Laboratorio de enzimologa y biocatlisis

Enero Mayo 2013

Extraccin y Purificacin de la Catepsina D

Goddard Jurez Lourdes Gmez Garca Karen Rub Zapata Zarracino Jahred Zurizaday Ruz Coln Gabriela

Contenido
INTRODUCCIN .................................................................................................. 2 ANTECEDENTES ................................................................................................... 3 JUSTIFICACIN .................................................................................................... 5 HIPTESIS ........................................................................................................... 6 OBJETIVOS ........................................................................................................... 6 MTODOS............................................................................................................ 6

Exclusin, precipitacin, fraccionamiento. ...................................................... 7 Cromatografa de Afinidad. ............................................................................. 7 Cromatografa de Intercambio Inico .............................................................. 8
RESULTADOS ESPERADOS .................................................................................. 10 INNOVACIN Y APLICACIONES .......................................................................... 10

Genes y mecanismo de control de la Expresin ............................................. 10 Modelos knock-out ....................................................................................... 11 Distribucin de rganos y localizacin celular ............................................... 11
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Apoptosis ...................................................................................................... 11 Rol en el desarrollo de cncer........................................................................ 11

PERSPECTIVAS ................................................................................................... 12 Trabajos citados ................................................................................................... 13

INTRODUCCIN
DESCRIPCIN DE LA ENZIMA
Catepsina D (EC 3.4.23.5) La catepsina D es una enzima cido lisosomal perteneciente a la familia de las pepsinas de las aspartil proteasas que interviene en la proliferacin y diseminacin de los tumores mamarios. Esta proteasa aumenta la metstasis favoreciendo el crecimiento celular, disminuye la inhibicin por contacto y activa las formas precursoras de otras enzimas proteolticas como catepsinas B y L. el trmino actual de la catepsina se usa para referirse a proteasas intracelulares localizadas en los lisosomas que son activas a pH cido. Su concentracin en los lisosomas es muy alta desde 10-40mg/mL. La catepsina D tiene una estructura bilobulada, est compuesta por dos cadenas de polipptidos, una de 30kDa y otra de 14kDa. Su pH ptimo vara entre 3.5 y 5.0 dependiendo de las condiciones de experimentacin y el sustrato que se utilice. En pH cido la catepsina acta como proteasa y a pH neutro como ligando de diferentes receptores como el del factor de crecimiento insulnico tipo II. Su actividad puede ser inhibida por pepstatina A. Adems de su actividad relacionados con la proliferacin celular y la apoptosis. El gen de la enzima est formado por nueve exones y est localizado en el cromosoma 11p15. La regin promotora contiene una regin con alto contenido de G+C y la secuencia TATAA, lo que sugiere un mecanismo de expresin regulada. La catepsina D est presente prcticamente en todos los tejidos y rganos animales, en mamferos e invertebrados. En mamferos, se han detectado mayores concentraciones de la enzima en el hgado y placenta. Tambin est presente en altas cantidades en el cerebro, principalmente en las neuronas. Su actividad biolgica est relacionada con efectos fisiolgicos y patolgicos. La importancia de la enzima en el desarrollo de clulas y tejidos fue determinado mediante experimentos en ratn, en los cuales se detect atrofia intestinal, destruccin de clulas linfticas, almacenamiento lisosomal, incluso ocasionando la muerte por insuficiencia de catepsina D. Altos niveles de catepsina D tambin reportan
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proteoltica, la catepsina D est implicada en muchos procesos biolgicos

condiciones patolgicas, algunas de las cuales son causadas por el descontrol de inhibidores intracelulares o variaciones en el pH neutro en el microentorno que provocan la activacin de las catepsinas. Por otro lado, la inhibicin de su actividad enzimtica, generalmente por mutaciones, causa ceroidolipofuscinosis neuronal (NCL) que provoca neurodegeneracin, prdida de la vista y epilepsia. La pro-catepsina D (precursor protico de la catepsina D) tiene actividad mitognica, es decir acta estimulando la divisin celular. Cuando se encuentra en ambientes cido, ocasiona la protelisis de membranas basales. Se considera que estos eventos favorecen la invasin y el desarrollo de metstasis (propagacin de un foco cancergeno). Altos niveles de catepsina D se han observado en clulas de tumores mamarios, de hecho en un tercio de ellos. Su sobreexpresin est asociada con un alto riesgo de recurrencia a la enfermedad.

ANTECEDENTES
El aislamiento de peptidasas de bazo ha sido demostrado desde principios del siglo XX, siglo en el cual se introdujo el nombre de la catepsina. En 1940, Anson sugiri que estas peptidasas no son del tipo de la papana y esta idea fue apoyada por Press, quien ms tarde emple el trmino catepsina D para nombrar a una peptidasa intracelular con una ptima de pH cido. Los aislamientos originales revelaron la complejidad de las formas de enzimas y muchos fueron separados por cromatografa y electroforesis. Obras de Keilova sobre la especificidad, la inhibicin y la modificacin covalente del sitio activo, seguido por otros grupos, mostraron que la catepsina D tiene un mecanismo cataltico similar a la pepsina y pertenece a la misma familia. Las relaciones con otras peptidasas se confirmaron posteriormente por la identificacin de similitudes en las secuencias N-terminales de la enzima madura. Tambin se demostr que la protena est formada por dos cadenas peptdicas, y se sugiri que una pro-forma de peso molecular ms elevado es un precursor final de la forma hidrolticamente procesada. La existencia de un precursor inactivo fue confirmada luego por otros estudios. Los estudios realizados en los aos siguientes se centraron hacia varias direcciones. Se estudi el trfico intracelular y el procesamiento de pro-catepsina D, junto con la caracterizacin
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del gen de la catepsina D humana. Determinacin de la estructura tridimensional, junto con numerosos estudios sobre la especificidad y la inhibicin de la catepsina D, han permitido la caracterizacin de la enzima. Trabajos pioneros de Rochefort en la secrecin de la catepsina D en clulas derivadas de cncer han comenzado una nueva rama en la investigacin de la catepsina D fisiopatologa. Tras diversos estudios, tambin se ha postulado que el gen de la catepsina D podra potenciar la susceptibilidad de la apo-E4 (apoenzima E4). La catepsina D es una aspartil-proteasa lisosomal que puede hallarse tanto en lisosomas como en el complejo de Golgi de las clulas. Esta enzima proteoltica es utilizada actualmente como indicador pronstico del cncer de mama; se ha empleado una combinacin entre el receptor para estrgenos (ER) y el receptor para progesterona (PgR), ya que todos se miden en el citosol, obtenidos de un extracto del tumor, y son expresados en nmol/g de citosol. Se ha propuesto su implicacin en la etiopatogenia de la enfermedad de Alzheimer (EA) por sus propiedades similares a la -secretasa in vitro, pues genera fragmentos de ab a partir de protena precursora de -amiloide (APP). En los cerebros de pacientes con EA, catD se localiza en los endosomas tempranos, que son tipos de internalizacin y procesamiento inicial de APP y apo11 y contiene 9 exones. En la posicin 224, localizada en el exn 2 del gen de catD, se caracteriz un polimorfismo que consiste en el cambio de una citosina por una timina y resulta en una sustitucin de un residuo de alanina por un residuo de valina. Este polimorfismo se asocia a un aumento de la secrecin de pro-catD y una alteracin de la maduracin intracelular. Ya que esta mutacin podra tener consecuencias funcionales en trminos de un incremento de la actividad enzimtica, el procesamiento aumentado de APP generara ms cantidad de componentes amiloidognicos, lo que a su vez elevara el riesgo de padecer EA. La catepsina D interviene en la proliferacin y diseminacin de los tumores mamarios pues la proteasa potencia la metstasis favoreciendo el crecimiento celular, disminuyendo la inhibicin por contacto y a su vez activa formas precursoras latentes de otras enzimas proteolticas como las catepsinas B y L. A
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E. El gen de catD est localizado en la regin 15.5 del brazo corto del cromosoma

pH cido la catepsina D acta como una proteasa y a pH neutro como ligando de diferentes receptores, preferentemente el del factor de crecimiento insulnico tipo II. Los primeros trabajos evidenciaron la asociacin entre incrementos citoslicos D y un mayor riesgo de recidiva y muerte en los tumores mamarios sin afectacin ganglionar axilar. As, cifras superiores a 60 pmol/mg prt fueron, junto al tamao, factores pronsticos independiente de un menor intervalo libre de enfermedad y una mayor propensin a recidivas loco-regionales. Asimismo, junto al inhibidor 1 del sistema de activador del plasmingeno (PAI-1) la catepsina D permite definir un subgrupo de tumores mamarios con reducidas posibilidades de recidivas, con el activador del plasmingeno tipo uroquinasa (u-AP) puede dar informacin til acerca de la evolucin de ciertos subtipos de tumores y por s misma puede predecir el beneficio del tamoxifen en los casos receptores de estrgenos positivos (Ruibal y cols., 2001).

Figura 1. Estructura tridimensional de la

JUSTIFICACIN

catepsina D humana.

La catepsina D es una proteasa lisosomal acdica presente en la mayora de los rganos y tejidos de animales. La enzima Catepsina D ha sido blanco de estudio para determinar su funcin, actividad y cmo se puede aplicar el conocimiento en favor de la disminucin de los casos de cncer de mama. Su actividad enzimtica, se ha determinado que tiene efecto en proliferacin y diseminacin de los tumores mamarios, y adems se ha demostrado que la enzima es secretada por las clulas de cncer de mama con actividad promotora del crecimiento y proteoltica extracelular, sin embargo la sobreexpresin de la protena tambin se ha visto que favorece la disminucin del cncer.

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El objetivo del presente trabajo es reunir informacin sobre la enzima, su funcionamiento, factores inhibidores y activadores, y el efecto que produce en clulas cancergenas con el fin de tener una visin general de sus potencialidades y posibles aplicaciones en el rea de la medicina. Adems, estudiaremos el mtodo de obtencin de la enzima, extraccin, purificacin y aplicaciones industriales.

HIPTESIS
Usando tcnicas de extraccin y purificacin de la catepsina en tejidos de hgado de pollo y rata, se podr desarrollar un protocolo que pueda ser utilizado para la extraccin de catepsina D humana con el fin de utilizarla para estudios de cncer.

OBJETIVOS
General
Desarrollar el protocolo terico que nos lleve a la purificacin de la catepsina D humana.

Particulares
Investigar los protocolos actualmente utilizados para extraer catepsina en
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animales. Comparar los resultados obtenidos en cada uno de ellos y formular una propuesta de protocolo para la catepsina D humana.

MTODOS

Extraccin de protena total y Autolsis

Precipitacin

Fraccionamiento con acetona

Cromatografa por afinidad

Cromatografa por intercambio inico

Exclusin, precipitacin, fraccionamiento.

La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los lmites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos. Obtenindose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberacin de las protenas de inters evitando la degradacin trmica o las alteraciones secundarias por oxidacin, protelisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de tcnicas de disrupcin celular, que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) mtodos fsicos mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin a alta presin o extrusin por presin; b) mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin, descongelacin, sonicacin o secado; c) mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes, cidos o sustancias caotrpicas Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separacin y purificacin de los componentes celulares. Como primera medida, puede realizarse una
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centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelos especficas. En este caso, las protenas asociadas a membrana quedarn en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugacin) y las solubles en el sobrenadante. En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan las protenas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamao o carga, proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias en la solubilidad de las protenas.

Cromatografa de Afinidad.
La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la

matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.

Cromatografa de Intercambio Inico

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo de separacin que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases, la fase estacionario o intercambiador inico y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electroestticas fijas, que tienen contra iones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil. La fase mvil suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas en forma de buffer. Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por los sitios de la fase estacionaria. El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de una forma reversible de modo inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con tampones de diferente pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn con el material por los sitos de unin. Nuestra propuesta solucin es la siguiente:
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que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente

El hgado se descongela durante toda una noche.

Se homogeniza la muestra en Cloruro de Sodio al 1%

Se disuelve Cloruro de Calcio Dihidratado en la mezcla y se agrega Fosfato hidrogenado dipotsico

Se agita la mezcla vigorosamente.

Se ajusta el pH a 7.

Se centrifuga a 1500g por 30 min a 15C

El sobrenadante se ajusta a pH 3.6 y se incuba una noche en bao mara a 37C

La solucin se enfra hasta 2C con acetona a -10C.

Se centrifuga por 15 min a 0C y 1500g; se elimina el sobrenadante.

Una segunda porcin de acetona se agrega al precipitado.

Se filtra (Hyflo Super Cell)

Se tira el filtrado y la parte solida se suspende en un volumen mnimo de 50mMEDTA en 50mM Tris-HCL a pH 8

La suspensin se dializa por 24 horas, cambiando dos veces EDTA-Tris.

Se vuelve a dializar con buffer 2mM tris-HCl, pH 9, hasta que alcance un pH 7.5

Filtrar

400 ml de preparado de enzima se aplica en una cama de celulosa Whatman DE52

Se eluye la columna a 110ml/h con un gradiente linear de 0-0.2 de Cloruro de Sodio en tris-HCl.

Se colectan las fracciones (10 ml) y muestras de 1microl se toman para el ensayo enzimatico.

La cama se lava con el mismo buffer (30 ml) antes de eluir la enzima.

Fracciones de 3 ml se recogen a un flujo de 30 ml/h.

Las fracciones que contienen proteina se combinan y se dializan con una solucin de glicina 1%.

La mezcla se corre en una columna LKB Anfolina 8101 en un gradiente de sucrosa, pH 5-7.

La muestra fue introducida en la parte del gradiente negativo.

La columna se corre por 48 h a 600 V con un flujo de agua fra a 4C.

La columna se introduce a una cmara de luz UV, se opera a 280 nm.

El flujo fue recogido para ensayos enzimaticos.

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100 ml de la mezcla enzimatica se corre en una cama de celulosa Whatman CM 52, con buffer de acetatos a pH 4.75.

RESULTADOS ESPERADOS
En la tabla que se presenta a continuacin se muestran los resultados esperados del protocolo experimental. La actividad especfica esperada de la catepsina humana no es tan alta como la de la catepsina de pollo, sin embargo, este es el protocolo con mejores rendimientos que se han encontrado en la literatura y es suficiente para la investigacin.

INNOVACIN Y APLICACIONES
Seg Rawlings (2013) la Catepsina D tiene diversas aplicaciones en distintas reas de la medicina, en un principio solo se consideraba como una enzima involucrada en la digestin intracelular. Actualmente se ha visto que tiene un alto impacto en aspectos fisiolgicos y patolgicos tales como:

Genes y mecanismo de control de la Expresin

La catepsina D es un gen formado por 9 exones localizados en el cromosoma 11p15. Las regiones promotoras del gen as como la caja TATA son indicadores de que existen otros mecanismos de regulatorios que controlan la expresin de este gen. Por tal razn esta es una protena ha sido un objetivo en la terapia gnica.

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Modelos knock-out
La importancia de la catepsina D, fue por primera vez observada en estudios con ratones para el desarrollo de organismos knock-out, donde se detect que los organismos modelo presentaban atrofia intestinal, la destruccin de clulas linfticas y la acumulacin de liposomas en neuronas as como afecciones en la retina. Esto sugiere que la catepsina D juega un papel importante en la regulacin y el desarrollo del crecimiento de tejidos durante el modelamiento celular.

Distribucin de rganos y localizacin celular

La catepsina D, se ha demostrado que se expresa en todos los rganos y tejidos ya que se localiza en los liposomas. Se ha reportado que ha altas concentraciones de suero la catepsina D tiene efectos patolgicos. El zimgeno de catepsina D ha sido detectado en humanos y bovinos y cuando existe una deficiencia importante de la enzima se relaciona con los procesos dependientes de otras protenas.

Apoptosis
Estudios sobre esta enzima sugieren su papel en la apoptosis como un regulador de la induccin o inhibicin de la misma. Tiene tanto propiedades apoptticas como anti apoptticas. Esta enzima funciona buscando sitios especficos de activacin y de acuerdo a una seal previa determina si la clula es funcional o ya mostraron que la catepsina D, induce de manera directa la apoptosis pero al mismo tiempo es un mediador que se regula por seales exgenas.
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puede realizar el proceso de apoptosis. Estudios con organismos knock-out

Rol en el desarrollo de cncer

Rocheford (1980) realiz estudios que describieron la expresin del precursor de la enzima en lneas celulares, lo que ocasion un gran avance ya que se pudieron ubicar las principales funciones de esta enzima que se pueden dividir en 3 grandes grupos: Mecanismo de secrecin Su rol en los procesos extracelulares Su importancia para el diagnstico y la prevencin de ciertas enfermedades. La secrecin de procatepsina D en cierto tipo de clulas parece ser consecuencia de la sobreexpresin y saturacin de las rutas de inters. Reportes acerca de las

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funciones de la catepsina D en la matriz extracelular de las clulas cancergenas muestra dos posibles modelos de accin. El primer modelo la procatepsina D puede ser activada por el medio cido generado alrededor de los tejidos tumorales y procesada por otras protenas que promueven el crecimiento de tumores y el desarrollo de metstasis en otros tejidos. El segundo modelo es en el cual la procatepsina D acta como un agente mitgeno independiente se su actividad proteoltica que se demuestra mediante estudios de clulas mutadas que no pierden su actividad mitgena.

PERSPECTIVAS
Todas estas razones realzan la importancia de la enzima ya que al ser parte principal del metabolismo y de los procesos fisiolgicos as como los recientes estudios sobre su papel en la regulacin de la apoptosis celular as como en la formacin de clulas cancergenas la vuelve un objeto de estudio relevante que se puede utilizar como base para el desarrollo de una terapia gnica o sus extraccin y purificacin significara producirla en grandes cantidades y poder desarrollar algn medicamento para poder ser probado primero qumicamente en el humanos e incluso hablar de una comercializacin y venta al mercado de un producto con alto impacto en los tratamientos de cncer ya sea como mtodo de diagnstico o de prevencin.
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laboratorio y con organismos modelo para despus hacer las pruebas en seres

CONCLUSIONES
La catepsina D es una proteasa lisosomal dependiente de estrgenos que se sintetiza en tejidos normales y es sobreexpresada y secretada por algunos tumores de mama. Su precursor proteico (pro-catepsina D) tiene actividad mitognica y en un ambiente cido ocasiona protelisis de membranas basales, por lo que se ha postulado que esta enzima favorecera la invasin y el desarrollo de la metstasis. Esta enzima est localizada en los lisosomas y fagolisosomas de las clulas de tumores mamarios y en macrfagos que se pueden encontrar en estos tejidos, como parte del infiltrado inflamatorio. Coincidentemente se ha

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observado que los niveles de catepsina D tienden a ser mayores en los casos con metstasis positivas. Niveles altos de catepsina D se encuentran en un tercio de los carcinomas mamarios. Su sobreexpresin est asociada con un alto riesgo de recurrencia y baja sobrevida, principalmente por su relacin con el compromiso ganglionar. Mediante la creacin de un protocolo para la purificacin de esta enzima se pueden realizar diversos anlisis que pueden ayudar a la creacin de mtodos de deteccin o terapias gnicas que podran ser una propuesta para reducir el ndice de incidencia de cncer por metstasis.

Trabajos citados
Kenji, Y. (1979). Cathepsin D of Rat Spleen. European Journal of Biochemestry, 459-467. Rawlings, N. (2012). Handbook of Proteolytic Enzymes. Boston: Academic Press. SISIB. (2010, Enero). Biblioteca Digital de la Universidad de Chile. Retrieved from Mtodos Generales para la obtencin indutrail de enzimas: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmace
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