, remontan los bronquios y la trquea; pasan al esfago, llegan al intestino delgado, donde se desarrollan las formas adultas.
Huevos de A. lumbricoides frtiles y decorticado
Huevo infrtil de A. lumbricoides
Ciclo de Ascaris lumbricoides
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Accin patgena:
Los efectos patolgicos producidos por Ascaris en el organismo humano, se presentan en varios sitios de acuerdo a la localizacin de las diversas formas evolutivas. Las larvas al pasar por el pulmn producen ruptura de los capilares y de la pared alveolar, y por lo tanto hay hemorragia e inflamacin. Cuando ocurre en forma masiva se denomina sndrome de Loefler, caracterizado por lesiones de los alvolos, exudado inflamatorio y hemorrgico, que se ve a los rayos X como opacidades diseminadas. Cuando las larvas no siguen el ciclo normal del pulmn, siguen por los capilares a la circulacin arterial y se diseminan en distintos rganos formando granulomas ( por ej. en hgado). Los parsitos adultos en el intestino delgado causan irritacin de la mucosa por el movimiento y la presin que ejercen, cuando hay gran cantidad producen obstruccin del intestino especialmente en nios. La patologa de mayor gravedad se produce por las migraciones de Ascaris adultos, por ejemplo en vas biliares obstruyndolas, tambin se producen abscesos en el hgado. Puede migrar al peritoneo perforando el intestino y apndice, en ocasiones pueden observarse fstulas. Tambin puede migrar a la boca, fosas nasales y otros sitios. Tambin puede existir Ascariosis congnita, al migrar las larvas y atravesar la placenta infectando al feto. Manifestaciones clnicas:
a) respiratorias y alrgicas: catarro, expectoracin, fiebre, tos y eosinofilia. b) de otros rganos: se han descrito granulomas en ojo, SNC y algunas vsceras. La localizacin cerebral
pude dar sntomas variados, incluso convulsiones.

c) intestinales: irritacin mecnica, diarrea, meteorismo, nauseas y vmitos. No es un productor
importante de diarrea, dolor intestinal cuando hay obstruccin.

d) nutricionales: produce anorexia, y disminuye la utilizacin de carbohidratos, grasas y protenas.
Mecanismo de transmisin: Ingiriendo agua o verduras contaminadas con los huevos. Diagnstico: Se realiza por el examen microscpico de heces, directo o previo enriquecimiento, que permitir el hallazgo de huevos. Con frecuencia el enfermo llega a eliminar el parsito entero, en cuyo caso el reconocimiento es macroscpico. Distribucin geogrfica: Cosmopolita, ms frecuente en las regiones clidas y hmedas. Profilaxis: Hervir las verduras y el agua que son los elementos capaces de transportar los huevos. Medida que las
Higiene de las manos. No emplear materia fecal humana como abono del suelo.
condiciones socio-econmicas, educativas, ambientales y culturales aumenten, la ascariosis y todas las otras parasitosis intestinales disminuirn. ENTEROBIOSIS U OXIUROSIS La Oxyuriosis o enterobiosis es una helmintiosis ms frecuente en nios que en adultos, de muy amplia distribucin en el mundo y con gran tendencia a diseminarse directamente de persona a persona, sin pasar por la tierra. Agente etiolgico: Oxyuris vermicularis o Enterobius vermicularis. Morfologa: nematodo filiforme y blancuzco, cubierto por una cutcula estriada, la que forma en el extremo anterior dos expansiones a cada lado, que le dan una forma de boquilla. El macho mide 4 mm y la hembra 8 mm. El extremo posterior en el macho es arrollado en espiral y posee una espcula en la cloaca sexual para dilatar la vulva, mientras que en la hembra termina en forma aguda, sin arrollarse. Aparato digestivo: Constituido por la boca trilabiada, el esfago, alargado y que presenta una dilatacin llamada bulbo esofgico, el intestino y el recto que termina en la cloaca sexual en el macho y en un ano en la hembra. Aparato reproductor: En el macho consta de un testculo filiforme que rodea al intestino, le sigue un conducto deferente, vescula seminal, conducto eyaculador, que desemboca en la cloaca sexual. En la hembra consta de dos ovarios, dos teros que se fusionan formando la vagina, la cual termina en la vulva. Los huevos son blancos, transparentes, con un lado aplanado, con forma similar a la letra D, cuando se observan con una posicin que muestre el lado plano. Si esto no sucede, se ven en forma ovalada. Poseen doble membrana y desde el momento que salen estn muy evolucionados, por lo cual es frecuente observarlos con larva en su interior. Tienen un tamao aproximado de 50 micras de longitud por 25 de ancho. Ciclo biolgico: Evolucin Directa: husped definitivo; hombre. El ciclo de vida de los oxiuros tiene caractersticas muy especiales, debido a que la hembra sale por el ano del paciente a depositar los huevos en la regin perianal, anal y perineal, lo que tiene una gran importancia para el diagnstico y la epidemiologa de la Oxyuriosis. La migracin de las hembras y la postura de los huevos, ocurre durante las ltimas horas de la tarde y en la noche durante el sueo, an no est claro este mecanismo pero se cree que migran al exterior en busca de oxgeno y lo hacen de noche, posiblemente debido a una mayor relajacin muscular del paciente. Estos huevos son infectantes casi inmediatamente, sin necesidad de caer a la
tierra. Los parsitos adultos viven en el intestino grueso despus de copular, los machos son eliminados y las hembras forman los huevos, aproximadamente 10.000 a 12.000. Luego que la sustancia pegajosa de la membrana que los mantiene adheridos a la mucosa y a la piel se seca, los huevos pueden dispersarse en la ropa interior, ropa de cama, etc.
Ciclo de Enterobius vermicularis
Huevos de Enterobius vermicularis Accin patgena: No existen lesiones anatomopatolgicas caractersticas producidas por los oxiuros.
La migracin de los parsitos adultos por la piel a diferentes sitios puede desencadenar una reaccin inflamatoria local, agravada por infecciones secundarias o por lesiones traumticas por el rascado.
Manifestaciones clnicas: Por accin mecnica: la principal molestia es la salida y entrada del ano, lo que causa prurito, ligero dolor o sensacin de cuerpo extrao e irritacin, si el prurito es grande puede interferir con el sueo. Invasin genital: en nias principalmente, se puede producir irritacin o infeccin en vulva y vagina, y tambin flujo vaginal. Alteraciones del comportamiento: el prurito hace que los nios pierdan atencin en la escuela, que se despierten durante la noche. Otros sntomas, como rascado nasal, chasquido de dientes, enuresis nocturna, etc., no tienen relacin directa con el parasitismo relacionarse con las alteraciones psicolgicas. Reacciones alrgicas: no se encuentran manifestaciones alrgicas generalizadas ni eosinofilia. Localizaciones ectpicas: se han descrito en peritoneo, pared de intestino, apndice cecal, ovario, hgado, pulmn, etc., por migraciones de los parsitos. Puede causar apendicitis. Mecanismo de transmisin: El elemento infestante es el huevo embrionado. La infeccin puede producirse por verduras y aguas contaminadas por huevos, pero lo fundamental es que en esta parasitosis se produce el contagio interhumano, a partir del ambiente familiar generalmente contaminado (padres, hermanos y otros contactos), por contacto directo o indirecto (utensilios, ropas, juguetes, etc.), por eso debe tratarse toda la familia. Autorreinfeccin exgena: los nios al rascarse la zona anal contaminan sus uas y manos con huevecillos, los que al ser llevados a la boca forman luego nuevos gusanos. Autoreinfeccin endgena: las hembras fecundadas atraviesan la pared intestinal y se alojan grvidas en el espesor de la submucosa, donde mantienen latente la infeccin al no actuar sobre ellas la medicacin. All hacen la postura de los huevos de los que nacen nuevos vermes que recomienzan el ciclo. Diagnstico: El diagnstico de laboratorio de la Oxyuriosis se hace generalmente por el hallazgo de los huevos en la regin perianal, perineal o vulvar, utilizando el mtodo de la cinta engomada transparente, que fue descrito originalmente por Graham. Test de Graham: se entregan al paciente 7 portaobjetos, teniendo cada uno adherido un trozo de cinta adhesiva transparente, en la que se deja una pequea agarradera. Las tomas se harn por la maana en la misma cama del paciente. El nio se ubica en posicin decbito ventral y se les separan las nalgas: 1) despegar la cinta, 2) envolver con la cinta el dedo ndice de la mano derecha con la parte adherente hacia afuera, sostenindola con los dedos mayor y pulgar de la misma mano, 3) pegar y despegar del
aunque s pueden
ano y en las mrgenes, 4) volver a pegar la cinta sobre el portaobjetos, tratando de que quede bien adherida y sin pliegues. Evitar lavar la zona anal para evitar el arrastre de los huevos. Tampoco se usarn supositorios, talcos o pomadas sobre el ano. En el laboratorio se har la observacin microscpica de los portaobjetos, utilizando el condensador bajo, para dar mejor contraste porque los huevos son de color blanco y transparentes.
Distribucin geogrfica: Cosmopolita. Parasitosis muy difundida en Argentina. Profilaxis: Recomendar normas de higiene: uas cortas y al ras; lavado de manos y cepillado de uas varias veces al da, muda diaria de la ropa interior y hervido peridico de la misma, cambio diario de toallas. Se indicar tratamiento a todo el grupo familiar.
TRICOCEFALOSIS Agente etiolgico: Trichuris trichiura o tricocfalo, del trmino trico que significa pelo. Morfologa: nematodo blanquecino. Tiene una forma tpica por ello se lo denomina lombriz ltigo, el macho mide 3 cm, y la hembra alrededor de 5 cm. Aparato digestivo: posee una boca inerme, un esfago largo, un intestino que termina en la cloaca sexual en el macho y en un ano en la hembra. Aparato reproductor: en el macho. Un testculo, conducto deferente, vescula seminal, conducto eyaculador y cloaca sexual. En la hembra, un ovario, oviducto, tero y vagina. Los huevos son muy caractersticos, con aspecto de limn y con tapones albuminoideos en los polos, membrana doble, color caf y miden 25 micras de ancho por 50 de largo.
Ciclo biolgico: El hombre se infecta al ingerir huevos embrionados, la larva se libera en el intestino y en el colon se convierte en parsito adulto, el husped elimina huevos con la materia fecal, estos huevos embrionan en la tierra, y luego as embrionados contaminan aguas y alimentos. La evolucin es directa, el husped definitivo es el hombre.
Huevo de Trichuris trichiura Accin patgena: Como otras parasitosis pueden cursar asintomtica o con sntomas mnimos o marcados, el parasitismo intenso se caracteriza por diarrea persistente de larga evolucin que est relacionada con la irritacin del colon. Las heces contienen moco y sangre, en el examen
microscpico se pueden ver cristales de Charcot - Leyden, como en otras parasitosis (uncinariasis y amebiasis). Un sntoma frecuente es el prolapso rectal debido a la desnutricin crnica y el debilitamiento de los elementos de sostn. No hay autoinfecciones y al no existir migracin de larvas no es frecuente la eosinofilia. Se ha descripto la presencia de dedos en palillo de tambor en nios con tricocefalosis crnica. Mecanismo de transmisin: Ingiriendo agua o verduras contaminadas con los huevos. Diagnstico: Se realiza por el examen de heces, previo enriquecimiento, que permite el hallazgo de los tpicos huevos con sus tapones albuminoideos. Se puede hacer recuento de huevos para ver la intensidad de la infeccin. La rectosigmoidoscopa permite ver los parsitos localizados en la mucosa, es indispensable que el mdico y el laboratorista sepan identificar los parsitos adultos, para poder hacer un diagnstico correcto. Distribucin geogrfica: Cosmopolita; preferentemente en regiones clidas y hmedas. Profilaxis: Hervir el agua y las verduras que representan la fuente de infeccin. Higiene de las manos. Prohibir el abono de la tierra con heces humanas. TRIQUINOSIS Agente etiolgico: Trichinella spiralis: de zonas templadas, otras especies: Trichinella pseudospiralis: de aves Trichinella nelsoni: de Africa tropical, Trichinella nativa: de zonas rticas. Huspedes de T. spiralis: rata, cerdo, perro, gato y hombre. Morfologa: es un pequeo nematodo blanquecino y filiforme con su extremidad anterior ms adelgazada que la posterior. La hembra mide entre 3 y 4 mm. y el macho es de menor tamao , se aloja en la pared del intestino delgado. Aparato digestivo y reproductor similar al de otros nematodos.
Ciclo biolgico: Ciclo evolutivo directo: Huspedes definitivos: Cerdo, gato, rata, perro hombre y otros mamferos. Un mismo individuo es husped definitivo e intermediario del parsito. El hombre adquiere la infeccin a travs de la ingestin de carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida con larvas de triquina. Los jugos digestivos digieren la carne y las larvas quedan en libertad en el intestino, donde a las 48 hs. se diferencian en machos y hembras adultas. Copulan en el intestino, los machos son eliminados con las deposiciones del husped luego de cumplida su funcin. Las hembras grvidas (vivparas) se ubican en la mucosa intestinal. Al 3 o 5 da comienza la postura de larvas, atraviesan el intestino pasan por los capilares linfticos y venosos y llegan a la circulacin, diseminndose a todo el organismo, pero se enquistan solo en la musculatura esqueltica. As se origina el quiste larval con varias larvas en su interior, que mide de 250 a 400 micras, no es visible a simple vista, pero si con una lupa o con microscopio de pequeo aumento, tiene el aspecto de un limn al cabo de un mes se calcifican. Ciclo domstico: ratas infectadas ----- cerdo ----hombre
El ahumado, salado no mata la larva, s la congelacin a -15 C 20 das o -30 C (24hs)
Ciclo evolutivo completo de T. spiralis Referencias: 1.-LM enquistadas ingeridas. 2.- Larvas liberadas en intestino delgado
Larva enquistada de T. spiralis en msculo estriado Accin patgena: Destruccin parcial de fibras musculares por la larva, cuadro toxialrgico por la presencia de protenas extraas. En intestino los gusanos adultos producen una inflamacin, hay mialgias, la toxialergia dura un mes. Hay eosinofilia muy marcada, hay astenia, luego declinacin de los sntomas. En casos graves, muerte por afeccin del SNC o cardaco. a) perodo de incubacin: desde la ingestin de la carne hasta los primeros signos. Similar a gripe. b) perodo de invasin: reproduccin de parsitos en el intestino, postura de larvas, y llegada de estas por va sangunea al intestino. Hay fiebre, cefalea, astenia, sntomas oculopalpebrales bilateral. Sntomas gastrointestinales son poco frecuentes. c) perodo de estado: enquistamiento larval. Aparece el sndrome infeccioso: 95%: fiebre 80%: mialgias 67%: sntomas oculopalpebrales. Sntomas gastrointestinales ms
frecuentes: dolor abdominal, nuseas, vmitos y diarrea. Mecanismo de transmisin: Por medio de carne de cerdo contaminada con las larvas. Diagnostico: Si hay un brote epidmico es ms fcil, sino puede ser difcil. Hemograma: aumento de leucocitos (variable), Aumento de eosinfilos (40-60% 70%) Medir enzimas de origen muscular: CPK (creatinina quinasa) y LDH (deshidrogenasa lctica), estn generalmente aumentadas. ELISA, HAI y TIF, son + a la 2da y 4a semana post infeccin. BIOPSIA MUSCULAR: del deltoides, sera tericamente el mejor diagnstico pero es poco prctico e invasivo. Distribucin geogrfica: Cosmopolita. Los israeles y mahometanos estn exentos de esta parasitosis. Profilaxis: Prevencin en la infeccin del cerdo: crianzas higinicas. Combatir las ratas (reservorio de la parasitosis). Consumir carnes cocidas. Inspeccin de las carnes: controlar cortes de msculo con triquinoscopio (microscopio de pequeo aumento).Control veterinario de los cerdos en los mataderos.
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Esta geohelmintosis, es una de las principales parasitosis intestinales, por la anemia que causa y por la repercusin sobre la economa, al disminuir el rendimiento laboral de los pacientes afectados, ataca a los trabajadores dedicados a la agricultura, como caf, cacao, banano, etc. Es una parasitosis esencialmente rural y asociada a deficientes condiciones socioeconmicas. Agente etiolgico: Pertenecen a la familia Ancylostomidae, el hombre es afectado por dos gneros: Ancylostoma, con dientes y Necator con placas cortantes. Las dos especies principales son A. duodenale y N. americanus. Adems de las especies mencionadas se encuentran: Ancylostoma braziliense (perro y gato) Ancylostoma caninum (perro) y Ancylostoma ceylanicum (India, Malasia, China etc.). Morfologa: Son gusanos cilndricos, de 8 a 12 mm, dimetro de 0,4 a 0,6 mm. Tambin se los denomina uncinarias por la curvatura de la extremidad anterior, como un gancho, donde la cpsula bucal tiene dientes (Ancylostoma duodenale) o de lminas cortantes (Necator americanus). Ambas especies se diferencian en su morfologa y en su distribucin geogrfica, pero presentan idntico ciclo biolgico y similar cuadro clnico. Morfologa del Ancylostoma duodenale: es un nematodo pequeo, blanquecino, el macho mide de 8 a11 mm, y la hembra de 10 a 18 mm. El extremo anterior es romo, y el posterior ensanchado en el macho, y en la hembra cnico con una pequea espina. Poseen aparato digestivo: cpsula bucal con dos pares de dientes, (el Ancylostoma braziliense presenta tres pares de dientes), esfago, e intestino. Poseen aparato genital: En el macho hay un testculo, vescula seminal y un conducto eyaculador. En la hembra: hay 2 ovarios, dos teros y una vagina que desemboca en la vulva. Morfologa del Necator americanus: Es muy semejante a la del Ancylostoma duodenale, se diferencian en: 1) cuerpo: tienen dos curvaturas con forma de S, a diferencia del Ancylostoma con forma de C. 2) es ms pequeo, el macho mide de 8 a 10 mm y la hembra de 10 a 14 mm. 3) la cpsula bucal presenta un par de lminas cortantes en vez de dientes. 4) el extremo posterior de la hembra carece de espina terminal. 5) el huevo presenta las mismas caractersticas que el de Ancylostoma. El huevo de Necator mide 64 a 76 micras y el de Ancylostoma 36 a 40 micras., tienen una cubierta hialina, no son segmentados. Ciclo biolgico. Evolucin directa: Husped definitivo: Hombre Los huevos en el momento de su expulsin, no son embrionados, se eliminan con las heces del individuo parasitado. En el exterior y en condiciones favorables(humedad, oscuridad y temperatura de
28 C), se forma en 24 hs el embrin, traspasa la membrana y llega a la tierra, donde se forma la larva rhabditoide, esta luego se transforma en larva filariforme o strongyloide, la cual luego se enquista, y esta es la infectante. Cuando sta toma contacto con la piel de una persona que anda descalza en el barro, la atraviesa, pierde su vaina, y por va hemtica llega al corazn derecho, pulmn, bronquios trquea, esfago y finalmente llega al duodeno, localizacin definitiva, para luego alcanzar el estado adulto.
Huevo de uncinarias Mecanismo de transmisin: Por penetracin transcutnea de la larva infestante. Tambin por las manos. Existen infecciones congnitas .Las larvas pueden pasar la placenta e infectar al feto. Accin patgena: La fase ms patente de la enfermedad est relacionada con el establecimiento de los parsitos en el intestino, se puede presentar un cuadro digestivo con dolor abdominal, diarrea aguda o crnica por la fijacin del parsito en la mucosa intestinal con sus dientes. El sntoma fundamental es la anemia, es microctica e hipocrmica. El paciente presenta astenia, palpitaciones, etc. Hay microhemorragias, se debe investigar sangre oculta en materia fecal. La eosinofilia es casi constante. Diagnstico: Se realiza por el hallazgo de los huevos de uncinarias en estudios parasitolgicos de materia fecal. Se deben hacer exmenes directos y enriquecidos, realizar tambin de flotacin. Mediante este estudio no se puede establecer si la uncinariosis es producida por Ancylostoma o Necator, se deber confirmar por la identificacin del parsito adulto. Para saber el nmero aproximado de parsitos que aloja un individuo es necesario hacer recuento de huevos por gramo de heces, por tcnicas como la de Stoll o Kato- Katz por ejemplo. Distribucin geogrfica: Amrica, Europa, Asia, frica. En Argentina existe una zona endmica: Corrientes, Misiones, norte de Entre Ros, este del Chaco y Formosa. Profilaxis: Usar calzado a fin de evitar la penetracin de las larvas Strongyloides enquistadas. Evitar la contaminacin del suelo con las heces. Tratar los enfermos.
palidez, cansancio fcil,
Ciclo evolutivo de Necator americanus ACTIVIDADES A DESARROLLAR: 1) observacin macroscpica de los parsitos: Quiste hidatdico Tenias scaris Fasciola Oxiuros 2) observacin microscpica de huevos de cestodos Tenia sp Hymenolepis Diphyllobthrium Y ganchos de Echinococcus granulosus de un quiste hidatdico 3) observacin microscpica de huevos de nematodos scaris Uncinarias Enterobius (de escobillado perianal y de test de Graham) Trichuris trichiura 4) consulta con atlas de Parasitologa Mdica: Elba Rodrguez Prez -Vigar Zaman
Trabajo de Aula N 5 RESOLUCION DE PROBLEMAS CLNICOS
OBJETIVOS: 1- Integrar los conocimientos tericos individuales de las parasitosis aprendidas, con el resto de las manifestaciones clnicas que pueden afectar a un paciente. 2- Plantear diagnsticos diferenciales. 3- Afianzar los conocimientos adquiridos, realizando un estudio puntual y crtico de los datos aportados, para poder obtener el diagnstico certero del paciente. 4- Relacionar al profesional bioqumico con el resto de los profesionales del equipo de salud.
Caso Problema N 1 Una mujer de 42 aos, residente en la provincia de Buenos Aires, consult al mdico por la eliminacin de un parsito con forma acintada. El profesional le solicit un estudio parasitolgico seriado de materia fecal y le sugiri el envo del ejemplar al rea de Parasitologa del Hospital de Clnicas para su anlisis. Tanto la paciente, como su grupo familiar, haban consumido sushi, con una frecuencia de dos a tres veces por semana, en dos restaurantes diferentes del Gran Buenos Aires. El ejemplar era de color blanco amarillento, meda 95 cm de longitud, y estaba constituido por progltides trapezoidales ms anchos que largos (7 mm x 5 mm). No se hall el esclex en la muestra remitida. Al realizar la observacin microscpica de los
segmentos con un aumento de 400X, se evidenci la presencia de un poro genital central y un tero en forma de roseta. Los huevos tpicos, con una media de 68,4 mm de largo por 52,1 mm de ancho, se obtuvieron por mtodos de concentracin y por puncin del tero de los progltides grvidos. Con estos datos, junto al antecedente de haber consumido sushi (plato oriental cuyo ingrediente principal es el salmn crudo), se presume el agente causante de la infeccin. La paciente fue tratada con una nica dosis de 600 mg de praziquantel y se le indic la realizacin de un estudio control. Preguntas 1 Cual es el agente causante del cuadro?
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA 2 Describa el ciclo del mismo 3 Indique como se produce la infeccin en el caso clnico
4 Segn la epidemiologia es posible hallar este parsito en Argentina?, Dnde? 5 Explique cmo se realiza el diagnstico de la parasitosis del caso anterior.
Caso Problema N 2 Se presenta el caso clnico de un paciente de sexo masculino, 31 aos de edad, con un cuadro de un ao y medio de evolucin, el cual presenta episodios intermitentes de astenia, adinamia, hiporexia, prdida de peso, fiebre nocturna, vmito postpandial y escalofro. El paciente consulta cuando su cuadro clnico agudiz con dolor abdominal, diarrea ftida con moco, sin sangre en mltiples ocasiones, mareo y prdida de aproximadamente 30 kilos de peso. Al examen coprolgico y coprocultivo no se observaron parsitos ni enteropatgenos. La prueba de ELISA para VIH fue positiva por lo cual se le hicieron nuevamente otras dos pruebas que confirmaron el diagnstico. La tcnica de Western-blott se report como positiva con una carga viral de 405.453 copias. En los recuentos celulares se encontr: CD4: 13/mm3 y CD8: 866/mm3, por lo que se instaura tratamiento antirretoviral. A la coloracin de Ziehl-Neelsen en muestras seriadas de materia fecal para bsqueda de coccidios, el laboratorio de parasitologa report la observacin del parsito involucrado en la patologa, se inici tratamiento con espiramicina, 1 tableta de 3 millones cada 8 horas durante 6 semanas. Despus de tres meses de evolucin el paciente fallece.
Coloracin de Z.N Preguntas 1. Cul es el patgeno causante del cuadro? Describa sus caractersticas morfolgicas. 2. Qu relacin tiene con la inmunodeficiencia del paciente? 3. Describa el cuadro clnico que produce en los pacientes inmunocompetentes, e inmunodeprimidos.
4. Cmo se produce la infeccin del patgeno causante del cuadro clnico? 5. Cmo se realiza el diagnstico del cuadro? Qu tcnicas conoce para poner en evidencia al micro-organismo?
Caso problema N 3 Paciente de sexo femenino de 10 aos de edad, oriunda de la provincia de Crdoba. No present antecedentes personales de inters, salvo el proceder de un medio con probables malas condiciones higinico-sanitarias. Evidenci retrasos del crecimiento, desnutricin leve, diarrea de 2 meses de duracin, abundantes, amarillentos sin sangre ni moco. Exploracin fsica: pesa 20 kg y mide 125 cm. El resto de la exploracin fsica fue normal. Parmetros bioqumicos: Hemograma: leucocitos 6.200/mm3 (N 46%, L 45%, M 5%, E 3,6%, B 0,5%), Hb 13 g/dl, plaquetas 232.000/mm3. Pruebas: Cultivo bacteriolgico: se observa crecimiento bacteriolgico propio del intestino, sin patgenos bacteriano. Escobillado perianal: negativo Estudio de parsitos en heces (mtodo de formol-ter): presencia de numerosas estructuras ligeramente elpticas de 40 m dimetro. Con ganchos en paralelo en la parte central del embrin y 2 mamelones polares con varios filamentos. (Figura 1) Evolucin: Se repiti el estudio de parsitos en heces al cabo de 1 semana y de nuevo se observaron los mismos huevos, pero ahora asociados con quistes de un protozoo flagelado intestinal patgeno que se observa en la figura 2. Tratamiento: Metronidazol (375 mg/24h) durante 5 das Niclosamida (1 g el primer da y 500 mg/ 24h durante 6 das). Se desconoce la evolucin clnica posterior.
Figura 1 Preguntas 1. Nombre los patgenos identificados.
Figura 2
2. Describa la epidemiologa de los microorganismos involucrados en este caso clnico. 3. Indique mecanismos de diagnsticos que deben usarse para la identificacin. 4. Detalle las caractersticas morfolgicas de los parsitos involucrados, y de sus formas infectantes. 5. Explique brevemente el ciclo infectante del primer parsito (figura 1) y la patogenia del mismo.
Caso problema N 4 Paciente de 40 aos de edad, sexo femenino, dos hijos, estado civil casada, procedente de Mendoza, pero gran parte del ao permanece en una casa de la zona rural de Chile. Sin antecedentes mrbidos de importancia, que el da 8 de Mayo del 2000, estando en la va pblica, presenta en forma repentina, sin existir un factor desencadenante, cuadro caracterizado por nuseas, sudoracin profusa, agregndose minutos despus dolor abdominal difuso, tipo clico, de moderada intensidad, de predominio epigstrico. No present vmitos. Esta sintomatologa se mantuvo por 30 minutos, cediendo posteriormente sin mediar tratamiento mdico. Ese mismo da consult mdico, quien solicit hemograma, cuyos resultados son los siguientes: Leucocitos: 7000/ul, N: 53%, E: 12%, B: 0%, L: 30%, M: 5%. Hto: 35%, Rto: 3800000/ul, Hb: 10,5%. Perfil bioqumico: Glucemia: 80mg/dl, Uremia: 25mg/dl, creatinina: 0,8mg/dl. Bilirrubina Total 1,2mg/dl, FAL: 600 UI/ml, GOT: 60 UI/ml, GOT: 61 UI/ml, gGT: 100 UI/ml, amilasa: 200 UI/ml. Eritrosedimentacin: 70 mm/en 1hora. Orina completa y urocultivo fueron normales. Tambin se realiz una ecotomografa abdominal, la que describi una
dilatacin fusiforme del coldoco (1 cm de dimetro) con elementos serpentijinosos en su interior de etiologa incierta. No se encontr evidencia de clculos u otra imagen de tipo obstructivo. Fue evaluada por cirujano quien solicit coproparasitolgico seriado e indic repetir la eco tomografa. Esta se realiz tres das despus y slo mostr hepatomegalia leve homognea. El cultivo de materia fecal no arroj una etiologa bacteriana, se obtuvo desarrollo de E. coli. El parasitolgico con tres muestras seriadas, no presento quistes o huevos de parsitos, que evidenciaran la patologa, es por ello que el cuerpo mdico ante la no evolucin clnica de la paciente, decide realiza una endoscopa para obtener liquido duodenal para observacin. En el laboratorio luego de la preparacin se pueden observar huevos del parsito causante del cuadro (figura 1). Adems se consign el antecedente que la paciente era consumidora ocasional de berros crudos. La paciente decidi consultar gastroenterlogo, quien solicit exmenes inmunolgicos para la deteccin del parsito. Adems aplic esquema de tratamiento con triclabendazole 10 mg/kg peso dividida en dos dosis nicas despus de desayuno y de almuerzo. Tras la ingesta de la primera dosis de triclabendazole, la paciente refiri haber presentado intenso dolor clico abdominal que cedi con Viadil EV, mantenindose posteriormente asintomtica hasta la fecha.
FIGURA 1 Preguntas: 1. Cul es el parsito involucrado en la patologa? 2. Describa las caractersticas morfolgicas del huevo y del parsito adulto. Escriba sobre su patogenia. 3. Indique la epidemiologia y la forma de transmisin. En el caso expuesto que factor indicara una posible parasitosis por este agente. 4. Relacione los resultados obtenidos en los anlisis y el cuadro con el que cursa esta parasitosis.
5. Explique porqu no se observaron huevos en el copro-parasitolgico realizado al paciente? Indique otros tipos de anlisis diagnstico que se pueden realizar para esta parasitosis.
Caso problema N 5 Paciente femenino de dos aos de edad procedente de Formosa (Argentina), pero que frecuentemente viaja a Brasil por razones laborales de los padres. La vivienda de la paciente contaba con servicio de cloaca, agua potable y piso de cemento. Ingres el 30 de Enero de 2005 al Hospital Escuela de la Provincia, donde permaneci durante catorce das por Sndrome gastro-entrico. En los anlisis realizados al ingreso se informo: Hto: 21%, Hb: 7,2 g/dl, leucocitos 18.750 con N=61%, E: 3%, B: 0%, L: 30%, M: 6%. Plaquetas 260.000/mm3 recibi tratamiento con ampicilina I.V. x 6 das y dos transfusiones de 200 ml. de sangre total, con lo cual su hemoglobina subi a cifras de 11 g/dl, posteriormente inici un deterioro progresivo presentando sangrado digestivo alto con sangre de color rojo vivo y melena.Al examen fsico se encontr una paciente irritable, en mal estado nutricional por la presencia de edemas fros no dolorosos en los miembros inferiores hasta el nivel de ambas rodillas, palidez extrema, con signos vitales: Fc (frecuencia cardiaca)=138 por minuto Fr (frecuencia respiratoria)=26 por minuto t=38.5 C (rectal) y peso 11 kg-, el resto de la exploracin fsica revel equimosis en los sitios de puncin, en el fondo del ojo no se observ hemorragias retinianas. Entre los antecedentes la madre de la paciente record un cuadro respiratorio que su hija haba sobrellevado sin consulta mdica unos meses atrs. Un hemograma posterior (2 das despus) report cifras de: Hto: 15%. Leucocitos 27.000 con N=72%, E: 3%, B: 0%, L=20%, M: 5% y plaquetas 50.000, y fue tratado como una septicemia complicada con CID (coagulacin intravascular diseminada), los tiempos de coagulacin fueron normales sin embargo continu presentando deposiciones de hasta 300 ml. 3 a 4 veces al da observndose cogulos y sangre roja adems de melena y vmitos hemticos por lo que se incluy tratamiento contra sangrado digestivo alto (cimetidina I.V. y anticido por sonda nasogstrica ). Al tercer da de hospitalizacin se le practic una panendoscopa alta la cual revel esofagitis. La madre revel que un da antes de ingresar al hospital regional a la nia se le administro dos cucharaditas de aguarrs con la intencin de combatir las lombrices, ese da y por persistir las deposiciones con grandes prdidas de volumen sanguneo ms su aspecto txico infeccioso con Temperaturas: 39.8 C y aparicin de flictemas de color violceo en un miembro se les traslad a la Unidad de Cuidados Intensivos donde se modific el esquema de antibiticos y se manejo sin sonda naso gstrica.Al da siguiente se le realiz un estudio parasitolgico recolectando la materia fecal de todo el da; en el laboratorio se realizo los mtodos de estudio adecuado para la bsqueda de elementos parasitarios, observndose en el estudio las estructuras mostradas en la figura 1.
Continu presentando deposiciones de 300 a 500 ml de sangre, 3-4 veces al da de los cuales eran repuestos inmediatamente, llegando a recibir hasta 2 litros de sangre en un da se le practic una pan endoscopa alta de control que revel que las erosiones de esfago y estmago se encontraban cubiertas de fibrina sin sangrado activo. El laboratorio posteriormente informa el parsito causante de la patologa, por la observacin de caractersticas obtenidas in-vitro del mismo. Figura 2 Debido a lo anterior y la persistencia del sangrado digestivo bajo se practic una colonoscopa al sptimo da de hospitalizacin, encontrando en el colon ascendente una gran cantidad de parsitos y un mayor nmero a nivel de la vlvula ileocecal donde se observ dos ulceras sangrantes, debido al grosor del endoscopio no se pudo entrar a leon terminal pero se observ que de este sitio provena sangre. En la figura 3 se puede observar un gusano adulto del parsito causante del cuadro. Este da se inici tratamiento con mebendazol sin embargo la paciente falleci cuando se le intentaba practicar una exanguineo transfusin para contrarrestar la septicemia que mantuvo asociada. El Hemocultivo revel Enterobacter sp. sensible (in vitro) a la Amikacina la cual fue incluida en su esquema antimicrobiano desde el 2do da de ingreso.
Figura 1.
Figura 2
Figura 3
Preguntas 1. Qu parsito es el causante de la patologa?. Descrbalo. 2. Cmo el laboratorio pudo determinar que se trataba de este gnero y clasificar la especie (describa tcnicas)? Con que otro gnero y especie se puede confundir? 3. Describa el cuadro clnico caracterstico. En el caso problema hay una sintomatologa que aparentemente no fue tomada en cuenta, diga cual es y que la causa? 4. Describa el ciclo biolgico del parsito, y como puede haberse infectado la paciente.
5. La septicemia que le causa la muerte a la paciente est asociada al cuadro parasitolgico o no? Explique.
BIBLIOGRAFIA 1. Rev. Argentina de microbiologa v.39 n.2 Ciudad Autnoma de Buenos Aires abr./jun. 2007. versin impresa ISSN 0325-7541 2. Cryptosporidium SPP: Informe de un caso clnico en Popayn, Cauca Cryptosporidium SPP: Report of a clinic case in Popayan, Cauca. Oriana Rivera L.1 Luis Reinel Vsquez A. Revista Colombiana de Gastroenterologia. Rev Col Gastroenterol vol.21 no.3 Bogot Sept. 2006. Print version ISSN 01209957 3. Casos clnicos. Fasciolasis heptica. Aliro Venturelli L, Marcia Monje K*, Vctor Assef P*, Francisco Venturelli M*. Cuadernos de Ciruga, Vol. 17 N 1, 2003, pp. 43-46 4. Fasciolosis humana y compromiso gastrointestinal: Estudio de 277 pacientes en el Hospital Nacional Cayetano Heredia. 1970 2002. Gilberto Blancas Torres
(2,3) (1)
; Anglica Terashima Iwashita

(2,3)
; Ciro Maguia Vargas

(2,3)
(2,3)
; Luis Vera Lujn
(4)
; Humberto Alvarez Bianchi
; Ral Tello
Casanova
5. Sangrado Digestivo Masivo por Uncinariasis. Presentacin de dos casos clnicos. Dr. F. Ernesto Dala Sierra*, Dr. Francisco Cleaves* Dr. Orison Velsquez*, Dra. Martha Matamoros de Lpez* Dr. Alex Zavala'
Valores de Referencia para determinaciones Bioqumicas Ver anexo
Trabajo Prctico de Laboratorio N 6 TCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO
OBJETIVOS: El presente trabajo prctico capacitara al alumno en los siguientes tems: Realizar correctamente la siembra de los microorganismos para lograr un cultivo microbiano puro. Conocer las diferentes temperaturas de incubacin. Conocer distintas tcnicas de siembra y su aplicacin. Conocer y aplicar tcnicas de aislamientos de microorganismos. Adquirir destreza en la generacin de microcultivos y conocer su utilidad.
INTRODUCCIN TEORICA: Siembra Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Todos los cultivos para hongos se incuban a temperatura ambiente o preferentemente a 30 C y se mantienen durante 30 das antes de descartarlos como negativos. Algunos hongos requieren incubacin a 35-37 C para mostrar sus formas de levaduras. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estril segn la naturaleza de la muestra.-
Siembra en medio lquido Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formacin de velo o pelcula, o por sedimento. Siembra en medio slido Puede ser en tubos o placas: Tubos con agar inclinado: Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar. Tubos sin inclinar: Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura. Siembra en placas: Puede ser en superficie o incorporada.
En superficie: Se colocan 0.1 ml de la dilucin de la muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estril. Se siembra con un ansa para aislar o se siembra con un hisopo. Incorporada: Se coloca 1 ml de la muestra en una placa estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 ml de medio de cultivo slido fundido y termostatizado a 45 C; luego se agita la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja solidificar. En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino adems para contar y aislar.
Aislamiento Aislar es separar un microorganismo a partir de una poblacin que los contiene de varios tipos. En hbitats naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego as poder identificarlos. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos estn en una proporcin adecuada. Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: Aislamiento por diluciones sucesivas en agar: Se aprovecha la propiedad que tienen los medios de cultivo con agar (medios slidos), de permanecer lquidos a temperatura relativamente baja, lo que permite la incorporacin de la mezcla microbiana. Una serie de 4 a 6 tubos de cultivo, cada uno de los cuales contiene 10 ml de un medio de agar adecuado, se calienta en bao de agua para fundir el agar. Enfriar el contenido de los tubos a 45 C; se aade al primero de ellos un volumen de 1ml del material que contiene la levadura agitando cuidadosamente, se lleva 1 ml a un segundo tubo y el resto se vierte aspticamente en una placa de Petri; se agita el segundo tubo y se separa 1 ml para el tercero, vertiendo el resto en la placa de Petri. Se contina del mismo modo hasta obtener 4 o 6 muestras, y como el cultivo se va diluyendo de una a otra, en alguna de ellas habr ya un cultivo puro con los microorganismos inmovilizados y separados uno de otro, originando colonias que se pueden contar para realizar el recuento. Aislamiento por agotamiento en superficie: Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Una de ellas consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar (ver figura 1). La placa tambin se puede dividir en cuadrantes sembrado en cada uno de ellos sin volver a cargar el ansa.
Aislamiento por agotamiento (Fig 1)
Aislamiento por siembra espontnea: Permite obtener la flora micolgica del aire de una localidad o ambiente. Se colocan placas con medio de cultivo Sabouraud-glucosa abiertas en los lugares apropiados. Al cabo de un intervalo de tiempo variable (5-15-30 minutos), se cierran las cajas y se incuban a 28 C durante una semana. Aparecern en la superficie colonias de hongos que se encontraban en el aire, se pueden realizar repiques de las colonias que nos interesen para trabajar con un hongo determinado. Mtodos especiales de aislamiento Recurriendo a las propiedades biolgicas del hongo: Por ejemplo el anzuelo queratinoso permite el aislamiento de aquellos hongos capaces de desarrollar con queratina como nica fuente de nutricin. La tierra en estudio es colocada en una caja de Petri estril; sobre ella se colocan pelos (humanos o de caballo) estriles y se humecta. Se incuba a 28 C durante 15 a 30 das, trasladando luego los pelos con los hongos queratinoflicos a un medio de cultivo adecuado.-
Microcultivo Permiten la observacin microscpica del micelio fngico y sus elementos de reproduccin en forma intacta.-
A-Cultivos de adhesin: El preparado de microcultivo (tambin conocido como cultivo en portaobjeto) se realiza de la siguiente manera En la superficie de una caja de Petri se coloca un pedazo de papel de filtro o un trozo de algodn y dos varillas de vidrio, cortadas de un tamao adecuado. Se coloca un portaobjeto sobre las varillas y se esteriliza. Se corta un pequeo bloque de agar Sabouraud o similar previamente vertido en una caja de Petri hasta una profundidad de 4 mm. Esto puede hacerse usando una hoja de bistur estril o un tubo de ensayo recto estril sin bordes. Con el mismo bistur estril se coloca el bloque de agar
sobre la superficie del portaobjeto. Con un ansa aguja estril se remueven porciones pequeas de colonia de hongos que se desea estudiar y se inocula en los cuatros cuadrantes del bloque de agar. Luego de la inoculacin, se coloca un cubreobjeto estril sobre la superficie del agar. Se humedece el papel o el trozo de algodn y se incuba. La colonia crecer por debajo de la superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje peridicamente a simple vista para determinar si la colonia ha madurado y esta lista para su observacin microscpica. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto con pinzas estriles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de lactofenol azul de algodn. Si se desea un montaje permanente, se limpia la superficie del portaobjeto inmediatamente adyacente al borde del cubreobjeto y se aplica esmalte para uas color claro.
B- Cultivo en lmina gelosada: En una placa de Petri estril colocar los soportes y un portaobjeto previamente flameado. Depositar sobre el porta agar Sabouraud-Glucosa (previamente fundido,
enfriado a 50 C y sembrado con esporas del hongo a estudiar), obteniendo una lmina de medio bien delgada. Dejar solidificar. Humectar el fondo de la caja de Petri con agua destilada estril, incubar a 28 C. Para su observacin depositar sobre el desarrollo fngico un cubreobjeto y colocar el porta as preparado en el microscopio. Mtodo de las diluciones para el recuento de colonias se trabaja de forma similar al mtodo de aislamiento por diluciones sucesivas en agar realizando las diluciones en Solucin Fisiolgica estril y luego vertiendo las diluciones obtenidas en placas de Petri estriles a las que a continuacin se les agrega el agar fundido y enfriado a 45 50 C, se homogenizan, se dejan solidificar y se incuban a la temperatura adecuada. Esta tcnica se realizar en el laboratorio.
1 ml
1 ml
1 ml Tubos con SF
Inoculo primario 9 ml S.F. 9 ml S.F. 9 ml S.F.
10 ml Verter en Placas de Petri luego de mezclar
Dilucin 1
Dilucin 2
Dilucin 3
Agregar a cada una de las cajas el agar previamente fundido y enfriado a 45-50 C, dejar solidificar e incubar.
(1)Demasiadas colonias
(2) Nmero adecuado de colonias
(3)Pocas colonias
SIEMBRA DE COLONIA GIGANTE: Sembrar con ansa aguja en el centro de botellas utilizadas en los hemocultivos o tubos de ensayos con el medio dispuesto en pico de flauta, tambin se pueden usar cajas de Petri, que contengan un sustrato de por lo menos 3-4 mm de espesor; en este caso el hongo desarrollar libremente en todas direcciones. Incubar. Son tiles para describir las caracteres macroscpicos de las colonias (dimetro, elevacin, aspecto ptico, textura, bordes, color, etc.), haciendo las observaciones a los 3 4 das y luego cada semana, durante un mes.
MATERIALES Y METODOS - ACTIVIDADES A DESARROLLAR: Con las muestras de hongos suministradas por la Ctedra procedern a trabajar de la siguiente manera: Siembra por estras en caja de Petri y pico de flauta Mtodo de diluciones para recuento de colonias (trabajar con hongos levaduriformes), Siembra espontnea en algn ambiente cercano al laboratorio (por ej. baos, aulas, etc.) Preparacin y siembra de microcultivo Siembra de colonia gigante (trabajar con hongos filamentosos) Debemos tener la precaucin de trabajar correctamente con el ansa y con las pipetas para evitar posibles contaminaciones de los medios de cultivo y de todo el personal presente.-
Trabajo Prctico de Laboratorio N 7 TCNICAS DE OBSERVACIN
OBJETIVOS: Con el siguiente prctico el alumno deber estar capacitado para: Observar el crecimiento de hongos en medios slidos. Observar la morfologa de colonias: parmetros para su descripcin. Observacin en fresco y coloraciones. Conocer y describir las caractersticas del crecimiento en distintos medios.
INTRODUCCIN TEORICA: La micologa es esencialmente descriptiva. El estudio y clasificacin de los hongos se hace, pues, en base a los caracteres:
Morfolgicos macroscpicos del desarrollo del hongo. 1. Morfolgicos macroscpicos: Permiten conocer la morfologa del cuerpo del hongo o
el aspecto de la colonia. Para ello, se toman todos los datos de los caracteres que se observan a simple vista: forma, aspecto, color, consistencia, tamao, estructura, reverso, tipo de crecimiento, superficie, zonas de desarrollo, etc. 2. Morfolgicos microscpicos del mismo.
La macro morfologa de un mismo organismo puede variar enormemente segn el medio de cultivo. Por ello, al realizar el estudio macroscpico de una colonia, se debe indicar en que medios de cultivos se sembr, pues si se varan las condiciones de los mismos, no existe constancia en el desarrollo, an de hongos de la misma especie, por ejemplo Mucor rouxii desarrollado en iguales condiciones y tiempo (4 das) en medio Agar glucosado desarrolla una colonia dos veces ms grande y algodonosa que en Agar Sabouraud miel. Caracteres microscpicos: Se estudian empleando todas las tcnicas de observacin, desde el uso de la simple lupa hasta el microscopio electrnico. Un microscopio con diferentes aumentos es suficiente para los trabajos de rutina en Micologa. a. Observaciones con lupa: Permiten la observacin de hongos de grandes dimensiones, sin
necesidad de recurrir a tcnicas ms complejas.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA b.
Observaciones microscpicas directas: se efectan con material entre porta y cubreobjeto,
tomando una pequea cantidad de material que se deposita sobre el portaobjeto. Se puede usar una gota de lquido de montar (ver ms adelante), o solucin fisiolgica, agua destilada, solucin acuosa de glicerina al 30%. Tambin puede usarse una gota de colorantes vitales (rojo neutro, azul de metileno, etc.) que permiten ver al hongo al estado vivo. Las preparaciones para las observaciones microscpicas directas pueden realizarse por: 1) Disociacin: Preparaciones directas por disociacin: Se realizan cuando el hongo es filamentoso. Se coloca en un portaobjeto una gota de cualquiera de los lquidos arriba mencionados y con un ansa en gancho se toma una pequea porcin de desarrollo. Se deposita sobre la gota y se disgrega cuidadosamente con agujas de diseccin. Una vez que el material est ms o menos homogeneizado, se coloca un cubreobjetos y se observa. Se deben usar los objetivos a seco de menor y mayor aumento. 2) Impresin: Preparaciones directas por impresin: son especialmente usadas para montar o disgregar materiales clnicos donde se visualizar al hongo luego de una coloracin. Consiste en colocar una pequea cantidad de material a observar, por ejemplo esputo o trozos de rganos, entre dos portaobjetos colocados transversalmente (en cruz) y hacer una ligera presin de uno sobre el otro hasta disgregar el material. Cuando se utiliza esta tcnica para hacer preparaciones coloreadas de escamas de piel, se debe colocar este material entre portaobjetos en los que previamente se haya extendido una pelcula de suero que servir para adherir las escamas a los portas. Se presiona igual que en el caso anterior. Para efectuar la coloracin, se deja secar previamente a temperatura ambiente y recin se
colorea. A tener en cuenta: Los hongos levaduriformes producen colonias mantecosas, pastosas con una superficie lisa que simula colonias bacterianas. Los hongos filamentosos producen colonias vellosas, algodonosas o acordonadas por el crecimiento de hifas areas. Usos de lquidos de montar. Se utilizan para observaciones de hongos tomados de medios de cultivo. Los ms usados son: -Lquido de montar de Patterson Sol. de acetato de K al 2% Glicerina Alcohol CuSO4 colorear 50 ml. 20 ml 30 ml. c.s.p.
Se usa para observaciones en fresco, til para aquellos casos en los que se necesite aclarar la preparacin sin modificar la morfologa ni el color de los elementos. Evita la formacin de burbujas. -Colorante de Gueguen cido lctico Sudan III Azul cotton Solucin yodo alcohlica 100 ml. 0,1gr. 0,1gr. 10 a 30 gotas
Se disuelve el Sudn III en el cido lctico por trituracin en un mortero. Luego se calienta suavemente hasta color rojizo. Enfriar y dejar reposar 24 hs. filtrar y agregar el Azul cotton y la solucin de Yodo. Algunos elementos del hongo aparecen as muy bien diferenciados y coloreados. Las grasas aparecen en color rosa o rojo por el Sudan III, el glucgeno en caoba y el almidn en azul por el yodo. El azul cotton da el fondo y es tomado por el protoplasma joven y por la pared celular. El cido lctico es aclarante y fijador. -Azul de lactofenol Agua destilada cido lctico Cristales de fenol Azul de anilina (azul algodn) Glicerol
20 ml 20 ml 20 g 0,05 g 40 ml
Disolver el fenol en cido lctico, glicerol y agua, calentando suavemente. Luego agregar el azul de anilina. Se utiliza para preparados hmedos cuando se remueve una pequea cantidad de agar con el cultivo.
Criterio a usar en muestras clnicas Es importante que un hongo sea reconocido tempranamente, ya que a menudo el tratamiento de las micosis es duro, puede tener complicaciones y no debe administrarse tentativamente, hasta haber hecho un diagnstico definitivo. Las siguientes son pautas para hacer una evaluacin potencial de una especie de hongos obtenida de muestras clnicas: 1. Los hongos saprobios habitualmente tienen un crecimiento rpido, producen colonias en 1 a 5 das. 2. Los hongos patgenos dimrficos crecen lentamente, entre 10 a 45 das, sin embargo Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum pueden producir colonias maduras antes de los 10 das.
3. Los hongos saprobios no pueden convertirse en levaduras o esfrulas por incubacin a 37C, mientras que s pueden hacerlo los dimrficos patgenos. A su vez, estos tienen una contraparte saprobia que tambin desarrolla a 25 30 C. 4. Debido a que los hongos saprofitos son inhibidos en medios de cultivo con cicloheximida es necesario usar medios de aislamiento con inhibidor y sin inhibidor (Recordar que: la mayora de los hongos dimrficos son capaces de crecer en presencia de este agente antimictico) 5. El cultivo de los hongos dimrficos presenta colonias de aspecto sedoso brillante, debido a que sus hifas son ms estrechas que las de los hongos saprofitos y tienden a ubicarse paralelas dando un aspecto como de cuerda, en cambio los hongos saprofitos sus colonias tienen un aspecto lanoso, velloso, algodonoso, yesoso.
Morfologa macroscpica Sobre medios de cultivo generales se deber tener en cuenta: 1. Descripcin del aspecto de las colonias Las colonias se pueden describir teniendo en cuenta el tamao, color, superficie, etc. Tamao: Grande, mediana, pequea Color: Ver en superficie, reverso o difusin al medio. - Los hongos dematiceos dan color marrn o negro en el anverso y negro en el reverso. - Los dermatofitos presentan diversa gama de colores en el anverso y reverso de la colonia. Superficie: Brillante, lisa, granular, rugosa, aterciopelada, terrosa, algodonosa Consistencia: Viscosa, mantecosa, friable (se disgrega al tocarla), dura. Densidad (con luz a travs de la colonia): Opaca, Transparente, Traslcida Forma:
Puntiforme
Circular
Filamentosa
Irregular
Rizoide
Lanceolada
Elevacin:
Chata
Elevada
Convexa
Cpula
Umbonada
Umbilicada
Margen:
Entero
Ondulado
Lobado
Ondeado
Filamentoso
Morfologa microscpica Pueden usarse diversos mtodos para el examen microscpico directo de hongos Mtodo de montaje con K(OH) El hidrxido de potasio se utiliza para aclarar y ablandar muestras como piel, raspado de uas y pelos infectados o muestras de esputos. Se coloca una gota de K(OH) al 10% que contiene glicerina en un portaobjeto y se mezcla con una pequea cantidad de material a examinar (piel, pelo, escamas, etc.). Se pasa suavemente el portaobjeto a travs de la llama baja de un mechero Bunsen para facilitar el aclaramiento (no hervir). Se coloca un cubreobjetos sobre la gota y se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se examina en el microscopio buscando las hifas micticas. Mtodo de montaje hmedo El procedimiento se lleva a cabo con el ansa de gancho o con una aguja montada sobre un trozo de varilla, se procede tomando una pequea porcin de la colonia a estudiar (a veces es necesario ayudarse con otra ansa). La muestra debe tomarse de un sitio intermedio entre el centro y la periferia de la colonia. Este pequeo fragmento de colonia se transfiere a una gota de lactofenol azul de algodn en un portaobjeto y se cubre con un cubreobjetos. Se presiona suavemente directamente sobre el fragmento de la colonia para deprimir las hifas y otras estructuras y permitir un mejor examen microscpico. Mtodo de montaje con cinta adhesiva Se aconseja usar cinta adhesiva de alta transparencia. Se hace un doblez de una tira de 4 cm, con el lado adhesivo hacia afuera, y se sostiene entre los dedos pulgar e ndice. El lado adhesivo se presiona
firmemente contra la superficie de la colonia del hongo. El micelio areo se adhiere a la superficie y puede separarse del resto. Las tiras de cinta inoculadas se colocan en una gotita de lactofenol-azul de algodn en un portaobjeto. Hifas: 1. Tabicadas Hialinas Dematiceas 2. No tabicadas Micelio vegetativo: Hifas en raqueta Hifas en espiral Hifas en peine Candelabros fvicos
Esporulacin area: Esporangios Microconidias Macroconidias Ascosporas dentro de ascas Basiodiosporas sobre bsides
Esporulacin vegetativa: Artrosporas (Ej. Coccidioides. immitis) Blastosporas (Ej. levaduras) Clamidosporas (Ej. Cndida. albicans) Identificacin preliminar de cultivos de hongos Para la identificacin de un moho se precisa una descripcin completa del organismo. Para estudiar sus caractersticas, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio y da muy buenos resultados con fines comparativos para Penicillium y Aspergillus. El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y segunda semana de incubacin. Las observaciones macroscpicas deben realizarse con la ayuda de una lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de hongos es
filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un aspecto velloso o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con superficies lisas. Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos as deducir lo siguiente: velocidad y forma de crecimiento, tamao y color de los cuerpos fructferos e hifas; elevacin y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o ausencia de peritecios (frutos de reproduccin sexual), variaciones en la forma y tamao de los ncleos de mohos. Debe observarse la consistencia de la superficie de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la presencia de pigmentos en la superficie o el reverso o su difusin hacia el medio circundante Invirtiendo la placa de Petri puede observarse el color del fondo de la colonia, as como cualquier coloracin producida en el medio. Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el hongo, pero para identificar el gnero y la especie es preciso el estudio al microscopio. Con las esporas se efectan las observaciones siguientes: forma, tamao, color y caractersticas. En las hifas frtiles se examinan: ramificaciones, tabiques, anchura, color, caractersticas y naturaleza de las paredes (lisas, picadas o rugosas). A partir de las observaciones as adquiridas y
complementadas con las tcnicas de coloraciones conocidas, puede intentarse la identificacin del moho conociendo la descripcin de los gneros.
Levaduras Formadoras de hifas en Agar Harina de Maz No formadoras de hifas en Agar Harina de Maz
Pseudohifas: Cndida sp. Artrosporas : Geotrichum sp. Trichosporum sp.
Cryptococcus neoformans Saccharomyces sp. Rodotorula sp. Cndida glabrata
Hongos filamentosos o mohos
Hifas no tabicadas
Hifas tabicadas
Dematiceos Phycomicetes: Conidias Multicelulares Tabiques transversales *Rhizopus sp. y longitudinales: *Histoplasma capsulatum *Mucor sp. Dimrficos:
Hialinos Dermatofitos: Conidiforos con
vescula dilatada:
*Microsporum sp. *Aspergillus sp.
*Alternaria sp. *Coccidiodes immitis *Trichophyton sp. *Curvularia Conidiforos se ramifican: que
*Absidia sp. Conidias unicelulares: *Paracoccidiodes brasiliensis *Epidermophyton sp. *Penicilium sp. *Cladosporium sp. *Nigrospora sp. forman racimos: De crecimiento lento: *Fusarium sp. *Phialospora sp. *Fonsecacea sp. *Sporotrix schenkii Conidiforos que
Blastosporas y Clamidosporas de Cndida albicans
Microconidias y Clamidosporas
Macro y Microconidias
Aspergillus sp
MATERIALES Y METODOS ACTIVIDADES A DESARROLLAR: Observacin de materiales clnicos Observacin macroscpica de los cultivos Observacin microscpica de los desarrollos, realizando distintas tcnicas Observacin del desarrollo en microcultivo
Trabajo Prctico de Laboratorio N8 IDENTIFICACIN DE LEVADURAS DE INTERS MDICO
OBJETIVOS: El trabajo prctico capacitara al alumno en los siguientes tems: Adquirir el criterio adecuado para la confeccin de esquemas mnimos de identificacin de levaduras de inters mdico. Observar el crecimiento de hongos en medios lquidos.
INTRODUCCIN TEORICA: Cuando se observa el desarrollo de una colonia sobre cualquiera de los tubos del primocultivo, se procede a identificar el aislamiento. La identificacin de las levaduras puede variar desde unos pocos test simples, para identificacin presuntiva de Cndida albicans y Cryptococcus neoformans a una gran variedad de pruebas necesarias para identificar a todas las levaduras comnmente aisladas en los laboratorios de micologa. El primer paso en el estudio de una cepa es la obtencin de un cultivo puro a partir del cual se puedan iniciar los estudios sistemticos de sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y sexuales bajo condiciones estandarizadas. Si no se ha comprobado la pureza de una cepa y los estudios morfolgicos, fisiolgicos y sexuales no se han realizado en condiciones debidamente estandarizadas, es imposible identificarla o describirla con certeza. A continuacin se enumeran las principales pruebas diferenciales para la identificacin de levaduras por el mtodo de referencia. Se subrayan aquellas que se consideran posibles de realizar en todo laboratorio hospitalario a fin de arribar a la identificacin presuntiva de Cndida albicans y Cryptococcus neoformans. Las pruebas sin subrayar requieren mayor infraestructura, son onerosas, y se centralizan en laboratorios de referencia. Estos test pueden ser subdivididos en dos categoras: los usados para identificacin presuntiva y los confirmatorios.

1. Prueba de formacin de tubo germinativo por Candida albicans. 2. Prueba de formacin de Clamidosporas por Candida albicans. 3. Agar semillas de girasol para diferenciacin de Cryptococcus neoformans. 4. Prueba de la produccin de ureasa para Cryptococcus neoformans. 5. Crecimiento a 28 C y 37 C. 6. Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfolgico. 7. Cultivo en lmina en agar morfologa (Difco) para estudio micromorfolgico. 8. Crecimiento en agar morfologa (Difco) para macromorfologa. 9. Ensayo de asimilacin de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, cido ctrico, eritritol y m-Inositol.
10. Ensayo de asimilacin de nitrato de potasio y peptona. 11. Ensayo de fermentacin de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa.
12. Crecimiento en medio libre de vitaminas. 13. Produccin de ascosporas. 14. Tinta China para revelar la capsula de Cryptococcus neoformans.
Produccin de tubo germinativo Esta prueba es considerada hasta el presente como la ms confiable para identificar presuntivamente a C. albicans, tiene una exactitud del 95%-100% cuando se compara con la identificacin convencional. Procedimiento: Hacer una suspensin ligera (100.000 a 1.000.000 de clulas/ml) de un cultivo de 24 h de la cepa en estudio en 0,5 ml de suero bovino. La suspensin puede hacerse tocando la superficie de una colonia con la punta de una pipeta Pasteur estril y luego emulsionando suavemente las clulas adheridas a la pipeta en el suero. Incubar a 37 C y observar microscpicamente cada media hora, hasta las tres horas. Es necesario inocular simultneamente un testigo positivo (C. albicans) y uno negativo (C. guilliermondii u otra). Interpretacin: El tubo germinativo se ve como una proyeccin filamentosa delgada, que no presenta constriccin en el punto de origen. Coloracin con Tinta China Se realiza para detectar C. neoformans en las muestras de LCR y fluidos corporales. Tambin es til para estudiar cepas recuperadas de muestras clnicas cuando se sospecha C.neoformans. Mtodo: Colocar una gota del LCR u otro fluido corporal sobre un portaobjetos limpio Agregar sobre la muestra una gota de tinta china diluida con agua destilada estril 1:1, homogeneizar (si es necesario), y colocar un cubreobjetos. Observar rpidamente al MO con objetivos de bajo y mediano aumento.
Interpretacin: El ensayo es positivo si se observan levaduras de 4-20 micrones, rodeadas por una cpsula de 1-20 micrones de espesor, que refringe contra el fondo negro del preparado. Por otra parte, existen reactivos comerciales que permiten arribar a la identificacin presuntiva como el Chromagar Candida, Chromagar ID, o bien los reactivos comerciales que permiten la identificacin confirmatoria como el ID 32C, API 20C, Vitek, entre otros. A raz de la dificultad que presenta la identificacin de levaduras diferentes de Candida albicans y Cryptococcus neoformans en los laboratorios de microbiologa general de los centros de salud, se propone un algoritmo de identificacin presuntiva con la intencin de brindar una ayuda al momento de arribar a la identificacin fenotpica. Se recuerda que las metodologas propuestas slo permitirn una identificacin presuntiva de los aislamientos, por lo tanto, es necesario completar el esquema de identificacin mediante la realizacin de metodologa estndar, o bien derivando a los Centros de Referencia. A continuacin se adjuntan el algoritmo de identificacin presuntiva y las caractersticas micromorfolgicas ms importantes de las especies de levaduras de aislamiento ms frecuente en los laboratorios de rutina. Se adjuntan, adems, los procedimientos de laboratorio y los medios de cultivo que sugerimos se utilicen para realizar la identificacin presuntiva de los aislamientos de levaduras.
Algoritmo de identificacin de levaduras
Muestra clnica
Siembra en Agar cromognico (1)
Siembra en Sabouraud con ATB
Observacin Examen directo (2)
Levadura Re-aislamiento
en Sabouraud con ATB
Levadura Cultivo Puro Observacin del aspecto de la colonia:
Pigmentada de color rosa o salmn
No pigmentada. Color blanco o crema
Rhodotorula spp.
IDENTIFICACIN
1. Realizar la siembra del primocultivo en un agar cromognico (contiene antibitico) permite en 24 h la visualizacin de las colonias puras, la deteccin de una infeccin mixta de levaduras y la identificacin presuntiva de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei. 2. Es conveniente realizar una observacin de las colonias obtenidas para asegurarse que el cultivo est libre de bacterias.
Levadura no pigmentada
Tubo Germinativo
Negativo
Positivo
MICROMORFOLOGA
Candida albicans
PRESUNTIVA*
IDENTIFICACIN
Micro morfologa: la observacin de la micromorfologa se debe realizar siempre, ya sea para la identificacin presuntiva como para la identificacin completa. Se puede realizar en extracto de malta lquido, donde observar fundamentalmente las principales estructuras que caracterizan a la reproduccin vegetativa: blastoconidias, artroconidias, pseudomicelio, y el tipo brotacin: monopolar o multipolar o fisin. Se puede realizar en agar harina de maz (CMA), que permite la observacin de la disposicin de las estructuras y adems, en el caso de C. albicans, se puede ver la formacin de clamidoconidias. Identificacin presuntiva: Adems de las caractersticas macro y micromorfolgicas, la identificacin presuntiva puede realizarse incluyendo otras pruebas:
Siembra en un agar cromognico, especialmente CHROMagar Candida que permite identificar: C. albicans, C. tropicalis y C. krusei.
Prueba de ureasa. Agar semillas de girasol. Asimilacin de trehalosa. Disco de fluconazol de 25 g.

128 2011
Especie de Levadura
Micromorfologa
CHROM Agar
Trehalosa Urea
Disco fluconazol
C. albicans
Pseudomicelio con blastoconidias agrupadas, clamidoconidias Pseudomicelio largo y ramificado, blastoconidias dispuestas a lo largo Pseudomicelio corto, ramificado, blastoconidias ovoides Clulas alargadas (en forma de habano) con blastoconidias terminales. Blastoconidias muy pequeas sin pseudomicelio
Verde
Neg.
Neg.
----------
C. tropicalis
Azul
Positivo (+ de 3 horas)
Neg.
----------
C. parapsilosis
Crema (ND)
Neg.
Neg.
----------
C. krusei
Rosa seca Rosa, crema (ND)
C. glabrata
Neg. Positivo confirma (dbil) con halo< 14 mm. Positivo (a partir Neg. --------de las 2 hs)
C. guilliermondii
Blastoconidias muy pequeas con Pseudomicelio Rudimentario (escaso) Levaduras redondas brotantes.
(ND)
Neg.
Neg.
----------
Cryptococcus neoformans Trichosporon beigelii
(ND)
Neg.
Positivo --------
Blastoartroconidias, Clamidoconidias intercalares * ND: No se distingue por color.
Azul violceo
Neg.
Positivo
---------
Colonia de aspecto levaduriforme
Colonia rosa o salmn Urea +
Colonia blanca o crema
Rhodotorula spp.
Tubo germinativo + Clamidoconidia
Negativo
Positivo
Agar morfologa, Extracto de malta lquido + Agar cromognico
Cndida albicans
Xilosa, trehalosa y alfa-metil-D-glucsido Negativo
Asimilacin y fermentacin
C. albicans C. tropicalis C. krusei
Trehalosa
Otras levaduras Trichosporon, Cryptococcus, etc.
C. glabrata
(Urea, semilla girasol, etc.)
Asimilacin de azcares
Identificacin definitiva de levaduras
Mtodos comerciales: La laboriosidad y el alto costo que representa realizar el mtodo clsico de identificacin de levaduras ha llevado a la elaboracin de mtodos comerciales cada vez ms eficaces y rpidos, los cuales permiten identificar un elevado porcentaje de las levaduras de inters en infecciones hospitalarias. Esta metodologa permite que la mayora de los hospitales puedan tener acceso a la identificacin de levaduras al nivel de especie, obtenindose un resultado altamente confiable en la mayora de los casos. Los mtodos que existen actualmente en el mercado son los siguientes:

ID 32C (bioMrieux, Marcy I`Etoile, France) API 20C Aux system (bioMrieux Vitek Inc., Hazelwood, Mo.) VITEK YBC system (bioMrieux-Vitek) VITEK 2 System Fungichrom . Yeast Star Auxacolor RapID Yeast Plus system
ID 32C (bioMrieux, Marcy I`Etoile, France): El equipo consiste en una tira de plstico descartable con 32 pocillos, los cuales contienen 29 sustratos deshidratados para pruebas de asimilacin (carbohidratos, cidos orgnicos y (aminocidos), una prueba de sensibilidad a cicloheximida, una prueba colorimtrica para determinar hidrlisis de la esculina y un control negativo. El procedimiento se realiza segn indicaciones del fabricante, pudindose obtener resultados a las 48 horas de incubacin a 30 C. La lectura se realiza visualmente y el crecimiento se determina por presencia de turbidez en el pocillo correspondiente. Los resultados se convierten en un bio-cdigo numrico de 8 dgitos que permite la identificacin a travs de un manual de cdigos (ID 32C, ndice analtico de perfiles) La identificacin requiere de la observacin micromorfolgica. Este mtodo es el ms comnmente utilizado por los pases europeos. Permite identificar el 92% de los aislamientos comunes y el 85 % de los aislamientos ms raros. Entre las especies que no pudieron ser identificadas se encuentran: C. albicans, C.guilliermondii, C. neoformans, Rhodotorula spp. y Saccharomyces cerevisiae. Este sistema permite una mejor identificacin de cepas atpicas.
API 20C Aux system (bioMrieux Vitek Inc., Hazelwood, Mo.): El equipo consiste en una tira de plstico descartable con 20 pocillos los cuales contienen 20 sustratos deshidratados para pruebas de asimilacin. El procedimiento se realiza segn indicacionesdel fabricante pudindose obtener resultados a las 72 horas de incubacin a 30C. La lectura se realiza visualmente y el crecimiento se determina por presencia de turbidez en el pocillo correspondiente. Los resultados se convierten en un biocdigo numrico de 7 dgitos el cual permite la identificacin a travs de un manual de cdigos (API 20C, ndice analtico de perfiles) La identificacin requiere la observacin micromorfolgica y a veces pruebas suplementarias como utilizacin de KNO3, crecimiento a 42 C y produccin de ureasa. Este es el sistema ms utilizado en EEUU. Este sistema permite identificar el 97% de los aislamientos comunes y un 88% de los menos comunes. Entre las especies que no pudieron ser identificadas se encuentran: C. albicans, C. guilliermondii y C. krusei.
VITEK YBC system (bioMrieux-Vitek.): El equipo consiste en una tira de plstico descartable con 30 pocillos, los cuales contienen 26 sustratos deshidratados para pruebas de asimilacin y 4 controles negativos. El procedimiento se realiza segn indicaciones del fabricante, pudindose obtener resultados a las24-48 horas de incubacin a 30C. La lectura se realiza a travs de un sistema computarizado. La identificacin requiere la observacin micromorfolgica. Este sistema permite identificar alrededor del 89% de los aislamientos, sin embargo este porcentaje vara segn las especies estudiadas. Entre las especies cuya identificacin puede ser errnea o pueden no ser identificadas se encuentran: C. tropicalis, C. krusei, C. rugosa, C. zeylanoides, C. neoformans, entre otras. Este mtodo posee la ventaja de que puede identificar presuntivamente C. dubliniensis.
VITEK 2 ID-YST System (sistema automatizado para identificacin y sensibilidad a antifngicos): Este es el ms reciente de los sistemas y todava esta en evaluacin. Puede identificar especies de levaduras a las 15 horas a travs de una tcnica muy sensible basada en la fluorescencia. ID-YST comprende 47 reacciones bioqumicas e incluye nuevas especies descriptas. El mtodo permiti identificar 92 % de las cepas probadas. Un 6,2% fue no identificado (C. inconspicua, C glabrata, C. krusei, C. norvegensis, C. parapsilosis) y 1,7 % errneamente identificada (C. kefyr, C. krusei, S. cerevisiae).
FUNGICHROM I: Es un equipo que basa la identificacin de levaduras en la presencia o ausencia de ciertas enzimas, que se visualiza mediante reacciones colorimtricas. La actividad enzimtica se revela con 3 tipos de reacciones: 1. Hidrlisis de sustratos cromognicos. 2. Asimilacin de sustratos naturales: utilizacin de GAL; SAC, TRE, MAL, CEL, RAF, LAC;
resistencia a la cicloheximida e hidrlisis de urea. 3. Oxidacin de sustratos sintticos (fenoloxidasa). El equipo consiste en una tira de plstico descartable con 16 pocillos, los cuales contienen los sustratos. Se prepara un inculo a partir de un cultivo de24 horas y se siembran dos gotas en cada una de las celdas, se incuba 24 o 48 horas a30C y, simultneamente, se debe realizar el examen macro y microscpico de las colonias con lo que la sensibilidad aumenta a 91 %.
BIBLIOGRAFIA -Curso Identificacin presuntiva de levaduras de inters mdico INEI ANLIS Dr. C.G. Malbrn Ao 2009
Trabajo de Aula N9 RESOLUCIN DE CASOS CLNICOS
OBJETIVOS: 1 Integrar los conocimientos tericos individuales de las micosis aprendidas, con el resto de las manifestaciones clnicas que pueden afectar a un paciente. 2 3 Plantear diagnsticos diferenciales. Afianzar los conocimientos adquiridos, realizando un estudio puntual y crtico de los datos aportados, para poder obtener el diagnstico certero del paciente. 4 Relacionar al profesional bioqumico con el resto de los profesionales del equipo de salud.
Problema Clnico N 1 Datos del paciente: Paciente J.C. de 33 aos de edad, procedente de la localidad de Fontana, provincia de Formosa, Repblica Argentina. La zona es subtropical, hmeda, con temperatura media anual de 23 C y est situada en el nordeste argentino. El paciente era trabajador rural en un obraje y abata rboles de maderas duras. Fue admitido en el Hospital Muiz el da 17/12/2007. El motivo de la internacin fue la presencia de lesiones lcero-vegetantes de aspecto verrugoso en ambos pies, con marcado predominio en el pie derecho, acompaadas de linfoedema de la pierna homolateral. Fue enviado desde la ciudad de Formosa para confirmacin del diagnstico e inicio del tratamiento. Antecedentes: En el ao 2005 sufri un accidente en el cual un rollizo de quebracho se cay sobre su pie derecho y le ocasion heridas graves, que motivaron la amputacin de la primera falange del cuarto dedo de ese pie. A partir de este episodio comenzaron a aparecer las lesiones que presentaba en el momento de la internacin y en los ltimos meses se produjeron lceras y vegetaciones en el pie contra-lateral. Despus del accidente, al aparecer heridas infectadas y zonas de necrosis, adems de la amputacin, se le efectuaron limpieza quirrgica de la herida y tratamiento con ciprofloxacina y clindamicina. Pese a estas medidas present un linfoedema progresivo de la pierna derecha. El paciente no refiri episodios febriles, ni astenia, ni prdida de peso.
Examen fsico: Paciente en buen estado general, decbito activo indiferente, afebril, estatura 1,70 m, peso 79 kg contextura fsica atltica. Temperatura axilar 36,7 C, frecuencia cardaca 56 por minuto, tensin arterial 145/80 mm Hg y frecuencia respiratoria 16 por minuto. En el pie derecho se observaron lesiones lcero-vegetantes de aspecto verrugoso que abarcaban la planta, los bordes laterales y el taln y ascendan hasta el tobillo del mismo lado. En la pierna homolateral present edema fro e indoloro, desde el dorso del pie hasta la rodilla, con aspecto elefantisico. En el pie izq. se observaron lesiones similares, pero ms pequeas y menos numerosas que abarcaban la planta y los bordes laterales (Figuras 1 y 2). No se palparon adenomegalias en la vecindad, ni en otros territorios y el resto del examen fsico no arroj otros datos positivos. Se formularon algunos diagnsticos presuntivos y se propuso el siguiente plan de estudios: exmenes de laboratorio de rutina, radiografa de trax, ecografa abdominal, tomografa de miembros inferiores, radiografas de pies.
Resultados de los exmenes de laboratorio de rutina: Eritrosedimentacin: 10 mm en la primera hora, Hematocrito: 44,6%, Hemoglobina: 14,9 g% Leucocitos: 7.500/l (Neutrfilos 59%, eosinfilos 7%, basfilos 1%, linfocitos 26% y monocitos 7%) hepatograma, uremia, glucemia, creatininemia y uricemia dentro de los lmites normales. Sodio 144 meq/l y potasio 4,5 meq/l. Serologa para enfermedad de Chagas Mazza: hemaglutinacin y ELISA reactivas Prueba de VDRL reactiva 2 diluciones (2dils). Serologa de VIH 1/2 no reactiva. Recuentos de clulas CD4-positivas: 736/l (36%) y CD8-positivas: 389/l (19%).
Estudios radiolgicos: Las radiografas de trax presentaron aumento del espesor del intersticio pulmonar en ambas bases, aumento del espesor de la cisura del lbulo medio del pulmn derecho y aumento del tamao de ambos hilios pulmonares (Figura 3). Las radiografas de pie no mostraron lesiones seas activas (Figura 4).
Tomografa computarizada de los miembros inferiores. Slo se observ edema de partes blandas en la pierna derecha. Ecografa abdominal. Hepatomegalia leve con escaso aumento de la ecogenicidad. Vescula biliar pequea y de paredes finas, imagen compatible con un clculo de 32 mm que casi llena por completo la luz. Pncreas de tamao normal, ligeramente heterogneo. Esplenomegalia homognea de 120 mm de dimetro e imagen calcificada de 3 mm en el polo inferior. Riones de aspecto normal. Retroperitoneo: no se observaron adenomegalias. En un estudio histopatolgico de piel, previo a su internacin, se comprob hiperqueratosis, hiperacantosis, papilomatosis, eliminacin transepitelial del proceso inflamatorio y, en la dermis, proceso inflamatorio mixto, granulomatoso y supurativo con congestin vascular. No se encontraron microorganismos. Se le efectuaron tres biopsias de las lesiones cutneas, pruebas cutneas y serolgicas que permitieron aclarar el diagnstico e instituir un tratamiento adecuado. a. Examen micolgico de biopsia cutnea remitida en solucin salina estril, cuyo examen microscpico directo mostr elementos esfricos, hialinos de 15 a 20 m de dimetro, con pared celular refringente, de doble contorno y varios blastoconidios que rodeaban a la clula madre. Los cultivos en medio de agar-glucosado de Sabouraud, lactrimel de Borelli y agar-infusin de cerebro y corazn con antibiticos, incubados a 28 C y 37 C no presentaron el desarrollo de hongos.
Examen microbiolgico de la misma muestra clnica, la coloracin de Ziehl-Neelsen no present bacilos cido-alcohol resistente y los cultivos en medios de Lwenstein-Jensen, previa homogeneizacin, no exhibieron el desarrollo de micobacterias a los 60 das de incubacin a 30 C y 37 C. c. Examen histopatolgico de una biopsia cutnea fijada en formol al 10% en solucin salina a pH 7,4 present granulomas epitelioides con reas de supuracin en la dermis papilar y profunda, hiperqueratosis, hiperacantosis y eliminacin transepitelial del proceso inflamatorio. En la coloracin de Grocott, dentro de las clulas gigantes, se observaron elementos esfricos, multibrotantes, Grocottpositivos, de dimensiones que oscilaron entre los 8 m y los 25 m. d. Exmenes microbiolgicos y citolgicos de lavado broncoalveolar, no presentaron hallazgos patolgicos. e. Se realizaron pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada con PPD 2 UT, paracoccidioidina (antgeno de Fava Netto) e histoplasmina, que arrojaron resultados negativos. f. Se realizaron pruebas de inmunodifusin en gel de agar con paracoccidioidina e histoplasmina. La inmunodifusin con paracoccidioidina result positiva con ttulo 1/8 y la contra-inmunoelectroforesis con inmunodifusin secundaria fue positiva con la presencia de tres bandas andicas y cuatro catdicas. Las pruebas con histoplasmina fueron negativas.
Preguntas: 1Cules son las posibles causas de las lesiones verrugosas de los miembros inferiores? Marque con una cruz la o las posibles causas de dar este tipo de lesiones: Tuberculosis cutnea verrugosa Piodermitis vegetante Sfilis terciaria Criptococosis menngea
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Leishmaniasis cutnea verrugosa Cromoblastomicosis Esporotricosis Cnceres cutneos
2. La presencia de eosinfilos con que patologas puede corresponderse, nombre tres, y los valores que pueden observarse en ellas. 3. Qu importancia puede haber tenido el traumatismo grave que sufri el paciente dos aos antes de la enfermedades actual? 4. De acuerdo a los resultados de los estudios realizados, indique cul es la patologa que compromete la salud del paciente. 5. Describa brevemente las caractersticas que crea ms sobresaliente de este micro-organismo. 6. Indique la epidemiologa de este micro-organismo.
Caso clnico problema N2 Datos del paciente: Paciente B. R. O., 75 aos, sexo masculino. Reside en Villa Mercedes, Provincia de San Luis. En casa de buena construccin con sanitarios completos. Trabaj muchos aos como rematador de ganado y ahora est retirado. Tiene un buen nivel socio-econmico y cultural. Antecedentes patolgicos previos: En 1962 tuvo una lcera gstrica sangrante por la cual fue sometido a una intervencin quirrgica, gastrectoma subtotal (Bilroth II), esto condicion un dficit crnico de la absorcin del hierro y una gastritis biliar crnica, con lcera de la neo-boca. Se le plante una nueva intervencin quirrgica que fue rechazada por el paciente. Debe recibir constantemente aporte exgeno de hierro para suplir el dficit. En 1972, present un cuadro respiratorio, con infiltrados radiolgicos pulmonares, que se acompaaron de artralgias en las grandes articulaciones, fiebre y eosinofilia sangunea. Fue diagnosticado como sndrome de Loeffler. Recibi corticosteroides y el cuadro clnico remiti. En 1973, consult por granulomas cutneos, de aspecto vegetante, en la zona dorsal del dedo medio de la mano derecha. Se le efectu una biopsia cutnea cuyo estudio histopatolgico acus un granuloma epitelioide con clulas gigantes en el cual se comprob la presencia de un hongo dimorfo. Este diagnstico fue confirmado ms tarde por las pruebas serolgicas especficas. Durante 1973 y 1974, recibi dos series de anfotericina B de aproximadamente 1000 mg en total y ms tarde fue tratado con ketoconazol 400 mg/da, durante seis meses. La lesin cutnea desapareci y su estado general de salud era excelente.
En 1994 tuvo convulsiones tnico-clnicas generalizadas, que respondieron al tratamiento con fenobarbital y fenitona. La tomografa axial computadorizada (TAC) y resonancia nuclear magntica (RNM) de cerebro mostraron pequeas anomalas, tanto en la sustancia gris como en la blanca, a las cuales los neurlogos le dieron escasa importancia. En 2003 present un episodio bronconeumnico con fiebre, dolor torcico, sudoracin profusa y tos con escasa expectoracin. Durante el mismo tuvo elevacin de la concentracin de la fosfatasa alcalina (345 U/l) y de la eritrosedimentacin (58 mm en la primera hora). Fue tratado con ceftriaxona y se produjo la remisin del cuadro clnico. Enfermedad actual: Consult por una osteoartritis de la rodilla izquierda de tres aos de evolucin, dola espontneamente, tena impotencia funcional y el dolor aumentaba con el movimiento, el apoyo y la palpacin. La rodilla estaba tumefacta, fluctuante, con choque rotuliano positivo, pero sin aumento de la temperatura local y sin eritema cutneo. Rx de rodilla: no visualiz lesiones seas. RNM mostr una lesin destructiva del cndilo interno del fmur. Signos de artrosis, con osteofitos en los cndilos femorales y platillos tibiales. Imgenes hipodensas en los cartlagos de los meniscos interno y anterior y menisco interno de pequeo tamao. Se observ abundante lquido intraarticular, con zonas tabicadas, compatible con artritis purulenta. La ecografa abdominal mostr una esplenomegalia homognea de 13 cm. La radiografa de trax no present alteraciones seas, ni modificaciones de la silueta cardaca, ni lesiones pleuropulmonares activas, se comprob un enfisema pulmonar difuso. La puncin articular obtuvo un lquido purulento cuyo examen microscpico no permiti observar ningn microorganismo. Los exmenes complementarios de laboratorio acusaron los siguientes resultados: Hemograma: hemates 3.300.000 mm3, hematocrito 30%, hemoglobina 9,40 g%, glbulos blancos 6.100 mm3, neutrfilos en cayado 1%, neutrfilos segmentados 63%, eosinfilos 13%, basfilos 0%, linfocitos 22%, monocitos 1%, clulas plasmticas 0%. Eritrosedimentacin 4 mm en la primera hora, glucosa 92 mg%, urea 23 mg%, colesterol 159 mg%, colesterol HDL 32 m%, colesterol LDL 103 mg%, cido rico 3,8 mg%, triglicridos 82 mg%. Hepatograma: bilirrubina total 0.64 mg%, bilirrubina directa 0,20 mg%, bilirrubina indirecta 0,44 mg %, GPT 20 U/l, GOT 22 U/l, fosfatasa alcalina 218 U/l, protenas totales 6,50g/dl. Orina: color amarillo claro, aspecto ligeramente turbio, sedimento regular cantidad, densidad 1020, examen qumico: pH 5,20, reaccin cida, protenas totales no contiene, glucosa no contiene, cuerpos cetnicos no contiene, urobilingeno no contiene, pigmentos biliares no contiene, hemoglobina no contiene, sedimento: clulas planas escasa cantidad, clulas redondas no se observan, leucocitos 15 a 20 por campo, piocitos regular cantidad, pus: escasa cantidad. El urocultivo no present desarrollo de colonias bacterianas.
La ecografa prosttica demostr aumento heterogneo de la glndula. El examen neurolgico fue normal, pero el electroencefalograma mostr una disritmia cerebral. Electrocardiograma: ritmo sinusal con bradicardia, tensin arterial 130/80. El lquido articular fue sembrado en medios de agar-glucosado de Sabouraud y agar infusin de cerebro y corazn con antibiticos, la incubacin se efectu a 28 C y 37 C, durante tres semanas y el examen microscpico present el aspecto que se expone en la figura 2. Adems se llevaron a cabo pruebas serolgicas especficas, examen micolgico de orina y una RNM del encfalo.
Preguntas: 1Cul es la infeccin que aqueja al paciente? 2 Describa las caractersticas macroscpicas y microscpicas de la colonia que crece en el medio de cultivo? 3. Qu relacin tiene este episodio con el que tuvo hace 30 aos? 4. Nombre el micro-organismo que aqueja al paciente y la distribucin geogrfica de la afeccin? 5. Explique las distintas formas de este hongo, y su relacin con la patogenia.
Problema clnico N 3 Antecedente personales: Paciente S.A., sexo masculino, 43 aos de edad. Naci en la provincia de Jujuy (norte de Argentina, lmite con Bolivia), vive actualmente en Avellaneda (sur del gran Buenos Aires). Acudi a consultas del Hospital Francisco Javier Muiz por tos, expectoracin mucopurulenta, disfona y odinofagia en agosto de 2008. Hace 20 aos tuvo tuberculosis pulmonar con afectacin de las vrtebras dorsales (mal de Pott). Hizo tratamiento anti-tuberculoso completo y slo quedaron como secuelas una cifoescoliosis dorsal y fibrosis pulmonar.
GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Toma alcohol y es fumador. Enfermedad actual:
Refiri tos, catarro, disfona y odinofagia de tres meses de evolucin, acompaada de prdida de 5 kg de peso. Examen fsico. Paciente adelgazado, con astenia y con manifiesta dificultad respiratoria, tiraje y estertores traqueales. Altura 1,60 m, peso 45 kg, piel triguea. Tensin arterial 110-70 mm Hg, frecuencia cardaca 82 por minuto, frecuencia respiratoria 18 por minuto, temperatura axilar 37,5 C. El examen otorrinolaringolgico acus la presencia de granulomas farngeos y en las cuerdas vocales. El especialista solicit el examen fibroendoscpico traqueobronquial para visualizar mejor la regin sub-gltica. Este estudio demostr disminucin de la luz traqueal en un 30%, por compresin extrnseca en el tercio superior y numerosos granulomas en la mucosa traqueal. Se tomaron muestras de biopsia para histopatologa en formol al 20% y para micologa y bacteriologa en solucin salina isotnica estril. Despus de las biopsias, el endoscopista coloc una prtesis anular para permitir el libre paso del aire por la regin subgltica y la trquea. El resto del examen fsico mostr cifoescoliosis dorsal, adenomegalias pequeas en el cuello y la ingle, hepatomegalia de dos traveses de dedo por debajo del reborde costal y disfona muy acentuada. Exmenes complementarios de laboratorio. Eritrosedimentacin: 90mmen la 1 hora, Eritrocitos: 4,2 x 106/l, hematocrito: 36,3%, hemoglobina: 12,8 g/dl, Leucocitos: 21.800/l, neutrfilos: 14,9%, eosinfilos: 66,7%, basfilos: 0%, linfocitos: 14,7%, monocitos: 3,7% uremia: 37 mg/dl, uricemia: 2,2 mg/dl, glucemia: 74 mg/dl, creatininemia: 0,60 mg/dl, bilirrubina total: 0,9 mg/dl, directa: 0,4 mg/dl, transaminasa glutmico oxalactica: 6 U/ml, transaminasa glutmico pirvica: 12 U/ml, fosfatasa alcalina: 301 U/ml, glutamiltranspeptidasa: 126 U/ml, protenas totales: 7,5 g/dl, albmina 3,2 g/dl, sodio: 138 mEq/l, potasio: 4,1 mEq/l. Rx de trax. Infiltrados heterogneos en ambos vrtices pulmonares, ms acentuados y densos en el izquierdo. Tomografa lineal del mediastino. Aumento del dimetro transversal del mediastino superior por masas heterogneas y desviacin de la trquea. Tomografa axial computarizada de trax. Infiltrado denso del vrtice del pulmn izquierdo, con un rea central reblandecida. Infiltrados acinales pequeos y engrosamiento de los tabiques interalveolares y disminucin del tamao del pulmn izquierdo con desplazamiento del mediastino. Tomografa computarizada del cuello. El examen fue dificultado por la movilidad del paciente. Se visualiz la colocacin de una prtesis traqueal y subgltica.
Ecografa abdominal. Hepatomegalia homognea, va biliar intraheptica no dilatada, vescula biliar de tamao y contenido normal, coldoco de calibre normal. Pncreas difcil de observar por meteorismo. Bazo de 120 mm homogneo. Riones eco estructura conservada. Adenomegalia del ligamento hepatoduodenal de 2 cm de dimetro isoecoica. Tanto el examen micolgico como el histopatolgico permitieron llegar a un diagnstico de certeza. Se realizaron, adems, estudios serolgicos y pruebas cutneas. Fue instaurado un tratamiento con una sola droga que mejor considerablemente al paciente, recibiendo el alta mdica del hospital. Durante la internacin se produjo la reduccin de la leucocitosis a 12.300/l y de la eosinofilia al 13,4%, en tanto que la fosfatasa alcalina aument a 630 U/ml. Debi recibir corticosteroides durante una semana para tolerar la colocacin de la prtesis y se le administraron, adems, dos monodosis de ivermectina. Preguntas 1 Cul es la patologa que aqueja al paciente, y quien la produce? 2 Describa las formas en las que puede encontrarse el hongo y explique la patogenia del mismo? 3 Cmo procesara Ud. las muestras destinadas a los estudios microbiolgicos?, y que caractersticas van a presentar los cultivos. 4 En una coloracin de una muestra clnica se puede observar el agente patgeno, explique? 5. Segn la clnica del paciente con que micosis se correlaciona, nmbrelas. Qu pruebas cutneas hara?
Preparacin al estado fresco de la biopsia traqueal, y coloracin del patgeno Problema Clnico N 4 Antecedentes Personales: Paciente L.P.A., sexo masculino, 31 aos de edad, reside en San Antonio de Areco, Provincia de Buenos Aires. Trabaj como albail. Adicto a cocana, heterosexual promiscuo. Conoca su condicin de VIH-seropositivo desde 1998, slo realiz tratamiento antirretroviral durante 2 aos con
AZT, 3 TC. En el momento de la consulta no reciba tratamiento antirretroviral. Sufri un herpes zoster intercostal izquierdo tres meses antes de la consulta. Enfermedad actual: La enfermedad actual haba iniciado 40 das antes con fiebre persistente, tos productiva, prdida de peso no cuantificada, astenia y deterioro del estado general. Fue internado en el Hospital Carrillo del cual fue dado de alta a los pocos das, sin diagnstico y con leve mejora. En el momento de su admisin en el Hospital Francisco Javier Muiz se comprob que el paciente estaba adelgazado, astnico, con palidez de piel y mucosas, refiri cefalea persistente, orientado en tiempo y espacio, colaborador, febril (temperatura axilar 38,5 C), sin signos menngeos ni de foco neurolgico. Se observaron secuelas hiperpigmentadas del herpes zoster, una adenopata supraclavicular izquierda, de 2 x 3 cm de dimetro, de consistencia firme, no adherida a los planos superficiales, adherida a los planos profundos, sin periadenitis, poco dolorosa a la palpacin y hepatosplenomegalia moderada. La semiologa cardaca y respiratoria no acus signos de inters. La frecuencia cardaca era de 96 por minuto, la respiratoria de 17 por minuto y la tensin arterial de 120-80 mm Hg. Radiografa de trax: imagen nodular en campo medio del pulmn derecho, de 3 a 4 cm de dimetro, rodeada por un halo con aspecto de vidrio esmerilado. Exmenes complementarios de laboratorio: Eritrosedimentacin 71mmen la primera hora, hemates 3.3 x 106/l, leucocitos 3.900/l (neutrfilos 46%, linfocitos 39%,monocitos 7%, eosinfilos 8%, B 0%), hemoglobina 10,5 g%, hematocrito 30,3%, plaquetas 179.000/l, glucemia 85 mg/dl, uremia 35 mg/dl, creatininemia 0,86 mg/dl, colesterolemia 117 mg/dl, cido rico 2,4 mg/dl, sodio 135 meq/l, potasio 4,2 meq/l. Protenas totales 7,1 g%, albmina 3,6 g%, lctico deshidrogenasa 475 U/ml. Pruebas serolgicas: HBc Ac positivo, HBs Ag negativo, HCV no reactivo, VDRL no reactivo, serologa para tripanosomiasis americana (Chagas) no reactiva, serologa para toxoplasmosis IgG positiva e IgM negativa. Ecografa abdominal: Hepatomegalia homognea, esplenomegalia de 125 mm, heterognea con imgenes hipoecoicas, la mayor de 20 mm, el resto de los rganos sin alteraciones. Se efectu una puncin lumbar y el examen del L.C.R. present 30 clulas/l (80 neutrfolas 20% linfocitos), protenas 241 mg/dl y glucosa 21 mg/dl. Se realizo la tcnica de Burri cuya observacin se muestra en la figura B. Se le efectuaron hemocultivos para hongos por el mtodo de lisis-centrifugacin, en el cultivo se observo el crecimiento de una colonia cremosa Preguntas:
1. Qu tipo de infeccin tiene el paciente, y que microorganismo podra estar producindola? 2. Describa las caractersticas microscpicas de patgeno, y su crecimiento en medios de cultivos 3. Indique que poblacin es ms susceptible de infectarse. 4. El paciente una vez infectado la infeccin se puede diseminar, y a que rganos?. Explique la patogenia de hongo. 5. Para qu sirve y que observa con la tcnica de Burri?
Problema Clnico N 5 La paciente A. B. acude al servicio de otorrinolaringologa del hospital por presentar lesiones en lengua. La paciente tiene 65 aos de edad, es oriunda de la Provincia de Buenos Aires. Entre los antecedentes generales refiere que hace aproximadamente 6 meses fue intervenida quirrgicamente y estuvo hospitalizada durante 8 das. En ese momento le indicaron terapia antibitica por 13 das. Al examen clnico bucal, se observ placa eritematosa de bordes difusos, superficie despapilada, ligeramente engrosada, localizada en el dorso de lengua de aproximadamente 3 x 4 cm. Tambin se aprecia placa blanca (FOTO 1).
Refiere sentir ardor lingual desde hace dos semanas. Adems se evidencia que la paciente es edntula total superior e inferior, en la mucosa de paladar se observa placa eritematosa difusa con unos puntos rojizos ms acentuados. En la mucosa de reborde superior derecho presenta zona eritematosa. (FOTO2).
La paciente es portadora de prtesis removibles total superior e inferior las cuales usa desde hace un ao, las mismas se encuentran en buen estado, no las usa para dormir y realiza control de higiene adecuado. Se indica toma de muestra por raspado para cultivo de la mucosa de lengua, mucosa de paladar y de las prtesis. Las mismas fueron sembradas en medio de Agar-Sabouraud por 48 horas. Se obtuvo resultado en el cultivo de las muestras de lengua y paladar, en prtesis fue negativo para hongos. El tratamiento consisti en la administracin tpica de Nistatina vulos, 3 veces al da por dos semanas, dejando disolver el vulo en la boca. A las dos semanas se realiz control clnico, donde se observ ligera mejora de la lesin con disminucin de eritema en lengua y paladar y de la sintomatologa. (FOTO 3).
A la tercera semana se hace control donde se evidencia disminucin del eritema de lengua y paladar, no presentando ya el ardor lingual.
A la cuarta semana se observ notable mejora de ambas lesiones. (FOTO 4).
Preguntas 1. Indique cual es la patologa del paciente, y el hongo que la causa. 2. Describa al menos tres sitios donde presenta este hongo la patologa citada e indique las manifestaciones clnicas observadas en el lugar de la toma de la muestra. 3. Nombre especies del gnero del hongo causante de este tipo de patologas. 4. Indique los factores que pueden predisponer a la aparicin de esta enfermedad. En el caso clnico ledo cual fue el factor predisponente? 5. En que medio de cultivo se debe sembrar este patgeno, e indique y explique mtodos de diferenciacin de especies.
Bibliografa
1 Problemas clnicos en Micologa Mdica: problema N 31. Ricardo Negroni, Alicia I. Arechavala, Elena Maiolo, Mario H. Bianchi, Gabriela Santiso, Santiago Garro y Toms Orduna Unidad Micologa, Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muiz, Buenos Aires, Argentina 62 Rev Iberoam Micol 2008; 25: 62-64. 2 Problemas clnicos en Micologa Mdica: problema n 36. Ricardo Negroni, Elena Maiolo, Alicia Arechavala, Roberto Dur, Cristian Sacheri y Tomas Orduna Unidad Micologa, Servicio de Endoscopia, Servicio de Otorrinolaringologa, y Unidad 9, Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muiz, Buenos Aires, Argentina 3 Problemas clnicos en Micologa Mdica: problema n 30. Elena Maiolo, Alicia I. Arechavala, Gabriela Santiso, Mario H. Bianchi, Florencia Troglio, Toms Orduna y Ricardo Negroni. Unidad Micologa y Unidad 9 de Patologa Regional, Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muiz, Buenos Aires, Argentina 330 Rev Iberoam Micol 2007; 24: 330-331 Casos clnicos Direccin para correspondencia: Dr. Ricardo Negroni. Unidad Micologa. Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muiz. Uspallata n 2272. 1282 Buenos Aires, Argentina Fax: +54 11 4304 4655. E-mail: hmmicologia@intramed.net 2007 4 Problemas clnicos en Micologa Mdica: problema n 12. Ricardo Negroni, Alicia Arechavala y Pablo Bonveh. Centro de Estudios Micolgicos, Buenos Aires, Argentina. Rev Iberoam Micol 2004; 21: 213-215 213 5 Candidiasis eritematosa de la cavidad bucal. Reporte de un caso y revisin de la literatura. VOLUMEN 41 N 3 / 2003

Guía de Estudio para Trabajos Prácticos de Parasitología y Micología

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GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA

GUA DE ESTUDIO PARA TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA AO 2011

Revisin Editorial: Nidia GOMEZ Nora ESCUDERO

1 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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2 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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EXAMEN PARASITOLOGICO DE MATERIA FECAL Trabajo Prctico de laboratorio N 1

Diagnostico de parasitosis intestinales

3 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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5 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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6 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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7 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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8 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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9 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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cido ctrico Formol Agua destilada Densidad

12 g. 2 cc. 86 cc. 1.047

10 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA

-Mtodo de Faust Reactivo: Solucin de Sulfato de Zinc al 33 % (densidad 1.180)

11 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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PROTOZOARIOS QUE PARASITAN INTESTINO Y VAGINA Trabajo Prctico de Laboratorio N 2

Phylum Sarcomastigophora Ciliophora (ciliados) Apicomplexa Microspora

Subphylum Sarcodina (amebas) Mastigophora (flagelados)

12 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA

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Figura 1. Trofozoto de E histolytica/dispar

14 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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movimientos Menos activa, movimientos

esporas, quistes de otros protozoarios. hemates. Nunca

Posee accin patgena, ulceras, No posee accin patgena. abscesos.

15 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Ciclo biolgico:

16 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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Figura 3. Ciclo evolutivo de E. histolytica

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18 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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Foto 2. Ulcera en botn

19 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Distribucin geogrfica: cosmopolita.

Profilaxis: se efecta en forma similar a la de la Entamoeba histolytica.

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS DE PARASITOLOGA Y MICOLOGA Morfologa:

25 REA DE ANLISIS CLNICOS 2011

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Figura 4. Trofozotos y quiste de G. lamblia

Foto 3. Trofozotos de G. lamblia (Giemsa)

Foto 4. Trofozotos de G. lamblia. Coloracin tricrmica

Foto 5. Trofozotos de G. lamblia en fresco