OSMOTOLERANCIA

Mauricio Tomasso, 2004

La fermentacin alcohlica es lenta en un medio que no contenga ms que algunos gramos de azcar por litro, su velocidad aumenta con el tenor de azcar hasta 15 o 20g/L. Unos 100 o 200g/L no entorpecen a las levaduras, pero una tasa ms elevada posee un efecto inhibidor que se suma al del alcohol y contribuye a detener prematuramente la fermentacin. La inhibicin por el azcar se explica por un fenmeno de smosis: si una clula de levadura est situada en una disolucin de azcar de presin osmtica ms fuerte que la del contenido de sus vacuolas, la clula ser ms o menos plasmolizada. Azcar del mosto (g/L) Alcohol formado en 2 meses (% vol.) 370 420 470 550 750 8.6 6.3 5.9 3.4 0
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Cuando la concentracin de azcar inicial es elevada, la fase lag se prolonga, la viabilidad celular durante la fase lag disminuye y los recuentos de clulas viables durante la fermentacin dan valores bajos. En sntesis, la fermentacin se retarda y quedan elevados niveles de azcar residual. (Nishino et al., 1985) Osmolalidad es una medida de la cantidad total de partculas osmticamente activas en una solucin y es igual a la suma de las molalidades de todos los solutos presentes en esa solucin.

Es de destacar que es la cantidad y no el tamao de las partculas quien tiene importancia, por esto, un simple in, como por ejemplo el potasio, contribuye de igual forma a la osmolalidad de un jugo de uva que un aminocido, un carbohidrato o cualquier macromolcula presente.

Para estudiar el efecto de la presin osmtica en el comportamiento de la levadura, los volmenes celulares fueron medidos a diferentes presiones osmticas. La diferencia de presin osmtica medida antes y despus de la inoculacin parece servir como medida del efecto de la presin osmtica en la actividad de la levadura.

Efecto de la presin osmtica sobre el crecimiento y la actividad fermentativa de la levadura Clulas de levadura pasaron de un jugo con 10 y 20% (w/v) de azcar a uno con 26% (w/v). Las diferencias de presin osmtica medidas antes y despus de la inoculacin fueron de 0,7 y 0,1Osm respectivamente. El volumen inicial de partida de las clulas fue de 82 m3, llegando a 42 y 56m3 luego de la inoculacin cuando las diferencias de presin osmtica fueron 0,7 y 0,1Osm respectivamente.

82 m3

Cuando la presin osmtica sufre un cambio brusco en la inoculacin, la fase lag prcticamente se duplica y la proporcin de clulas muertas tambin se incrementa marcadamente (3 a 36%). Dentro de las 15hs luego del inicio de la fermentacin, las clulas recuperan su volumen inicial (82 m3)
1.03x108 4.7x107

Cuando la diferencia de presin osmtica inicial es mayor en la inoculacin, el n mximo de clulas por mL fue de 4.7x10 7, mientras que en el otro caso fue de 1.03x10 8. La diferencia puede deberse a la disminucin en el n de clulas viables en la fase temprana del crecimiento.
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A 14% v/v de alcohol producido, el porcentaje de clulas viables disminuye notoriamente de 82% a 28% cuando la diferencia de presin osmtica se incrementa de 0,1 a 0,7Osm.

La velocidad de ingreso de azcar a la clula no es afectada por el choque de presin osmtica en el momento de la inoculacin.

75

82

56

68

Un incremento en el inculo de 4x106 a 10x10 6 cl/mL resulta en una menor reduccin del volumen celular (vol inicial 82m3) Se sugiere que un incremento en el inculo inicial reduce el efecto de la presin osmtica en la clula.

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El inicio de la fermentacin se reduce significativamente a medida el tamao celular es mayor debido a un mayor inculo inicial. Esto indica que el volumen celular luego de la inoculacin depende de la diferencia de presin osmtica medida antes y despus de la siembra y del tamao del inculo.
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En este trabajo se ha estudiado entonces el efecto de los cambios de presin osmtica sobre: Volumen celular Tiempo de inicio de la fermentacin Muerte celular debida al choque osmtico Recuento de clulas viables durante la fermentacin Poder fermentativo As como la influencia del tamao del inculo sobre el choque osmtico de las levaduras. Este trabajo propone que los cambios en el volumen celular en la inoculacin pueden servir como indicador para el crecimiento y la actividad fermentativa de las clulas de levadura.

Bioqumica de la Osmotolerancia
Transportadores de azcares en S. cerevisiae (Bisson, 1999)
La disminucin en la velocidad de consumo de azcares est correlacionada con la disminucin en la capacidad de la levadura de tomarla del medio, a pesar de que el resto de la va glicoltica se mantiene intacta y activa. La capacidad de transporte a travs de la membrana plasmtica y no el nivel de enzimas internas determinan la velocidad de produccin de CO2. La levadura equilibra la velocidad de ingreso de azcar con la velocidad del catabolismo. La velocidad de flujo a travs de la gliclisis es equivalente a la velocidad de flujo a travs de los transportadores. Los procesos de transporte son exquisitamente regulados a fin de igualar, pero no exceder, las necesidades metablicas de la clula.

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Saccharomyces posee una familia multignica de transportadores (18) llamados genes HXT. HXT1 y HXT3 codifican transportadores de baja afinidad (Km=50-100mM), mientras que HXT6, HXT7 y GAL2 son transportadores de glucosa de alta afinidad (Km=1-2mM). HXT2 y HXT4 poseen afinidad moderada (Km=10mM) Los transportadores HXT2 aparentemente pueden existir en estados de alta y baja afinidad, sugiriendo que las condiciones ambientales pueden modificar la cintica de esta protena. La propia glucosa funciona como regulador de expresin de los genes HXT (induccin o represin)

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Por qu hay tantos transportadores en Saccharomyces? El transporte de glucosa y fructosa ocurre por difusin facilitada. Estos sistemas son ptimamente operativos solo en un rango pequeo de concentraciones de sustrato. La fluidez de la membrana debe permitir el cambio conformacional de las protenas transportadoras para lograr el ingreso de sustrato. A elevadas concentraciones de azcar, transportadores con sitios mltiples de reconocimiento (estructura abierta), estn sujetos a inhibicin por sustrato. A elevadas concentraciones de azcar transportadores con estructura relativamente cerrada son requeridos.

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La estrategia de acoplar la expresin de los genes HXT a las concentraciones externas de glucosa asegura que transportadores con afinidad apropiada y sensibilidad a la inhibicin por sustrato sern expresados en el momento apropiado durante la fermentacin. Una segunda razn para la existencia de mltiples especies proteicas catalizando el mismo paso en el catabolismo, concierne a la velocidad de adaptacin a condiciones cambiantes (hiptesis del consorcio) (Bisson et al., 1993) En Saccharomyces el transporte es el sitio principal del control de la velocidad de fermentacin. Cuando las condiciones ambientales se tornan adversas la velocidad de fermentacin disminuye debido a la degradacin especfica de los transportadores HXT.

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Seales de estrs osmtico y osmoadaptacin en levaduras (Stefan Hohmann, 2002)

Luego de un cambio a un ambiente de elevada osmolaridad la levadura rpidamente estimula una cascada de proteinquinasa activada por mitgeno (MAP), la va del glicerol de alta osmolaridad (HOG) la cual orquesta parte de la respuesta transcripcional. Los cambios expresados luego de un cambio a alta osmolaridad apuntan a un ajuste en el metabolismo y produccin de protectores celulares. La acumulacin de glicerol, el cual es tambin controlado alterando su transporte transmembrana, es de central importancia. Luego de un cambio de alta a baja osmolaridad las clulas de levadura estimulan una cascada de MAP quinasa diferente, la va de integridad celular. La salida rpida de glicerol es un evento importante en la adaptacin a condiciones de baja osmolaridad.
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Esquema de las vas involucradas en el metabolismo del glicerol en S. cerevisiae

Gpd1p, 2p, NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase; Gpp1p, 2p, glycerol-3phosphatase; Gut1p, glycerol kinase; Gut2p, FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase; Dak1p, 2p, dihydroxyacetone kinase; Fps1p, glycerol facilitator; Gcy1p and Ypr1p, putative NAD(P)H dependent glycerol dehydrogenase; Gup1p, 2p, glycerol uptake protein; G3P, glycerol 3-phosphate; GAP, gliceraldehdo-3-fosfato; DHAP, dihidroxiacetona fosfato.
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