REVISTA DE BIOLOGIA E CINCIAS DA TERRA Volume 11 - Nmero 1 - 1 Semestre 2011

ISSN 1519-5228

Produo de substncias envolvidas no fenmeno de antagonismo bacteriano

Flvio Henrique Ferreira Barbosa1; Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa2; Leandro Henrique Silva Bambirra3; Flvia Figueira Aburjaile4

RESUMO O termo microbiota normal ou indgena refere-se populao de microrganismos que habita a pele e as mucosas de pessoas normais e sadias. Em geral, os membros da microbiota transitria exercem pouco impacto no hospedeiro, enquanto a microbiota residente normal permanece intacta. Entretanto, se a microbiota residente for perturbada, os microrganismos transitrios podem colonizar e proliferar, produzindo doena. A utilizao pelo homem de produtos naturalmente fermentados por bactrias cido-lticas constitui um hbito alimentar milenar em algumas culturas. Estas bactrias, que tm papel fundamental na produo de alimentos fermentados, podem inibir o desenvolvimento de microrganismos patgenos e de microrganismos causadores de deteriorao de alimentos. Esta inibio ou habilidade conservativa pode ocorrer atravs da competio entre os microrganismos ou por ao de metablitos antimicrobianos, nos quais se incluem cidos orgnicos, perxido de hidrognio, compostos de baixo peso molecular e bacteriocinas. Palavras-chave: Antagonismo, Lactobacillus, Bacteriocinas, Microbiota Indgena.

Involved substance production in the phenomenon of bacterial antagonism

ABSTRACT Normal or indigenous microbiota mentions the population of microorganisms that inhabits the skin and the mucosae of normal and healthy people. In general, the members of microbiota transitory exert little impact in the host, while microbiota resident normal remains unbroken. However, if microbiota resident will be disturbed, the transitory microorganisms can colonize and proliferate, producing illness. The use for the acid-lactic products constitutes a millenarian alimentary habit in some cultures. These bacteria, that have basic paper in the production of fermentation food, can inhibit the development of pathogens microorganisms and .causing microorganisms of food deterioration. This inhibition or conservative ability can occur through the competition between the microorganisms or for action of antimicrobial metabolic, in which if they include acid organic, hydrogen peroxide, bacteriocins composites of low molecular weight. Keywords: Antagonism, Lactobacillus, Bacteriocins, Indigenous Microbiota.

1 INTRODUO 1.1 Microbiota Indgena do Corpo Humano O termo microbiota normal ou indgena refere-se populao de microrganismos que habita a pele e as mucosas de pessoas normais e sadias. A existncia de uma microbiota viral normal nos seres humanos duvidosa. A pele e as mucosas sempre abrigam uma variedade de microrganismos que podem ser classificados em dois grupos: (1) a microbiota residente, que consiste em tipos relativamente fixos de microrganismos encontrados com regularidade em determinada rea e em determinada idade; sendo que se perturbada, recompe-se prontamente; e (2) a microbiota transitria, que consiste em microrganismos no patognicos ou potencialmente patognicos que permanece na pele ou nas mucosas por horas, dias ou semanas; provm do meio ambiente, pode ou no provocar doena e no se estabelece de forma permanente na superfcie. Em geral, os membros da microbiota transitria exercem pouco impacto no hospedeiro, enquanto a microbiota residente normal permanece intacta. Entretanto, se a microbiota residente for perturbada, os microrganismos transitrios podem colonizar e proliferar, produzindo doena (TANNOCK, 1995; NICOLI & VIEIRA, 2004). 1.2 Funes da Microbiota Indgena Os microrganismos que esto constantemente presentes nas superfcies corporais so comensais. A colonizao destes, em determinadas reas depende de fatores fisiolgicos, como temperatura, umidade e presena de certos nutrientes e substncias inibitrias. Sua presena no essencial vida do hospedeiro, visto que os animais livres de germes podem ser criados na ausncia completa de uma microbiota normal. Contudo, a microbiota residente de certas reas desempenha um papel bem definido na manuteno da sade do hospedeiro (TANNOCK, 1995; NICOLI & VIEIRA, 2004).

Nas mucosas e na pele, a microbiota residente pode impedir a colonizao por patgenos e o possvel desenvolvimento de doena por meio de interferncia bacteriana. O mecanismo da interferncia bacteriana no est bem esclarecido. Pode envolver a competio por receptores ou stios de ligao (adeso) nas clulas do hospedeiro, a competio por nutrientes, a inibio mtua por produtos metablicos ou txicos, a inibio mtua por substncias antibiticas ou bacteriocinas ou outros mecanismos. Alm dos mecanismos j citados, pode-se observar tambm que a microbiota normal possui funo imunomoduladora, fazendo com que o organismo do hospedeiro esteja preparado para o combate efetivo de patgenos. A supresso da microbiota normal cria claramente um local parcialmente vazio que tende a ser preenchido por microrganismos provenientes do ambiente ou de outras partes do corpo. Estes microrganismos comportam-se como oportunistas e podem tornarse patgenos (GIBSON & ROBERTFROID, 1995; NICOLI & VIEIRA, 2004). Por outro lado, os prprios membros da microbiota normal podem provocar doena em certas circunstncias. Estes microrganismos esto adaptados ao modo de vida no-invasivo, definido pelas limitaes do meio ambiente. Se forem retirados fora das restries desse ambiente e introduzidos na corrente sangunea ou em tecidos, esses microrganismos podem tornar-se patognicos. De forma geral, os microrganismos da microbiota residente normal so incuos e so benficos na sua localizao normal no hospedeiro e na ausncia de anormalidades concomitantes (GORBACH & SIMON, 1987; NICOLI & VIEIRA, 2004). 1.3 O Fenmeno de Antagonismo Bacteriano So vrias as evidncias experimentais e clnicas, como citado anteriormente, demonstrando a produo de cidos, perxido de hidrognio e bacteriocinas antagnicas ao crescimento de patgenos, por parte da microbiota residente. Sem dvida, essas interaes e os seus produtos contribuem para 2

evitar um crescimento exagerado da microbiota do hospedeiro. Os metablitos produzidos por microrganismos que interferem no crescimento de outros microrganismos incluem: 1.3.1 cidos Orgnicos cidos graxos de cadeia curta no-volteis e volteis so encontrados no trato digestivo. Estes compostos so txicos para alguns tipos bacterianos alctones que entram no trato gastrointestinal de mamferos, especialmente em habitats do intestino grosso onde o potencial de xido-reduo baixo. Alm disso, tais cidos podem ser importantes fatores na sucesso autognica da microbiota de animais recmnascidos. Em camundongos, durante a sucesso que acontece na segunda semana aps o nascimento, cidos graxos volteis produzidos por bactrias anaerbias estritas podem reprimir os nveis populacionais das bactrias anaerbias facultativas (SAVAGE, 1977, 1987, 1999; MCFARLAND, 2000). A fermentao dos carboidratos pelos microrganismos resulta na produo de cidos orgnicos. A produo de cidos, principalmente cido lctico, torna o ambiente intestinal bastante desfavorvel proliferao de microrganismos patgenos ou putrefativos. O cido ltico inibe organismos transientes que colonizam habitats gstricos por diminuir o pH do estmago. O pH gstrico em sunos recm-nascidos muito baixo logo aps o nascimento, principalmente porque os Lactobacillus que colonizam superfcies epiteliais no estmago do animal produzem e liberam cido ltico no lmen. Alm disso, em mamferos adultos de algumas espcies, o cido ltico microbiano produzido no estmago e cidos graxos volteis produzidos no ceco influenciam o pH do lmen nestas reas (SAVAGE, 1977; 1987). A atividade antimicrobiana destes cidos decorrente de vrios fatores, entre os quais a drstica reduo de pH do meio a valores incompatveis com o crescimento da maioria dos microrganismos patognicos, sendo que as bactrias lticas, por serem acidoflicas, resistem bem a estes baixos valores. A acidez do contedo

intestinal parece ser tambm importante para favorecer o peristaltismo intestinal, combatendo assim a constipao intestinal. Ela responsvel pelo pequeno nmero de bactrias no intestino delgado proximal, sobrevivendo apenas os cocos e bacilos Gram-positivo mais tolerantes acidez (NARDI et al., 1999). A atividade antimicrobiana dos cidos ltico e actico , em parte, devido ao fato de que estes cidos na forma no dissociada podem atravessar a membrana celular microbiana reduzindo o pH intracelular, o que ir interferir com importantes funes metablicas como a translocao de substratos e a fosforilao oxidativa (NAIDU et al.,1999). Por outro lado, o cido actico apesar de ser produzido em menores concentraes do que o cido ltico possui um efeito inibitrio mais acentuado, uma vez que sua constante de dissociao maior do que a do cido ltico (PIARD & DESMAZEAUD, 1992). 1.3.2 Perxido de Hidrognio O crescimento de alguns microrganismos (por exemplo, Lactobacillus spp.) em condies de aerobiose leva formao de metablitos do oxignio como o nion superxido (O2-), o perxido de hidrognio (H202), e radicais hidroxila (OH-), que constituem os principais fatores responsveis pela toxicidade do oxignio. Como alguns destes microrganismos no sintetizam catalase, o H202 produzido acumularse-, podendo, ento, inibir os microrganismos que no possuem esta enzima. Embora a toxicidade seja um fato comprovado, os mecanismos de ao no foram claramente elucidados (PIARD & DESMAZEAUD, 1991). Algumas das possveis aes deletrias podem incluir a oxidao dos compostos sulfidrlicos celulares, alm da peroxidao dos lipdeos de membrana e injrias nos cidos nuclicos bacterianos (PIARD & DESMAZEAUD, 1991, VANDENBERG, 1993). 1.3.3 Substncias Antimicrobianas de Natureza No-Protica

Os compostos de natureza protica produzidos por alguns microrganismos que foram purificados e caracterizados compartilham algumas caractersticas comuns. Dentre estas, o pequeno tamanho com massa molecular menor do que 1 KDa e a estrutura qumica heterocclica ou aromtica, alm do amplo espectro de ao antimicrobiana frente s bactrias Gram-positivo, Gram-negativo e fungos. ABDEL-BAR et al., em 1987, purificaram e caracterizaram um composto aromtico de massa molecular menor do que 700 Da sintetizado por Lactobacillus bulgaricus, capaz de inibir Pseudomonas fragi e S. aureus. Das substncias de natureza no-protica descritas na literatura destaca-se a reuterina (hidroxipropanaldedo) produzida por Lactobacillus reuteri procedente do trato gastrointestinal de seres humanos e animais. Sua atividade antimicrobiana ampla, sendo capaz de inibir diversos microrganismos de interesse em sade pblica, como Salmonella spp., Shigella spp., Clostridium spp. Staphylococcus spp., Listeria spp., leveduras, fungos filamentosos e protozorios (TALARICO et al., 1988; NARDI et al., 2005). 1.3.4 Bacteriocinas Certas substncias macromoleculares so importantes fatores txicos que impedem a colonizao de microrganismos transientes em habitats gastrointestinais. Estas substncias, as bacteriocinas, so protenas produzidas por linhagens bacterianas de um grupo taxonmico que pode matar ou inibir a multiplicao de outras linhagens sensveis de um mesmo grupo taxonmico e, algumas vezes, de outros grupos, ou at mesmo controlar seu prprio crescimento de uma maneira auto-regulatria (SIMON GORBACH, 1982, 1984; SAVAGE, 1987). A sua atuao in vivo, contudo, parece ainda no ter sido definitivamente estabelecida. Existe uma extensa gama de substncias inibidoras que podem ser produzidas por microrganismos Gram-positivo (como a nisina) e Gram-negativo (como as colicinas produzidas por E. coli). Dentre estas substncias produzidas, as

bacteriocinas so, atualmente, as mais estudadas, devido grande potencialidade de sua aplicao biotecnolgica na indstria de alimentos. As bacteriocinas constituem um grupo heterogneo de peptdeos ou protenas que variam muito quanto ao seu espectro antimicrobiano, propriedades bioqumicas, mecanismo de ao e caractersticas genticas (JACK et al., 1995; PIARD & DESMAZEAUD, 1992; BONAD et al., 2001). As bacteriocinas produzidas por bactrias so sintetizadas pelo ribossomo bacteriano, e se distinguem dos antibiticos que possuem um largo espectro de atividade, por serem peptdeos e terem seus genes estruturais freqentemente presentes em plasmdios e transposons. (JACK et al., 1995). Os antibiticos peptdicos de origem microbiana tm origem da condensao enzimtica de aminocidos livres, como a gramicidina S, bacitracina A e polimixina (KOLTER & MORENO, 1992). Considera-se, ainda que, para a caracterizao das bacteriocinas produzidas por bactrias, necessrio seguir pelo menos dois critrios: o composto deve ser de natureza protica e no deve ser letal a clula produtora (KONISKY, 1982). O espectro de atividade antimicrobiana das bacteriocinas varia. Algumas espcies produzem a bacteriocina contra linhagens da mesma espcie ou contra bactrias relacionadas, que competem pelo mesmo nicho ecolgico, enquanto outras possuem um espectro de atividade antimicrobiano mais amplo incluindo bactrias de gneros no to prximos com relao a sua classificao filogentica (KLAENHAMMER, 1988, 1993; SCHILLINGER & LCKE, 1989). O mecanismo de ao das bacteriocinas, em geral, deve-se a desestabilizao funcional da membrana citoplasmtica das clulas sensveis. Este processo constitudo por trs etapas: interao e insero na membrana, formao de poros e morte celular (JACK et al., 1995). A biossntese de bacteriocinas ocorre durante ou no final da fase exponencial do crescimento bacteriano e modulada de acordo com as condies ambientais (fatores nutricionais 4

e fsico-qumicos) (TAGG et al., 1976). A mxima produo obtida suplementando-se o meio de cultura com fatores limitantes de crescimento, tais como: aucares vitaminas e fontes de nitrognio (PARENTE & HILL, 1992). A amplitude do espectro de espcies e linhagens inibidas depende de cada bacteriocina e varia entre aquelas de um espectro muito restrito, limitado a certas linhagens taxonomicamente muito prximas (por exemplo, a lactocina A), e as que possuem um espectro de ao amplo, que incluem microrganismos deteriorantes de alimentos e patognicos, como Listeria monocytogenes, S. aureus, Clostridium botulinum, e Clostridium perfringens (por exemplo, nisina e pediocina PA-1) (MAGRO et al., 2000 a). Geralmente as bacteriocinas possuem atividade contra um grande nmero de bactrias Gram-positivo. J existem alguns trabalhos que descrevem o efeito antimicrobiano das bacteriocinas sobre Gram-negativo (JACK et al., 1995). As bactrias Gram-negativo, por possurem uma membrana externa, tm maior proteo ao das bacteriocinas (MAGRO et al., 2000 b). A produo de bacteriocina foi muito pouco estudada em bactrias anaerbicas. Podemos citar, tambm, alguns estudos relevantes quanto produo de bacteriocinas por microrganismos anaerbios estritos, como o Ruminococcus gnavus. A habilidade de algumas linhagens de bactrias do grupo Bacteroides fragilis, isoladas da cavidade oral e intestino de pequenos primatas, para produzir bacteriorina foi demonstrada por FARIAS et al., em 1992. Nesta pesquisa, observou-se atividade antagonista em 52% dos isolados intestinais, sendo que trs mostraram a atividade de auto-antagonismo. Uma atividade mais elevada, avaliada pelo tamanho do halo da inibio, foi observada no gar BHI-S, e a inibio maior foi obtida aps 72 horas de incubao (FARIAS et al., 1992). Outro estudo seria o de uma bacteriocina intracelular produzida por um Bacteroides ovatus, isolado da microbiota fecal humana. Esta bacteriocina se mostrou estvel em uma escala de pH de 3-10, em 60 C por 24 horas, e em -70 C

por 6 meses. Observou-se tambm, que a mesma era inativada por enzimas proteolticas. Das cinqenta linhagens do grupo Bacteroides fragilis que foram isoladas das amostras fecais, quarenta e um produziam uma substncia antagonista (MIRANDA et al., 1993). FARIAS et al., em 1994, descreveu tambm, a produo de uma bacteriocina (fragilicina) produzida por uma linhagem de Bacteroides fragilis, isolada de um pequeno primata (Callithrix penicillata). Duas fraes ativas (36 e 150 KDa) foram isoladas por cromatografia. A substncia se apresentou estvel entre pH 3 e 10 e em 60 C por 24 horas. Testes de susceptibilidade a enzimas proteolticas como a tripsina e proteinase-K mostraram-se efetivas na inativao da bacteriocina, dando a evidncia de sua natureza protica. Em uma pesquisa com Fusobacterium, OLIVEIRA et al. (1998), constataram que num total de 167 isolados de microrganismos deste gnero e que foram testados para a produo de bacteriocina (70 obtidos da cavidade oral dos pacientes com doena periodontal, 47 foram recuperados de cavidades orais saudveis de humanos e 50 da cavidade oral de Callithrix penicillata), observou-se auto-antagonismo e o iso-antagonismo quando os mesmos foram testados contra si mesmo. Hetero-antagonismo foi detectado quando os isolados de Fusobacterium foram testados frente a 14 linhagens de referncia e a duas linhagens de Actinobacillus actinomycetemcomitans. Estes fenmenos de hetero-antagonismo observados neste estudo sugeriram um papel ecolgico importante na manuteno do ambiente oral. As bactrias produtoras de bacteriocinas so insensveis a suas prprias bacteriocinas, devido sntese concomitante de protenas de imunidade (SARIS et al., 1996). As protenas de imunidade da segunda classe so usualmente pequenas, compostas de 51 a 150 aminocidos, que mostram um baixo grau de homologia entre si, particularmente quando as bacteriocinas correspondentes so intimamente relacionadas ou idnticas, o que sugere que elas no interagem diretamente com a bacteriocina (NES et al., 1996). 5

As bacteriocinas so geralmente estveis no pH cido ou neutro, indicando que so substncias bem adaptadas ao ambiente de produo das mesmas. Existem algumas excees como, a solubilidade e estabilidade da Nisina em pH 2 so mximas (57 mg/mL) e esses parmetros vo decrescendo medida que aumentamos o pH at 6 (1,5 mg/mL) (PIARD & DESMAZEAUD, 1992). A prova de difuso em gar , provavelmente, o bioensaio mais utilizado para a deteco da atividade bacteriocinognica (JACK et al., 1995). A natureza qumica e a resistncia trmica dos sobrenadantes obtidos das linhagens presumidamente bacteriocinognica so, geralmente, pesquisadas utilizando-se de diversos tratamentos enzimticos (proteases, lipases e amilases) e diferentes tratamentos trmicos (SOBRINO et al., 1992). As quatro classes distintas so: Classe I => formada por peptdeos contendo aminocidos modificados, os lantibiticos. Os lantibiticos so peptdeos menores do que 5 kDa, que se caracterizam por conterem aminocidos modificados como a lantionina e a -metil lantionina, 2,3didesihidroalanina (Dha) e 2,3didesihidrobutirina(Dhb), bem como a presena de anis intra-moleculares. So sintetizados na forma de pr-peptdeos, sofrendo modificaes ps-traduo para formar peptdeos biologicamente ativos. Em funo de aspectos qumicos e estruturais, os lantibiticos subdividem-se em peptdeos do tipo A e B (JUNG, 1991). Os lantibiticos do tipo A so peptdeos que desencadeiam a formao de poros na membrana celular, sendo esse um dos seus principais modo de ao inibitria, estando entre eles a nisina, sintetizada por Lactococcus lactis subsp. lactis e a ruminococcin A (Rum A), sintetizada por membros do gnero Ruminococcus (MORTVEDT et al., 1991; TURNER et al., 1999; DABARD et al., 2001; CHEN et al., 2004). Os lantibiticos do tipo B so peptdeos globulares imunologicamente ativos,

que inibem as atividades enzimticas celulares (JUNG, 1991). Classe II => A classe II compreende um grande nmero de peptdeos termoestveis compostos por aminocidos no modificados. Por sua vez podem subdividir-se em quatro subclasses: IIa- Caracterizam-se por possurem alto grau de homologia entre suas seqncias de aminocidos, principalmente na parte N-terminal dos peptdeos. So peptdeos pequenos, termoestveis e sintetizados na forma de precursores, os quais saem processados depois da adeso de dois resduos de glicina. Essas bacteriocinas e seus organismos produtores so de interesse considervel como bioconservantes devido a sua alta atividade antimicrobiana contra Listeria spp. Ex: pediocin PA-1, sakacinas A e P, curvacina A, leucocina A. IIb- Esto aqui agrupadas as bacteriocinas cuja atividade depende da ao complementar de dois peptdeos. Estes dois peptdeos so diferentes na seqncia, sugerindo que eles originam-se de duas bacteriocinas independentes e provalvemente diferentes (NES & HOLO, 2000). O primeiro relato de bacteriocina desta classe, a lactococcina G, foi isolada de Lactococcus lactis e possui cadeias e consistindo respectivamente de 39 a 35 resduos de aminocidos (NISSEN-MEYER et al., 1992; MOLL et al., 1996). IIc- Incluem as bacteriocinas que so transportadas utilizando um sistema secdependente e necessitam de resduos de cistena na forma reduzida para a atividade biolgica da molcula, como a lactocina B (CINTAS et al., 2001; NES et al., 1996). Classe III => So bacteriocinas com peso superior a 30 kDa, termolbeis e sem aminocidos modificados em sua estrutura primria. Por suas caractersticas proticas e sensibilidade ao aquecimento so a classe de bacteriocinas que possuem menor interesse industrial na atualidade (MAGRO et al., 2000 a). A helveticina J foi a primeira bacteriocina desta classe a ser purificada 6

e caracterizada em nvel gentico (JOEGER & KLAENHAMMER, 1990). Classe IV => A classe IV compreendida por aquelas bacteriocinas complexas que, alm de protena, requerem carboidratos ou lpideos para exercer a sua atividade biolgica (KLAENHAMMER, 1993). A grande maioria destas bacteriocinas de natureza hidrofbica, o que pode levar a uma interao com os lpideos ou outros materiais celulares, alm do fato de terem sido s parcialmente purificadas e caracterizadas apenas pelo uso de enzimas como proteases, amilases e lipases. Ex.: plantaricin S (JIMNEZ-DAZ et al., 1993). A indstria de alimentos utiliza, h vrios anos, a nisina, uma bacteriocina da classe I, sintetizada por Lactococcus lactis subsp. lactis. At o momento, esta a nica bacteriocina autorizada legalmente como conservante alimentcio no Brasil e em mais de cinquenta pases. O seu emprego permitido nos Estados Unidos da Amrica desde 1988 (MAGRO et al., 2000 b). Entretanto, outras bacteriocinas da classe II j foram patenteadas na Europa e EUA, e esto em fase de testes (MAGRO et al., 2000 a , b, CLEVELAND et al., 2001).

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2 CONCLUSO Pelo fato da microbiota intestinal constituir um ecossistema altamente competitivo, a produo de substncias antagonistas por seus componentes, representa uma vantagem ecolgica no controle dos nveis populacionais de outras espcies patognicas ou no.

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1 Flvio Henrique Ferreira Barbosa, PhD Professor Adjunto I Cincias Farmacuticas Universidade Federal do Amap UNIFAP flavio.barbosa@unifap.br 2 Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa, BSc Biloga / Consultora Real Biolgica Ltda larissa@realbiologica.com.br 3 Leandro Henrique Silva Bambirra , BSc Mdico Veterinrio / Estudante de Iniciao Cientfica Universidade Federal de Minas Gerais UFMG 4 Flvia Figueira Aburjaile, BSc Biomdica / Estudante de Iniciao Cientfica Universidade FUMEC

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