PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD DE LOS MATERIALES DENTALES

Martha Cardona Laura Infante Sandra Rojas

INTRODUCCIN La Odontologa como ciencia mdica se enfoca tanto en la prevencin de enfermedades, como en la restauracin de la funcin y la esttica de los pacientes; para ello es necesaria la utilizacin de diferentes materiales cuya seleccin depende del tipo de restauracin y de las caractersticas y propiedades de los mismos materiales a usar, mas las condiciones de los tejidos de soporte. No est de ms mencionar que estos materiales deben ser considerados Biomateriales Dentales, puesto que ellos interactan con tejidos vivos produciendo modificaciones en los mismos o en su defecto los fluidos bucales generen cambios en las propiedades de los materiales que puedan llevar al fracaso del tratamiento. Para evitar tales eventos indeseados se establece el estudio de la biocompatibilidad de los materiales dentales que busca no solo determinar los factores que puedan alterarse en los componentes de los materiales, sino tambin la interaccin que estos puedan tener con el medio oral. Adicionalmente la biocompatibilidad en la actualidad ha adquirido gran relevancia en los aspectos ticos, tcnicos, legales y sociales que se desarrollan conjuntamente al tratamiento.

DEFINICIN La propiedad ms importante de los biomateriales es la BIOCOMPATIBILIDAD. Existen muchos conceptos de biocompatibilidad que definen una habilidad, capacidad de los materiales de uso odontolgico para actuar con una respuesta biolgica favorable al interactuar con las estructuras de la cavidad oral en una aplicacin especfica. La Biocompatibilidad de los materiales utilizados en Odontologa para cualquier tipo de procedimiento, debe asegurar un procedimiento que no genere lesiones en el paciente tanto a nivel local como a nivel sistmico. La biocompatibilidad de los materiales varia con el tiempo y en nivel de exposicin a determinados factores locales, por lo tanto se entiende que esta es un proceso dinmico. La ventaja de la Odontologa actual son los procedimientos estticos que cada vez estn removiendo del ejercicio materiales de aleaciones metlicas. Los materiales deben interactuar mnimamente con el husped, ser inertes, con el fin de lograr una alta resistencia a la disolucin por el medio hmedo, no libere solutos txicos tanto a nivel local como sistmico y prevenir efectos citotxicos, neurotxicos y hasta bioenergticos. Los biomateriales los hay de diferentes naturalezas.

Polimrica: Como nylon, dacron, tefln, silicona que son de baja densidad, baja resistencia mecnica y degradacin con el tiempo (que puede incrementar con su permanencia en un medio hmedo y funcional). Metlica: Como acero, titanio, con buena resistencia al impacto y al desgaste, baja biocompatibilidad por la corrosin y alta densidad. Cermica: Tiene buena compatibilidad, resistencia a la corrosin e inercia qumica, no es resistente al impacto, no es elstica, tiene alta densidad y es de difcil produccin. Nanocompositos: Cermicas de metal-carbono o metal-nitrgeno pero son de alto costo.

PERSPECTIVA HISTORICA: Desde la poca de Hipcrates el concepto de tratamiento tico se ha instaurado y sigue vigente pero las pruebas que aseguran la compatibilidad de los materiales dentales es relativamente reciente. Para la aprobacin de un material dental durante el siglo XIX, las pruebas eran realizadas directamente sobre el paciente como ejemplo de este se encuentra el metal fusible de FOX , quien desarrollo dicho elemento con contenido de plomo y estao; el cual era fundido y colocado en la cavidad del paciente con temperaturas de hasta 100C. BLACK tambin realizo pruebas de materiales utilizados para la restauracin dental entre las cuales se encuentran las amalgamas. El manejo tico del paciente se viene estudiando desde hace 30 a 40 aos aproximadamente. Todos estos aos han podido concluir que el uso de pacientes como sujetos de pruebas de materiales sin conocer sus implicaciones biolgicas no es tico, ni legal. Tanto incide esto, que en los aos 60 este tipo de pruebas adquieren una connotacin poltica cuya finalidad es proteger al paciente. Como consecuencia de estos hechos nuevos productos aparecieron en el mercado. Las pruebas en nuestra actualidad estn reguladas por: Food and Drug Administration (FDA) o tambin conocida como la organismo para el control de alimentos y medicamentos. American National Standards Institute (ANSI) American Dental Association (ADA) Organizacin internacional de Normalizacin (ISO) En los ltimos 40 aos las pruebas biolgicas han evolucionado y las reacciones se daban empricamente en modelos de animales, posteriormente se utilizaron premolares extrados con fines ortodnticos. A medida que se desarrollaron tcnicas de cultivo celular, la investigacin se centro en la respuesta biolgica de los materiales. En la ltima dcada se han desarrollado nuevas tcnicas moleculares, biolgicas y de imgenes para complementar nuestros conocimientos.

CONCEPTOS GENERALES: La biocompatibilidad es un proceso dinmico, continuo donde hay interaccin entre el cuerpo y el material, la colocacin del material en el cuerpo crea una interfase que no est presente. La interaccin del biomaterial con los fluidos orales permite la formacin de una pelcula de iones, protenas y glicoprotenas que no deben alterar el medio ambiente oral. Como el proceso es dinmico, el material como el organismo pueden alterarse. La dinmica de estas interacciones determinar la respuesta biolgica al material, la capacidad del material para resistir la corrosin o degradacin en el cuerpo. Debido a que la interfase biolgica esta activa se cree que ningn material es inerte, la actividad de la interfase depende de la situacin del material, de su duracin en el cuerpo, de sus propiedades y de la salud del paciente. Los procesos de adhesin por ejemplo permiten trabajar a una proximidad exagerada del complejo dentinopulpar y por lo tanto debe ser inocuo. El biomaterial debe presentar respuesta celular, microbiana y del husped que no impida la agregacin, divisin, respuesta y migracin celular; entonces su integracin al medio debe lograr: camuflaje, funcionalidad y confort. Y los procedimientos deben disminuir la invasin, una textura mas tersa, disminuir la filtracin marginal, dar una base intermedia y una proteccin pulpar teraputica. La biocompatibilidad puede ser comparada con la propiedad del color en un objeto, puesto que este vara segn la fuente de luz al que sea expuesto, el material del que este elaborado el objeto, la capacidad de interpretacin del observador ante tales factores, el color por consecuencia puede variar.

El color del objeto percibido cambia segn la posicin del observador y la fuente de luz.

REQUISITOS DE LOS MATERIALES DENTALES: Los materiales de uso odontolgico deben cumplir con requisitos de Biocompatibilidad, entre estos se cuentan: No deben ser irritantes para la pulpa y los tejidos blandos. No deben contener sustancias txicas difusibles que puedan ser liberadas y absorbidas en el sistema circulatorio y causar respuesta txica generalizada. Deben estar libres de potenciales sensibilizantes que puedan causar respuestas alrgicas. No deben tener potencial carcingeno. No deben generar reacciones inmunolgicas.

CLASIFICACIN DE LOS MATERIALES DENTALES SEGN LA INTERACCIN CON EL TEJIDO: Para poder comprender con ms claridad la importancia de las pruebas de biocompatibilidad, es necesario clasificar los materiales de uso odontolgico segn la interaccin (directa o indirecta) que tienen con el tejido o componente biolgico: Tipo 1: materiales que no entran en contacto con la cavidad oral. Tipo 2: se incluyen materiales que entran en contacto con las mucosas orales. Tipo 3: se cuentan aquellos materiales que interactan con la pulpa o los tejidos adyacentes. Tipo 4: materiales usados para obturar y tratar conductos. Tipo 5: materiales que pueden afectar los tejidos duros dentales. RESPUESTA BIOLGICA Los biomateriales odontolgicos pueden producir diferentes tipos de efectos que van desde lesiones leves tales como inflamaciones reversibles, alergias, hasta efectos graves tales como toxicidad, necrosis o mutacin. Factores locales de la cavidad oral como tiempo de exposicin en boca, fuerzas aplicadas a corto, mediano y largo plazo para obtener respuestas biolgicas, pueden afectar el potencial citotxico del material utilizado. No solo los efectos se generan como respuesta del material ante las condiciones orales, los tejidos biolgicos tambin producen alteraciones que se ven relacionadas por la interface entre el material y la estructura, dentro de estas se debe tener en cuenta tejido periodontal, morfologa y anatoma dental, zona periapical, permeabilidad de los tejidos dentales, condiciones ambientales bacterianas, las cuales pueden incidir favorable o desfavorablemente en las propiedades y biocompatibilidad del material. Para determinar cmo se presentan estas interacciones, antes de la utilizacin de los productos es necesario aplicar diferentes tipos de pruebas de biocompatibilidad. PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD Las pruebas de biocompatibilidad las ha clasificado Langeland con este esquema, el cual fue adoptado como Reporte tcnico 7405 en 1984, que consista de tres etapas: Pruebas iniciales o primarias: las cuales determinarn citotoxicidad y potencial carcinognico del material, estas pruebas se desarrollan in vitro o in vivo Pruebas secundarias o intermedias: las cuales se realizan en aquellos productos que han pasado la prueba inicial, estas se aplican para determinar el potencial inflamatorio e inmunogeno. Estas aplican en pruebas in vivo Pruebas terciarias o de uso: estas se aplican a los productos realmente prometedores los cuales deben cumplir las mismas caractersticas en animales como en humanos.

IN VITRO

IN VIVO

PRUEBAS DE USO

Citotoxicidad:

1. # de crecimiento celular. 2. Permeabilidad de la membrana celular. 3. Biosntesis enzimtica: DNA, MTT. 4. Pruebas indirectas (uso de barreras). 5. Pruebas de Barrera dentinal.

Irritacin de mucosas Sensibilidad cutnea Implantacin

En animales En humanos

Mutagnesis y carcinognesis:

1. AMES 2. STYLES

Investigadores reconocen que la manera ms eficiente, econmica y relevante para evaluar la biocompatibilidad de los materiales es realizando estudios que combinen los tres grandes grupos y deben aplicarse a todos los materiales para ser aprobados del uso en boca.

El nmero de pruebas disminuye con la progresin de las distintas etapas, los materiales no aceptables son eliminados desde etapas tempranas.

I. PRUEBAS IN VITRO INICIALES O PRIMARIAS: Estas se inician en laboratorio cultivando fibroblastos observando su lisis y disminucin en la divisin celular, se realizan en tubos de ensayo o placas de cultivo por fuera de un organismo vivo, se coloca el material en contacto directo con poblaciones celulares o bacterias, sirve para mirar el grado de citotoxicidad, crecimiento celular, funciones metablicas de la clula y el efecto del material sobre el material gentico de la clula (mutagnesis). Las clulas utilizadas son las clulas primarias y continuas; las continuas son ms estables gentica y metablicamente que las clulas primarias, las cuales son tomadas de tejido animal crecen durante un periodo corto de tiempo y mantienen las caractersticas in-vivo.

Ventajas de esta prueba: Rpida Fciles de realizar Menos costosa Desventajas: Las clulas provienen de un solo individuo. Resultados poco fiables sobre la respuesta biolgica del material.

1. PRUEBAS DE CITOTOXICIDAD Esta prueba evala el efecto de los materiales sobre diferentes poblaciones celulares midiendo el nmero o crecimiento celular luego de la exposicin a los materiales. Adems estas pruebas determinan daos a nivel de la membrana celular, biosntesis o actividad enzimtica y el material gentico.

a. NMERO Y CRECIMIENTO CELULAR Cuando se hace esta prueba el material es colocado directamente en contacto con un cultivo celular de agar. Si el material no es citotxico, las clulas permanecen en contacto con el material y continan creciendo normalmente, por otra parte, si el material es citotxico, el crecimiento celular se detiene y se observar un halo de inhibicin alrededor del material. Estas pruebas tambin son utilizadas para medir la capacidad antimicrobiana de los materiales sobre microorganismos patgenos. Con estas pruebas aplicadas a materiales endodnticos se ha demostrado que algunos muestran una elevada capacidad antibacteriana, otros frecuentemente inducen efectos adversos severos durante y despus del tratamiento endodntico, adems de ser citotxicos y mutagnicos.

Cultivo de Agar

b. PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA Esta prueba mide la citotoxicidad de un material evaluando los cambios en la permeabilidad de membrana celular una vez las clulas han sido expuestas al material odontolgico. Esto se

realiza observando la facilidad con que un colorante pueda atravesar la membrana celular, se basa en que la prdida de la permeabilidad de la membrana es equivalente a un dao celular severo o a la muerte celular. La gran ventaja de estas pruebas es que identifican tanto clulas vivas como muertas, esto es importante debido a que las clulas pueden estar fsicamente presentes pero muertas. Hay dos tipos de tintes para realizar estos ensayos: Colorantes Vitales como el Cromo 51 (Na51CrO4) y Rojo Neutro (RN) estos son transportados activamente al interior de la clula y quedan retenidos cuando la clula est vital y el material que est en prueba no ha generado un efecto citotxico sobre la clula. Por otra parte, si el material es citotxico, el colorante sale del interior de la clula, indicando as muerte celular. Colorantes No Vitales como el Tripan Azul que no son transportados activamente al interior de una clula viva; si el material es citotxico y genera daos a nivel de la membrana celular, ocasiona que el colorante sea transportado al interior de la clula indicando muerte celular.

Permeabilidad selectiva de celula con membrana intacta a colorantes vitales y colorantes no vitales se difunden a travs de membrana celular lesionada

c. BIOSNTESIS ENZIMTICA Algunas pruebas in Vitro utilizan la actividad biosntesis enzimtica de las clulas para evaluar la respuesta citotxica; miden la sntesis de DNA o la sntesis proteica, agregando precursores de radioistopos marcados (3H-timidina o 3H-leucina) al cultivo celular estos se incorporan al DNA o protena para ser posteriormente cuantificados. De esta forma se determina la influencia del biomaterial en prueba sobre la sntesis de protenas en un cultivo celular. Otra prueba es el ensayo MTT que mide la citotoxicidad del material de prueba por la actividad de la deshidrogenasa celular. No requiere radioistopos. La deshidrogenasa celular convierte el MTT (molcula amarilla y soluble) en Formazan (molcula azul e insoluble) por medio de diferentes agentes reductores; cuando la deshidrogenasa esta inactiva por el efecto citotoxico del material de prueba, no se formara Formazan. El Formazan producido es directamente proporcional al nmero de clulas viables.

CRAIG, R. Materiales de Odontologa restauradora. Ed. Harcourt Brace. 11 edicin. Pg.. 137. La deshidrogenasa celuar convierte la molecula MTT por agents reductores, en Formazan

d. PRUEBAS INDIRECTAS (Uso de Barreras) En la mayora de las pruebas de citotoxicidad, el material entra en contacto directo con los cultivos celulares. Investigadores reconocen que In vivo, existe poco contacto directo entre las clulas y el material, esto debido a la presencia de un epitelio queratinizado, dentina o matriz extracelular. Un ejemplo de ensayos indirectos es Mtodo de cubierta de Agar. El Agar forma una barrera entre las clulas y el material dental, el cual es colocado encima del agar. Nutrientes, gases y sustancias txicas solubles pueden difundirse a travs del agar, si el material es citotxico, las clulas sern lesionadas y el rojo neutro ser liberado, dejando as una zona de inhibicin de crecimiento celular.
GUESS, W. Agar difussion method for toxixity screening of plastics on cultured cell monolayers. J. Pharm Sci 54:1545,1965 Si el material e citotoxico, las clulas lesionadas liberan el rojo neutro y hay una zona de inhibicin.

e. PRUEBAS DE BARRERA DENTINAL Muchos estudios han demostrado que la dentina forma una barrera por la cual atraviesan sustancias txicas que logran lesionar el tejido pulpar, por este motivo se han ideado ensayos que utilizan discos de dentina como barrera entre el material y el cultivo celular, la finalidad de este es determinar la capacidad de filtracin del material a travs del tejido dentinal que como consecuencia pueda producir irritacin o inflamacin pulpar.

La dentina es una barrera por la que atraviesan sustancias toxicas que lesionan la pulpa. Atlas del Diente. Universidad Federal de Paraiba.

2. PRUEBA DE MUTAGENESIS O PRUEBA DE AMES Esta prueba recibe su nombre por su creador Bruce Ames, para esta prueba se usan bacterias como la Salmonella Typhurium mutantes que requieren de histidina exgena (las bacterias nativas no necesitan histidina exgena); los materiales a estudio se colocan en el interior de estas cajas y se incuban; al anlisis se determina si el biomaterial tiene la habilidad de convertir clulas mutantes en clulas nativas cuando se excluye la histidina exgena; entonces entre mayor sea el nmero de bacterias mutantes convertidas en nativas mayor ser el potencial de mutagenicidad del material. Hay muchos mecanismos por los que un material puede afectar el material gentico de la clula: MUTAGENOS GENOTOXICOS afectan el DNA pero no son cancergenos, pueden ser mutagnicos en estado nativo o requerir biotransformacion, entonces se llaman PROMUTAGENOS.
El material tiene la habilidad de convertir clulas mutamtes en nativas, por la exclusin de Histidina exogena

3. PRUEBA DE STYLES O CARCINOGENESIS Utiliza cultivos celulares de fibroblastos nativos que no crecen en agar blando, pero los fibroblastos genticamente transformados s. Entonces los fibroblastos nativos se ponen en contacto con el material dental en un medio de Eagle, despus de un tiempo determinado los fibroblastos son puestos en gel de agar y si el crecimiento celular es positivo, quiere decir que las clulas fueron transformadas a cepa mutante y por lo tanto el material en prueba es potencialmente cancergeno. MUTAGENOS EPIGENETICOS no alteran directamente el DNA, pero favorecen el crecimiento tumoral, porque alteran la bioqumica celular son CANCERIGENOS
STYLES, J. Tissue culture methods of evaluating biocompatibility of polymers, 1981. Vol. 2. CRC Press. Fibroblastos capaces de crecer en agar, por exponerse al material con potencial cancerigeno

Carcinognesis se denomina como la capacidad del material dental para producir neoplasia In Vivo. Esta se determina mediante el anlisis del material gentico celular de las pruebas. Por lo tanto los mutagenos pueden o no ser carcinognicos y los carcinognicos pueden o no ser mutagenos.

tomada de http://www.sandia.gov/newscenter/news-releases/2005/images/ mitopic.jpg Diferencias estructurales entre las celulas

Celula normal Celula cancerigena II. PRUEBA IN VIVO EN ANIMALES PEQUEOS O INTERMEDIAS O SECUNDARIAS: Se realizan directamente sobre mamferos como ratones, ratas, hmsteres y conejillos de indias, aunque se utilizan muchos otros animales. Se mide la alteracin en la funcin heptica y el aumento en la induccin tumoral por una reaccin qumica. Estas pruebas permiten interacciones entre el biomaterial de prueba y un sistema biolgico funcional, generando una respuesta inmune o del sistema complemento que no se logra en las pruebas in vitro. Involucra aspectos ticos-legales, son demoradas y costosas.

tomada de www.boulesis.com/bioetica/conclusion/Mostrando un estudio in vivo realizado en una rata

a. PRUEBA DE IRRITACIN DE MUCOSAS Determina si un material puede generar inflamacin a nivel de mucosas o piel erosionada. El ensayo se realiza colocando el material a evaluar, adems de los controles positivos (+) y negativos (-) sobre la mejilla de un animal, en estos casos se utilizan preferiblemente animales pequeos. Luego de varias semanas de estar en contacto con el material los animales son fotografiados y luego sacrificados para llevar a cabo los respectivos estudios histopatolgicos del tejido y as determinar finalmente la respuesta inflamatoria que gener el material.
Se coloca el material a evaluar sobre la mejilla de un animal, los animales son fotografiados y posteriormente sacrificados para estudios histopatolgicos.

b. PRUEBA DE SENSIBILIZACIN CUTNEA Estos ensayos evalan si un material genera una respuesta inflamatoria ya sea con eritema, edema o puede no generar respuesta alguna. Se llevan a cabo inyectando el coadyuvante de

Freund(que potencializa la respuesta) y luego el biomaterial de forma intradrmica o en parches adhesivos para crear una respuesta de hipersensibilidad de la piel. Se observa la respuesta que se genere en los tejidos que puede ser desde muy leve hasta muy severa con enrojecimiento intenso e inflamacin. El grado de respuesta y el porcentaje de animales que presentaron la reaccin son la base para estimar el grado de alergenicidad de un biomaterial.

Se inyecta el coadyuvante de Freund que potencializa la respuesta luego parches adhesivos que contienen el material que se est examinando y se observa la respuesta que se genere sobre los tejidos.

c. PRUEBA DE IMPLANTACIN Estos ensayos sirven para evaluar los materiales que entrarn en contacto con tejidos subcutneos o hueso, ya que determinan la alergenicidad, inflamacin crnica o formacin de tumores. El implante es colocado dependiendo de los tejidos que entren en contacto con el material durante su uso clnico (por ejemplo tejido conectivo, hueso o msculo). La mayora de estas pruebas se llevan a cabo en materiales que entren en contacto directo con tejidos blandos como son los implantes dentales, materiales utilizados en endodoncia y en periodoncia, aunque la amalgama y ciertas aleaciones son evaluadas tambin ya que entran en contacto con tejido gingival en algunas restauraciones. Hay pruebas a corto plazo (1 a 11 semanas) para luego evaluar el tejido por mtodos de histoqumica e inmunohistoquimica y largo plazo (1 a 2 aos) para identificar inflamacin crnica o formacin de tumores

Se implantan los Tubos de polietileno abiertos con el material y luego de un periodo de tiempo se evala la respuesta que gener el material sobre los tejidos.

III. PRUEBA DE USO Son estudios clnicos esenciales de un material ya que son las ms relevantes de todas y se diferencian de otros ensayos en animales porque en este caso el material debe ser utilizado bajo las condiciones idnticas a las de su futuro uso clnico.

Pruebas de Irritacin Pulpar En algunas ocasiones se hace indispensable su estudio en humanos para ello se eligen cavidades clase V de premolares indicados para extraccin, una vez transcurrido de 1 a 8 semanas de estudio se determinan pruebas de sensibilidad y posteriormente se realizan extracciones atraumticos, estas muestras son debidamente analizadas para determinar lesiones pulpares, respuestas inflamatorias, produccin de dentina reparativa y terciaria entre otros. Se extraen los dientes, se seccionan y por un fotomicrometro se evala el grosor de dentina remanente y reparativa tanto como las respuestas inflamatorias como necrticas, basndose en su apariencia, disrupcin del tejido y nmero de clulas inflamatorias crnicas y agudas. Existen muchas variantes que se deben considerar cuando se realizan pruebas de irritacin pulpar, como por ejemplo: el mtodo de preparacin, la condicin de la pared de dentina remanente, la presencia de bacterias, el mtodo de aplicacin del material restaurativo. La respuesta inflamatoria puede ser:

Leve: se observa poca hiperemia del tejido, pocas clulas inflamatorias y ligera hemorragia en la zona odondoblstica. Moderado: hay un aumento considerable de clulas inflamatorias, hiperemia y una ligera desorganizacin de la capa odondoblstica Severa: se observa un marcado infiltrado de clulas inflamatorias, hiperemia, desorganizacin completa de la capa odontoblstica en la zona de la preparacin cavitaria, reduccin o ausencia de la predentina y en algunos casos abscesos localizados.

Al igual que en procesos cariosos, las clulas mononucleares son usualmente ms prominentes en respuestas inflamatorias. Si hay presencia de neutrfilos, se debe sospechar la presencia tambin de bacterias o productos bacterianos. La mayor parte de estos estudios han sido realizados en dientes sin caries con tejido pulpar sano o intacto. Actualmente se reconoce el hecho de que el tejido pulpar inflamado responde de forma diferente que el tejido pulpar sano a las bases cavitarias, los cementos y agentes restaurativos, por lo que se han hecho esfuerzos para crear tcnicas que logren identificar las diferentes respuestas generadas por los tejidos pulpares en distintos estados.

CORRELACION ENTRE LAS PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD: Las pruebas iniciales y secundarias son inespecficas porque no reflejan la aplicacin clnica, las pruebas terciarias son especficas por el uso de modelos biolgicos en donde se intenta simular el uso clnico del material (Autian).

El estudio de la biocompatibilidad Autian lo esquematiz en tres niveles, mostrando como el nmero de pruebas disminua con la progresin de las distintas etapas, los materiales no aceptables eran eliminados desde etapas tempranas.

Hay nuevos esquemas que reconocen la necesidad de usar varios tipos de pruebas al tiempo y tratan la biocompatibilidad como un proceso continuo.

El nuevo esquema para las pruebas de biocompatibilidad reconoce la necesidad de usar varios tipos de pruebas al tiempo y tratar la biocompatibilidad como un proceso continuo.

En el ltimo tiempo ha habido desarrollo y perfeccionamiento de las pruebas in Vitro, principalmente la preocupacin de los profesionales de la salud ante el aumento de las demandas por responsabilidad profesional y la promulgacin de distintas normas y reglamentos que buscan un desarrollo tecnolgico que permitan un bienestar humano que no se d a expensas del maltrato a otras especies. BIBLIOGRAFIA JOHN C. WATAHA, Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry, agosto 2001 p203-209. Anusavice K. J. La Ciencia de los Materiales Dentales de Phillips. 10 edicion, Mexico, McGraw-Hill Interamericana, 1996. Macchi R. L. Materiales Dentales. 3 edicion, Mexico, Editorial Medica Panamericana, 2000. SCHMALZ. Concepts in biocompatibility testing of dental restorative materials, Clin. Oral Invest. 1997, 1:154-162.