UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER CARRERA DE BIOLOGA LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR (20071) Oriana Serna Biloga 2013

ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADN

INTRODUCCIN Los geles son una herramienta que permiten la separacin e identificacin de cidos nucleicos basados en su carga de migracin. La migracin de las molculas de cidos nucleicos en un campo elctrico es determinada por el tamao y la conformacin de las molculas, permitiendo que fragmentos nucleicos de diferentes tamaos sean separados. Sin embargo, la relacin entre el tamao del fragmento y la tasa de migracin no es lineal, dado que fragmentos grandes tienen ms friccin y son menos eficientes en la migracin a travs del polmero. Anlisis de cidos nucleicos en geles de agarosa, es el mtodo ms usado para analizar fragmentos de DNA de 0.1 25 kb. Concentracin de agarosa La concentracin del gel de agarosa usada es dependiente del tamao de los fragmentos de DNA que sern analizados. Bajas concentraciones son usadas para separar fragmentos grandes, mientras altas concentraciones son usadas para tener ms resolucin de fragmentos pequeos. La mayora de los geles se corren con agarosa estndar, aunque algunas formas especiales estn disponibles para aplicaciones especiales. Por ejemplo agarosa low-melt que permite reacciones enzimticas in situ.

Buffers de electroforesis Buffer de corrida Los buffers ms comnmente usados son TBE (Tris-Borato-EDTA) y TAE (Tris-Acetato-EDTA). Aunque es ms frecuente el uso de TAE, este presenta capacidad de buffer ms baja que el TBE. TBE puede ser usado para electroforesis de DNA de bajo peso molecular y en los sistemas en los cuales es usado no requiere de sistemas adicionales de recircularizacin. En la siguiente tabla se especifica la composicin del buffer de carga ms comn:

Buffer de carga Son adicionados a las muestras antes de servirlas en el gel con tres propsitos: - Incrementar la densidad de la muestra y asegurar que esta llegue al fondo del pozo. - Adicionar color a la muestra con el uso de colorantes indicadores como Azul de Bromofenol (BPB) o Xileno Cianol (FF) para facilitar la toma de la muestra. - Permitir el seguimiento de la electroforesis dada la co-migracin de los colorantes indicadores con fragmentos de DNA de tamao especfico. En la siguiente tabla se especifica la composicin del buffer de carga ms comn:

Coloracin Para permitir la visualizacin de muestras de DNA, geles de agarosa son coloreados con un colorante. El colorante ms usado en el agente intercalante Bromuro de Etidio, que puede ser adicionado antes o despus de la electroforesis. Mtodos alternativos con los colorantes recientemente introducidos como SYBr, GelRed, GelGreen y EZ Vision. Los colorantes, forman complejos con el DNA que incrementan la fluorescencia, lo que significa que la iluminacin de un gel o una muestra coloreada bajo luz UV (254-366nm), permite que las bandas de DNA sean visualizadas. La imagen del gel puede ser recuperada por la toma de fotografas con sistemas de documentacin.

METODOLOGA: ELECTROFORESIS SOBRE GEL DE AGAROSA 1. Preparar un molde de minigel cerrndolo hermticamente en las extremidades. Colocar el peine. 2. Fundir 0.4 gramos de agarosa en 50 ml de 0,5X TBE en el horno microondas hasta disolver la agarosa y verter la solucin de agarosa en el molde. 3. Una vez enfriado el gel a temperatura ambiente sumrjalo en buffer de corrida 0,5X TBE.

4. Sobre ParaFilm mezcle las muestras una a una con el buffer de carga y el colorante. Inserte la punta de la micropipeta en el fondo del pozo (Tenga cuidado de no romper el gel!) y suavemente descargue la muestra. Recuerde debe depositar entre 100 y 500 ng de las diferentes soluciones de DNA: a. Referencia de peso molecular (1Kb Thermo) b. Amplificado. c. DNA genmico d. Plsmido recombinante e. Plsmido no recombinante 5. Conecte los electrodos para que el DNA migre hacia el nodo (electrodo +) (No olvide cubrir la cmara de electroforesis para protegerse de un choque elctrico) 6. Encienda la fuente de poder y corra el gel a 1-10V/cm hasta que los indicadores hayan migrado la distancia apropiada. Esto ser dependiente del tamao del DNA analizado, la concentracin de agarosa y la separacin requerida. 7. Visualizar el ADN bajo la lmpara UV. Tomar una foto o dibujar las observaciones.

OBSERVACIN Y ANLISIS DE LOS RESULTADOS: 1. Reconocer las bandas del ADN de referencia. 2. Observar el patrn de migracin de los diferentes fragmentos de ADN (lineal, circular relajado, circular superenrrollado, etc.) en relacin con el ADN de referencia. 3. Estimar el tamao de los fragmentos de ADN (graficar sobre papel semilogartmico o dibujar en Excel). 4. Tomar registro fotogrfico del gel.

BIBLIOGRAFIA - Libros relacionados en el programa de la asignatura. - Sambrook, J., Fitsch, E., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). - Ausubel, F.M, Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1992). Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed. Green Publishing Associates, New York. - Promega Corporation, (1991). Promega protocols and applications guide (Madison: Promega Corporation). - Glover, D. (1988). DNA cloning: a practical approach (Oxford: IRL Press).