1 1. Introduco Neste presente trabalho desenrola-se em volta das proteinas, que so macromolculas de aminocidos ligados por ligaces peptidicas.

As protenas se caracterizam por serem o grupo mais abundante de macromolculas, encontradas dentro e fora das clulas, e de importncia vital aos seres vivos. Suas funes vo desde catlise de reaes qumicas (enzimas), transporte de outras molculas, transmisso de impulsos nervosos, proteo imunitria e at mesmo funo hormonal, entre outras. A alimentao humana deve incluir protenas que so encontradas em carne, peixe, ovo, leite e derivados, entre outros. Estas proteinas, sob algumas condices em pressenca de certas substancias podem dar reacoes coloridas, isto , ao reagir com certas substancias forma compostos coloridos. ainda importante realcar-se que as proteinnas podem precipitarem, ao serem submetidas a condices como: temperatuas elevadas, reaces com sais de metais pesados.

2 2. Objectivos Identificar e descrever as principais reacoes coloridas das proteinas; Explicar porque as proteinas em algumas condices precipitam; Elaborar um Guio de experincias onde esto envolvidas as reaces coloridas e precipitao das proteinas;

3 3. Reaces de coloraco das Proteinas Para um composto apresentar cor, necessrio que haja absoro de luz na regio do visivel do espectro electromagntico, ou seja, reagio compreendida na faixa espectral de com o comprimento de onda entre 400 e 700 nm aproximadamente , um corpo absorver radiaco se tiver energia necessria para promover um electro de menor energia (estado fundamental) para um estado de maior energia(estado excitado). Uma vez que para que ocorra a visibilidade da cor necessrio qu exista electres desemparelhados, na sua maioria, os compostos que reagem com as proteinas para formarem reaces cloridas, tem elementos de transico, os quais na sua maioria apresentam electroes desemparelhados principalmente num subnivel d. As reaces que caracterizam as protenas produzem coloraces tpicas, dentre tantas as seguintes:

4. Reacao xantoproteicas A reacao xantoproteica consiste em formacao de uma cor amarela quando uma proteina tratado com o acido nitrico concentrado devido a formacao de produtos nitrados de estruturas aromaticas com um dos aminoacidos incluidos na proteina. Exemplo: C6H5- CH2-CH-COOH + HNO3 conc Fenilalanina

(NO2)2-C5H5-CH-CH-COOH

Dinitrofenilalanina (Cor amarela)

5. Reacoes de Milon Este tipo de reaces ocorre quando se ferve uma solucao de uma protena com Hg(NO3)2 , forma-se um precipitado vermelho.

6. Reaco do Biureto Biureto o nome dado a estrutura originada a partir da decomposico da ureia, quando essa submetida a uma temperatura de aproximadamente 180oc. Soluces alcalinas que contenham biureto desenvolvem uma coloraco violeta, quando em presenca do sulfato de cobre(CuSO4) .

4 Esse fenmeno deve-se a formaco de um complexo entre o io Cu2+ e os tomos de Nitrognio presentes na molecula do biureto. O esquema abaixo representa um modelo da formacao desse complexo:

Se fizermos uma boa observaco, veremos que as ligaces existentes na molcula de biureto so muito parecidas com as ligaces peptdicas estabelecidas entre os aminocidos durante a formaco de peptideos e, finalmente, das protenas. Observando o esquema acima que representa a interracao entre as ligacoes peptidicas de uma proteina ou peptideo com ioes Cu2+. Assim, a reacao de peptideos e proteinas com o sulfato de cobre recebeu o nome de Teste de Biureto, e utilizada para pesquisas de ligaces peptdicas.

7. Reaes de precipitao de Protenas Quando uma protena precipita -se, ela desnatura -se. A desnaturao de uma protena a desorganizao das estruturas quaternrias, tercirias e secundrias. Agentes desnaturantes so os que provocam a desorganizao. So eles: som) agentes qumicos (cidos fortes, bases fortes, metais pesados e uria) A protena desnaturada apresenta as seguintes alteraes: a) Fsicas: aumento da viscosidade; no podem ser cristalizadas ou auto-organizadas. - agentes fsicos (calor, radiaes UV, alta presso e ultra

5 b) Qumicas : maior reatividade: devido a exposio de grupos qumicos que estavam encobertos por estruturas; dim inuio da solubilidade e conseqente precipitao. 7.1. Floculao : um processo reversvel de precipitao, porque pode-se solubilizar a protena pela adio de base ou cido Biolgicas: perda de suas propriedades enzimticas, antignicas e hormonais; facilmente di geridas por enzimas hidroltica.

7.1. Coagulao : a desnaturao drstica, ou seja, um processo irreversvel de precipitao, porque no pode -se mais solubilizar a protena.

8. Precipitao por Sais neutros( efeito da forca inica) Quando adicionamos sais neutros a uma soluo, ocorre um aumento da forca inica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas

quantidades de sal a uma soluo contendo protenas, as cargas provenientes molculas da dissociao do sal passam a interagir com as proticas diminui ndo a interao entre elas.

Consequentemente, temos um aumento da solubilidade da protena no meio aquoso, as interaes protena -proteina, favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse fenmeno d- se o nome de salting in. Esse efeito, porm, no se estende indefinitivamente. Em condies de elevada forca inica, decorrente da adio de grandes quantidades de sal, temos o efeito contrrio. Se em uma soluo aquosa de uma protena qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro, a gua, que apresenta um grande poder de solvatao, ,passa a interagir com as duas espcies: as protenas e os ies provenientes da dissociao do sal. Porm, as molculas de gua apresentam maior tendncia de solvatao de partculas menores (nesse caso, ies). As molculas de gua, ocupadas em sua interao com ies abandonam estrutura proteica. Como consequncia, temos: maior

6 interao protena -protena, diminuio da solubilidade em aquoso e consequentemente,precipitao da protena. A esse fenmeno de in solubilizao da protena em decorrncia de um considervel aumento da fora inica do meio d -se o nome de saltingout. A precipitao de protenas pela alta concentaao de sais um processo muito importante para a separao de misturas complexas de protenas, uma vez que a concentrao de sal necessria para meio

precipitao diferente para cada protena,

9. Precipitao por solventes orgnicos A precipitao por solventes orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos, quando utiliza dos a temperaturas baixas, so bastantes teis na separao de misturas de protenas . temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar desnaturao por

rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de interaes apolares, importantes na manuteno da conformao protica.

3. Precipitao pelo Calor A temperatura um fator importante na solubilizao das protenas. Em geral, entre O e 40 C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cintica das molculas de protena, facilitando a interao destas com o solvente. Entretanto, acima de 40 C, as protenas comeam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam to intensos que os grupamentos qumicos se afastam alm da distncia permitida para se reassociarem, aproximando -se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundria, terciria e quaternria e a protena adquire outra conformao, uma conformao inativa (desnaturada).

10. Precipitao por sais de metais pesados Os sais de metais pesados (Pb, Hg, Ag, Cu) causam a desnaturao de protenas, isto , modificam a sua conformao natural com a atividade biolgica (conformao nativa) para uma conformao no natural biologicamente inativa (desnaturada). As molculas proticas desnaturadas precipitam. Os sais de metais pesados, portanto,

precipitam as protenas por desnaturao.

III. Separaco e identificaco de diferentes princpios activos por micro-mtodos qumico-fsico Princpios da Espectrometria de massa A espectrometria de massa um mtodo de determino precisa de massas molares. Um espectrometro de massa formado basicamente de duas partes : O sistema de ionizao das moleculas responsaveis por vaporiz-las e carrega-las electicamente, e o analizador de massa , o espectrmetro de massa propriamente dito que separa os ies resultantes de acordo com a massa . Actualmenete, duas tcnicas de ionizao que se completam e se sobrepem, dominam a anlise de proteinas: a dessoro a laser e a eletropulverizao. Dessoro a laser A palavra dessoro, refer-se ao fenmeno de rettirada de substancias adsorvidas ou absorvidas por outras. No caso da espectrometria de massa , a proteina ou a mistura proteica ou peptidica em estudo misturada a uma matriz cida e irradiada com um feixe de de laser, cuja energia causa a dessoro da molcula. A matriz cida transfere protes para as molculas de proteinas, fazendo que fiquem ionizadas positivamente. A dessoro das molculas de matriz e de proteina faz que elas passem para o estado gasoso. Estar na forma inica e no estado gasoso condico para que uma molcula possa ser analizada por espectrometria de massa. A principal tcnica empregada na anlise de proteinas baseada no fenmeno da dessoro a laser conhecida como MALDI- sigla em ingles para matrix assisted laser desorption ionization.

Electropulverizao Na ionizao por electopulverizao, a proteina dissolvida emu ma solunao acidificada a qual pulverizada em uma agulha metlica ou um capilar de vidro revestido de metal submetida a intenso campo electico, o que causa sua ionizao.. uma corrente de gs inerte flui no sentido contrrio ao da pulverizao, o que causa sua dessolvatao. A proteina j ionizada e no estado gasoso atraida para dentro do espetrmetro de massa, onde analizada.

Aplicaes A espectrometria de massa uma tcnica capaz de determinar massas molares de forma muito precisa em experimentos rpidos (poucos minutos). Essas informaes possibilitam a resoluo de diversos problemas em qumica de proteeinas, tais como: checagem de correo de uma sequencia de aminocidos, identificaco de protenas.

Guo de experincias sobre Proteinas I. Reacoes de coloraco das Proteinas Teste de biureto Materiais 5 Tubos de ensaio Reagents Reagente de Biureto; Soluo do ovoalbumina 2% gua destilada

Procedimentos: Introduza 2ml de soluo de ovoalbumina 2% um tubo 1; Introduza 2ml da soluo de glicina 0,1% tubo 2; Introduza 2ml de gua destilada tubo 4; A cada tubo de ensaio adiciona, gota a gota, o reagente de biureto Agite os tubos

Reaces Xantoproteicas Materiais Tubo de ensaio Reagents Soluo proteica cido ntrico concentrado;

Procedimentos: Em um tubo de ensaio, introduz-se 2ml da soluo proteica; Adiciona-se 1ml de de cido ntrico concetrado; Observa-se o que acontece. II. Reaces de precipitaco das proteinas Precipitaco por sais Materiais 1 tubo de ensaio; pipetas (vidro ou plsticos); Reagentes soluo de clara de ovo; soluao satuarada de sulfato de amnio(NH4)2SO4; Solucao de cloreto de sdio; gua destilada

Procedimentos: Em um tubo de ensaio, coloca 2ml da soluo de protena; Adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2ml de sulfato de amnio; Anota as observaes

Precipitaco pelo calor Materiais Fonte de calor Reagentes Soluo de clara de ovo

Procedimentos: Preparar um banho-maria fervente. Adicionar em um tubo de ensaio 2 mL de ovoalbumina Colocar este tubo no banho-maria fervente por 5 minutos. Observar o resultado. Precipitaao atraves de sais de metais pesados

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Materiais Tubo de ensaio Fonte de aquecimento

Reagents Acetato de Chumbo Soluo de clara de ovo

Procedimentos Em um tubo de ensaio, colocar 1ml de soluo proteica junta-se o Hidrxido de sdio e leva-se ao aquecimento at a ebulio;; Adicionar 0,5 ml de acetado de Chumbo; Observa-se e interpreta-se os resultados. 4. Precipitao por solvents orgnicos Materiais 4 tubos de ensaio; pipetas ; Reagents Soluo de proteinas; Etanol 95% gelado; Acetona gelada; Cloreto de sdio; gua destilada;

Procedimentos: Tome 2 tubos de ensaio e coloque em cada um, 2ml da soluco protica; Adicionar 4ml de etanol gelado a cada tubo ; agite; Em um dos tubos coloque uma pequena quantidade de NaCl slido sob agitao; Observa o que acontece qual o efeito do lcool sobre a proteina na presence e na Ausena de um eletrlito? Adicione 6ml de gua destilada e observa; Repita as etapas anteriores substituindo o etanol pela acetonas; Compare os resultdos.