Dos canales de calcio dependientes de voltaje co-existen en la membrana

plasmtica apical de Arabidopsis thaliana de los pelos radiculares

RESUMEN
- El Calcio (Ca2 +)-de la membrana plasmtica permeable de los canales
ionicos son fundamentales para el pelo radicular en el alargamiento y
direccin de este. La membrana del pelo radicular de Arabidopsis
thaliana contiene un canal de Ca2 + (HACC) con conductancia
hiperpolarizacin activados. Aqu, la co-residencia de HACC con un
canal de Ca2 + (DACC) de la conductancia de la despolarizacin-
activado ha sido investigado.
- Celulas enteras de la membrana plasmtica apical se ha usado para
estudiar las conductancias de Ca2 y revelan que la conductancia tiene
una inclinacin negativa tpica de DACCs. Protocolos de voltaje
especficos, Ba2 +-permeacin y la inhibicin por el canal de cationes ,
bloqueador de Gd3 + se han utilizado para identificar la conductancia
DACC.
- La conductancia DACC Gd3 + sensibles se identific en slo una
minora de las clulas. La actividad DACC fue enmascarado
rpidamente por el desarrollo de la conductancia HACC. Sin embargo,
en el perodo comprendido entre la desaparicin de la de la
conductanciade la inclinacin negativa y el predominio de HACC,
actividad DACC todava poda ser detectado.
- La DACC coexiste con HACC en la conductancia de la membrana
plasmtica apical de los pelos radiculares y podra proporcionar Ca2 +
afluencia en un amplio rango de voltaje, en consonancia con un papel en
la sealizacin.
INTRODUCCION
El Calcio (Ca) de la absorcin del apoplasto, mediada por Ca2 + -de los
canales inicos permeables en la membrana plasmtica, es un componente
fundamental del alargamiento de las clulas de la raz (Cramer & Jones, 1996;
Capataz et al., 2003). Adems, la elevacin citoslica libre de Ca2 + ([Ca2 +]
cyt) desempea una funcin de codificacin de la seal de la planta ,
transduccin (Hetherington y Brownlee, 2004). Patch-clamp.
Los estudios electrofisiolgicos han revelado la existencia de tres tipos
principales de canales de Ca2 + en la membrana plasmtica de las clulas de
la raz de Arabidopsis thaliana, todos difieren en su sensibilidad de voltaje de la
membrana, pero todos potencialmente capaces de contribuir al influjo de Ca2 +
(Thion et al, 1998;.. Kiegle et al, 2000; Vry y Davies, 2000; Demidchik et al,
2002, 2003, 2007,. Capataz et al., 2003).
Los canales de calcio activados por hiperpolarizacin (HACC) se ha encontrado
en el pice de los pelos radiculares de Arabidopsis thaliana (Muy y Davies,
2000;. Capataz et al, 2003), en protoplastos a partir de la epidermis joven y
maduro (Kiegle et al, 2000.; Demidchik et al., 2002, 2007) y en la zona de la
corteza de elongacin (Kiegle et al., 2000). Estos canales se activan
(fisiolgicamente ) a la membrana relevante de tensiones ms negativo que -
150 mV pero la activacin a valores menos negativos se puede efectuar
mediante el aumento de [Ca2 +] cyt (muy y Davies, 2000; Demidchik et al,
2002.)
Los HACCs estn firmemente implicados en la elongacin celular raz (Davies,
2000; Demidchik et al, 2002;. Capataz et al, 2003).Adems, se regulan diversas
maneras por diferentes reactivos de especies de oxgeno tal vez para integrar
las respuestas de crecimiento y estrs (Capataz et al, 2003;. Demidchik et al,
2007.).
Canales de cationes no selectivos (NSCCs) forman el segundo clase de la
membrana plasmtica de iones de canales de Ca2 +-permeables ya han sido
identificados en protoplastos derivados de la raz .Zona de elongacin de
Arabidopsis y la epidermis madura (Demidchik et al., 2002). Los NSCCs
permitiran que el Ca2 + entre en valores moderadamente negativos de la
tensin de la membrana que se producen como el aumento de K en el suelo
aumenta y que no favorezcan la entrada de HACC (Demidchik et al., 2002).
Ambos HACCs y NSCCs coexistir en la zona de elongacin protoplastos de
Arabidopsis epidrmicas y puede estar acoplado funcionalmente (Demidchik et
al., 2002). Se prev que NSCC mediada por Ca2 + ingrese estimulada. La
actividad de HACC desplazando tensin de activacin de este ltimo a menos
valores negativos de la tensin de la membrana. Como HACCs generan mucho
mayor que de la conductancia de Ca2 + NSCCs, la activacin HACC podra
entregar Ca2 + significativa y sostenida afluencia de crecimiento o adquisicin
de nutriente (Miedema et al, 2001;. Demidchik et al., 2002).
Los canales de calcio activados por despolarizacin (DACCs) son el tercer tipo
de canales de Ca2 + presentes en la raz de Arabidopsis de la membrana
plasmtica de protoplastos (Thion et al., 1998). Los DACCs mostraron
activacin mxima a -80 mV (externo 30 mm CaCl2), mostraron una
caracterstica de la conductancia con inclinacin negativa, pero son inestable y
slo aparecen con poca frecuencia (34% de protoplastos; Thion et al., 1996,
1998). La evidencia de la actividad DACC en otras especies y tipos de clulas
ha sido revisado por White (2000). Sin embargo, la existencia de DACCs ha
sido llamado cuestionada por un estudio de patch-clamp en la membrana
plasmtica de los canales de Ca2 + en las races de Arabidopsis (Kiegle et al.,
2000). Se observ de la conductancia la despolarizacin-activado en las
condiciones favoreciendo la actividad de los canales de Ca2 +. Se muestra la
caracterstica de la conductancia con inclinacin negativa de un DACC pero
era insensible a los iones de aluminio (Al3 +) (como un bloqueador de canal de
cationes) y aparecio para llevar a cabo aniones en lugar de Ca2 + (Kiegle et al.,
2000). La posibilidad de una conductancia de aniones confusin y las
dificultades tcnicas asociadas con la deteccin de DACC ha afectado los
avances en la caracterizacin DACC. De lo se conoce de su dependencia del
voltaje y la amplitud de corriente, se ha postulado que la funcin DACCs en la
sealizacin por Ca2 + (Miedema et al., 2001). Como voltaje de la membrana
celular vegetal flucta entre un hiperpolarizado y un estado despolariza
(Grabov y Blatt, 1998; Lew, 1991a;. Hamilton et al, 2000), la coexistencia de
una DACC con HACCs y NSCCs hara permitir a la clula de tomar Ca2 +
sobre una amplia gama de membrana voltaje, por lo tanto mejorando
potencialmente la clula de fisiolgica flexibilidad (Miedema et al., 2001).

Debido a la diversidad de los canales de Ca2 + posiblemente presentes, la
caracterizacin de cada va de flujo de Ca2 + es central para nuestra
comprensin del crecimiento y la transduccin de seales. Asignacin de los
papeles fisiolgicos para erradicar los canales de Ca2 + de la membrana
plasmtica no slo requiere informacin sobre su regulacin (por ejemplo, por
el voltaje de la membrana), sino tambin en la convivencia dentro de un
determinado tipo de clula y la amplitud de Ca2 + corriente generada. Es
fcilmente se prev que la captacin de Ca2 + en un amplio rango de voltaje
podra apoyar la dinmica, punta alta [Ca2 +] cyt gradiente encontrado en la
raz de Arabidopsis pice pelo (Wymer et al., 1997). Raz membrana
plasmtica apical cabello contiene HACCs pero no tienen habido
manifestaciones de otros Ca2 + actividades canal (muy Y Davies, 2000;
capataz et al, 2003).. Este estudio investiga si o no la actividad DACC se puede
demostrar en la la membrana plasmtica de las clulas apicales de pelos
radicales. Mediante el uso de una combinacin de protocolos de impulsos de
voltaje y la farmacologa que proporcionar evidencia de que, adems de una de
la conductancia anin, la membrana plasmtica de estos pelos de la raz
contiene tanto DACC y HACC.
Materiales y Mtodos
Material vegetal y cultivo
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Columbia) las plantas de semillero deben
haber sido desarrolladas aspticamente y verticalmente en 3% (w: v) de Bacto-
agar (Difco, Detroit, MI, EE.UU.) suplementado con 0,1 mm KCl y 0,1 mm de
CaCl2 (si se utiliza para el aislamiento de lser de esferoplastos) o medio de
Murashige y Skoog (MS) (Duchefa, Haarlem, los Pases Bajos) con 1% (w: v)
de sacarosa. Las plntulas fueron desarrolaadas de 3 a 14 d de 20-21 C, con
una intensidad de luz de 250 mmol fotones m-2 s-1 y bajo un rgimen de 13 h
luz: 11 h oscuridad.

Aislamiento de esferoplastos pelos radicales
Protoplastos apicales de jvenes pelos de la raz se aislaron ya sea por la
pared celular digestin enzimtica (Capataz et al., 2003) o con lser .La
ablacin (muy y Davies, 2000). Observacin constante y la falta de
vacuolizacin que ofrece la identificacin de esferoplastos apicales.
Electrofisiologa
Productos qumicos (ultrapura grado) fueron adquiridos de Sigma. A menos
que se indique lo contrario, la solucin de la pipeta contena (en mm): 1,9
CaCl2, 2 MgATP, 2 etilenglicol-bis (beta-aminoetil ter)-N, N, N ', N'-
tetraactico (EGTA) y 10 N-2- cido hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfnico
(HEPES) / Tris pH 7.3 (libres de Ca2 + actividad = 1 m) y la solucin del bao o
bien 10 o 100 de CaCl2, se ajust a pH 6 con 10 2 - (Nmorpholino)
etanosulfnico (MES) / Tris. La osmolalidad de la pipeta y bao de solucin se
ajust con d-manitol a la solucin de 270 mOsM. Debido a la baja fuerza inica
de esta solucin de la pipeta, la resistencia de entrada o una pipeta (Rp) era
50-70 mW. Debido a la relativamente pequea corriente de clulas enteras
magnitud (en 100 mm de CaCl2 y a -150 mV, tpicamente c. 50 pA), la cada de
tensin en la resistencia en serie (R ~ 150 mW = 2.5Rp) era a lo sumo 7,5 mV.
El dimetro de los esferoplastos liberados por ablacin con lser fue
tpicamente 15 micras, lo que indica una capacitancia de clula entera de 7 pF
(basado en una capacidad de membrana especfico de 0,01 pF m-2). La
combinacin de una capacidad WC de 7 pF y R de 150 mW resulta en una
constante de tiempo de (des) carga de la membrana 1 ms. Actividades Ion se
estimaron con el calcio programa (versin 2.1, Fhr et al., 1993) y geoqumica-
PC (Parker et al., 1995).
Las grabaciones se realizaron utilizando un Axopatch Amplificador 200A,
relacionado con una interfaz Digidata 1200 (Axon Instruments, Foster City, CA,
EE.UU.). -Clulas enteras de los datos se muestrearon a 2 kHz y se filtraron a
1 kHz utilizando el filtro de Bessel de paso bajo del amplificador Axopatch.
Datos El anlisis se realiz con el software de ordenador pClamp 8.0 (Axon
Instrumentos). El electrodo de tierra comprenda un 2% (w: v) agar/2.5 m
puente KCl. Potenciales de unin lquida se midieron segn Ward y Schroeder
(1994); con la solucin de la pipeta estndar y 10 mm de CaCl2, este potencial
fue de -10 mV
15micras, lo que indica una capacidad de clula entera de 7pF(sobre la base
de una capacitancia de membrana especficade0,01pFm-2). La combinacin de
una capacidad WC de7pF y un R
s
de 150 M resultados de una constante de
tiempo de(descarga de la membrana de 1ms. Las actividades de iones se
estimaron con el programa de calcio(versin 2.1, Fhret al., 1993)
ygeoqumica-PC (Parker et al., 1995).
Se realizaron grabaciones se usando un amplificador Axopatch 200A,
relacionado con una interfazDigidata1200(Axon Instruments, Foster City, CA,
EE.UU.).Los datos de clulas enteras fueron muestreados a 2kHzy filtrada a 1
kHz utilizando un filtro Besselthelow de paso del amplificador Axopatch. El
anlisis de datos se realiz con el software de ordenador pClamp8.0(Axon
Instruments). El electrodo de tierra comprenda un 2% (w: v) aga /2.5 de de
KCl. Los potenciales de unin lquida se midieron segn
WardySchroeder(1994); con la solucin de la pipeta fue de 10mmde CaCl2,
este potencial era10mV.
Resultados
Un Gd3+ es sensible a la conductancia DACC en la membrana plasmtica
apical de los pelos radiculares.

La deteccin de la actividad DACC requiere un medio para identificar esta
conductancia especfica contra un fondo de otros canales inicos. Aparte de
supermeabilidad de Ca2+ , una caracterstica distintiva de DACCes una
Inhibicin dependiente de la tensin que causa la confabulacin de clulas
enteras de voltaje de la corriente-(IV) para visualizar unaconductancia
dependiente negativa. Debido DACC cercanos en respuesta a una mayor
hiperpolarizacin de la membrana, la conductancia(-clula entera) disminuye a
pesar del aumento de la fuerza ejecutora para el movimiento de iones. Esta
caracterstica de puerta se utiliza como un criterio para la delimitacin de la
actividad DACC en las corrientes de clulas enteras.











La figura1muestra las corrientes de clulas enteras se muestran por un
esferoplasto apical del pelo radicular , baada en 50 mm CaCl2. La
conductancia mostr la pendiente negativa DACC esta caracterstica se ha
descrito anteriormente (Thuleauet al, 1994a, b;.. Thionet al, 1996, 1998).
Corriente alta de entrada se alcanza a una tensin despolariza de aprox. -
10MVy disminuy con el tiempo.
La media positiva} SEtensin de reversin(Erev) de46} 6mV(n= 3) indic
claramente permeabilidad de Ca2+(potencial de equilibrio para el Cl- (ECL)
fue -58mV, la CEPA fue de 154 mV). Como apicales esferoplastos la raz del
pelo radicular carecen de vacuolas, el flujo de salida de aniones de este
compartimiento no influira en la tensin de reversin. A
concentraciones> 1mm, lantnidos y los bloqueadores orgnicos tales como
verapamilo puede bloquear ms altos a los canales de aniones de membrana
plasmtica de las plantas y K+ a los canales de flujo de salida (Terry et al.,
1992, Lewis&Spalding, 1998).
Su uso para delinearlos canales de cationes por lo tanto requiereprecaucin.
Aqu, 0,1mm de gadolinio(Gd3 +) reduce tanto la pendiente negativa y la
corriente mxima (fig. 1, n = 3). El uso de Gd3+ a esta concentracin
submilimolar sugiere que la corriente se lleva a efecto por cationes.


.figura1Efecto de gadolinio (Gd3+) en lacorrientede clulas enteras. Despus
de mantener el potencial de membrana a -70mV(de clulas enteras
configuracin) y 10s repulso de los casos el 80mV 100mV, la tensin reduce
hasta-180mVen 42s. La aplicacin de100m MGd3+ elimino la conductancia
dependiente negativa. Recuadro:, La alta densidad de corriente de entrada en
funcin del tiempo despus de alcanzar la disposicin de clula completa y en
presencia de 100mMGd3+. La solucin de la pipeta que comprende(en mM):
40 Na-gluconato, 10 de Na Cl, 0,81,2-bis-(2-aminofenoxi) etano-N, N, N', N
tetracido actico(BAPTA), 2Ca(OH )2, ajustado a pH 7,2 con la base de Tris y
dando como resultado un de Ca2+ de100nM libre. La solucin de inmersin
contena CaCl2 y 5022-(N-morfolino) etanos ulfnico(MES) con la base de Triss
se ajust a pH 5,7; ECa154Mv
La cima de corriente aumenta con la fuerza motriz deCa2+

Figura2a muestra las corrientes dependientes de voltaje se muestran por un
esferoplasto apical, baada en 10mmCaCl2. Los 1 micras libre deCa2+ en la
solucin de la pipeta se utiliza aqu este representa el [Ca2 +] apical de
crecimiento en los pelos de la raz(Wymeret al., 1997). Un minuto despus de
la obtencin de la configuracin de clula completa(en la que la membrana
plasmtica est en serie con el electrodo de registro), hiperpolarizar el potencial
de membrana(de un valor de retencinde-10mV) provoc corrientes hacia el
interior instantneos pero estas corrientes desactivados durante el transcurso
de la etapa de tensin. La relacinIVcorrespondientea partir delas corrientesde
estado estacionarioal finaldelos impulsos de tensinse muestraen la figura. 2b.

Tambin se muestra una relacin de IV a partir de un esferoplasto diferente
pero con CaCl2 100 mM en lugar de CaCl2 10 mM en la solucin del inmersin
. Ambos esferoplastos muestran la conductancia pendiente negativa. El
aumento de CaCl2 externa aument la corriente alta , en consonancia con una


El actual en 10mm CaCl2 pico fue de 8+ 3mAm2n= 7. La tensin a la que se
produjo la corriente mxima de aglomeracin de Ca+2 era insensible a los
cambios en DCE. En CaCl2 10 mM, la corriente maxima se alcanza a-108 +
7mV(n = 7; ECl= 40mV); en100mmde CaCl2era -107 y-119mV(n = 2), cerca
de la EClde-94mV. Estas observaciones descartan Cl-como un importante
contribuyente mximo actual .La tensin mxima de Ca2+ aumento la corriente
con la fuerza motriz de Ca2

Se desconoce en la actualidad la causa, pero la diferencia en Ca2+ citoslico
libre entre los dos conjuntos de datos puede ser importante. Al igual que en
estudios anteriores (. Thionetal,1996, 1998), se observ que la pendiente
negativacon poca frecuencia(en 10mm CaCl2 externa, en 7 de cada 47
esferoplastos, y en 100mm CaCl2 externa, en 2 de cada5). Sin embargo,
encontraste con los estudios de Thionet al. (1996, 1998), la incorporacin de
200micras de la disruptor de colchicina de microtbulos en la solucin de la
pipeta no estabiliz la conductancia de pendiente negativa, aumentar su
amplitud o frecuencia de la observacin.









Figura2 Efecto del calcio externo (Ca2+) y El Tiempo.(a) de Grabacin actual
1min despues de establecerla configuracin de clula Completa. La membrana
s sujeta una tensin-200+40m V a 6 s, en Pasos de 20mV(sosteniendo
potencial-10mV). Por Razones de Claridad, s muestran Solo un nmero
Limitado de huellas.
La solucin de la pipeta contena 1mM libre de Ca2+ y la solucin del 10mM
CaCl2. (b) actual relacin de tensin-(IV) basado en los niveles de corriente
de estado estacionario( smbolos cerrados) en(a) y una relacin de IV obtenido
a partir de un esferoplasto diferente y con100mM deCaCl2 en la solucin del
bao (abierto smbolos). (c) los rastros actuales obtenidos de la misma
esferoplastos como en (a), peroregistraron3minutos ms tarde(es decir,
4minutos despus de establecerla configuracin de clula completa). (d) las
relaciones de estado estable IV de la esferoplastos en(a) y (c) la formacin 1,
4 o 7min despus de alcanzar la clula entera. Los nmeros al lado de los
restos de (a) y (c) se refieren al nivel de corriente cero y voltaje de la
membrana, respectivamente y la lnea.Ca2+ actividad de los canales despus
de la desaparicin de la pendiente negativa

La conductancia de la pendiente negativa desapareci con el tiempo. Figura 2c
muestra trazas de corriente obtenidos a partir de la misma como en
esferoplastos
. figura 2a (10 mm CaCl2), pero se registrarn 3 minutos ms tarde (es decir, 4
min despus de alcanzar la clula entera). Relaciones en el estado estacionario
IV para Intervalos de 3 min se muestran en la figura. 2d. Por 7 min de la
conductancia negativa la pendiente se desapareci . Despus de su
desaparicin, la membrana plasmtica apical de esferoplastos todava
exhibieron uncorriente instantnea que desactiva en el transcurso de un
escaln de tensin (ver. Figura 2c). Tambin se observaron tales corrientes en
todos los esferoplastos que no muestran la pendiente de conductancia negativa
en los primeros 10 minutos de la grabacin. Estas corrientes
de la dependencia del tiempo de las corrientes y sus potenciales de inversin
(probador y Blatt, 1989; Hille, 1992; Thuleau et al, 1994a;.. Kurkdjian et al,
2000).

Se examin en primer lugar, la posible contaminacin por una conductancia de
aniones. Slo cuando la tensin de la membrana se mantuvo aun valor
hiperpolarizado (160mV), en lugar de la norma
despolariza-10mV, se pudo detectar una conductancia de anin. Con este
protocolo, de corriente medida directamente despus del inicio de contraccin
de de tensin(20 ms) fue de -12mV(n = 18, fig. 3). Por el contrario, la relacin
IV sobre la base de las corrientes de estado estacionario (desde el final del
pulso de voltaje) dio lugar a un Erev de aprox. 45mV. Este cambio positivo de
Erev(en el transcurso del pulso de voltaje) lejos de ECL (-40 mV) y hacia la
ECA (109 mV) indica la presencia de una conductancia de aniones, pero uno
que inactiva rpidamente. Por lo tanto, al continuar usando una tensin de
mantenimientode-10mVdespolarizante y toma de muestras
corriente de estado estacionario al final del pulso de voltaje, la contaminacin
de las mediciones de la actividad del canal de aniones se podra evitaren
ensayos adicionales

La media SEErev de las corrientes en estado estacionario (manteniendo
tensin, -10 mV; 10mmCaCl2) fue 43} 2mV(n= 47, registradoen11minde
lograr clulas enteras). Como CEPA yECleran109y-40mV, respectivamente, el
desplazamiento de ErevdeEClde> 80mVindica claramente una+ conductancia
deCa2. Es posible que el desplazamiento negativo de Erev de ECA fue
causada en parte por flujo de salida de Mg 2+. Este ion slo estaba presente en
la pipeta y es la nica otra ion potencialmente permeables con un potencial de
equilibrio negativo. En comn con los
estudios anteriores en los que se detect la conductancia de pendiente
negativa, el Erev de corrientes aqu era insensible a ECL (vara de -94mV a+ ,
Tabla 1). Inclusos externa Cl-(que puede promover la actividad Cl-canal;
revisado porRoberts,2006), el Erev cambi poco. Los pequeos cambios en
Erev fueron consistentes con un ECa relativamente constante de107-130mV.
Por consiguiente, el voltaje de la membrana de esferoplastos sigue estando
dominado por una conductancia+permeable alCa2 despus de la aparente
prdida de la pendiente negativa.

Fig 3 La desactivacin de la conductancia de un anin permeable, (a) las
corrientes de clulas enteras se registr utilizando un protocolo de fijacin de
voltaje similar a la utilizada en la figura. 2 pero a partir de un potencial de
mantenimiento de -160 mV en lugar de -10 mV. Para mayor claridad, se
muestran slo un nmero limitado de huellas. La corriente se mide
directamente despus del inicio del pulso de la tensin (20 ms; flecha 1) y al
final (2,5 s; flecha 2). Los nmeros al lado de las huellas y la lnea se refieren al
nivel cero de la corriente y el voltaje de la membrana, respectivamente.(b)
relacin corriente-tensin (IV) a partir de datos en (a).Corriente muestreada a
20 ms (1; crculos abiertos) invirti cerca de la ECl de -40 mV. Que mide a 2,5 s
(2; crculos cerrados) invirti cerca de la ECa de 109 mV. El cambio de Erev
(en el transcurso de la pulso de voltaje) lejos de EClhacia de la CEPA indica la
presencia de una conductancia de anin que inactiva rpidamente. Soluciones
estaban como en la figura. 2 (a). Los datos provienen de un representante
esferoplasto de 18 ensayos.

Por una conductancia de Ca2 +-permeable despus de la aparente prdida de
una pendiente negativa.

Ca2 +-corrientes hacia adentro delECl

La actividad de los canales de Ca2 + fue detectada en ECl de esferoplastos o
ya no manifiestan la conductancia una pendiente negativa. En esta tensin no
hay red de Cl-actual y cualquier corriente que circula debe realizarse por otro
ion (probador y Blatt, 1989;.Thuleau et al, 1994a).
La figura 4a muestra dos Grficos de corriente, uno obtenido con 100 mm de
CaCl2 externa y la otra despus de reemplazar con CaCl2 100 mm BaCl2. Las
corrientes se registraron despus de un impulso de activacin a 80 mV (no
mostrado) seguido por un pulso de ECL (-95 mV).
Por definicin, y dada las composiciones de las soluciones utilizadas, la
corriente de entrada detectada en el ECL ser causada por Ca2 + (o Ba2 +) flujo
(probador y Blatt, 1989;.Thuleau et al, 1994a), aunque esto no ofrece ninguna
informacin sobre la persistencia de una pendiente negativa.
LapermeacinBa2 + muestra que la conductancia no estaba mediada por
canales de K +ya que estos son Ba2 + impermeable (Schroeder et al., 1987).


figura 4 La desactivacin de la entrada de calcio (Ca2 +) y bario (Ba2 +) las
corrientes en ECl. (a) Canales se activaron a 80 mV (no mostrado) y la cintica
de desactivacin fueron seguidos en ECl de -95 mV (bao de CaCl2 100 mM o
100 mM de BaCl2). Las lneas continuas representan ajustes a un doble
exponencial, de 100 mM de CaCl2 que resulta en constantes de tiempo de, en
este caso particular, 51 y 342 ms. Mediciones similares de 100 mM BaCl2, dio
lugar a constantes de tiempo de 26 y 186 ms. La solucin de la pipeta contena
1 mM libre de Ca2 +. La lnea se refiere al nivel de corriente cero. (b) La media
SE constantes de tiempo de desactivacin medidos en 100 mM CaCl2. Los
datos proceden de ocho esferoplastos.

Tabla 1 Efecto de Ca2 externa + y Cl-en el potencial de inversin (Erev) de
la membrana plasmtica actual


La solucin de la pipeta contena 1 mM libre de Ca2 + y 3.5 mM Cl-. Los
valores de la CEPA, ECl y Erev se basan en actividades de iones. El potencial
de mantenimiento fue de -10 mV.
a
Todo en presencia de la colchicina 200 micras de la solucin de la pipeta.
b
31 (Erev = 44 2 mV) en presencia y 16 (Erev = 41 4 mV) de la ausencia de
la colchicina de la solucin.
c
4 de la presencia y 1 en ausencia de la colchicina.

Grficos de corriente registrados en CaCl2 estaban mejor equipados con un
doble exponencial con constantes de tiempo de desactivacin de 37 11 y 339
18 ms (n = 8). Estos dos valores indican claramente que la respuesta no
representa una capacitancia pasiva transitoria, pero es de hecho un resultado
de las puestas de canales ionicos.Del ajuste ptimo por una doble exponencial
sugiere la cintica de activacin peridica son ms complejas que las predichas
por un nico abierto y estadocerrado. La figura 4b muestra las constantes de
tiempo de la desactivacin en relacin con voltaje de la membrana, tal como se
mide de 100 mm de CaCl2.

Considerando que la constante del tiempo ms pequea en promedio es 45 ms
era minsculos voltajes, la constante de aproximadamente 200 ms a -145
mVde mayor tiempo doble a aproximadamente 400 ms a un voltaje de la -65
mV.

. figura 5 Desarrollo del la conductancia de canal de calcio activado por
hiperpolarizacin (HACC). Corriente de entrada se registr a -180 mV, desde
3,5 hasta 23 minutos despus de la consecucin de la configuracin de clulas
enteras.
La lnea se refiere al nivel de corriente cero. Soluciones estaban como en la
figura. 2a.

Conductancia HACC domina con el tiempo

A medida que pasaba el tiempo durante las grabaciones de clulas enteras, la
corriente ms interna se puede observar y HACC domin el perfil actual. 'Picos'
Corriente aparente en la grabacin a -190 mV en la figura. 2c se asemejan a la
aparicin de la activacin HACC a alto nivel intracelular de Ca2 + (1 micras;
Vry y Davies, 2000). Un ejemplo de la aparicin de la actividad HACC con el
tiempo se da en la figura. 5, que muestra huellas de corriente registrados en -
180 mV, desde 3,5 hasta 23 minutos despus de la consecucin de la
configuracin de clulas enteras. En contraste a las corrientes DACC-
dependen primeros, la corriente despus hacia el interior era dependiente del
tiempo. HACC activacin completa (por ejemplo, -400 Pa a Vm = -180 mV, 23
min) tpico de esferoplastos apicales de pelosjvenes de races (muy y Davies,
2000;. Capataz et al, 2003). En la Epidermis y raz principal (Demidchik et al,
2002, 2007) se observ. El HACC de la raz es fuertemente dependiente del
voltaje (muy y Davies, 2000;.Demidchik et al, 2002, 2007), en contraste con la
membrana plasmtica de Arabidopsishiperpolarizacin activada por canal de
aniones (Lew, 1991b).

Discusin

Un estudio previo en membrana plasmtica de la raz de Arabidopsis inform
de que no despolarizacin-activado las conductancias de canal de calcio-
permeables (DACC) se podan encontrar; la pendiente negativa de la
conductancia caracterstica del DACCs fue el resultado de los canales de
aniones (Kiegle et al, 2000.). Esto no estaba de acuerdo con la descripcin de
DACC de clulas de la raz de Arabidopsis por Thion et al. (1998). El estudio de
DACCs ha sido abandonado desde el informe de Kiegle et al. (2000). Una
posible conductancia DACC se inform en la membrana plasmtica de las
clulas de la raz epidrmicas maduros en Arabidopsis, pero no se caracteriz
(Demidchik et al., 2002). El presente estudio proporciona evidencia clara de
que la membrana plasmtica apical de pelos radiculares de Arabidopsis
contiene una conductancia DACC co-residente con canales de calcio que
muestran una dependencia de voltaje opuesto (HACCs).
Diversas lneas de apoyo de actividad DACC evidencias como la fuente de la
conductancia una pendiente negativa. En primer lugar, el perfil actual se
muestra en la figura. 2a se diferencia de HACC, que comprende una corriente
instantnea seguido de activacin actual dependiente del tiempo (muy y
Davies, 2000). Tambin es distinto del tiempo independiente de Ca2 +-
permeables las corrientes NSCC presentes en la membrana plasmtica de las
clulas de la raz (Demidchik et al, 2002.) ni lospelo de la raz es dependiente
del tiempo K rectificador de entrada +-selectiva (Gassmann y Schroeder, 1994;
Reintanz et al., 2002).
Las conductancias de potasio rectificado hacia el interior tambin se pueden
manifestar una pendiente negativa, por ejemplo, en la membrana plasmtica de
la clula guardia Vicia (Blatt, 1988).Los canales de K + Arabidopsis AKT2 y
TPK4 actan como rectificadores dirigidas hacia el interior, pero de alta Ca2 +
extracelular provoca un bloqueo dependiente de la tensin del corriente de
entrada, que se manifiesta como una conductancia una pendiente negativa
(Becker et al, 2004;.. Latz et al, 2007). Ni AKT2 ni TPK4 estn presentes en los
pelos radiculares (Ivashikina et al, 2001;. Becker et al, 2004;.. Latz et al, 2007)
y se puede descartar como la fuente de la conductancia de la una pendiente
negativa observada aqu. La prdida de la AtKC1 canal de K + subunidad
provoca una voltaje dependiente de Ca2 + bloque del corriente de K + interna
de membrana plasmtica de raz del pelo y por lo tanto una conductancia de
una pendiente negativa en las relaciones IV (Reintanz et al., 2002). Sin
embargo, Ca2 + permeabilidad de los canales de K + no puede explicar la
conductancia de una pendiente negativa observada aqu. El Ca2 +
conductancia era Ba2 + permeable, canales de K + no son (Schroeder et al.,
1987).
El pelo de la raiz de la conductancia DACC muestra cierta similitud con los
descritos por primera vez por DACCsThuleau et al. (1994a, b) y Thion et al.
(1996) de las clulas en suspensin de zanahoria y ms tarde por Thion et al.
(1998) de clulas de la raz de Arabidopsis. Sin embargo, en contraste con un
estudio anterior DACC (Thion et al., 1996), los pelos de la raiz estaba DACC ni
estabilizado ni estimulada por el agente desestabilizador de microtbulos,
colchicina. El mutante ton2 Arabidopsis que es defectuoso en la organizacin
de los microtbulos corticales (por lo tanto, el apoyo a una mayor y ms estable
actividad DACC de la raz principal; Thion et al, 1998.) No se puede utilizar
como la mutacin no afecta a los microtbulos pelos de la raiz (Traas et al,.
1995).
Sin embargo, hemos demostrado aqu que la manipulacin de voltaje de la
membrana y las condiciones inicos permite que la actividad DACC a detectar
ms all de la apariencia de la conductancia de una pendiente negativa. Esta
demostracin habilitado de Ca2 + y Ba2 + permeabilidad al ECL, apoyando
claramente la existencia de un DACC.
Adems de DACC y HACC, los datos tambin indican la presencia de un anin
de la conductancia la membrana plasmtica apical de pelos de la raiz, que in
vivo podra permitir el flujo de salida de Cl-.Las conductancias de aniones de la
Razdeflujo de salida contribuyen a la osmorregulacin y respuestas de estrs
abitico (Diatloff et al, 2004;. Roberts, 2006) y se han identificado tanto en
Arabidopsis (Dauphin et al, 2001;.. Diatloff et al, 2004) y Medicago (Kurkdjian et
membrana plasmtica de pelos de la raiz al., 2000). Apical de Cl-flujo de salida
est implicada en la regulacin del crecimiento de las puntas del los tubos de
polen (Zonia et al, 2002.) Y de los pelos radiculares bien puede estar implicado
en la regulacin de voltaje durante la sealizacin (Felle et al, 1998;.. Dauphin
et al, 2001 ).Por ejemplo, se piensa que el flujo de salida de Cl-en respuesta a
factores Nod para mediar la despolarizacin del voltaje de la membrana (Felle
et al., 1998). La conductancia anin evidente en este estudio ahora requiere
ms estudios para ayudar a establecer su contexto fisiolgico. Actividad de un
permeable a aniones (incluyendo cidos orgnicos) de la conductancia flujo de
salida (con una pendiente negativa) factible podra tener un efecto sobre la
tensin aparente a la que se produce en el interior actual DACC mediada.
La presencia de los dos tipos de voltaje dependiente de canal de Ca2 + (DACC
y HACC) aumentara significativamente la flexibilidad del la captacin de Ca2 +
en condiciones que modulan la tensin de la membrana (Miedema et al., 2001).
Debido voltaje de la membrana de los pelos radicales jvenes puede ser ms
negativos que -200 mV (Hermann y Felle, 1995), HACC parece ser el camino
ideal para la captacin de Ca2 + en estas condiciones (Capataz et al., 2003).
Por el contrario, DACC estara preparada para un influjo de Ca2 + en el voltaje
de la membrana menos negativo y, como se muestra en este estudio, podra
funcionar a baja o alta [Ca2 +] cyt. En Arabidopsis, si otros estudios muestran
que la alteracin de microtbulos aumenta la actividad DACC entonces el
DACC podra ser colocado firmemente en el contexto posicional del
sealizacin por Ca2 +. Tales resultados podran vincularlo a los apical [Ca2 +]
'hotspots' cyt (causados por la ruptura de microtbulos farmacolgica) que
predicen reorientacin pelos de la raiz (Bibikova et al., 1999). Es posible que
DACC tambin podra mediar en la sealizacin de Ca2 + de pelos sequa-
estresados en el que voltaje de la membrana se despolariza (Dauphin et al.,
2001).
Voltaje de la membrana apical tambin puede despolarizar como consecuencia
del de flujo de salida de electrones por la actividad de la NADPH oxidasa
(capataz et al, 2003;.Behe y Segal, 2007). Si el DACC estaban presentes en
las leguminosas que podra estar implicado en la nodulacin de sealizacin,
ya que est bien establecido que los factores Nod causan voltaje de la
membrana para despolarizar (Lhuissier et al., 2001). Puede ser el caso de que
la despolarizacin como resultado de la entrada de Ca2 + a travs de HACC
dara lugar a la activacin de los DACC ni (como se propone por Felle et al.,
1998) influjo de Ca2 + provoca la despolarizacin de membrana a travs de la
activacin de los canales de de flujo de salida Cl-.

El papel de DACC de los pelos de la raiz se dirige ms fcilmente a travs del
uso de un mutante una vez que se descubre el gen que codifica. Aunque TPC1
(dos canales de poro 1) fue propuesto como un gen candidato para DACC (.
Furuichi et al, 2001) que ahora se sabe que en Arabidopsis este gen codifica un
canal calciumpermeable vacuolar (Pieter et al, 2005;.Bonaventure et al. , 2007).
Este estudio ha establecido un mtodo para monitorizar la actividad DACC en
el tipo salvaje, lo que permite una confirmacin segura de la prdida de la
actividad de un mutante posterior. Por lo que demuestra que DACC se puede
resolver, incluso cuando una la conductancia anin est presente, se espera
que la investigacin sobre este tipo de canal se relanza.