BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS DE AVANZADA

G E N E R A C I O N

Desarrollo generacional de la biotecnolog biotecnologa de la reproducci reproduccin

1 1908 INSEMINACION ARTIFICIAL

2 1970 CONTROL HORMONAL-SUPEROVULACION TRANSFERENCIA, CONGELACION, DIVISION DE EMBRIONES 3 1980 SEXADO DE EMBRIONES Y ESPERMATOZOIDES (83) PRODUCCION EMBRIONES in vitro (87) CLONACION CON CELULAS SOMATICAS (97) TRANSGENESIS

4 1990 5 2000

Giselle del Carmen Gamarra Lazo

Ing. Zootecnista, Responsable del Centro de Investigacin y Enseanza en Transferencia de Embriones - CIETE Convenio Ministerio de Agricultura - Universidad Nacional Agraria La Molina

Palma & Gottfriend, 2001

Objetivo fundamental de las biotecnolog biotecnologas reproductivas de avanzada

Factores que determinan la productividad animal

z

Produccin de cras de sexo y composicin gentica pre-determinada de acuerdo a las necesidades del mercado. Optimizacin de la eficiencia productiva (productividad) de los animales en explotacin. Hacer viables la creacin de nuevos y mas eficientes sistemas de produccin Animal

z z

Productividad animal = eficiencia de los animales para transformar los recursos ofrecidos por el hombre en productos animales para su beneficio Eficiencia de transformacin depende de la composicin gentica del animal y su interaccin con el ambiente La proporcin (frecuencia) de genes deseables para el carcter en particular determina la habilidad gentica del animal para producir eficientemente el producto animal especifico

Progreso Gen Gentico (PG)

z

Factores que determina el Progreso Gen Gentico

z z

El PG es el incremento en la produccin anual debido a cambios en la composicin gentica de los animales Debemos incrementar la frecuencia de genes deseables para incrementar la productividad animal . La intensidad con la que podemos distribuir los genes deseables en la poblacin depende de la tecnologa reproductiva que usemos.

Intensidad de seleccin: es la proporcin de animales de la poblacin total que son seleccionados como reproductores. Precisin de seleccin: Es la medida del grado de coincidencia entre nuestra estimacin del valor gentico de un animal y su valor gentico real. Variabilidad gentica: Si no hay variacin no hay posibilidad de seleccin ya que todos los animales seran iguales. Intervalo entre generaciones: Se define como la edad promedio de los padres al momento de producirse el nacimiento de la cra. Cuanto ms avanzada la edad de los padres al momento del nacimiento de la cra menor ser el ritmo del PG.

Interacci Interaccin de los Factores del PG

Valor gentico de la cra

La Frmula del PG es la siguiente:
= Valor gentico del padre + Valor gentico de la madre 2

PG = Intensidad de seleccin x Precisin de seleccin x Variabilidad gentica Intervalo entre generaciones

Las biotecnologas reproductivas utilizadas para la reproduccin animal, influyen en cada uno de los factores determinantes del ritmo del progeso gentico del animal.

Maximizaci Maximizacin de progreso gen gentico por generaci generacin

z z

Uso de tecnolog tecnologas reproductivas de avanzada para optimizar el ritmo de Progreso Gen Gentico
a) Inseminaci Inseminacin artificial: artificial: basada en la maximizaci maximizacin del uso de machos de
alto valor gen gentico (incremento de la tasa reproductiva de los machos): ganancia gen gentica 1.5% sobre el promedio de la poblaci poblacin por a ao. b) Incremento de la tasa reproductiva de las hembras: cra por hembras: mas de una cr madre selecta:(Ganancia gen gentica 3.5%/a 3.5%/ao): 1. -Superovulaci Superovulacin, colecci coleccin y transferencia embrionaria. 2.2.- Colecci Coleccin de ovocitos, producci produccin de embriones in vitro y transferencia embrionaria. c) Clonaci gentica en la Clonacin de individuos selectos: selectos: 120 a 125% de ganancia gen primera serie.

z z

Seleccin deber ser tan intensa en el lado paterno como en el materno. Normalmente 75 a 80% de las hembras de la poblacin son potenciales madres de la futura generacin mientras que solo el 3 a 4% de la poblacin de machos son potenciales padres de la futura generacin. En el bovino, una vaca solo produce en promedio 0.75 cras por ao. La nica forma de lograr una alta intensidad de seleccin en las madres es produciendo varias cras por madre por ao. Para seleccionar solo el 10% superior como madres de la siguiente generacin cada madre deber producir 3 cras hembra por ao para un sistema de reemplazo del 25%.

TECNICAS REPRODUCTIVAS
Las principales biotecnologas reproductivas desarrolladas en vacunos son: Inseminacin artificial y congelacin de semen. Superovulacin, transferencia y congelacin de embriones.
Produccin in vitro de embriones. Determinacin y seleccin del sexo de embriones y espermatozoides.

Micromanipulacin de embriones para producir mellizos,

homocitos y quimeras. Clonado de animales por medio de transferencia nuclear.

Fuente: Dr. William Vivanco Mackie

Inseminaci Inseminacin Artificial

Maximiza el uso de machos de alto valor gentico (incremento de la tasa reproductiva de los machos) Eliminacin y disminucin enfermedades sexuales de

TECNOLOGIAS DE AVANZADA PARA EL INCREMENTO DE LA TASA REPRODUCTIVA EN HEMBRAS

Superovulacin, transferencia y congelacin de embriones

Aumento de la eficiencia de la estimacin del valor gentico (test de progenie) Correcta fijacin cervical

Coleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro

Ganancia gentica 1.5% sobre el promedio de la poblacin por ao

Produccin y Transferencia de embriones in vivo

(Tcnica MOET)
VENTAJAS :
z

Tecnologa de la produccin de embriones in vivo

DESVENTAJAS :

z z

z z

z Requiere de tcnicas avanzadas y Produccin de cras selectas a complejas. mayor escala (para venta o z Requiere investigacin en las incremento de la intensidad de reas de: alimentacin, seleccin). reproduccin, mejoramiento, etc. Bajos costos de transporte de z Mayor costo comparado a la IA. material gentico. z Efectos adversos por el uso de hormonas (desarrollo de Disminuye el intervalo de anticuerpos en algunos casos). generacin en la seleccin de z Desviar la lnea de crianza por ncleos de reproductores (Mtodo mala seleccin. MOET). z Registros complejos Obtencion de crias de hembras con (inspecciones del tipo sanguneo). problemas de fertilidad. Disminuye la propagacin de enfermedades de transmisin sexual. Recuperacin ms eficaz de individuos exticos y razas en Ganancia gen gentica 3.5%/a 3.5%/ao peligro de extincin

Vaca donadora y terneros quintillizos producidos en una sola coleccin embrionaria por lo especialistas del CIETE en el establo Monte Grande Puente Piedra.

Eventos del ciclo estral con dos ondas foliculares en una hembra bovina

DESARROLLO FOLICULAR

celo

celo

Folculo Primordial

Folculo Primario

Folculo Primario (multilayer) Cel. Teca

zona pelucida Cel. Granulosa Cel Cumulus

0 Folculo antral Folculo de Graff Ovocito (ovulacin)

3
Foliculo ovulatorio Foliculo potencial

9
Luteinizacion Foliculo dominate

12

15

18

21 Dia del Ciclo

Luteolisis

Cuerpo luteo en actividad

Foliculo dominate en atresia

Foliculo en atresia

Tecnologa de la produccin de embriones in vivo

Superovulacin de la donadora Inseminacin Coleccin de embriones
AM PM

Superovulacin de la donadora
Implante de Progesterona y estrogeno FSH FSH FSH, aplicacin a receptoras PG FSH FSH , PGF , se retira el implante FSH IA (deteccin de celo) IA (deteccin de celo) Coleccin de embriones de acuerdo al da de IA

FSH

FSH

Da 1

Da 5

Da 6

Da 7

Da 8

Da 9

Da 16

Congelacin embrionaria
Respuesta superovulatoria Hormona FSH FOLLTROPIN V

Transferencia de embriones Tasa de preez: ~ 55%

Implante de Progesterona CIDR-B

Inseminacin
z

Coleccin de embriones
Recoleccin de embriones por el mtodo transcervical comnmente usado. Sistema cerrado: medio ingresa por gravedad y sale por sifonaje. Intervalo de coleccin da 6 y 8 despus del celo. Optimo: Da 7 (Blastocisto, blastocisto expandido)

2 - 3 Inseminaciones cada 8 -12 horas segn la duracin del celo

Proceso de coleccin de embriones

Clasificaci Clasificacin de los embriones

Excelente : blastmeros de color y tamao uniforme. Bueno: escasa imperfecciones, exclusin de algn blastmero. Regular: leves alteraciones de la forma, degeneracin en alguna clula o varios blastmeros excluidos. Pobre: Clulas degeneradas 30-50% numerosos blastmeros externos.
Mrula compacta regular Mrula compacta pobre

Brete a desnivel

Anestesia epidural

Materiales necesarios y medio MDPBS + antibitico

(antes Limpieza del recto y determinacin de CL)

Blastocisto excelente

Blastocisto bueno

Filtrado Coleccin Bsqueda de embriones

No Usar
Estructuras no fertilizadas NF Estadios muy tempranos ET Degenerados Deg

Congelacin embrionaria
Embriones son equilibrados con la solucin de trabajo (crioprotector 1.5M Etilenglicol + 0.1 M Sucrosa en MDPBS al 0.4%). Luego se colocan en pajillas de 0.25, con al embrin en solucin de trabajo y medio MDPBS 0.4% BSA). El congelador realiza un descenso controlado de la temperatura desde 6 C hasta 32C, a razn de 0.1 C/minuto y de 32C a 35C a razn de 0.3 C/minuto. El seeding se realiza a 6C. Almacenamiento en tanques de N2 liquido.
Sala de congelacin embrionaria

Para TE o congelamiento

NF

ET

Deg

Congelador de embriones Duracin del proceso aprox. 1 hora.

Transferencia no quirrgica de embriones

POSICION DE LA TRANSFERENCIA

Materiales necesarios

La receptora ideal es la hembra joven libre de enfermedades que ha parido sin ayuda y ha destetado exitosamente sus propias cras y que an es joven y capaz de gestar normalmente. Es recomendable programar dos receptoras por embrin disponible.

Producci Produccin in vitro de embriones

VENTAJAS
Uso de hembras infrtiles o que no responden a tratamientos superovulatorios. Produccin de embriones ovarios de matadero. con

DESVENTAJAS

Tecnologa de coleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro

Obtencin de ovocitos
Animales beneficiados (ovarios de camal) Animales vivos por aspiracin folicular (OPU)

Sndrome del ternero grande Altos costos en la inversin inicial. Capacitacin especializada

Eficiencia en la utilizacin de semen (1 dosis puede inseminar 200 ovocitos). Disminuye aun mas el intervalo generacional al trabajar con terneras > 5 meses de edad. Cropreservacin de ovocitos. Se pueden preeces utilizar vacas con tempranas.

Maduracin in vitro Fertilizacin in vitro Cultivo in vitro (20 35% blastocistos) 40% de preez

Aspiraci Aspiracin y b bsqueda de ovocitos de ovarios de camal

Colecci Coleccin Transvaginal en Vacunos Ovum Pick Up (OPU)

Transporte del ovario en solucin salina a 25 oC

Lavado de ovarios con alcohol 70% y solucin salina

Ovarios mantenidos a 25 C

X
Bsqueda de ovocitos en estreo microscopios y colocacin a placas de 35 mm con medio MDPBS + Heparina Aspiracin del fluido folicular a placas de 90 mm Agujas de 19 Gx11/2 bisel corto

Coleccin Transvaginal de ovocitos (TVR OPU)

guia
transductor multiangulo

Bsqueda y clasificaci clasificacin de ovocitos

aguja
A B C

Sonda

Pared vaginal ultrasonografia

Instrumento y ovario

Completamente rodeado por 4-5 capas de clulas del cmulo

Parcialmente rodeado por clulas del cmulos

Ovocitos denudados

Rodeado de fibrina

* Descartar categora C y D

Maduraci Maduracin de ovocitos

Ovocito maduro en fase de Metafase II Tipos: z Utilizando medios de maduracin muy simples TCM 199 (tissue culture
media 199 de Sigma)
z

Ambiente de maduraci maduracin: Incubador de CO2

Utilizando medios complejos (TCM

199 + aditivos, factores de crecimiento, inductores de divisin celular, etc.)

Maduracin in vivo

38.5 C, 5% CO2, Humedad Alta

Objetivo de la maduraci maduracin

Fertilizaci Fertilizacin in vitro

Cultivo por 24 h Ovocitos con vescula germinal

Ovocitos maduros Espermatozoides capacitados Micro ambiente adecuado 38.5 C, 5% CO2, 98% Hd

* Clulas del cmulo muy importantes para el proceso de maduracin

Ingresos del espermatozoide y formaci formacin del segundo cuerpo polar

Ovocitos en metafase II

Inseminaci Inseminacin

*Concentraciones bajas: Fallas de fertilizacin *Concentraciones altas: Polispermia

Proncleo (masculino y femenino

Cultivo de embriones
Tiene como objetivo continuar el proceso de desarrollo del embrin hasta el da 7 u 8.

Micro ambiente de Cultivo

Incubador modular Incubador Seco

Sistema de Co-cultivo: embriones se cultivan con cellas somticas.

z

Incubador seco

Celulas preparadas en el laboratorio: Celulas epiteliales del oviducto, celulas de la granulosa ovrica (ms usadas).

Medio utilizado: SOFFaa (Sinthetic Oviduct Fluid)+ 5% SFB Mezcla de gases: 5% CO2, 7% O2, 88% N2 z Temperatura: 38.5 C
z

embriones

*Los embriones permanecen en las placas de cocultivo hasta el da 7 u 8.

DESARROLLO EMBRIONARIO

Primeros embriones in vitro en el Per Per

Ovocitos maduros (1 cuerpo polar) Ovocito fertilizado (2 cuerpos polares) Embriones de 2 clulas (da 1-2)

Embriones de varios estadios (da 7-9)

Embriones de 8 clulas (da 5)

Embriones de 4 clulas (da 3-4)

Embriones de varios estadios (da 7-9)

Eficiencia comparativa entre MOET y OPUOPU-TVR

Produccin de embriones entre los 30 y 90 das post parto MOET OPU-IVP Numero de embriones producidos por coleccin embrionaria o por TVR Numero de colecciones embrionarias en el periodo Numero de embriones producidos en el periodo Porcentaje de terneros nacidos Numero de terneros producidos Porcentaje de eficiencia en la produccin de terneros (haciendo MOET = 100%)
Fuente: Vivanco, 1997

Produccin de embriones dedicando las donantes a produccin embrionaria todo el ano MOET 5 7 35 55% 19 100% OPU-IVP 2 80 160 40% 64 337%

Factores que determinan la adopci adopcin de la tecnologia de transferencia embrionaria

A. Relacin Beneficio / Costo B. Existencia de Programas de Mej. Gentico C. Grado de tecnificacin de la granja D. Acceso a servicios tcnicos E. Tipo de tecnologa a usarse F. Percepcin del ganadero, consideraciones ticas, opinin publica.

5 2 10 55% 5.5 100%

2 16 32 40% 13 236%

Tecnolog Tecnologas complementarias a la producci produccin de embriones

z

Sexado de embriones

Aumentan la presin de seleccin en la poblacin de madres debido a que se puede incrementar aun mas la produccin de cras por madre selecta:
Sexado de embriones Uso de espermatozoides sexados: aumento en numero

de cras del sexo requerido; utilizacin eficiente de ovocitos colectados. Clonacin (multiplicacin) de embriones sexados

Obtencion de biopsia Reaccion en cadena de polimerasa (PCR) para determinar presencia de cromosoma Y Reaccin enzimatica Fluorescencia 95% de muestras son sexadas exitosamente No se afecta la viabilidad

Determinacin del sexo de embriones por el Mtodo PCR

Reacci Reaccin en cadena de polimerasa (PCR)

Multiplicaci Multiplicacin de embriones sexados por bisecci biseccin o clonado perfecto

BISECCION DE EMBRIONES

Multiplicaci Multiplicacin de embriones sexados por disgregaci disgregacin de blast blastmeros

Separaci Separacin de espermatozoides X e Y para la produccion de crias de sexo predeterminado

z z z z

Mtodo comprobado: Citometria de flujo Precisin de sorteo: 85% (Y) y 90% (X) Eficiencia: 350 mil a 12 millones por hora Preez: Baja si se insemina por va transcervial en bovinos. Aun en estudio los mtodos de inseminacin Disponibilidad comercial: Disponible en Argentina y prximamente en Brasil.

Cel. Totipotentes

Separaci Separacin de espermatozoides X e Y por citometria de flujo

Efecto gen gentico de producci produccin de cr cras de sexo pre determinado

z 7%

sobre la tasa de mejora gentica anual obtenida con la tcnica reproductiva en uso. de cras de sexo predeterminado tiene un efecto comercial de gran impacto econmico: produccin exclusiva de animales requeridos por el mercado.

z Produccin

Clonacin de individuos
z Efectos

Mtodo de clonaci clonacin de individuos

z

genticos similares a la clonacin embrionaria z Ventaja: multiplicacin de animales de superioridad gentica comprobada z Desventaja: incremento de intervalo generacional

Enucleacin de ovocitos y construccin de embriones mediante Transferencia Nuclear (TN) de clulas somticas reprogramadas para comportarse como clulas embrionarias totipotentes:
Clulas fetales Clulas de animales jvenes Clulas de animales adultos Clulas de animales muertos

TRANSFERENCIA NUCLEAR
Aspiracin de folculos pequeos. Aislamiento de ovocitos y maduracin in vitro por 24 horas en medios especiales (FSH+LH+Estradiol-17B). z Remocin de clulas del cmulos. z Remocin del cuerpo polar + cromosomas en metafase.
z z z Insercin

del ncleo donador en el ovocito receptor. z Fusin elctrica y activacin celular. z Transferencia del embrin a receptora del tero.

Enucleaci Enucleacin y transferencia nuclear

Clonado de animales por medio de transferencia nuclear

120 a 125% de ganancia gen gentica en la primera serie

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Primer clon de mam mamfero adulto : Dolly (por el Roslin Institute, Escocia)

Primer vacuno clonado en el mundo: Clonaci Clonacin de Lady (Vivanco, Wells y colaboradores, Ruakura NZ)

Elizabeth, vaca con el mayor numero de copias nacidas (mas de 40 a la fecha, Vivanco, Wells y colaboradores, Ruakura NZ)

Centro de Investigaci Investigacin y Ense Enseanza en Transferencia de Embriones CIETE

Convenio MINAG - UNALM

VISION:
Productores pecuarios competitivos, rentables y sostenibles econmicamente, profesionales, alumnos y tcnicos aplicando eficientemente biotecnologas reproductivas para el mejoramiento gentico de la ganadera.

MISION
Promover la formacin de ncleos genticos lites en puntos estratgicos del mbito nacional a fin de potenciar el mejoramiento gentico de la ganadera en el pas.
z

OBJETIVOS ESTRAT ESTRATGICOS.

Desarrollar y mejorar la actividad ganadera del pas (bovina, camlida, ovina y caprina) incrementando el potencial gentico y productivo; mediante la aplicacin de biotecnologas reproductivas de punta: inseminacin artificial, ovulacin mltiple transferencia embrionaria (MOET) y fertilizacin in vitro. Establecer ncleos de Reproductores de vacunos, ovinos, camlidos Sudamericanos y caprinos de alto potencial gentico, generados por el CIETE, en regiones de importancia ganadera. Fortalecer actividades de enseanza, investigacin y proyeccin social en la formacin universitaria y en la capacitacin de tcnicos y ganaderos del pas.

Capacitar y difundir el uso de biotecnologas reproductivas para su aplicacin a nivel nacional por parte de ganaderos, profesionales, estudiantes y tcnicos.

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ESQUEMA DE MEJORAMIENTO GENETICO CIETE

Ganado genticamente puros y seleccionados de la poblacin nacional en base a caractersticas productivas)

Establos lecheros participantes: Huampani, UNALM, Los Patitos, Monte Grande, El Sequin, Santa Maria Puno.

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION

NUCLEO GENETICO ELITE (NGE) Aplicacin de alta tecnologa reproductiva y alta intensidad de seleccin

Reemplazo Banco Nacional de Semen

Reemplazo Descartes Camal

Cras macho

Cras hembra

Embriones y/o exceso de hembras

Reparto a productores y formacin de nuevos NGE

Actualmente: Puno, Arequipa y Ucayali

Ing. Giselle del Carmen Gamarra Lazo ggamarra@minag.gob.pe

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