Las tcnicas de contrastacin del semen, tanto por su utilizacin en investigacin y, especialmente, en la rutina de produccin, deben ser precisas,

sencillas, rpidas y econmicas . Tras todo lo dicho, cabe destacar que hasta el momento no se ha conseguido un mtodo de evaluacin seminal in vitro, que al utilizarlo solo o en combinacin con otros sea capaz de predecir de forma segura la capacidad fecundante de una muestra de semen. Sin embargo, debido a que la valoracin in vitro de la calidad seminal es muy importante en la valoracin androlgica de los machos y es, adems, el mejor indicador del grado de conservacin del semen congelado descongelado, se han dedicado grandes esfuerzos al diseo de tcnicas que midan la capacidad fecundante del semen fresco y congelado. Los parmetros clsicamente usados para conocer la calidad seminal de un eyaculado son los que siguen:

Esquema del aparato reproductor de un toro.

Concentracin
Existe una alta correlacin significativa entre el nmero de espermatozoides inseminados y la fertilidad del toro. La presencia de un mayor nmero de espermatozoides, siempre y cuando sus caractersticas sean normales, incrementa la posibilidad de fertilizacin. Este aspecto es crucial en el caso de los toros con baja concentracin espermtica, o en los casos en que se utiliza semen descongelado, que ha sido diluido y sometido a estrs durante el proceso de congelacin descongelacin, provocando un dao irreversible en un porcentaje elevado de espermatozoides. La fertilidad de un toro usado en IA, entre otras razones, depender bsicamente del nmero de espermatozoides normales que se utilicen al inseminar. Existe una variabilidad muy grande en la concentracin de un eyaculado a otro, y de un toro a otro, siendo importante conocer el nmero de espermatozoides por eyaculado, ya que de este parmetro depende el nmero de hembras a inseminar. La concentracin puede calcularse por varios mtodos a partir de la muestra de semen. Entre estos mtodos, destacan la espectrofotometra, la colorimetra, la citometra de flujo y el uso de cmara de recuento celular, como las de Brker, Neubauer o Thoma. La espectrofotometra, tcnica usada en nuestro laboratorio, es un mtodo indirecto, que mide la luz monocromtica absorbida por las partculas en suspensin o los espermatozoides. Esta densidad ptica de la muestra es comparada frente a una curva estndar patrn previamente validada, y permite, as, conocer el nmero de espermatozoides. CUALIDADES QUE DEBEN TENER LOS ESPERMATOZOIDES DE UN EYACULADO FECUNDANTE

-Motibilidad progresiva -Morfologa normal -Metabolismo energtico activo -Capacidad para desarrollar una motibilidad hiperactivada -Integridad estructural y funcionalidad de la membrana -Integridad de las enzimas asociadas con la fecundacin -Capacidad de penetracin -Transferencia ptima del material gentico

Motilidad
La motilidad es uno de los parmetros ms importantes de la analtica seminal. Hasta hace pocos aos el estudio de la motilidad espermtica se haca exclusivamente mediante mtodos semicuantitativos. Estos mtodos evalan el porcentaje de espermatozoides mviles, as como el tipo de movimiento que presentaba la media de una poblacin espermtica. Estas medidas ofrecen una descripcin general de la motilidad espermtica, pero la exactitud y precisin estn limitadas por las condiciones del sistema de medida y por la destreza del observador. A pesar de ello, la valoracin subjetiva de la motilidad hecha por personas experimentadas es de gran valor, debido a que la informacin se presenta de forma inmediata, al tiempo que es un mtodo econmico y de fcil ejecucin. Los primeros intentos de objetivizar el movimiento espermtico se basaron en exposiciones fotogrficas mltiples o video micrografas. Estos mtodos son tediosos, largos y costosos, por lo que hoy en da no son de eleccin. Sin embargo, la aparicin de los sistemas informatizados de digitalizacin de imgenes abri un nuevo campo en el estudio de la motilidad de los espermatozoides. Estos sistemas, denominados genricamente CASA (Computer Assisted Motility Analysis), han automatizado y simplificado el proceso. El anlisis computerizado de la motilidad fue propuesto por primera vez hace 25 aos y es usado actualmente en centros de investigacin en androloga y centros de reproduccin asistida. El CASA establece, de una manera efectiva, medidas cuantitativas del movimiento individual de los espermatozoides. Con este tipo de anlisis se espera obtener medidas correctas de la motilidad espermtica que proporcionen informacin precisa acerca del estado funcional del axonema y de las membranas espermticas. Los sistemas automticos de medicin de imgenes se basan en la captura sucesiva de espermatozoides en movimiento provenientes de un microscopio. Estas imgenes se digitalizan identificando las clulas espermticas que contienen la primera imagen. Luego se procede al seguimiento de estas clulas en imgenes sucesivas y al establecimiento de trayectorias definitivas. Las trayectorias se procesan matemticamente, obteniendo as resultados numricos precisos. Los parmetros determinados para cada espermatozoide son la velocidad de movimiento sobre la base de varios descriptores, las trayectorias que realiza la cabeza del espermatozoide y la frecuencia de los cambios de direccin que efecta. Actualmente, tambin existen en el mercado varios tipos de CASA que capturan el movimiento espermtico y lo analizan, tanto en tiempo real, como de manera diferida, aportando un gran volumen de informacin.

Componentes de un sistema CASA (Microptic/Barcelona, Versin 2002).

DEFINICIONES Axonema Acrosoma smosis Resistencia omtica Eje interno del flagelo o proyeccin movil del espermatozoide y que permite su desplazamiento. Revestimiento interno de la cabeza del espermatozoide, cuya principal funcin es perforar la membrana del vulo para penetrar en el mismo. Paso de una sustancia a travs de una membrana semi impermeable que separa las soluciones de diferentes concentraciones. Capacidad del espermatozoide para captar agua cuando este se encuentra en un medio hipoosmtico.

Viabilidad
La rotura de la membrana plasmtica est claramente asociada con la prdida de viabilidad celular, pero una membrana plasmtica intacta no siempre indica que la clula sea viable. El procesado del semen, incluida su criopreservacin, es "estresante" para el espermatozoide y afecta, primeramente, a sus membranas. Los daos que pueden producirse en stas pueden ser modificaciones en su organizacin, permeabilidad y composicin lipdica. Las membranas espermticas que pueden verse afectadas por la criopreservacin incluyen la membrana plasmtica, la membrana externa del acrosoma y las membranas mitocondriales. En cualquier caso, la criopreservacin, cuyo propsito es garantizar la supervivencia del semen, causa daos irreversibles en la membrana plasmtica, lo que conlleva la muerte de un gran nmero de espermatozoides o, en los supervivientes, cambios similares a los observados durante la capacitacin espermtica, que provoca un acortamiento de su perodo de vida til. La evaluacin morfolgica de la integridad de la membrana plasmtica se realiza usando la ptica de contraste de fases, la ptica de contraste diferencial de interferencia o de Nomarski o las tinciones supravitales, como el verde rpido/eosina o la eosina/azul de anilina, el tripn azul/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina. Tambin ha sido valioso el examen a travs de la microscopa electrnica o de barrido, para determinar aspectos de la integridad espermtica. Actualmente, se estn utilizando diversas tinciones fluorescentes, las cuales presentan una mayor precisin en el estudio de las caractersticas de la membrana plasmtica. As, se ha estado usando ampliamente el diacetato de carboxifluorescena y el ioduro de propidio, visualizndose con esta tcnica los espermatozoides viables de color verde, frente a los muertos que se observan de color rojo anaranjado (Fotografa 1).

Fotografa 1.- Espermatozoides teidos con ioduro de propidio y diacetato de carboxifluorescena. El espermatozoide con membrana plasmtica intacta se observa verde brillante, el moribundo comienza a estar rojo y el daado es claramente rojo (1000x).

Estado del acrosoma

El acrosoma juega un papel fundamental en la fecundacin y esta importancia hace que convenga realizar una valoracin especfica del mismo. En un espermatozoide que tenga el acrosoma en perfectas condiciones se pueden distinguir tres regiones claramente diferenciadas en la cabeza: la zona acrosomal, con un borde apical, la zona postacrosomal y el segmento ecuatorial entre ambas. Las muestras seminales con alta proporcin de acrosomas alterados o ausentes suelen tener una fertilidad baja. Para determinar el estado del acrosoma se han usado desde hace mucho tiempo diferentes tinciones. Entre stas tenemos la tincin de eosina/verde rpido, Giemsa y la de eosina/nigrosina, las dobles y triples tinciones, basadas en la combinacin del azul tripn con otros colorantes y tinciones comerciales como el Spermac7. Recientemente, se han utilizado anticuerpos acrosomales especficos marcados con fluorescencia. En el caso de los espermatozoides bovinos, su tamao permite poder valorarlos mediante un microscopio ptico de contraste de fases con un objetivo de gran aumento (Fotografa 2).

Fotografa 2.- Izquierda, espermatozoide con acrosoma intacto. Derecha, espermatozoide con acrosoma
daado (1000x).

Pruebas de funcionalidad espermtica

La membrana espermtica es una estructura dinmica que participa en el reconocimiento y transporte de molculas. Estas funciones permiten que el espermatozoide adapte su metabolismo al medio circundante, proporcionando as un sistema molecular para el reconocimiento del ovocito. El anlisis de la integridad de la membrana constituye una informacin importante en la evaluacin de la fertilidad del macho. Adems, esta integridad no slo es fundamental para el metabolismo espermtico, sino que tambin lo es para una adecuada capacitacin y reaccin acrosmica, y, por tanto, para la fertilidad del macho. Un grupo de pruebas de funcionalidad espermtica que han centrado gran inters por su simplicidad y su valor predictivo son las de resistencia osmtica. Estas pruebas se basan en la capacidad del espermatozoide para captar agua en un medio hiposmtico y en que la hinchazn osmtica est asociada con el enrollamiento de la cola del espermatozoide, que se desenrolla cuando la clula es devuelta a un medio isosmtico. Dentro de las pruebas desarrolladas a partir de este fenmeno destaca el test de endsmosis que consiste en situar los espermatozoides en presencia de un medio de presin osmtica ms baja que la fisiolgica, lo que causa una entrada de agua en la clula en un intento de equilibrar la presin osmtica interna con la del medio externo. Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmtica del espermatozoide debe estar ntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando correctamente. La entrada de agua provoca en estas clulas un hinchamiento y enrollamiento del flagelo (Fotografa 3). Las clulas con la membrana fsica o funcionalmente daada no experimentan cambios en la forma del flagelo. Los valores obtenidos en esta prueba se correlacionan con otros parmetros de calidad seminal, como la motilidad, la viabilidad o la morfologa.

Fotografia 3.- Izquierda, espermatozoide negativo al test de endsmosis.Derecha, espermatozoide endmosis

positivo (1000x)

Morfologa
El anlisis morfolgico de los espermatozoides es uno de los principales componentes de la evaluacin de las caractersticas de una muestra seminal. La valoracin de la morfologa del espermatozoide se basa en la relacin directa que haya entre la proporcin de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto morfolgico y su relacin con la fertilidad in vivo de los toros. Atendiendo a una clasificacin estrictamente morfolgica, las anomalas que puedan generarse se clasifican en anomalas en la cabeza, en el tracto intermedio y en la cola. Segn el rgano donde pueden haberse generado diferenciamos las anomalas primarias y secundarias. Esta evaluacin de la morfologa espermtica puede ser utilizada para eliminar toros con pobre calidad seminal (Fotografa 4) y refleja la funcionalidad de los testculos, epiddimos y glndulas accesorias, por lo que siempre deben estar incluidas en las pruebas de evaluacin espermtica.

Fotografia 4.- Cabeza desprendida de un espermatozoide, junto a otro normal (400x)

Esquema de un espermatozoide.