Biodegradacin de hidrocarburos monoaromticos voltiles (BTX) a nivel microcosmos en suelos contaminados con gasolina

Ana Laura Deyta y Susana Saval Universidad Nacional Autnoma de Mxico Instituto de Ingeniera, Coordinacin de Bioprocesos Ambientales Ciudad Universitaria, D.F., 04510 Mxico e-mail: ssb@pumas.iingen.unam.mx

RESUMEN

Se estudi la biodegradacin de BTX por microorganismos nativos en dos suelos que estuvieron expuestos a contaminacin con gasolina, uno proveniente de una terminal de almacenamiento de combustibles (M) y otro de los alrededores de un poliducto para transporte de combustibles (T). Se empleo un sistema a nivel microcosmos con suelo no saturado, previamente caracterizado fsica, qumica y microbiolgicamente. El suelo del sitio M result ser un suelo franco arenoso y el del sitio T un suelo arenoso; en ambos casos, su caracterizacin reflej las condiciones tpicas de suelos de zonas calientes, manifestndose el pH como un parmetro de presin selectiva hacia el desarrollo de comunidades bacterianas. La capacidad de los microorganismos para degradar BTX presentes en ambos sitios se hizo evidente al alcanzar porcentajes de biodegradacin de 82.74 % para el suelo M y 76.38 % para el suelo T, bajo condiciones controladas de humedad y de suministro de nutrientes. El seguimiento tanto del consumo de oxgeno y produccin de bixido de carbono fue importante en la deteccin y confirmacin de la actividad degradadora de los microorganismos nativos en ambos suelos.

INTRODUCCIN

Cada da se han hecho ms evidentes los problemas de contaminacin del ambiente como resultado de la actividad industrial. Uno de los medios que resultan ms impactados por el uso excesivo de agroqumicos y la liberacin incontrolada de hidrocarburos es el suelo; el cual por su tiempo de formacin que va de 1 cm de espesor en 100 o ms aos, se le debe considerar como recurso natural no renovable. El derrame de combustibles como la gasolina durante la operacin diaria de instalaciones industriales y zonas de abastecimiento es muy comn. Las prdidas en tanques y tuberas debidas a fugas, derrames accidentales y tomas clandestinas, han causado problemas ambientales en grandes extensiones de suelo superficial y de subsuelo a nivel ms profundo. Una vez que penetran los combustibles en el suelo, pueden amenazar la salud pblica, como una consecuencia de su migracin y contacto con los mantos freticos, que en su gran mayora son la fuente de abastecimiento de agua para las poblaciones aledaas. Por otra parte, los combustibles tambin pueden afectar la estructura, fertilidad y productividad del suelo, situacin que es una realidad en pases en desarrollo como Mxico. La necesidad de eliminar contaminantes presentes en suelos y acuferos ha promovido el desarrollo de tecnologas de biorremediacin, las cuales se caracterizan por ser, efectivas, seguras y econmicas. Dichas tecnologas se basan en la capacidad que tienen los propios microorganismos del suelo, para transformar o degradar compuestos orgnicos en compuestos qumicos ms sencillos, logrando incluso una degradacin completa hasta bixido de carbono y agua. De ah, surge el inters de realizar estudios sobre la actividad biodegradadora de las poblaciones autctonas de los suelos, sobre compuestos orgnicos txicos como es el caso de los hidrocarburos monoaromticos: benceno, tolueno y xilenos (BTX), constituyentes bsicos de las gasolinas.

En la literatura hay pocos trabajos con referencia a la degradacin de BTEX en suelos no saturados a nivel microcosmos, ya que la mayora se refiere a la zona saturada o mantos acuferos, as mismo se destacan los trabajos empleando cepas puras aisladas de un hbitat especfico (Chen y Taylor, 1995), o bien producto de la ingeniera gentica (Lee et al., 1994). Los medios de cultivo lquidos que se han empleado son qumicamente definidos y los estudios bsicamente estn dirigidos a discernir rutas metablicas de degradacin de estos hidrocarburos. Por lo que se resalta la necesidad de trabajar con la zona no saturada, que evidentemente sirve como fuente potencial de contaminacin de las zonas ms profundas y al mismo tiempo desempean una funcin amortiguadora y de proteccin de los mantos freticos.

OBJETIVO

El objetivo de este trabajo fue estudiar la biodegradacin de los hidrocarburos monoaromticos BTX por las comunidades microbianas nativas, en muestras de suelo provenientes de dos sitios diferentes que estuvieron expuestos a contaminacin con gasolina.

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

La estrategia experimental consisti del desarrollo y adecuacin de tcnicas eficaces para el seguimiento del estudio, seleccionadas conforme a las necesidades y tipo de informacin que se requera. El muestreo de los suelos afectados realiz en una terminal de almacenamiento de combustibles (M) y un sitio contaminado por una fuga accidental en los alrededores de un poliducto para transporte de combustibles (T). Del sitio M se tomaron dos muestras (M1 y M2) y un control no contaminado (CM). En el caso del suelo T se tomaron dos muestras (T1 y T2) y dos controles (CT1 y CT2), uno para cada muestra debido a la heterogeneidad del suelo en ese sitio. Las muestras para los anlisis fsicos y qumicos se obtuvieron por excavacin, se colocaron en frascos de vidrio con sello hermtico y se almacenaron en fro hasta su procesamiento, mientras que las muestras inalteradas para la caracterizacin microbiolgica se obtuvieron en cartuchos de acetato de 45.5 cm de longitud y 2.2 cm de dimetro con ayuda de un nucleador manual. La caracterizacin fsica, qumica y microbiolgica de las muestras se realiz de acuerdo con Jackson (1982), Klute (1986) y Carter (1993). Durante la caracterizacin microbiolgica se cuantific el contenido de bacterias totales, hetertrofas y degradadoras de tolueno. La evaluacin de la capacidad degradadora de los consorcios microbianos nativos, se realiz a nivel microcosmos, cuyo volumen fue de 150 ml y en el cual se colocaron 20g de suelo. La cuantificacin de hidrocarburos residuales se realiz de acuerdo a una modificacin de las tcnicas EPA 8020A y EPA 3810 para headspace (Garbarini et al., 1985; Roe et al., 1989). Se utiliz un cromatgrafo de gases Varian modelo 3350, equipado con detector de ionizacin de flama (FID) y columna capilar 100% metilsilicona de 60 m de longitud y 0.25 mm de dimetro interno; se aplic un programa de temperatura de 40 a 110C durante un periodo de 11.6 min. El gas acarreador fue helio a un flujo de 1.3 ml/min. El oxgeno y el bixido de carbono se cuantificaron en un cromatgrafo de gases Fisher modelo 1200 de doble columna (Poropak Q y malla molecular SA), equipado con detector de conductividad trmica (TCD). Se incluyeron testigos negativos y de fuga del sistema, esterilizando los microcosmos en autoclave a 1.5 2 kg/cm de presin y 120C de temperatura durante 30 minutos, repitiendo sta operacin tres veces. As mismo se montaron testigos para la produccin natural de bixido de carbono y consumo de oxgeno del sistema, empleando los suelos control sin esterilizar, bajo las mismas condiciones de prueba.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Caracterizacin fsica. En la Tabla 1 se resumen las caractersticas fsicas de las muestras de suelo analizadas. En ambos casos, el color de los suelos no est determinado por la cantidad de materia orgnica, ya que el porcentaje de sta es muy reducido (Tabla 2), por el contrario, est ms influenciado por la fraccin inorgnica representada por los slidos fijos, que en ambos casos representan ms del 91 % del peso total. En cuanto a su mineraloga, slo se puede asumir para el sitio M, que la presencia de complejos de arcilla les confieren colores grises o pardo grisceos y que son ricos en slice, as como algunos feldespatos, los cuales suelen dar coloraciones grises (Gilbert, 1967; Don et al., 1992). En cuanto al sitio T se asume una mayor presencia de feldespatos, pus las muestras tienden a obscurecerse cuando se humedecen.

Tabla 1. Caracterizacin fsica de las muestras de suelo utilizadas

SITIO M M1 40 - 60 10YR7/3 Pardo muy plido 2.5Y5/4 Pardo olivo claro Franco arenoso 77.2 8.5 14.24 13.99 (5.58) 870.19 2.21 97.79 1.58 (15.11) 2.13 (20.40) 25.59 SITIO T CT2 50 10YR6/4 Pardo amarillento claro 2.5Y4/2 Pardo grisceo oscuro Arena 97.2 2.56 0.24 4.23 (2.79) 957.95 0.56 99.44 1.43

PARMETRO Profundidad (cm) Color en Seco

CM 15 - 30 10YR6/3 Pardo plido 2.5Y4/4 Pardo olivo Arena 93.2 2.56 4.24 4.27 (8.51) 959.53 0.95 99.05 1.38 (14.16) 2.64 (2.72) 47.89

M2 30 -50 10YR6/2 Gris Ligeramente Pardusco 2.5Y5/2 Pardo Grisceo Franco arenoso 70.0 13.0 17.0 18.87 (9.13) 802.29 3.15 96.85 1.49 (12.47) 2.39 (4.90) 37.50

CT1 50 10YR6/3 Pardo Plido 2.5Y4/4 Pardo Olivo Arena 97.2 2.56 0.24 1.26 (5.24) 987.72 0.63 99.37 1.39

T1 90

T2 50 2.5Y4/2 Pardo grisceo obscuro 2.5Y3/2 Pardo grisceo muy oscuro Franco limoso 43.2 48.56 8.24 26.66 (5.14) 743.37 6.99 91.67 1.16

2.5Y5/4 Pardo olivo claro 2.5Y3/2 Pardo grisceo muy oscuro Arena 87.2 8.56 4.24 5.67 (2.59) 940.76 0.54 99.49 1.52 (6.39)

Color en hmedo Textura % Arena % Limo % Arcilla % humedad (CV*) ST (mg/g) SV (%) SF (%) Densidad aparente 3 (g/cm ) (CV*) Densidad real 3 (g/cm ) (CV*) % Porosidad

2.69 (0.74) 48.38

2.24 (3.07) 32.46

2.76 (6.18) 48.10

2.62 (0.07) 55.79

* el coeficiente de variabilidad (CV) se expresa en %

La clase textural indica que ambos son suelos muy permeables al aire y al agua, sin embargo, estn limitados por la baja capacidad de retencin de agua y de almacenamiento de nutrientes (Tabla 2). Esto debido a la relacin que guardan estas caractersticas con la reducida superficie total del conjunto de sus partculas y que estn representadas por arenas. La humedad presente en las muestras contaminadas del sitio M, y ms en M2 con un 18.87 %, se considera buena, tomando en cuenta que el porcentaje ptimo de humedad para el desarrollo microbiano

es de 20 %. La diferencia que guardan las muestras con respecto al 4.27 % del control CM, que es bajo, se establece bsicamente por una proporcin de arena, de 93.2 %. En el caso del sitio T, la humedad fue reducida para CT1, T1 y CT2, debido tambin a la clase textural, en las que predominan las arenas y una baja proporcin de limos y arcillas, lo cual favorece una mayor filtracin a travs del suelo. El contenido de humedad en la muestra T2 (26.66 %), se debe a una mayor proporcin de limo (48 %). La densidad aparente refleja en gran parte la estructura del suelo, ya que se toma en cuenta los espacios porosos del sistema. En estos casos los valores obtenidos caen dentro de los intervalos reportados para 3 3 suelos arenosos (1.4 a 1.6 g/cm ) y minerales (1.0 a 1.6 g/cm ) (Porta et al. 1994; Thompson et al. 1982). La densidad real es inductiva de la composicin misma del suelo, sin embargo, los valores obtenidos para ambos sitios difieren en poco de los valores reportados por Porta et al. 1994 y Thompson et al. 1982, 3 3 para los suelos minerales (2.6 g/cm ), pero se asume la presencia de cuarzo (2.3 a 2.8 g/cm ), ortoclasa 3 3 3 (2.5 a 2.6 g/cm ), feldespatos (2.0 a 2.6 g/cm ) y en menor grado minerales de arcilla (2.0 a 2.6 g/cm ). El porcentaje de porosidad, que se obtienen a partir de la relacin entre las densidades real y aparente, se considera poco satisfactorio para el sitio M y las muestras CT1, T1 y CT2 del sitio T con valores que estn por debajo del 50 %, en cuanto al aprovisionamiento de agua y oxgeno y la tasa de movimiento del agua. Sin embargo, esto se ve minimizado ya que el espacio poroso de los suelos arenosos esta compuesto de poros grandes, los cuales son muy eficaces para el movimiento del agua y el aire. Para la muestra T2, con un 55 % de porosidad se le considera satisfactoria. Caracterizacin qumica. El anlisis qumico de las muestras se resume en la tabla 2. El pH de ambos suelos tiende hacia la alcalinidad, con lo que se estima que hay cierto grado de saturacin de bases que favorece el incremento de la concentracin de iones OH en la solucin del suelo, lo que es caracterstico de este tipo de suelos de regiones ridas y semiridas, por otra parte, ocasiona un crecimiento selectivo de entidades bacterianas. Tabla 2. Caracterizacin qumica de las muestras de suelo utilizadas
SITIO M PARMETRO pHH O Conductividad (S/m) Materia orgnica % (CV*) Carbono orgnico % (CV* mg Nitrgeno Total / kg (CV*)
2

SITIO T M2 8.29 428 1.35 (22.17) 0.79 (22.19) 417 (2.39) 26.43 0.043 (14.01) 0.070 (32.76) CT1 7.25 133 0.32 (34.96) 0.19 (34.96) 850 (71.76) 1.59 0.164 (0.49) 0.494 (51.57) T1 7.33 446 0.31 (44.21) 0.18 (44.43) 239 (33.47) 1.6 0.002 (83.33) 0.914 (5.36) CT2 8.39 142 0.15 (86.64) 0.09 (86.65) 146 (0.68) 1.65 0.005 (117.47) 0.192 (6.78) T2 8.00 129 0.50 (10.91) 0.29 (10.95) 2735 (3.65) 81.74 0.008 (12.82) 0.193 (2.58)

CM 8.46 140 0.29 (117.51) 0.17 (117.51) 122 (90.16) 14.27 0.035 (8.62) 0.018 (25.13)

M1 8.40 418 0.39 (54.07) 0.2242 (54.07) 532 (9.39) 34.11 0.068 (1.47) 0.024 (29.28)

mg N-NH4+ / kg mg N-NO3 / kg (CV*) mg P-PO4 / kg (CV*)

3-

* el coeficiente de variabilidad (CV) se expresa en %

La baja conductividad de ambos suelos descarta la posibilidad de una alta salinidad, tomando en cuenta que a una conductividad de 4 a 8 dS/m, empiezan a manifestarse los problemas de salinidad para los cultivos sensibles (Carter, 1993). Sin embargo, los valores obtenidos si son un indicativo de que la

velocidad de movilizacin de los elementos nutritivos es baja, al igual que su capacidad de intercambio inico (Jackson, 1982). El contenido de materia orgnica de ambos sitios es muy bajo, excepto en la muestra M2 del sitio M, que corresponde a un suelo pobre (Aguilera, 1989). Este aspecto era de esperarse, pues el aporte de sustancias orgnicas es muy limitado o casi nulo, ya que solo se restringe al aporte de la vegetacin y de la microfauna, que en estos sitios es escaso. La cantidad de nitrgeno total, es tambin muy baja con valores que corresponden a suelos pobres, exceptuando la muestra T2, cuyo valor es superior a 1000 mg/kg que corresponde a un suelo medianamente pobre (De la Garza, 1986). El contenido de nitrgeno amoniacal es apropiado para el sitio M y bajo o deficiente para el sitio T, exceptuando, la muestra T2 que con 81.74 mg/kg se clasificara como un suelo con buen contenido, considerando que 25 mg/kg es una cantidad que se reporta como adecuada (Lpez et al., 1987). Los nitratos tambin se encuentran en muy baja proporcin en ambos suelos. Por lo que respecta a la concentracin de fosfatos en todos los casos corresponde a suelos extremadamente pobres, tomando en cuenta que valores por debajo de 30 mg/kg de fsforo indican deficiencia del elemento (Lpez et al., 1987). Caracterizacin microbiolgica. En la tabla 3 se enlista el conteo de bacterias totales, hetertrofas y degradadoras de tolueno por gramo de suelo seco, obtenidos a una profundidad promedio de 40 cm para el sitio M y de 50 cm para el sitio T. El nmero de bacterias totales presentes comnmente en el suelo es de miles de millones (10 ) por 7 11 gramo de suelo; y en ambos sitios se obtuvieron conteos de esta magnitud (de 10 a 10 para el sitio M y 9 11 de 10 a 10 para el sito T). Por otra parte, no se ve una diferencia marcada de las muestras contaminadas con respecto a sus controles para ambos suelos; de tal forma que la densidad bacteriana no se ve afectada por la presencia del contaminante, esto debido a que el sitio ha estado expuesto a la gasolina por varios aos, y es de esperar que la poblacin susceptible desapareciera, y aquella que sobrevivi gener un equilibrio natural en la poblacin bacteriana. Esto se puedo corroborar, ya que al realizar las observaciones al microscopio se aprecio una mayor proporcin de bacteria teidas de color rojo naranja, que representan la poblacin viable.
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Tabla 3 Caracterizacin microbiolgica de los suelos

SITIO M Parmetro Profundidad (cm) Cuenta total de bacterias (bacterias/g) Cuenta total de hetertrofas (ufc/g) Cuenta de degradadoras de tolueno (ufc/g) CM 30 M1 50 M2 40 CT1 50 T1 90 SITIO T CT2 50 T2 50

1.96E+11

7.40E+10

8.7E+07

7.08E+10

4.88E+09

1.03E+11

6.06E+11

7.6E+04

9.3E+03

4.22E+02

6.9E+03

3.1E+04

2.8E+04

1.9E+06

3.06E+02

3.8E+02

4.3E+03

2.4E+03

A pesar del alto contenido de bacterias totales, la poblacin hetertrofa, que son las que tienen la capacidad para degradar substratos orgnicos, result ser muy baja en ambos sitios y an en los controles, con respecto a la poblacin total, pues no llega a representar ni el 1 % de esta misma, al obtener poblaciones que no rebasan el milln de bacterias, exceptuando la muestra T2 que alcanza un milln novecientas mil bacterias y aun as como porcentaje es muy bajo, ya que en algunos casos se

puede llegar ha hablar de casi un 50 % de poblacin viable (Ghiorse et al., 1983). La baja en la densidad de la poblacin hetertrofa es debido en gran parte al bajo contenido de materia orgnica presente, ya que las divergencias entre un conteo directo y de cultivo, son mayores en un suelo que no posee o no se le ha suministrado materiales ricos en energa, manteniendo en s un estado de latencia (Burges et al., 1971). Por lo que respecta a las bacterias degradadoras de tolueno estn presentes en las muestras contaminadas en los siguientes porcentajes con respecto al total de hetertrofas; del 3.29 % para M1 con 306 ufc/g; 90.05 % para M2 con 380 ufc/g; 13.87 % para T1 con 4300 ufc/g y 0.13 % para T2 con 2400 ufc/g, con lo cual se hizo evidente un bajo potencial de biodegradacin natural en el sitio bajo las condiciones existentes. Biodegradacin de BTX. Para las pruebas de biodegradacin, se decidi agregar nutrientes, as como hacer una ajuste de la humedad a un 20 % para el suelo del sitio M y a un 15 % para el suelo del sitio T, con el fin de tratar de activar a los microorganismos nativos ah presentes, tomando como base el medio mineral reportado por Robinson et al. (1990). Las muestras de suelo M1 y M2 del sitio M se mezclaron para trabajar una sola muestra. En el caso del sitio T, slo se trabaj con el suelo de la muestra T1 debido que las diferencias con el suelo de la muestra T2 fueron muy evidentes.

3000 2500 2000

BTX mg/kg

1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 das 5 6 7 8

1.2E-03 1.0E-03 8.0E-04 6.0E-04 4.0E-04 2.0E-04 0.0E+00 0 2 4 das M-CO2 CM-CO2 M-O2 CM-O2 6 8

1.8E-03 1.5E-03 1.2E-03 9.0E-04 6.0E-04 3.0E-04 0.0E+00

mmoles CO2

Fig. 1. Biodegradacin de BTX en el suelo del sitio M a nivel de microcosmos (arriba). Produccin de CO2 y consumo de O2 (abajo)

En las figuras 1 y 2 se esquematizan las cinticas obtenidas para la biodegradacin de BTX en los suelos del sitio M y T respectivamente, as como la produccin de bixido de carbono y consumo de oxgeno registrados durante el periodo de incubacin. La concentracin inicial de BTX en el microcosmos fue de 2.5 g/kg para el suelo M y de 4 g/kg para el suelo T.

mmoles O2

En ambos casos se obtuvo una reduccin en la concentracin de BTX debida a la actividad de los microorganismos nativos, confirmando esto con el seguimiento de los controles negativos y de los testigos de fuga del sistema, los cuales mantuvieron las concentraciones iniciales. La biodegradacin fue mayor en el suelo del sito M con un 82.74 % contra un 76.38 % alcanzado en el suelo del sitio T. La mxima biodegradacin se alcanz en ambos casos en aproximadamente 6 das.

4500 4000

500

BTX mg/kg

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 das BTX CF 5 6 7 8 0 100 300

200

1.6E-03

2.0E-03

1.2E-03

1.5E-03

mmoles CO2

C. Fuga BTX mg/kg mmoles O2

3500

400

8.0E-04

1.0E-03

4.0E-04

5.0E-04

0.0E+00 0 1 2 3 4 das T-CO2 CTCO2 T-O2 CT-O2 5 6 7 8

0.0E+00

Fig. 2. Biodegradacin de BTX en el suelo del sitio T a nivel de microcosmos (arriba). Produccin de CO2 y consumo de O2 (abajo)

Ambos porcentajes de biodegradacin se consideran buenos tomando en cuenta que incluso igualan a porcentajes alcanzados en medio lquido, que van desde un 70 % a un 99% (Chen et al., 1995; Lee et al., 1994; Van der Hock et al., 1989; Alvarez et al., 1991). Por otra parte Fan y Sow (1993), obtuvieron una 14 degradacin del 70 % para tolueno, empleando microcosmos con suelo no saturado, analizando C.

Las velocidades de biodegradacin que se obtuvieron ya en una franca disminucin de la concentracin de BTX, fueron de 16.24 mg/kg-h para el suelo M y de 37.62 mg/kg-h para el suelo T. En el caso del sitio T se observa que antes de la franca biodegradacin de los BTX, existe un periodo de adaptacin a las condiciones. El periodo de mayor biodegradacin coincide con el mayor consumo de

oxgeno y la mayor produccin de bixido de carbono, el cual se inicia despus de 12 horas de incubacin y termina poco despus de 2 das. Despus de ste tiempo la biodegradacin es ms lenta y la generacin de CO2 tambin. Para el suelo del sitio M no se observa la misma coincidencia en el intervalo de mxima biodegradacin con respecto al mayor consumo de O2 y produccin de CO2. Esto indicara que los microorganismos requieren de un periodo de adaptacin mayor. Sin embargo, la disminucin en la concentracin de BTX se observa en las primeras horas. Este desajuste en el perfil de las grficas no es atribuible a la actividad de los microorganismos, sino a la estructura y composicin del mismo suelo, que al contener una mayor cantidad de partculas de limo y arcilla provocan un retraso en el intercambio de gases.

CONCLUSIONES

Con base a la caracterizacin fisico-qumica realizada para ambos suelos, se observ que se los valores obtenidos reflejan las condiciones tpicas de los suelos arenosos de zonas calientes: colores claros que impiden una gran absorcin de calor, baja capacidad de retencin de agua, densidades caractersticas de suelos minerales, bajo contenido de nutrientes y de materia orgnica. El pH se manifiesta como un parmetro de presin selectiva hacia el desarrollo de bacterias, al tender hacia valores alcalinos y la baja conductividad elctrica es un indicio de que ambos suelos no presentan problemas de salinidad. La tendencia de produccin de bixido de carbono y consumo de oxgeno coincide con la disminucin de la concentracin del contaminante, confirmando su efectividad en la estimacin de la actividad degradadora microbiana. Por otra parte, ciertos parmetros pueden manifestar alguna limitante en el proceso de biodegradacin, como es el propio tipo de suelo, su baja capacidad de retencin de agua y de nutrientes. No obstante, el hecho de encontrar microorganismos nativos capaces de sobrevivir en esas circunstancias y de desarrollar una actividad degradadora de los hidrocarburos monoaromticos abre la oportunidad para nuevas investigaciones, dirigidad a evaluar el potencial de ateneuacin natural de suelos contaminados.

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