TCNICAS DE CLONACIN IN VITRO PARA CONFERAS Y LATIFOLIADAS

El concepto de CLON
Grupo de clulas o de organismos genticamente idnticos, originados a partir de una nica clula u organismo por reproduccin asexual, por divisin artificial de estados embrionarios iniciales o por transplante nuclear.

Grupo de plantas genticamente idnticas, obtenidas todas ellas por propagacin vegetativa de un individuo seleccionado.

El concepto de CLONACION
Clonacin de genes: tcnica que consiste en multiplicar un fragmento de ADN recombinante en una clula-husped (generalmente una bacteria o una levadura) y aislar luego las copias de ADN as obtenidas. Clonacin molecular: insercin de un segmento de ADN ajeno, de una determinada longitud, dentro de un vector que se replica en un husped especfico. Clonacin celular: proceso de multiplicacin de clulas genticamente idnticas, a partir de una sola de ellas.

Clonacin individual: proceso de multiplicacin o masificacin de un genotipo completo mediante tcnicas que utilicen todo o parte de una planta (clulas, tejidos, rganos).

WHAT IS CLONING?
Cloning BEARS - PANDAS CATS COWS DEER EXTINCT SPECIES GOATS HORSES HUMANS INSECTS MICE - RATS MULES PIGS SHEEP TREES

POR QU CLONAR, SI LOS ARBOLES SE REPRODUCEN FCILMENTE POR SEMILLAS? Y ADEMS, LOS GENETISTAS Y BIOTECNLOGOS COBRAN CARO !

PORQUE HAY RIESGOS...

CONCLUSION?

PROPAGACIN DE LEOSAS
Sexual
- Cruzamiento libre - Cruzamiento controlado

Asexual

Micropropagacin

Macropropagacin

Semilla Mejorada Semilla Artificial

Cultivo in vitro

Cuttings Acodos Injertos

Embriognesis somtica

Hijuelos, etc.

PLANTAS ARBOLES DE MAXIMA PRODUCTIVIDAD

ENTONCES? :
CLONACIN DE INDIVIDUOS SELECTOS
Cuttings TCNICAS MACRO TISULARES: Acodos Injertos Hijuelos, etc.

Micropropagacin de porciones de tallos, hojas, races, etc. Cultivo de meristemos. Cultivo de polen (andrognesis) Cultivo de protoplastos Cultivos celulares en suspensin

TCNICAS MICRO TISULARES:

Bioreactores
Hibridacin, Fusin de protoplastos

Cultivo de tejidos vegetales Cultivo in vitro:

Micropropagacin de porciones de tallos, hojas, races, etc. Cultivo de meristemos. Cultivo de polen (andrognesis) Cultivo de protoplastos Cultivos celulares en suspensin Bioreactores Hibridacin, Fusin de protoplastos

EJEMPLOS?
Cultivo de meristemos Microinjertos
Propagacin clonal y saneamiento del material vegetal (i.e.: eliminacin de virus).

Cultivo de pices caulinares Cultivo de yemas axilares Morfognesis directa Semilla artificial

Reproduccin vegetativa.

Cultivo de anteras y esporas Cultivo de vulos Cultivo de embriones haploides

Obtencin de lneas puras (mtodo haplo-diploide).

Seleccin celular Seleccin somaclonal

Aprovechamiento de la variacin somaclonal (variacin intraespecfica)

Fusin de protoplastos: - Hibridacin somtica - Hibridacin gametosomtica Cultivo de embriones zigticos

Aprovechamiento de la variacin interespecfica.

Transformacin gentica - T.G. va Agrobacterium - T.G. Biolistic, electroporacin, transformacin de protoplastos, microinjeccin, etc.).

Transferencia de genes (Variacin intraespecfica e interespecfica)

BIOTECNOLOGA FORESTAL v/s MEJORA

SER VIVO

GENOMA

LOCI

GEN

MEJORADOR DE PLANTAS

Muchos rboles, familias, sitios, tiempo, objetivos de produccin. Selecciona para un rasgo dado, el gen ms adecuado

Seleccin:

mejor grupo de rboles

BIOTECNOLOGO

Aade genes en distintos loci para objetivos determinados

Seleccin: mejor genotipo

ALTERNATIVAS PARA EL BIOTECNOLOGO?

ESCASAS !
HIBRIDACION VIA CRUZAS

O BIEN

TOTIPOTENCIA CELULAR

GRADO DE DETERMINACIN CELULAR

PROPAGACIN VEGETATIVA O ASEXUAL

ESTADO FISIOLGICO DEL MATERIAL BASE

CAPACIDAD MORFOGNICA

EXPRESIN DE LA TOTIPOTENCIA

ORGANOGNESIS

EMBRIOGNESIS SOMTICA

DIRECTA

INDIRECTA

DIRECTA

INDIRECTA

Organognesis

Conduce a la diferenciacin de meristemos caulinares y/o radiculares que originan tallos o races adventicias, respectivamente.

Propagacin vegetativa va cultivo in vitro

Conduce a la formacin de embriones somticos siguiendo las fases Formacin de del embrin cigtico (globular, corazn, torpedo, cotiledonar) aunque sin fecundacin.
Embriognesis Somtica

ETAPAS ORGANOGNESIS
Establecimiento

Proliferacin
Elongacin Enraizamiento

CAULOGNESIS

RIZOGNESIS

Aclimatacin

VENTAJAS
ALTAS TASAS DE PROLIFERACIN PRODUCCIN TODO EL AO

ORGANOGNESIS

PRODUCCIN RPIDA. PLANTAS HOMOGNEAS, VIGOR

PLANTAS LIBRES DE PATGENOS

RPIDAS GANANCIAS PRODUCTIVAS PRODUCCIN DE MADERA MS HOMOGNEA ARCHIVO GENTICO

Organognesis a partir de embriones (P. radiata)

Organognesis a partir de embriones (P. radiata)

Organognesis a partir de embriones (C. sativa)

Hasbn, R. 2004

Organognesis de tejido adulto (E. nitens)

Organognesis de tejido adulto (Q. saponaria)

Organognesis de tejido adulto (Q. saponaria)

EXPERIENCIA DE CLONACION DE RAUI ADULTO

Establecer metodologas de cultivo in vitro de material adulto evaluando tipo de tejido a introducir (yemas y hojas) y respuesta de induccin morfognica (organognesis y/o embriognesis somtica).
SECUENCIA OPERACIONAL. Base Copa

Material adulto de N. alpina

Formacin de zonas meristemticas y origen multicelular de los brotes adventicios.

100 um

- Existe conexin con el tejido materno (callo).

- En un punto indiferenciado comienza el ordenamiento del tejido vascular con la evidente presencia de elementos conductores en los nuevos brotes.

EMBRIOGNESIS SOMTICA
Multiproceso a travs del cual clulas vegetales somticas indiferenciadas originan embriones normales sin conexin vascular al tejido de origen.

FACTORES QUE AFECTAN LA INDUCCIN Y GENERACIN DE EMBRIONES SOMTICOS

TIPO EXPLANTO

MEDIO CULTIVO

AMBIENTE

EMBRIOGNESIS SOMTICA
VENTAJAS
Sistema de propagacin masiva. Clonacin genotipos selectos. Generacin de ambos polos de desarrollo (raz y tallo). Automatizacin del proceso mediante cultivo lquido. Criopreservacin de los e.Ss. Semilla artificial (facilidad de manejo). Regeneracin de plantas transformadas genticamente.

EMBRIOGNESIS SOMTICA

LIMITACIONES
Difcil induccin desde tejido adulto. Efecto del genotipo. Afinamiento protocolos de cultivo. Germinacin asincrnica. Embriones somticos con anormalidades. Variaciones somaclonales.

INDUCCIN EMBRIOGNICA
CLULAS COMPETENTES

REQUERIMIENTOS

AMBIENTE ADECUADO ESTMULO (ESTRS)

ES INDIRECTA ES DIRECTA

REDETERMINACIN DE CLULAS DIFERENCIADAS CLULAS PROEMBRIOGNICAS

ORIGEN UNI O MULTI CELULAR?

EXPRESIN EMBRIONARIA

* ORGANIZACIN ESPACIAL
* GENERACIN DE DIVERSIDAD CELULAR

AUTONOMA (RESPECTO AL TEJIDO MADRE) BIPOLARIDAD APARICIN DE BANDAS PROCAMBIALES

MADURACIN EMBRIONARIA

* EXPANSIN CELULAR
* ACUMULACIN SUSTANCIAS DE RESERVA

PROCESO ANLOGO A EMBRIOGNESIS CIGTICA REPRESIN DE LA GERMINACIN TOLERANCIA A LA DESHIDRATACIN EN OCASIONES SON NECESARIOS TRATAMIENTOS POSTMADURACIN

ABA

ESTRS OSMTICO
MADURACIN E. S.

ETILENO

pH

FOTOPERODO

GERMINACIN Y CONVERSIN
DESARROLLO DE LA RAZ Y BROTE CAULINAR GENERALMENTE OCURRE SIN REGULADORES DE CRECIMIENTO SE DEBE TENER PRESENTE SEMEJANZA AL PROCESO NATURAL EL CRECIMIENTO DE PLNTULAS DERIVADAS DE E.S. SE ENCUENTRA BAJO LA INFLUENCIA ACUMULATIVA DE UNA SERIE DE TRATAMIENTOS PREVIOS

MORFOLOGA NORMAL ?

REQUISITOS PARA CONVERSIN A PLANTA...

SUFICIENTE ACUMULACIN DE SUSTANCIAS DE RESERVA

TOLERANCIA A LA DESHIDRATACIN

FACTORES QUE AFECTAN LA INDUCCIN Y GENERACIN DE EMBRIONES SOMTICOS

TIPO EXPLANTO

MEDIO CULTIVO

AMBIENTE
Volumen del recipiente, medio lquido/slido, pH, ventilacin recipientes, etc. Temperaturas, HR, fotoperiodo, etc.

EMBRIOGNESIS SOMTICA
Directa

Indirecta
Recurrente

ESTUDIO DE CASO:

EMBRIOGENESIS SOMTICA RECURRENTE EN RAUL

(Nothofagus alpina)

MARCO DE REFERENCIA DE LA INVESTIGACION

CARACTERIZACIN PROCESO EMBRIOGNICO

EMBRIOGNESIS SOMTICA RECURRENTE

PROTOCOLO EMBRIOGNESIS SOMTICA

CARACTERIZACIN MOLECULAR LNEAS EMBRIOGNICAS CARACTERIZACIN MOLECULAR LNEAS CALLOGNICAS

Categora 1

Categora 2
Tercera Semana

Categora 3

En Presencia de Hormonas

En Ausencia de Hormonas

Encapsulado de embriones somticos

Resultados

Germinacin y conversin a planta de un embrin cigtico encapsulado en alginato de sodio al 3%.