UNIVERSIDAD EARTH

CUANTIFICACIN DE LA COMPOSICIN MICROBIOLGICA DE CUATRO ABONOS ORGNICOS USANDO EM (MICROORGANISMOS EFICACES) COMO NDICE COMPARATIVO

Por

LISANDRO JOS NIEVES

Trabajo de graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de INGENIERO AGRNOMO Con el grado de LICENCIATURA

Gucimo, Costa Rica Diciembre, 2005

Trabajo de graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de Ingeniero Agrnomo con el grado de Licenciatura

Profesor Asesor

____________________________ Moiss Soto Ballestero, Ing. Agr.

Profesor Asesor

____________________________ Vctor Quiroga G., Ph. D.

Decano

____________________________ Marlon Brev Reyes, Ph. D.

Candidato

____________________________ Lisandro Jos Nieves

Diciembre, 2005

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DEDICATORIA A mi madre Mara Nieves, una mujer muy especial, por su lucha incansable en forjar el mejor futuro para sus hijos e hijas. Mam te doy gracias por todo el amor que me has brindado y la entrega que has tenido hacia tus hijos e hijas. A mis hermanos, hermanas y Salvador, quienes me han apoyado en todos los momentos de mi vida. Que Dios los colme de bendiciones y felicidad. A mis sobrinos y sobrinas, por ser fuentes de inspiracin y alegra. Ustedes son el motor que mueve esta gran familia que somos. Que Dios los bendiga. A mi gente de El Bal, pueblo grande y generoso donde me cri, pueblo de gente buena. Para ustedes amigos y amigas, quienes me han dado su apoyo sincero.

AGRADECIMIENTO A mi Dios todo poderoso, gracias te doy por tu bendicin y proteccin sagrada. Por las oportunidades que me has otorgado en la vida, mil gracias. A mi donante, Moore Family Fundation, les agradezco por su apoyo financiero, por ser visionarios del progreso y creer en la misin y visin de la Universidad EARTH. Gracias por la oportunidad que me otorgaron. A la Universidad EARTH, agradezco por la enseanza que me han brindado, y la oportunidad de ser un hijo de la tierra. Muchas gracias a su excelente equipo de directivos, Facultad y Funcionarios. A mis profesores asesores, don Moiss Soto y don Vctor Quiroga por su apoyo, sabidura y por brindarme la oportunidad de trabajar con ustedes. Y por haber sido actores principales de mi enseanza. Que Dios les brinde la oportunidad de seguir pregonando y transmitiendo sabidura y conocimientos por muchos aos ms. A mi gran familia, por ser los impulsores de mis proyectos, por estar a mi lado en cada momento y por creer en m. Que Dios los bendiga y est siempre con ustedes. A mis compaeros de clases, parrandas y aventuras, Roberto El Parce, Alfonso Poncho y Jerry mi compaero de cuarto, caballeros ha sido un placer haber compartido con ustedes esta enriquecedora experiencia. Que la vida les depare todas cosas buenas. A doa Yolanda Morera y familia, en Cariari, por su amable hospitalidad, atencin y cario brindado, que Dios la colme de bendiciones. A Marelyn Medina, donde quieras ests, mil gracias por motivarme y ayudarme a venir a EARTH. Era justo lo que necesitaba, que Dios te ilumine siempre.

Lisandro J. Nieves

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RESUMEN El propsito del estudio fue cuantificar el nmero de colonias de microorganismos presentes en cuatro abonos orgnicos para dos condiciones de humedad usando medios de cultivos de empleo generalizado y validando EM (Microorganismos Eficaces) como testigo para estimar los umbrales de colonias en los abonos. Para alcanzar tal objetivo se evaluaron los abonos orgnicos y el EM, implementando el mtodo de extensin en placa en medios de cultivo de agar nutriente (AN) y agar de papa dextrosa (APD). Los resultados obtenidos no reflejaron valores cuantificables en crecimiento de bacterias para los cuatro tipos de abonos orgnicos evaluados. Los ensayos presentaron una masa bacterial de colonias poco aisladas imposible de cuantificar. El EM (testigo) en cambio mostr valores de 1.21x1011 UFC/g de bacterias. El nmero de colonias de hongos, fue muy variable entre muestras, situacin que se relaciona a los porcentajes de humedad de cada muestra de abono. El EM no present crecimiento de hongos. No se logr obtener un porcentaje de humedad similar en los abonos que permitiera compararlos entre s ya que el mtodo de secado usado no fue eficiente. Por la variabilidad en porcentajes de humedad y nmero de UFC/g no se estableci comparacin alguna entre poblaciones de hongos. La comparacin entre poblaciones de microorganismos no fue efectiva debido a que no se cuantific un nmero total de bacterias. La investigacin deber repetirse haciendo ajustes en la metodologa para ubicar los posibles puntos crticos en el procedimiento. Adems, debe descartarse el EM y considerar un suelo natural de origen orgnico como testigo. Palabras claves: microorganismos, medios de cultivo, bokashi, compost,

vermicompost, EM (Microorganismos Eficientes). Nieves, CR. 2005. Cuantificacin de la composicin microbiolgica de cuatro abonos orgnicos usando EM como ndice comparativo. Proyecto de Graduacin. Lic. Ing. Agr. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 26 p.

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ABSTRACT The main purpose of this study was to measure microorganism colonies present in four organic fertilizers in two moisture conditions using general-use culture mediums and retesting EM (Efficient Microorganisms) as a control to estimate the colonies threshold in fertilizers. To reach these objectives, the organic fertilizers and EM were evaluated, implementing the extension method on medium cultures of nutrient agar (NA) and potato dextrose agar (PDA). The results obtained did not show measurable values in the bacterial growth in the four types of organic fertilizers that were evaluated. The trials presented a mass of bacteria colonies, poorly isolated and impossible to measure. The EM (control), however, showed values of 1.21x1011 CFU/g in bacteria. The number of fungal colonies varied in samples, which is correlated to the percentages in moisture of samples from each type of fertilizer. The EM did not present fungal development. It was not able to obtain similar moisture percentages in the fertilizers to make a comparison, since the drying method was not efficient. Due to variability in moisture percentages and the number of CFU/g, the comparison among fungal populations couldnt be established. The comparison between microorganism populations was not effective since bacterial populations were not measured. The investigation is to be repeated following methodology adjustments to locate the possible critical points in the procedure. Additionally, EM should be eliminated and natural organic soil should be considered as the control. Key words: microorganism, medium culture, bokashi, compost, vermicompost, EM (Efficient Microorganisms). Nieves, CR. 2005. Cuantificacin de la composicin microbiolgica de cuatro abonos orgnicos usando EM como ndice comparativo. Proyecto de Graduacin. Lic. Ing. Agr. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 26 p.

TABLA DE CONTENIDO Pgina DEDICATORIA ....................................................................................................... V AGRADECIMIENTO ............................................................................................. VII RESUMEN ............................................................................................................. IX ABSTRACT............................................................................................................. X LISTA DE CUADROS .......................................................................................... XIII LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ XIV LISTA DE ANEXOS .............................................................................................. XV 1 2 INTRODUCCIN...............................................................................................1 OBJETIVOS ......................................................................................................3 2.1 OBJETIVO GENERAL...............................................................................3 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .....................................................................3 3 REVISIN DE LITERATURA............................................................................4 3.1 EL COMPOST ...........................................................................................4 3.1.1 El proceso de compostaje............................................................4 3.1.2 Microorganismos en el proceso de compostaje ...........................4 3.1.3 Fabricacin ptima de un compost ..............................................5 3.2 EL VERMICOMPOST................................................................................5 3.2.1 Requerimientos ambientales para el establecimiento..................5 3.3 BOKASHI EM ............................................................................................5 3.4 MICROORGANISMOS EFICACES (EM) ..................................................6 3.4.1 Modo de accin de los microorganismos.....................................6 3.4.2 Composicin del EM ....................................................................6 3.4.2.1 Bacterias fototrpicas ....................................................6 3.4.2.2 Bacterias cido-lcticas .................................................7 3.4.2.3 Levaduras......................................................................7 3.5 RECUENTO DE MICROORGANISMOS ...................................................7 3.6 MEDIOS DE CULTIVO ..............................................................................8 4 MATERIALES Y MTODOS .............................................................................9 4.1 DISEO EXPERIMENTAL ........................................................................9 4.2 MATERIALES ............................................................................................9 4.2.1 Materiales primarios.....................................................................9 4.2.2 Descripcin de materiales primarios ..........................................10 4.2.2.1 Microorganismos Eficaces (EM) ..................................10 4.2.2.2 Vermicompost de Coopevictoria..................................10 4.2.2.3 Compost de Coopepalmares .......................................11 4.2.2.4 Vermicompost de Coopepalmares ..............................11 xi

4.2.2.5 Bokashi de la Finca agro comercial de EARTH .......... 11 4.2.3 Materiales de laboratorio........................................................... 11 4.3 PRUEBAS DE LABORATORIO .............................................................. 12 4.4 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE COLONIAS DE MICROORGANISMOS ................................................................................................................ 12 5 RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 14 5.1 VALORES ENCONTRADOS EN EL CONTEO DE COLONIAS DE MICROORGANISMOS EN EL EM Y LOS ABONOS ORGNICOS ....... 14 5.1.1 Humedad................................................................................... 15 5.1.2 Cuantificacin de bacterias ....................................................... 15 5.1.3 Cuantificacin de hongos .......................................................... 17 6 7 8 9 CONCLUSIONES ........................................................................................... 19 RECOMENDACIONES................................................................................... 20 BIBLIOGRAFA CITADA................................................................................ 21 ANEXOS......................................................................................................... 23

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LISTA DE CUADROS Cuadro Pgina

Cuadro 1. Valores encontrados de humedad y microorganismos en abonos orgnicos y EM para ensayos y literatura..........................................................................................14

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LISTA DE FIGURAS Figura Pgina

Figura 1. Aislamiento de bacterias en vermicompost a 10-7. ......................................... 16 Figura 2. Aislamiento de hongos en vermicompost a 10-4. ............................................ 18

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LISTA DE ANEXOS Anexo Pgina

Anexo 1. Crecimiento de bacterias en el EM (Microorganismo Eficaces) a 10-9. ...........25 Anexo 2. Crecimiento de bacterias en vermicompost (10-5). ..........................................25 Anexo 3. Valores totales del recuento de colonias de hongos en medios de APD. .......26 Anexo 4. Crecimiento de hongos en vermicompost y compost (10-1).............................26

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1 INTRODUCCIN En la actualidad el mercado de abonos orgnicos tiene productos elaborados con materiales de calidades muy distintas (Soto, 2003). Los productos finales presentan variaciones segn el origen de la materia prima y el mtodo de fabricacin. Es un mercado que est en pleno auge despus de las malas experiencias vividas en los aos de la revolucin verde; perodo en que los sistemas productivos descuidaron el componente materia orgnica en el suelo y donde las fuentes de fertilizantes minerales cobraron importancia. Las empresas agroindustriales estn utilizando los desechos orgnicos de la actividad productiva, los cuales han cobrado valor monetario, para la manufacturacin de abonos orgnicos; convirtindose as en una industria en constante crecimiento que est creando un mercado propio formando la cultura del uso de los abonos orgnicos. Sin embargo, por mucho tiempo se han trabajado estos productos como enmiendas en la fertilizacin de los cultivos; tratndolos como fuente de suministro de minerales a las plantas. Estudios en abonos orgnicos han sido conducidos por diversos investigadores que han destacado los efectos fsico-qumicos de stos en el suelo. La agroindustria que los produce se basa en estos estudios para promover la comercializacin de los abonos, segn los resultados y beneficios encontrados, pero poco han destacado el componente biolgico de los mismos. Es necesario orientar investigaciones en microbiologa de abonos orgnicos para resaltar el componente vivo y destacarlo como el elemento de mayor relevancia en la comercializacin de estos productos orgnicos. En tal sentido el propsito de este estudio se orienta en la cuantificacin de colonias de microorganismos en cuatro abonos orgnicos usando dos porcentajes de humedad mediante el aislamiento de bacterias y hongos en medios de cultivos de empleo generalizado y usando EM (Microorganismos Eficaces) como indicador comparativo para estimar los niveles de poblaciones de colonias en estos productos orgnicos. Por estas razones expuestas y muchos otras, es preciso ir afinando parmetros de calidad para la produccin y comercializacin de abonos orgnicos. Puesto que ste 1

es un aspecto que debe ser regulado, ya que en el mercado actualmente se encuentran materiales de calidades muy variables. Por ejemplo, (Soto, 2003) dice que el registro de los abonos orgnicos para la comercializacin es un requerimiento a cumplir, ya que no existen normas mnimas establecidas en cuanto a calidades se refiere. Es importante recalcar que para el mejoramiento de la mayora de suelos, es quizs ms importante el contenido biolgico de los fertilizantes orgnicos que el qumico, ya que este ltimo contenido por lo general es sumamente bajo.

2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Cuantificar colonias de microorganismos en cuatro abonos orgnicos usando dos porcentajes de humedad mediante el aislamiento de bacterias y hongos utilizando medios de cultivos de empleo generalizado y validando EM (Microorganismos Eficaces) como indicador comparativo para estimar los niveles de colonias en estos productos orgnicos. 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS Comparar dos condiciones de humedad en los abonos orgnicos evaluados para relacionar sta variable con el nmero de colonias cuantificadas de microorganismos. Cuantificar las colonias de microorganismos presentes en los cuatro abonos orgnicos y en el EM mediante el mtodo de dilucin en serie y tcnica de vaciado en placa. Comparar las poblaciones microbiolgicas de los abonos orgnicos entre s y utilizando EM como ndice ptimo de comparacin.

3 REVISIN DE LITERATURA 3.1 EL COMPOST El compost es una palabra que viene del latn y significa componer (juntar). Una definicin aceptada de compostaje es la descomposicin biolgica aerbica de residuos orgnicos en condiciones controladas (INTEC, 1999). El proceso de compostaje depende de la descomposicin microbiana de compuestos orgnicos bajo condiciones en las cuales se permite el aumento de la temperatura como producto de la oxidacin aerbica de los desechos (Coyne, 2000). 3.1.1 El proceso de compostaje La fabricacin de compost es iniciada por organismos quimiohetertrofos mesfilos. A medida que stos respiran, la temperatura del compost aumenta y stos van siendo sustituidos por organismos termfilos (Coyne, 2000). Una divisin del proceso en tres fases fue establecida por Soto (2003). Iniciando con una fase mesoflica de descomposicin rpida de los materiales ms lbiles, tales como azcares, protenas, almidones y hemicelulosas. Luego una segunda fase termoflica, de temperaturas ms altas, donde se degradan los materiales ms recalcitrantes como celulosa y la lignina, para pasar finalmente la fase de sntesis, enfriado y maduracin, donde ser forman sustancias hmicas. 3.1.2 Microorganismos en el proceso de compostaje Rynk, citado por Uribe Loro (2003) dice que los grupos ms importantes de microorganismos presentes en los abonos orgnicos son las bacterias, hongos y actinomicetes. Y los grupos comprenden tanto especies mesoflicas como termoflicas. Paul y Clark, mencionados por Soto (2003) establecieron que las bacterias y hongos se encargan de la fase mesfila, especialmente bacterias del gnero Bacillus sp, aunque existen tambin algunos Bacillus termfilos. Adems, indican que el 10% de la descomposicin es realizada por bacterias, del 15-30% es realizada por actinomicetes. Despus de que los materiales lbiles han desaparecido, los predominantes son los actinomicetes, hongos y levaduras.

3.1.3 Fabricacin ptima de un compost Las consideraciones ms importantes asociadas con la fabricacin ptima del compost, sugeridas por Coyne (2000), son las siguientes: 1) el tipo y la composicin de los desechos orgnicos; 2) la disponibilidad de los microorganismos; 3) la aireacin; 4) los niveles de C, N y P; 5) el contenido de humedad; 6) la temperatura; 7) el pH; y 8) el tiempo. 3.2 EL VERMICOMPOST Es un mtodo que utiliza lombrices de tierra para consumir y procesar desechos orgnicos y convertirlos en un producto de uso agrcola (Coyne 2000, Soto 2001 citado por Uribe Loro 2003). Este mtodo de reciclaje es de creciente popularidad en la transformacin de desechos domsticos, agrcolas y animal, en humus de lombriz. Bollo (1999) citado por Soto (2003) comenta que la lombriz californiana, Eisenia foetida, fue seleccionada por Tomas Barret en 1930 en Estados Unidos, por su alta capacidad de reproduccin, su capacidad de vivir en altas densidades, el amplio rango de desechos orgnicos de los que se alimenta y su adaptacin a diferentes condiciones climticas. 3.2.1 Requerimientos ambientales para el establecimiento Entre los factores ms importantes para el establecimiento de la lombriz es el contenido de humedad de la cama, alrededor del 70-75%, dado que la lombriz requiere de un buen nivel para su alimentacin y respiracin (Soto, 2003). Igualmente el autor manifiesta que las condiciones de rango ptimo de los principales parmetros para el establecimiento de la lombriz californiana, Eisenia foetida, deben ser: oxgeno > 8%, temperatura 25-28 C, pH 6.8-7.2 y humedad 70-75%. 3.3 BOKASHI EM Bokashi es un trmino japons que significa materia orgnica fermentada y traducido al espaol, refirindose al abono, es abono orgnico fermentado (EM Bokashi Network-US, 2005). Sin embargo, el producto manufacturado en la Universidad EARTH, a base de desechos de banano, es un proceso enteramente aerbico, y puede hacerse

de la manera usual acorde con la materia orgnica disponible. El principal objetivo del bokashi es activar y aumentar la cantidad de microorganismos benficos en el suelo. El EM en el bokashi se usa como inculo microbiano en lugar de suelo del bosque y mejora la calidad de ste facilitando su preparacin. Se usa toda clase de desechos orgnicos; sin embargo, Soto (2003) dice que dadas las limitaciones para obtener los materiales originales de la receta actualmente se llama bokashi al sistema de produccin y no a la receta original; el bokashi como tal se considera que es un proceso de compostaje incompleto. 3.4 MICROORGANISMOS EFICACES (EM) Es una solucin que contiene varios microorganismos benficos tanto aerbicos como anaerbicos, los cuales tienen diferentes funciones. Como el EM est compuesto por microorganismos, es una entidad viva (Higa y Parr, 1994). 3.4.1 Modo de accin de los microorganismos Los diferentes tipos de microorganismos en el EM, toman sustancias generadas por otros organismos basando en ello su funcionamiento y desarrollo. Cuando los microorganismos eficaces incrementan su poblacin, como una comunidad en el medio en que se encuentran, se incrementa la actividad de los microorganismos naturales, enriqueciendo la microflora, balanceando los ecosistemas microbiales, suprimiendo microorganismos patgenos (FUNDASES, s.f.). 3.4.2 Composicin del EM Los principales grupos de microorganismos presentes en el EM lo conforman bacterias cido-lcticas, bacterias fototrpicas y levaduras. A continuacin se detalla brevemente cada uno de estos microorganismos. 3.4.2.1 Bacterias fototrpicas Son bacterias auttrofas que sintetizan sustancias tiles a partir de secreciones de races, materia orgnica y gases dainos, usando la luz solar y el calor del suelo como fuentes de energa. Los metabolitos son absorbidos directamente por ellas, y

actan como sustrato para incrementar la poblacin de otros microorganismos eficaces (FUNDASES, s.f.). 3.4.2.2 Bacterias cido-lcticas Estas bacterias producen cido lctico a partir de azcares y otros carbohidratos sintetizados por bacterias fototrficas y levaduras. El cido lctico es un fuerte esterilizador, suprime microorganismos patgenos e incrementa la rpida

descomposicin de materia orgnica. Las bacterias cido lcticas aumentan la fragmentacin de los componentes de la materia orgnica, como la lignina y la celulosa, transformando esos materiales sin causar influencias negativas en el proceso (FUNDASES, s.f.). 3.4.2.3 Levaduras Estos microorganismos sintetizan sustancias antimicrobiales y tiles para el crecimiento de las plantas a partir de aminocidos y azcares secretados por bacterias fototrficas, materia orgnica y races de las plantas. Las sustancias bioactivas, como hormonas y enzimas, producidas por las levaduras, promueven la divisin celular activa. Sus secreciones son sustratos tiles para microorganismos eficaces como bacterias cido lcticas y actinomycetos (FUNDASES, s.f.). 3.5 RECUENTO DE MICROORGANISMOS El conteo indirecto por el mtodo de placas petri de dilucin de suelos ha sido el mtodo comnmente ms usado. Las series de dilucin son preparadas e inoculadas en un medio slido o lquido. El nmero de colonias que se convierten da una estimacin del nmero de colonias que forman en UFC. A pesar del uso de una variedad de medios de cultivo, este mtodo da lugar generalmente a subestimaciones de 2 a 4 rdenes de magnitud y su uso se debe restringir a las estimaciones semicuantitativa en estudios comparativos (Lavelle y Spain, 2001). Las desventajas principales del mtodo son (i) que los medios de cultivo son selectivos hacia grupos particulares de microorganismos y son exageradamente alimentos ricos en comparacin a las condiciones de los suelos y (ii) que una sola UFC

fungicida se puede derivar de una espora o de un pedazo grande del mycelium, que no son comparable en biomasa o actividad asociada (Lavelle y Spain, 2001). 3.6 MEDIOS DE CULTIVO Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismo que se va a cultivar (Garca, 1995:62). Las bacterias que con mayor frecuencia se estudian son las hetertrofas, y se utilizan medios de cultivo que contienen sustancias tales como azcares, sales, peptonas, extractos de carne o de levadura, as como amortiguadores (buffer) apropiados (Garca, 1995:62). Los hongos pueden crecer en medios de cultivo muy simples, pues no presentan exigencias nutricionales. Para el cultivo de hongos en el laboratorio se han desarrollado una serie de medios similares a los utilizados para las bacterias. Algunos medios de cultivo son naturales como jugos de fruta, infusiones de vegetales o granos de cereales. Otros medios son sintticos y generalmente estn constituidos por carbohidratos, peptonas (producto de la degradacin de protenas) y agar (Garca, 1995:62).

4 MATERIALES Y MTODOS 4.1 DISEO EXPERIMENTAL La fase experimental de laboratorio const con cuatro tratamientos y un testigo (EM). Cada tratamiento consign cuatro repeticiones con diluciones en serie desde 10-1 hasta 10-9 y para dos grados de humedad. El testigo present un nico tratamiento con igual nmero de diluciones y repeticiones. Los tratamientos A, son las muestras de abonos sometidas al proceso de secado en secador solar. Y los tratamientos B, son las muestras originales de los abonos una vez finalizada la fase de compostaje y empaque. A continuacin se detallan los ensayos implementados. Bokashi A. Muestra secada del abono de la Finca agro comercial de EARTH. Bokashi B. Muestra original del abono. Compost A. Muestra secada del abono de Coopepalmares. Compost B. Muestra original del abono. Vermicompost A. Muestra secada del abono de Coopevictoria. Vermicompost B. Muestra original del abono. Vermicompost C. Muestra secada del abono de Coopepalmares. Vermicompost D. Muestra original del abono. 4.2 MATERIALES Los insumos utilizados en la investigacin fueron cuatro abonos orgnicos con condiciones agroclimticas distintas y como testigo EM. 4.2.1 Materiales primarios EM activado al 5%. Utilizado como testigo. Es manufacturado en la Universidad EARTH, Institucin ubicada en el cantn de Gucimo, Limn, Costa Rica. Vermicompost de broza de caf. Producido en Coopevictoria, empresa ubicada en el cantn de Grecia, Alajuela, Costa Rica. 9

Compost de broza de caf. Producido en Coopepalmares, empresa ubicada en el cantn de Palmares, Alajuela, Costa Rica.

Vermicompost de broza de caf. Producido en Coopepalmares, empresa ubicada en la localidad antes dicha.

Bokashi de pinzote de banano, Inoculado con EM, producido en la Finca agro comercial de la Universidad EARTH, Institucin ubicada en el cantn de Gucimo, Limn, Costa Rica.

4.2.2 Descripcin de materiales primarios A continuacin se presenta una breve descripcin de los materiales biolgicos utilizados en la investigacin. 4.2.2.1 Microorganismos Eficaces (EM) Es en un cultivo mixto de microorganismos benficos, de ocurrencia natural, que se aplican como inoculantes para incrementar la diversidad microbiolgica de los abonos, suelos y plantas, entre otras funciones (Higa y Parr, 1994). El contenido mnimo por cc, segn la etiqueta, es de bacterias cido-lcticas 104, bacterias fototrpicas 103 y levaduras 103. 4.2.2.2 Vermicompost de Coopevictoria Producto elaborado a base de broza de caf. Este material previamente es sujeto de un proceso de compostaje por espacio de un mes. Luego es suministro a las lombrices que se encargan de realizar el proceso de digestin en un perodo de cuatro meses. Luego que las lombrices han descompuesto todo el material, el humus resultante, sufre un proceso de secado de dos meses con volteos semanales antes de ser empacado1.

Soto Ballestero, M. 2005. Fabricacin de vermicompost (entrevista). Gucimo, CR, Consultor de Cooperativa Agrcola Industrial Victoria R.L. 10

4.2.2.3 Compost de Coopepalmares Es un compost de broza de caf que se somete a un proceso de descomposicin (compostaje) por un lapso de 8 semanas. Este producto es inoculado con Phasiolomisis lilanus, Beauveria bassiana, Metarhizium amisopliae y Trichoderma spp. (Promotora de Innovaciones Agrcolas, 2005). 4.2.2.4 Vermicompost de Coopepalmares Es un producto elaborado a base de broza de caf. La misma es previamente sometida a un proceso de compostaje por espacio de un mes. Schuldt (2004) dice que en el marco de la lombricultura el tiempo de compostaje a que se somete la MO est entre 45 y 90 das, situacin que vara segn el tipo de materia orgnica procesada. Luego de esto, es suministrada a las lombrices que se encargan de realizar el proceso de digestin en un perodo de cuatro meses. Por ltimo el producto sufre un proceso de secado, antes de ser empacado, de dos meses con volteos semanalmente (Promotora de Innovaciones Agrcolas, 2005). 4.2.2.5 Bokashi de la Finca agro comercial de EARTH Es un producto preparado a partir de los desechos de banano de la planta empacadora. Estos desechos son picados y colocados en camas de 1 m de ancho, 1 m de alto y 14 m de largo. Diariamente la cama recibe 2 L de EM (proporcin 1:30) y se agrega aserrn al 8% segn sea el grado de humedad. El material es volteado cada 3 das por espacio de 5 semanas, Cspedes (2003) citado por Kameko Soria (2003). 4.2.3 Materiales de laboratorio Agar Nutriente (AN). Medio de cultivo para crecimiento de bacterias. Marca Oxoid CM 0003. pH 7.4 0.2 a temperatura 25 C. Agar de Papa Dextrosa (APD). Medio de cultivo para crecimiento de hongos. cido Lctico al 25%. Usado para inhibir crecimiento de bacterias en medios de cultivos de ADP. Marca Oxoid CM 0139. pH 5.6 0.2 a temperatura 25 C. Placa Petri plstica, estril, 90 x 15 mm.

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4.3 PRUEBAS DE LABORATORIO Con el propsito de estandarizar la humedad de los abonos orgnicos, las muestras A de cada tipo de abono, fueron sometidas a un proceso de secado con temperaturas no mayores a los 40 C. Las mismas fueron colocadas en un secador solar por espacio de 3 horas con temperaturas no superiores a las ya indicada. Para los dos tipos de muestras, A y B, el contenido de humedad de los abonos se obtuvo usando el mtodo de secado al horno. Es una prueba sencilla que consiste en colocar una muestra del abono en el horno a 105 C por 24 horas registrando los pesos inicial y final. El porcentaje de humedad se calcula mediante la siguiente expresin: peso fresco - peso seco / peso seco x 100. 4.4 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE COLONIAS DE MICROORGANISMOS El mtodo seguido para la preparacin de los medios de cultivo es el descrito por Agrios (1995:286). Se usaron medios de cultivo solidificados de agar de papa dextrosa (APD) y agar nutriente (AN) los cuales son medios de empleo generalizado para crecimiento de hongos y bacterias respectivamente. La esterilizacin que se implement para el material de cristalera, que incluy pipetas y viales, se hizo en autoclave con vapor de agua a 15 PSI, a una temperatura de 121 C y por un perodo de 15 minutos. Y para los medios de cultivo y agua destilada, se hizo con la misma presin y temperatura, en un tiempo de 20 minutos. La operacin de dispensacin de los medios de cultivos en las placas petri, una vez esterilizados, se hizo en una cmara de flujo laminar. Esta misma cmara su us para hacer las diluciones en serie de las soluciones de la fuente de inculo y la inoculacin de los medios de cultivos en las placas petri. La dilucin de las soluciones contempl concentraciones desde 10-1 hasta 10-9 para el aislamiento y recuento de colonias de bacterias y hongos. En el proceso se utilizaron 9 viales, cada uno con 9 mL de agua estril. Se coloc 1 g de la muestra de abono (inculo) en el vial que representaba un factor de dilucin de 10-1. Luego se agit y con una pipeta estril se agreg 1 mL de suspensin que contena el cultivo de microorganismos. La transferencia se hizo hasta alcanzar un factor de dilucin de 10-9.

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La metodologa para el aislamiento de microorganismos est basada en el mtodo de extensin en placa. El mismo consiste en colocar una gota de inculo, 0.05 mL, en el centro de la placa petri con el tipo de medio de agar, y el inculo se extendi utilizando un tubo de vidrio doblado (Hockey-stick method). Se utilizaron 36 placas petri (4 repeticiones por dilucin) por ensayo y una vez inoculadas, se sellaron con papel Parafilm M e incubaron por un perodo de 48 horas, tiempo necesario para hacer el recuento de colonias de microorganismos. El recuento de las colonias de microorganismos, bacterias y hongos, se hizo con un contador de colonias n de catlogo 81520-000 (Manostat Colony Counter). Se cuantificaron las colonias en las placas petri que tuvieron un nmero entre 30-300 colonias y ese nmero se multiplic por el factor de dilucin. El resultado represent la cantidad de bacterias y hongos en UFC presentes por gramo de abono o por mililitro de solucin (EM).

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5 RESULTADOS Y DISCUSIN 5.1 VALORES ENCONTRADOS EN EL CONTEO DE COLONIAS DE

MICROORGANISMOS EN EL EM Y LOS ABONOS ORGNICOS Los resultados presentados en el cuadro 1 son los valores cuantificados de microorganismos en UFC/g de abonos orgnico en solucin y del testigo EM (Microorganismos Eficaces). De acuerdo a la metodologa empleada en el estudio no se pudo cuantificar un nmero de bacterias en los abonos orgnicos evaluados. La literatura muestra valores altos de bacterias en UFC/g en abonos semejantes a los analizados en el estudio. El conteo de colonias de bacterias en el EM hizo ver que el medio de cultivo, agar nutriente, funcion de acuerdo con el propsito requerido. El EM no mostr crecimiento de hongos, lo cual se justifica, puesto que es un producto inoculado nicamente con bacterias cido-lcticas, fototrpicas y levaduras2. En el anexo 1, se ilustra el crecimiento de bacterias en el EM en dos ensayos a un mismo factor de dilucin. Cuadro 1. Valores encontrados de humedad y microorganismos en abonos orgnicos y EM para ensayos y literatura.
Tipo de Abono en Ensayo Bokashi A Bokashi B Compost A Compost B Vermicompost A Vermicompost B Vermicompost C Vermicompost D EM (testigo) Tipo de Abono en Literatura Compost Bokashi Lombricompost ? Valores no cuantificados. Humedad (%) 37 38 41 45 55 61 34 37 Bacterias UFC/g ? ? ? ? ? ? ? ? 1,21 x 1011 Hongos UFC/g 35,625 311,250 <1,000 2,305 1,312,500 462,500 <1,000 5,225 0

23,000,000 26,786,000 103,879,000

990,000 2,679,000 10,519,000

Tomado de Uribe Loro. Calidad microbiolgica e inocuidad de abonos orgnicos, 2003.

Nishikawa, T. 2005. Composicin microbiolgica del EM (entrevista). Gucimo, CR, Universidad EARTH. 14

5.1.1 Humedad El propsito de la investigacin en establecer dos condiciones de humedad, para los abonos orgnicos evaluados, pretenda ver la relacin de este parmetro con el nmero de colonias de microorganismos presentes. Las condiciones de humedad definidas, fueron, la humedad original, una vez terminado el proceso de fabricacin y empacado. Desde el inicio fue relativamente baja, con un 38% para bokashi, 45% del compost y 37% el vermicompost (Coopepalmares). La otra condicin de humedad estaba dada por un proceso de secado que en primera instancia buscaba estandarizar las muestras de los abonos a un mismo valor. Por ser productos elaborados con distintos materiales no se logro la estandarizacin de la humedad de las muestras. El mtodo de secado implementado no fue muy eficiente puesto que la temperatura no estuvo uniforme durante el proceso. Y era necesario mantenerla porque un aumento de la misma poda provocar la muerte de los microorganismos termosensibles. 5.1.2 Cuantificacin de bacterias En un suelo con materia orgnica, por lo general, el mayor nmero de microorganismos est dado por las bacterias (Paul y Clark 1989, Uribe Loro 2003). En los abonos evaluados, particularmente, el comportamiento que se present fue en forma de una masa de bacterias. No hubo cuantificacin de este tipo de microorganismos en estos abonos orgnicos. Esto no significa que son productos con poco o ningn contenido de bacterias. Al contrario, la masa bacterial presente es un indicador del contenido bacteriano de los abonos. Las razones por las cuales, los ensayos, reflejaron este comportamiento no son claras. El bajo contenido de humedad, segn se muestra en el cuadro 1, pudo haber sido un factor que afect el crecimiento de las bacterias. Segn Epstein (1997), establece que la humedad afecta la actividad microbiana de dos maneras. Contenidos de humedad sobre el 60%, los microorganismos aerobios pueden carecer de oxgeno ya que el espacio de poros libre se puede bloquear por el agua, de tal modo que restringe la difusin del oxgeno. Y como todos los organismos, los microorganismos

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requieren agua para funcionar; un contenido de agua por debajo del 40% puede inhibir la actividad biolgica. El factor humedad se establece slo como una mera hiptesis porque segn los valores de humedad mostrados en el cuadro 1, hubo dos tipos de abonos con porcentajes de humedad entre 40 y 60%, que basado en Epstein (1997) debieron haber mostrado crecimiento. Otro parmetro que pudo haber afectado fue el factor de dilucin de las muestras. Sin embargo, hasta 10-9 es un factor muy amplio en dilucin, por lo que se esperaba un aislamiento de colonias de bacterias. Adems, una gota del inculo contena 0.05 mL de 10-1 lo que represent 10-2 a 10-3 como factor de dilucin3. Aun as, no se pudo hacer el recuento de colonias. La figura 1, es una representacin tpica del crecimiento bacterial conseguido en todos los ensayos con abonos orgnicos. Fue caracterstico, la formacin de una masa de bacterias poco aislada que impidi el recuento de colonias. En el anexo 2, tambin se ilustra un crecimiento difuso de bacterias con otro factor de dilucin en los vermicompost.

Figura 1. Aislamiento de bacterias en vermicompost a 10-7. La literatura para estos tipos de abono, muestra contenidos de bacterias de 23, 26.7 y 103.9 millones de UFC/g. El EM como testigo mostr una poblacin bacterial

Uribe Loro, L. 2005. Microbiologa de abonos orgnicos: recuento de bacterias y hongos (conversacin telefnica). San Jos, CR, Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Costa Rica. 16

adecuada, lo que indic que el medio de cultivo y el procedimiento fue correcto. Sin embargo, con la metodologa descrita en sta investigacin no se pudo obtener resultados cuantificables para los abonos. 5.1.3 Cuantificacin de hongos Todos los tratamientos mostraron rangos variables en el recuento de hongos, con poblaciones muy altas para las muestras A y B de vermicompost. Las mismas presentaron resultados contrarios a los esperados. Segn el efecto que produce la humedad se esperaba que la muestra secada tuviera un valor inferior en nmeros de colonias con relacin a la muestra original. Se lograron cuantificar colonias de hongos en todos los ensayos. El recuento mostr al bokashi como el abono con mayor poblacin de hongos, despus del vermicompost de Coopevictoria. Los valores que se muestran en el cuadro 1 para bokashi, aun estn por debajo de los conseguidos por Uribe Loro (2003) en el recuento de hongos en bokashi. Los valores mostrados en el cuadro 1, en el recuento de colonias hacen ver una diferencia enorme comparando los resultados de los ensayos con los obtenidos por Uribe (2003). En el anexo 3, se presentan los valores del recuento de colonias de hongos en medios de cultivo de agar papa dextrosa (ADP) para todos los tratamientos del ensayo. Esto hace pensar en un replanteamiento de la metodologa para el aislamiento y recuento de los microorganismos. Debido a que existen diferencias marcadas en los ensayos comparado con la literatura, entre los mismos tipos de abonos. La figura 2 caracteriza el crecimiento de los hongos en los ensayos con abonos orgnicos. Y en el anexo 4, se aprecia el crecimiento de colonias de hongos en dos abonos orgnicos distintos.

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Figura 2. Aislamiento de hongos en vermicompost a 10-4. Coyne (2000:81) dice que probablemente existen menos hongos que bacterias o actinomicetos. Pero debido a la produccin de esporas y a la fragmentacin de las hifas, resulta imposible obtener una estimacin precisa de las poblaciones de hongos, ya que el organismo original se ha multiplicado a travs de estas progenies directas. Lo que explica los resultados tan diversos, que indican gran variabilidad en las muestras, por lo que deben homogenizarse a travs de muestras mayores.

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6 CONCLUSIONES Se establecieron dos condiciones de humedad para todos los abonos orgnicos. Una muestra original y otra muestra secada en secador solar. La muestra secada no se logr estandarizar los porcentajes de humedad en valores iguales para todas las muestras de abono. Se logr establecer una comparacin de las variables humedad y nmero de colonias de microorganismos, con los valores encontrados de hongos en UFC/g. De acuerdo a los resultados obtenidos al bajar la humedad, afecta el nmero de colonias presentes, y disminuye los valores. Se logr cuantificar solamente colonias de hongos. Debido a que en el recuento de bacterias slo hubo una formacin de una masa bacterial poco aislada, no se cuantificaron bacterias. Los procedimientos metodolgicos indistintamente funcionaron para cuantificar ambos tipos de microorganismos. Los resultados no fueron precisos para establecer una comparacin de poblaciones de hongos entre tipos de abonos. Hubo mucha variabilidad en los resultados. En el caso de las poblaciones de bacterias no se cuantific nmero alguno. Por tal razn la comparacin no se hizo posible. Asimismo el EM no fue el testigo ms fiable debido a que tuvo poca o ninguna presencia de hongos.

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7 RECOMENDACIONES Con el propsito de conseguir los resultados congruentes, en una prxima vez, es necesario repetir los ensayos tomando en cuenta los factores que intervinieron. En tal sentido hay que tener presente llevar a cabo la fase de aislamiento y cuantificacin de microorganismos en una unidad de laboratorio especializada en microbiologa de suelos. Es preciso usar como testigo un producto que muestre un amplio rango actividad biolgica. Se espera que el testigo sea un producto con la mayor poblacin de microorganismos en estudio. En este caso el EM result presentar actividad biolgica de bacterias. Probar con un suelo natural con materiales de origen orgnico como testigo. Contar con la asesora de expertos en microbiologa de suelos para definir e implementar la metodologa de trabajo de laboratorio.

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8 BIBLIOGRAFA CITADA Agrios, G. 1995. Fitopatologa. 2 ed. Mxico, MX, Limusa. 838 p. Coyne, M. 2000. Microbiologa del suelo: un enfoque exploratorio. Trad. M Rasskin. Madrid, ES, Paraninfo. 416 p. EM Technology Network. 2005. EM teachers manual (en lnea). 2 ed. Arizona, US, EM Bokashi Network. Consultado 7 oct. 2005. Disponible en http://www.emtechnologynetwork.org/%7een/_web/library/teachersmanual/EMTe achersManual051005.pdf Epstein, E. 1997. The science of composting. Pennsylvania, US, Lancaster-Basel. 483 p. FUNDASES (Fundacin de Asesoras para el Sector Rural, CO). s.f. EM Microorganismos eficaces (en lnea). Bogot, CO, Minuto de Dios. Consultado 5 abr. 2005. Disponible en http://www.fundases.org/p/em01.html Garca, V. 1995. Introduccin a la microbiologa. San Jos, CR, UNED. 251 p. Higa, T; Parr, J. 1994. Beneficial and effective microorganisms: for a sustainable agriculture and environment. Atami, JP, International Nature Farming Research Center. 17 p. INTEC (Corporacin de Investigacin Tecnolgica de Chile). 1999. Manual de compostaje. Santiago, CL. 82 p. Kameko Soria, C. 2003. Determinacin del potencial de mineralizacin de nitrgeno de bokashi, compost y lombricompost producidos en EARTH. Proyecto de Graduacin Lic. Ing. Agr. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 41 p. Lavelle, P; Spain, A. 2001. Soil ecology. Dordrecht, NL, Kluwer Academic Publishers. 654 p. Paul, E; Clark, F. 1989. Soil microbiology and biochemestry. San Diego, US, Academy Press. 275 p. PIA (Promotora de Innovaciones Agrcolas, CR). 2005. Tratamiento de residuos slidos y lquidos del beneficio de caf de Coopepalmares RL. Palmares, CR. s.p. Schuldt, M. 2004. Lombricultura fcil. Buenos Aires, AR, M Schuldt. 151 p. Soto, G. 2003. Abonos orgnicos: definiciones y procesos. In Abonos orgnicos: principios, aplicaciones e impacto en la agricultura (2003, San Jos, CR). Memoria. Ed. G Melndez. San Jos, CR, CIA-UCR. 20-49 p. Uribe Loro, L. 2003. Calidad microbiolgica e inocuidad de abonos orgnicos. In Abonos orgnicos: principios, aplicaciones e impacto en la agricultura (2003, San Jos, CR). Memoria. Ed. G Melndez. San Jos, CR, CIA-UCR. 165-184 p.

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9 ANEXOS

Anexo 1. Crecimiento de bacterias en el EM (Microorganismo Eficaces) a 10-9.

Anexo 2. Crecimiento de bacterias en vermicompost (10-5).

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Anexo 3. Valores totales del recuento de colonias de hongos en medios de APD.

Factor de dilucin N Muestra Testigo Vermicompost A Vermicompost B Vermicompost C Vermicompost D Compost A Compost B Bokashi A Bokashi B 10
-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

10

-7

10

-8

10

-9

131.25 46.25 65.00 184.00 88.75 52.25 44.25 190.00 52.25 205.00

41.75

Anexo 4. Crecimiento de hongos en vermicompost y compost (10-1).

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