CRECIMIENTO Y REPRODUCCION DE LOS MICROORGANISMOS.

Cuando las bacterias se inoculan en un medio apropiado y se incuban en las debidas condiciones, se verifica un enorme incremento de su nmero en un tiempo relativamente corto. Algunas especies alcanzan el mximo de poblacin dentro de las 24 horas, aunque otras requieren un perodo mucho ms largo de incubacin. El trmino crecimiento, aplicado a las bacterias y otros microorganismos se refiere comnmente a la variaciones en la produccin total de clulas, y no a los cambios que experimentan los organismos individuales. Los ms frecuente es que el material de inoculacin contenga miles de organismos; de modo que por crecimiento se entiende el aumento del nmero de clulas sobre el que contena el material original de siembra. REPRODUCCION. PROCESOS REPRODUCTORES. La modalidad ms comn y sin duda la ms importante desde el punto de vista del ciclo normal de crecimiento en las poblaciones bacterianas, es la que se conoce como fisin binaria o fisin transversal. El resultado de este proceso reproductor es que la clula individual se divide en dos, despus de formarse un tabique transversal que separa los contenidos celulares. Este es un proceso de reproduccin asexual. La germinacin de las endosporas bacterianas produciendo clulas vegetativas no es una modalidad de reproduccin en el sentido de multiplicacin. Cada espora da origen a una clula, de modo que este proceso no supone aumento de la poblacin total.

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO. La modalidad predominante de reproduccin bacteriana es, la fisin binaria: una clula se divide dando origen a dos nuevas clulas. Tomando como punto de partida una sola bacteria, el incremento de la poblacin se hace en progresin geomtrica 1 - 2 - 4 - 8 - 16 - 32, etc. El tiempo que se requiere para que la clula se divida o sea, para que la poblacin se duplique, se denomina tiempo de generacin. No todas las bacterias tienen el mismo tiempo de generacin; para algunas como Escherichia coli, es de 15 a 20 minutos, para otras puede ser de varias horas. Tampoco es igual el tiempo de generacin para una bacteria determinada en todas las condiciones. La cantidad y la calidad de los elementos nutritivos disponibles en el medio y las condiciones fsicas ambientales predominantes dan lugar a variaciones en el tiempo de generacin.
Microorganismo Medio Temperatura (C) Tiempo de generacin (min) 35 35 17 23 34 792 24 32

Bacillus subtilis Clostridium botulinum Escherichia coli Shigella dysenteriae Pseudomona aureaginosa Mycobacterium tuberculosis Salmonella typhimirium Staphylococcus aureus

Medio complejo Caldo glucosa Caldo Leche Caldo lactosa Medio sinttico Caldo soya tripticasena Caldo glucosa

36 37 37 37 37 37 37 32

Cuando el desarrollo del proceso de reproduccin es uniformemente constante, puede determinarse matemticamente el tiempo de generacin y el nmero de generaciones, y en otros aspectos, analizar cuantitativamente el incremento del crecimiento. El procedimiento que se emplea con ms frecuencia es inocular el medio con un nmero conocido de clulas, dejar que las bacterias crezcan en condiciones ptimas, y despus, determinar la poblacin final. Los datos experimentales necesarios para calcular el tiempo de generacin son:

1. nmero de bacterias presentes al comienzo del experimento. 2. nmero de bacterias presentes al final de un intervalo de tiempo y 3. el intervalo de tiempo. El tiempo de generacin de una poblacin bacteriana puede ser expresado matemticamente como sigue: g = t - to / (log 2 N - log No) donde g es el tiempo de generacin y N y No representan la concentracin de clulas a los tiempos t y to , respectivamente. En microbiologa, las poblaciones son generalmente graficadas como logaritmos de base 10. La conversin de la ecuacin a logaritmos de base 10 da como resultado la siguiente ecuacin: g = 0.301 (t - to) / (log 10 N - log 10 No) Usando esta ecuacin, el tiempo de generacin de un cultivo puede ser determinado si se conoce la concentracin de clulas del cultivo a dos diferentes tiempos de incubacin. Por ejemplo, el tiempo de generacin de un cultivo conteniendo 103 clulas/ml en el tiempo to y 107 clulas/ ml 7 horas mas tarde podra ser calculado como sigue: g = 0.301 (t - to) / (log 10 N - log 10 No) g = 0.301 (7 - 0) /(log 10 107- log 10 103) g = 0.301 (7) / (7 - 3) g = 2.107 / (7 - 3) g = 2.107 / 4 g = 0.527 horas, 31.6 minutos Debido a que las bacterias crecen exponencialmente (al menos para una parte de su crecimiento), las curvas de crecimiento bacteriano son graficadas en papel semilogartmico (logaritmo del nmero de masa de bacteria contra tiempo) en lugar de una escala aritmtica.

CURVA DE CRECIMIENTO DE LA POBLACION BACTERIANA. Cuando despus de inocular un medio nuevo con un nmero determinado de clulas, se determina la poblacin bacteriana intermitentemente durante el perodo de incubacin de 24 horas (ms o menos) y se presente en una grfica de correlacin de los logaritmos de los nmeros de clulas en funcin del tiempo, se obtiene una curva como se muestra a continuacin:

En esta puede apreciarse que existe una perodo inicial en el que parece no haber crecimiento, seguido de un crecimiento rpido, despus una nivelacin o estacionamiento y, finalmente, un descenso de la poblacin viable. Entre cada una de estas fases existe un perido de transicin (parte curva). 1. Fase retardada o fase lag. La adicin del material de inoculacin a un medio nuevo no va seguida de la duplicacin inmediata de la poblacin conforme al tiempo de generacin. En vez de esto, la poblacin permanece sin cambio durante algn tiempo, Pero ello no significa que las clulas se encuentren en estado latente o de reposo; por el contrario, durante este perodo, las clulas individuales aumentan su tamao sobre las dimensiones normales. Fisiolgicamente, son muy activas, y sintetizan nuevo protoplasma. Las bacterias en el nuevo medio pueden ser deficitarias en enzimas o coenzimas, que han de sintetizar en primer lugar en las cantidades necesarias para el funcionamiento ptimo del mecanismo qumico de la clula. Cada clula exige cierto tiempo de ajuste al ambiente fsico circundante. Los organismos metabolizan, pero existe un retardo en la divisin celular. Al final de la fase lag, cada organismo se divide. Sin embargo, como no todos los organismos completan el perodo lag

simultneamente, durante este perodo el incremento de poblacin es gradual, hasta que, al final, todas las clulas son capaces de dividirse a intervalos regulares. 2. Fase logartmica o exponencial. Durante este perodo las clulas se dividen con regularidad, segn un rgimen determinado por el tiempo de generacin de cada bacteria en particular. En esta fase y en condiciones apropiadas, la velocidad de crecimiento es mxima. Durante la fase log, la poblacin total es casi uniforme, en lo que se refiere a la composicin qumica de las clulas, actividad metablica y otros caracteres fisiolgicos. 3. Fase estacionaria. La fase logartmica del crecimiento comienza a decaer despus de algunas horas, tambin en forma gradual, lo que se refleja en la representacin grfica por una curva de transicin entre dos lneas rectas, la segunda de las cuales, es la fase estacionaria. Esta tendencia a la suspensin del crecimiento puede atribuirse a varias causas, entre ellas el agotamiento de algunos nutrimentos y, con menos frecuencia, la produccin de sustancias txicas durante el crecimiento. La poblacin permanece constante por algn tiempo, quiz como consecuencia de la interrupcin completa de la divisin o del equilibrio entre las reproducciones y una proporcin equivalente de mortalidad. 4. Fase descedente o de mortalidad. Despus del perodo estacionario, las bacterias mueren a una velocidad superior a la de produccin de nuevas clulas, dando por supuesto que todava se reproduzcan algunas de ellas. La causa efectiva de muerte durante esta fase de cultivo depende de muchas circunstancias, y vara en cada tipo bacteriano. En general, el agotamiento de elemento nutritivos esenciales y/o la acumulacin de productos (por ejemplo, cidos) en una concentracin inhibidora, son suficientes para explicar esta evolucin. La transicin inmediata de la fase estacionaria a la coyuntura de disminucin de la poblacin va seguida, en algunos casos, de una proporcin de mortalidad que es la inversa logartmica de la fase log. Este grado de mortalidad puede continuar durante varios das, o bien todas las clulas pueden morir en 2 3 das, segn las especies bacterianas. Algunas especies de cocos gram-negativos mueren rpidamente, en 72 horas o menos, mientras que en otros tipos de bacterias pueden persistir algunos organismos viables durante meses y aun aos.

Las bacterias se pueden mantener en la fase exponencial en una curva de crecimiento a travs del uso de cultivos continuos. En ellos, el volumen del cultivo y la tasa de crecimiento son mantenidos a un nivel constante por la adicin de medio fresco y la remocin de una cantidad equivalente de medio utililizado y clulas viejas. Para conocer el nmero de bacterias viables en una suspensin, se utiliza el recuento en placa. La tcnica involucra el crecimiento de bacterias de una suspensin, en placas de agar, la formacin de colonias de clulas, las cuales son fcilmente vistas por el ojo humano. Las colonias que aparecen en el medio son enumeradas para determinar el nmero de clulas original en la suspensin. Algunos problemas se encuentran a menudo con bacterias que crecen en cadenas o filamentos, tales como los bacilos. Cuando stas clulas no se separan, la formacin de menos colonias que el nmero actual de clulas resulta errneo. Por tal motivo, los conteos resultantes son expresados generalmente como unidades formadoras de colonia (UFC) / ml de suspensin, en lugar de clulas / ml. Dado que el nmero de bacterias en una suspensin fcilmente alcanzan 109 clulas/ml, es necesario hacer diluciones de la suspensin original antes de poner las bacterias en las placas de agar para reducir suficientemente el nmero de clulas por ml para poder llevar a cabo el conteo, y que las placas no estn muy esparcidas, o muy amontonadas. Idealmente, las diluciones del cultivo dan como resultado que el crecimiento en las placas de agar caiga entre 30 -300 colonias. El crecimiento inferior a 30 colonias no tiene validez estadstica y en un crecimiento superior a 300 colonias pueden causar interferencia las clulas que estn juntas y las colonias durante el crecimiento. La dilucin de bacterias de una suspensin se debe desarrollar empleando la tcnica asptica, utilizando diluyentes de agua, o soluciones salinas, dependiendo de la bacteria.

En el ejemplo que se muestra, las bacterias de una suspensin celular son diludas en 9 ml de agua peptonada, y 0,1 ml de cada dilucin es vertido en la placa de agar nutritivo. Despus de incubar, solamente las placas de agar preparadas de la dilucin del tubo 4 tiene entre 30 y 300 colonias. Las 35 colonias en la placa de agar representan el nmero de bacterias en 0,1 ml de este tubo de dilucin. As el tubo 4 contiene 350 UFC/ml (35 UFC X 0.1 ml X 10) = 350 UFC/ml, y al multiplicar ese resultado por el inverso de la dilucin, esto es, 104, esto da como resultado, 3 500,000 UFC/ml o lo que es lo mismo que 3.5 X 106 UFC/ml, lo cual es el nmero de clulas que contiene la suspensin original.