ARTIGO MODELAGEM MOLECULAR: UMA FERRAMENTA PARA O PLANEJAMENTO RACIONAL DE FRMACOS EM QUMICA MEDICINAL1 Eliezer J.

Barreiro* & Carlos Rangel Rodrigues DTF - Faculdade de Farmcia - Universidade Federal do Rio de Janeiro - CP 68006 21944-390 - Rio de Janeiro - RJ Magaly Giro Albuquerque, Carlos Mauricio Rabello de SantAnna & Ricardo Bicca de Alencastro Departamento de Qumica Orgnica - Instituto de Qumica - Universidade Federal do Rio de Janeiro - Cidade Universitria, CT, Bl. A - Lab. 622 - 21949-900 - Rio de Janeiro - RJ Recebido em 18/4/96; aceito em 19/9/96

MOLECULAR MODELING: A TOOL FOR RATIONAL DRUG DESIGN IN MEDICINAL CHEMISTRY. The molecular basis of modern therapeutics consist in the modulation of cell function by the interaction of microbioactive molecules as drug cells macromolecules structures. Molecular modeling is a computational technique developed to access the chemical structure. This methodology, by means of the molecular similarity and complementary paradigm, is the basis for the computer-assisted drug design universally employed in pharmaceutical research laboratories to obtain more efficient, more selective, and safer drugs. In this work, we discuss some methods for molecular modeling and some approaches to evaluate new bioactive structures in development by our research group. KEYWORDS: molecular modeling; medicinal chemistry; drug design.

INTRODUO Em nenhuma outra rea da Qumica, o conhecimento completo da estrutura molecular to essencial como na Qumica Medicinal. Esta disciplina das Cincias Farmacuticas estuda as origens moleculares da atividade biolgica dos frmacos, determinando os parmetros que relacionam estrutura e atividade e aplicando estes fundamentos no planejamento racional dos frmacos2. As teorias desenvolvidas para explicar a atividade farmacolgica das drogas sustentam-se, numa primeira aproximao, no paradigma da chave-fechadura3. Neste modelo, as fechaduras ou receptores celulares so biomacromolculas de extrema sensibilidade, responsveis pelo reconhecimento molecular de espcies endgenas e exgenas capazes de apresentar atividade biolgica. Estes receptores interagem reversivelmente, em geral, com as molculas bioativas (mediadores celulares endgenos e frmacos), consideradas neste modelo como as chaves. Os complexos formados entre as molculas bioativas e os receptores provocam as respostas biolgicas e dependem de um mecanismo de reconhecimento molecular que determina a seletividade dos bioreceptores. O padro de seletividade a expresso do reconhecimento nvel molecular de apenas uma substncia dentre os inmeros compostos estruturalmente relacionados disponveis na biofase. A propriedade de reconhecimento molecular depende essencialmente da estrutura qumica e, em ltima anlise, determina a atividade farmacolgica de uma substncia2. Muitas vezes, um bioreceptor apresenta enantioespecificidade, ou seja, reconhece apenas um dos enantimeros de uma substncia quiral. Este ismero bioativo denominado eutmero . O outro enantimero, que no reconhecido pelo bioreceptor, chamado distmero3,4. Esta situao talvez o exemplo mais notvel da especificidade das interaes droga-receptor e de sua dependncia das relaes estruturais4,5. A nvel experimental, o conhecimento da estrutura molecular de uma substncia no tarefa simples. No so muitos os mtodos capazes de caracterizar completamente uma dada estrutura, permitindo sua descrio precisa em termos de distncias e

ngulos de ligao, alm de ngulos de toro (ou ngulos diedro) que difinem sua conformao. A cristalografia de raios-X6-8 , ainda, a tcnica experimental mais eficiente para a obteno destes dados. Limita-se, todavia, a substncias em fase cristalina. Alm disto, no h garantia de que a conformao no estado cristalino seja a mesma das molculas em soluo6,9, ou ainda a geometria assumida no complexo droga-receptor na biofase. Dentro deste contexto, a modelagem da estrutura molecular por mtodos computacionais surgiu como uma alternativa, especialmente aps o desenvolvimento de programas capazes de calcular a estrutura com um compromisso adequado entre velocidade e preciso, somados aos recursos da computao grfica e crescente diminuio dos custos de mquinas de alto desempenho capazes de operar estes programas e recursos10. A modelagem molecular consiste em um conjunto de ferramentas para a construo, edio e visualizao, anlise e armazenamento de sistemas moleculares complexos2,5. Estas ferramentas podem ser aplicadas em estratgias de modelagem direta e indireta de novas drogas2. Na primeira aproximao, faz-se o ajuste da droga a uma estrutura de receptor conhecida, por exemplo, atravs de dados de cristalografia de raios-X6,7 ou de ressonncia magntica nuclear (RMN)11,12. Na segunda aproximao, faz-se a anlise comparativa das estruturas de molculas ativas e de molculas inativas ao nvel de um determinado bioreceptor, utilizando-se o conceito de complementaridade para o desenvolvimento de um modelo topogrfico hipottico do stio receptor, denominado modelo farmacofrico. Existem muitas opes quanto ao mtodo de clculo a ser aplicado em uma determinada estratgia de modelagem molecular. Estes mtodos basicamente diferem quanto natureza do campo de fora, ou seja, do conjunto de funes de energia e parmetros numricos associados. Os campos podem ser totalmente empricos, como os utilizados em mecnica molecular, ou, no outro extremo, puramente tericos (mtodos ab initio), passando pelos chamados mtodos semi-empricos. A aplicao de um ou outro mtodo determinada pelo compromisso entre tempo e preciso dos resultados e pela complexidade do sistema a ser analisado2. Neste trabalho sero discutidos, brevemente, alguns mtodos
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e metodologias empregados em modelagem molecular e alguns exemplos de abordagens feitas pelo nosso grupo de pesquisa para avaliar e definir novas estruturas bioativas em desenvolvimento no Laboratrio de Avaliao e Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio). Mtodos de clculo utilizados em Modelagem Molecular O mtodo da mecnica molecular13 baseia-se na viso clssica da estrutura molecular como um conjunto de esferas unidas por molas com constantes de fora caractersticas. O campo de foras neste caso constitudo pelo somatrio de termos de energia relacionados s posies de equilbrio do sistema (distncias de ligao, ngulos de ligao, ngulos diedros, distncias de van der Waals, ligaes hidrognio, interaes eletrostticas, etc.) s quais podem ser associadas penalidades energticas para seu afastamento, isto , as constantes de fora das molas. Em geral, estas constantes de fora so avaliadas por meio de dados espectroscpicos. A principal vantagem da mecnica molecular a rapidez na avaliao de sistemas moleculares complexos. Os pacotes de programas de mecnica molecular (AMBER, CHARM, DISCOVER, MM2/MMP2, PCMODEL-MMX, SYBIL, etc.) utilizam diferentes funes de energia potencial para representar a energia interna de uma molcula7,14,15. O campo de fora AMBER (Assisted Model Building with Energy Refinement), por exemplo, expresso pela equao (1)15:

es hidrognio, importantes em sistemas biolgicos, o mtodo PM3 tem apresentado resultados mais prximos aos obtidos experimentalmente e por clculos ab initio22-24. As diversas aproximaes semi-empricas permitem evitar o clculo de um grande nmero de integrais, o que possibilita a aplicao destes mtodos em sistemas com um nmero maior de tomos. Nestes mtodos, os ncleos so assumidos em sucessivas posies estacionrias, sobre as quais a distribuio espacial tima dos eltrons calculada pela resoluo da equao de Schrdinger. O processo repetido at que a energia no mais varie dentro de um limite escolhido, ou seja, at se alcanar um ponto estacionrio da superfcie de energia. Esta procura por um estado estacionrio da geometria calculada no espao multidimensional o equivalente computacional da purificao experimental de uma amostra antes de se avaliar suas caractersticas fsico-qumicas. Em um sistema no estado fundamental, isto significa que a geometria tal que o calor de formao (Hf) um mnimo irredutvel (na verdade um mnimo irredutvel local), ou seja, todas as suas constantes de fora so positivas; para estados de transio, o sistema deve ter exatamente uma constante de fora negativa25,26. Deste modo, tem se tornado prtica comum nos trabalhos tericos de qualidade, a avaliao de todas as segundas derivadas (constantes de fora) da energia molecular em funo dos parmetros moleculares, para se determinar inequivocamente a natureza dos pontos estacionrios encontrados no processo de otimizao da geometria da estrutura25. METODOLOGIAS E PARMETROS USADOS EM MODELAGEM MOLECULAR

(1) em que os trs primeiros termos representam, respectivamente, as energias de deformao dos comprimentos e ngulos de ligao e ngulos diedro, dentro da aproximao harmnica; o quarto termo corresponde energia das interaes no ligantes (London) e eletrostticas (Coulomb); e o quinto termo representa as contribuies de ligaes hidrognio13,15,16. Outros exemplos so o campo de fora MM2, muito utilizado para molculas de baixo peso molecular, desenvolvido por Allinger13 e o campo de fora MMX, contido no programa PCMODEL, sendo derivado do campo MM2, acrescido de rotinas -VESCF (Valence Electron Self-Consistent Field) para clculos de sistemas . Os mtodos de mecnica quntica14,17, por outro lado, permitem maior preciso nos resultados, alm de fornecerem dados sobre a estrutura eletrnica, que no considerada na mecnica molecular. Isto implica em um custo computacional (tempo de computao e capacidade de memria necessria) maior. Os pacotes de programas de mtodos qunticos ab initio (CADPAC, GAMESS, GAUSSIAN, HONDO, etc.) e semiempricos (AMPAC, MOPAC, etc.) so baseados no formalismo de orbitais moleculares com diferentes abordagens7,14,15. Nos mtodos ab initio, um modelo para uma funo de onda particular selecionado e os clculos necessrios so realizados sem simplificao. Em tais abordagens o erro est associado ao conjunto de bases selecionado e ao nvel de tratamento da correlao eletrnica18. Os mtodos semi-empricos so baseados no mesmo formalismo dos mtodos ab initio, mas parte de seus parmetros so ajustados a dados experimentais. A parametrizao dos mtodos semi-empricos com dados experimentais aumentou significativamente a acuracidade qumica e a velocidade dos mtodos de orbitais moleculares. O sucesso desta abordagem indicado por inmeros estudos mostrando dados energticos que variam na faixa de 1,0 kcal/mol dos dados experimentais15. Os mtodos semi-empricos mais recentes so AM1 (Austin Model 1)19 e PM3 (Parametric Method 3)20,21, contidos nos pacotes AMPAC e MOPAC. Do ponto de vista da estrutura das liga-

A modelagem de uma estrutura permite isol-la e congella. Estruturas com tempos de vida muito curtos, tais como intermedirios de reao ou estados de transio hipotticos podem ser modelados e suas propriedades medidas com relativa facilidade14,27. A possibilidade do estudo das conformaes e propriedades de uma molcula isolada, simulando o estado gasoso, ou da molcula solvatada, ainda que por um nmero pequeno de molculas de solvente, permite predizer as conformaes preferenciais em cada caso particular. Em muitos casos, dados experimentais de espectroscopia de microondas podem ser utilizados para comparao com os dados calculados para a molcula isolada. Dados de difrao de raios-X e de difrao de nutrons podem tambm ser empregados, desde que se considere as foras de empacotamento cristalino. Estudos espectroscpicos de RMN e de infravermelho (FTIR) em soluo, podem ser tambm comparados com os dados calculados para a molcula solvatada, desde que se mantenham certas propriedades caractersticas do solvente, como por exemplo, a capacidade de formar ligao hidrognio e a constante dieltrica. Exemplos nesse sentido so, dentre outros, os programas computacionais capazes de simular a solvatao28, ou os que fornecem bancos de dados de estruturas tridimensionais de molculas que possuem os requerimentos estruturais exigidos para que se observe uma determinada bioatividade 29,30. Alm de fornecer dados estruturais, os clculos tericos so usados tambm na computao de ndices de interesse qumico e farmacolgico, tais como: calores de formao, energias eletrnicas, energias do HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) e do LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital), energias de ionizao, densidades eletrnicas atmicas, cargas atmicas lquidas, densidades eletrnicas dos orbitais de fronteira (HOMO e LUMO), ordens de ligao e momentos de dipolo, entre outros2,31. Dentre estes parmetros, as energias do HOMO e do LUMO esto correlacionadas s habilidades de doador e aceptor de eltron, respectivamente. Uma maior energia do HOMO est correlacionada com uma maior probabilidade de doar eltrons, enquanto que uma menor energia do LUMO est

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relacionada a uma maior facilidade em aceitar eltrons31,32. Expresses como CADD (Computer Aided Drug Design, desenho de drogas assistido computacionalmente), entre outras, foram recentemente incorporadas linguagem da Qumica Medicinal. Trata-se de uma metodologia que visa determinar distncias interatmicas e densidades eletrnicas de molculas de interesse biolgico, estudar o equilbrio conformacional das biomolculas definindo as conformaes potencialmente bioativas, explicar racionalmente as atividades farmacolgicas de substncias e definir, confirmar ou descartar hipteses para o mecanismo de ao a nvel eletrnico e molecular de diversos frmacos e, finalmente, identificar interaes especficas entre drogas e receptores, definindo os grupamentos farmacofricos33,34. possvel definir, ainda, hipteses topogrficas para stios receptores de diversas classes de drogas, deduzindo tridimensionalmente a interao molecular de uma determinada droga e seu receptor, modelando biomacromolculas-alvo (stios ativos de enzimas, de receptores e de cidos nucleicos; ou enzimas, receptores e cidos nuclicos ntegros) e a interao destas com molculas efetoras (substratos e agonistas naturais; frmacos inibidores, agonistas e antagonistas)9. Deste modo, pode-se planejar, numa base racional, novas drogas mais especficas e potentes, capazes de emprego teraputico mais seguro. Pelo exposto, conclui-se que a modelagem molecular, incluindo a anlise conformacional e o clculo de propriedades e parmetros estereoeletrnicas e fsico-qumicos, auxilia a interpretao das correlaes entre a estrutura qumica de uma substncia e sua atividade farmacolgica, sendo, portanto, uma importante ferramenta para o planejamento racional de novos frmacos2. APLICAES DE MODELAGEM MOLECULAR EM QUMICA MEDICINAL Neste tpico descreve-se alguns resultados recentes do LASSBio ilustrativos dos projetos desenvolvidos em nosso grupo de pesquisas na aplicao de tcnicas de modelagem molecular em Qumica Medicinal. Estudo de Inibidores de Cicloxigenase (COx) e 5-Lipoxigenase (5-LO): Proposta de Novos Inibidores Seletivos de 5-LO O cido araquidnico (cido 5-Z,8-Z,11-Z,14-Z-icosatetraenico, AA), liberado a partir de fosfolipdeos de membranas celulares pela enzima fosfolipase A235,36, desempenha um papel importante na inflamao. Como substrato para as enzimas 5-lipoxigenase (5-LO) e cicloxigenase (COx) - tambm conhecida como prostaglandina endoperxido sintase (PGHS) - o cido araquidnico produz, respectivamente, o hidroperxido (AA-OOH) que subsequentemente reduzido a leucotrienos (LTs), e o PGH2 que origina as prostaglandinas (PGs) (Fig. 1). Revises recentemente publicadas descrevem vrios aspectos dos inibidores de 5-LO37-39.

Figura 1. Esquema do metabolismo do cido araquidnico (AA).

O LTB4 um potente agente quimiotctil para as clulas inflamatrias (polimorfonucleares, PMN) e pode ter um papel importante na ltima fase da inflamao, comumente observada em pacientes asmticos. Os LTC4, LTD4 e LTE4, coletivamente identificados como substncias de reao lenta da anafilaxia (SRS-A), tm efeitos farmacolgicos potentes sobre as contraes dos msculos lisos, o estimulo da secreo de muco bronquial e o aumento da permeabilidade vascular, sendo considerados mediadores importantes dos processos alrgicos40,41. O emprego de tcnicas de modelagem molecular permitiu que fossem calculadas superfcies de energia potencial (parciais) utilizando o Hamiltoniano AM142-45 para vrios derivados de pirazolinas ( 1-2) e de indazolinonas (3-7), descritos como inibidores de COx e 5-LO. Foram tambm estudados alguns derivados de 5-tioaril-N-fenil-pirazis (8a-g ) sintetizados no LASSBio 46 que, embora estruturalmente relacionados com compostos anti-edematognicos da classe dos 5-arilamino-N-fenil-pirazis, no apresentaram atividade antiinflamatria significativa.. Estes estudos visaram a identificao de propriedades estereoeletrnicas, dependentes das estruturas, que pudessem estar relacionadas atividade inibitria. A partir dos resultados e considerando o mecanismo molecular de ao correntemente aceito para este tipo de atividade farmacolgica, foi possvel propor novos inibidores mais seletivos da enzima 5-LO42-45. A 5-LO uma enzima ferro-no-heme dependente, encontrada primariamente em PMN e eosinfilos. Como dito acima, esta enzima catalisa a bioformao dos leucotrienos a partir do cido araquidnico (Fig. 1), estando envolvida, portanto, nos eventos inflamatrios40,47. O mecanismo de ao de lipoxigenases proposto por Musser & Kreft 48, Chasteen et al. 49 e Schilstra et al.50 foi adotado em nossos estudos. Estes autores consideram a participao de um ciclo redox Fe(II)/Fe(III) neste mecanismo oxidativo. Cucurou et al . 47 indicaram que no caso da inibio da lipoxigenase-1 de soja (L-1), os inibidores BW755c ( 1 ) e fenidona (2) so oxidados a um ction-radical que seria a espcie ativa na inibio da atividade enzimtica. A etapa determinante do processo parece ser a oxidao enzimtica do tomo de nitrognio heterocclico (N1), destes inibidores (17), pelo Fe(III)48. A Figura 2 ilustra o mecanismo proposto. O processo de inativao de L-1 inicia-se com a oxidao da fenidona a um ction-radical (F+)51. Este ction-radical (F+) ou outras espcies radicalares (F ) geradas pela atividade peroxidase de L-1 parecem estar envolvidos na inativao irreversvel de lipoxigenases, entre elas a L-1 (Fig. 2). Ensaios com agentes redutores tais como o cido ascrbico e derivados de tiis (glutationa=GSH; etanotiol=RSH) foram realizados47, objetivando analisar o papel das espcies radicalares no processo de inativao de L-1. Os resultados demonstraram que ocorre reduo dos derivados radicalares (F ou F+) forma neutra (F) (Fig. 2). Entretanto, a ao nucleoflica do cido ascrbico e dos tiis no foi observada com os metablitos eletroflicos da fenidona j que estudos com fenidona[14C] no revelaram a presena de adutos marcados47. A oxidao posterior de F ou F+a 1-fenil-1H-pirazol-3-ol poderia ocorrer atravs de diferentes reaes (Fig. 2). Primeiramente, por dismutao, gerando fenidona e seu derivado desidrogenado (Fig. 2, via a) 42. Em segundo lugar, a oxidao pela L-1 poderia levar a desidro-fenidona via carboction ou on imnio, F+ (Fig. 2, via b). Esta espcie poderia formar ligao covalente com a protena por reao com um resduo nucleoflico de um amino-cido. Esta hiptese tem suporte experimental na correlao linear observada entre a formao de ligao covalente e a inativao da lipoxigenase47. O papel do oxignio na inativao da L-1 sugere, finalmente, a possibilidade de oxidao do ction-radical (F+) a desidro-fenidona e O2- (via c). Esta ltima espcie (O2-) poderia ser responsvel pela inativao da L-1 por um mecanismo relacionado

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Figura 3. Inibidores de 5-LO e COx (1-7 e 8a-g ).

Figura 2. Possvel mecanismo molecular da inativao da Lipoxigenase de soja (L-1) por 7 e 8 proposto por Cucurou et al .47

oxidao da metionina (Fig. 2). Na Tabela I esto descritos os dados fsico-qumicos mais relevantes, calculados por AM1, assim como as atividades farmacolgicas destes derivados. Os compostos 1-7 (Fig. 3,

Tabela I) so inibidores 52 de COx e 5-LO, sendo o derivado ICI207968 (7)52 o mais seletivo a nvel de 5-LO. Os compostos 8a-g (Fig. 3, Tabela I) foram sintetizados no LASSBio46 como provveis bioissteros com atividade antiinflamatria, apresentando, entretanto, fraca atividade. Os dados da Tabela I no evidenciaram qualquer relao entre os momentos de dipolo ou os potenciais de ionizao e a atividade inibitria. Entretanto, as densidades eletrnicas (DE) sobre N1 so muito diferentes para os compostos ativos e inativos. Esta diferena sugere que altas densidades eletrnicas so desejveis para a atividade. As densidades eletrnicas de 8a-g parecem insuficientes para participarem do ciclo redox inibitrio. Estes resultados suportam a hiptese mecanstica mencionada anteriormente e justificam a fraca atividade observada para os derivados sintticos da srie 8. Os dados da Tabela I sugerem, tambm, que as DEs sobre N2 tambm so muito baixas para participarem do ciclo redox. A anlise dos dados mostra que existe inverso de atividade atra-

Tabela I. Densidade eletrnica no HOMO (DEHOMO), momento de dipolo (m) e potencialde ionizao (PI) calculados por AM1 e atividade observada para os compostos 1-8: DEHOMO N(1) 1 2
a

N(2) 0,20 0,12 0,32 0,27 0,31 0,29 0,30 0,34 0,16 0,16 0,07 0,02 0,07 0,10 0,12 (D) 5,0 1,9 3,8 4,0 4,1 3,1 2,9 2,7 7,5 4,5 5,5 6,0 8,9 5,7 5,0

PI (eV) 8,5 8,4 9,1 8,8 9,0 9,1 9,1 9,2 8,7 8,8 9,0 8,7 9,2 8,7 8,9 LO 20,00 10,00 10,00 0,27 0,36 1,80 2,40 1,50 -

IC50 (mM) (in vitro)c COx 5 3 3 13 18 > 100 280 > 300 LO/COx 4:1 3:1 3:1 1:50 1:50 1:50 1:100 1:200 -

0,60 0,58 0,54 0,51 0,49 0,49 0,47 0,45

d

2b 3 4 5 6 7 8a

0,09 0,08 0,05 0,03 0,04 0,05 0,06

8b 8c 8d 8e 8f 8g
a

Forma enol bForma cetona cInibio de leucotrieno B4 (inibio de 5-LO) e prostaglandina E2 (inibio de COx)52 dResultados farmacolgicos no publicados

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vs da 5-LO e COx para os compostos 2 (DE N1=0,54) e 3 (DE N1=0,51), o que parece sugerir que valores menores de DE (37) esto associados com maior seletividade para 5-LO. Como uma extenso desta hiptese, uma srie de derivados triazlicos (9a-f) com as caractersticas estruturais mnimas necessrias atividade desejada foram planejados, considerando o perfil farmacolgico procurado42. Estes compostos, derivados do di-hidro-1,2,3-triazol (9a-f) (Fig. 4, Tabela II), so anlogos estruturais do BW755c (1)47 e da fenidona (2) e pos-

Figura 5. Inibidores propostos 10a-h para a 5-LO (derivados pirrlicos e pirazlicos).

Tabela III. Densidade eletrnica do HOMO (DEHOMO), momento de dipolo () e potencial de ionizao (PI) calculados por AM1 para os compostos 10a-h: DEHOMO N(1) 10a 10b
Figura 4. Inibidores propostos 9a-f para a 5-LO (derivados 1,2,3triazlicos).

X(3) 0,02 0,07 0,02 0,02 (D) 1,1 2,2 1,6 3,2 3,7 1,3 1,7 2,2

PI (eV) 9,3 9,3 8,9 8,9 9,1 8,5 8,7 8,5

N(2) 0,33 0,19 0,19 0,17 0,43 0,02 0,02 0,02

0,04 0,24 0,03 0,05 0,12 0,13 0,03 0,12

10c 10d

Tabela II. Densidade eletrnica do HOMO (DEHOMO), momento de dipolo () e potencial de ionizao (PI) calculados por AM1 para os compostos 9a-f: DEHOMO N(1) 9a 9b 9c 9d 9e 9f 0,41 0,35 0,06 0,06 0,43 0,45 N(2) 0,26 0,28 0,26 0,22 0,27 0,20 N(3) 0,06 0,09 0,20 0,07 0,13 0,07 (D) 2,8 1,0 1,1 2,8 3,3 2,4 PI (eV) 8,9 8,7 8,9 8,8 8,8 8,8

10e 10f 10g 10h

priedades hidrofbicas adequadas, determinar o perfil farmacocintico que as novas substncias podero apresentar, viabilizando sua avaliao farmacolgica in vivo. Estudo Terico da Tromboxana A2: Proposta de uma Conformao Bioativa Como mencionado anteriormente, a cicloxigenase (COx), tambm conhecida como prostaglandina endoperxido sintase (PGHS), responsvel pela ciclizao-oxidativa do cido araquidnico (AA, 11) a endoperxido de prostaglandina H2 (PGH2, 12), que isomerizado pela tromboxana sintase (TXS)

suem um segundo anel fenila de forma a potencializar suas propriedades hidrofbicas e, em consequncia, aumentar a seletividade frente a 5-LO53. O padro de substituio em C5 foi concebido de forma a permitir estudos mecansticos. A Tabela II descreve os resultados obtidos para estes compostos pelo mtodo AM1. Considerando a hiptese descrita acima, que correlaciona a atividade com a densidade eletrnica, espera-se que os derivados 9a, 9e e 9f se comportem como o composto 7, inibindo seletivamente a enzima 5-LO. Espera-se, por outro lado, que os compostos 9c e 9d sejam inativos. Foi proposto, ainda, uma segunda srie de derivados heterocclicos baseada nos mesmos critrios farmacolgicos, os derivados 10a-h (Fig. 5, Tabela III) 45. A Tabela III contm resultados obtidos pelo mtodo AM1. Como os compostos 8ag (Tabela I), as DEs sobre N1 destes derivados so muito baixas, impedindo a participao no ciclo redox Fe(II)/Fe(III). Entretanto, algumas densidades eletrnicas sobre N2 tem os valores desejados, o que permite antecipar que o composto 10e deve agir como um inibidor de ambas as enzimas 5-LO e COx, sendo seletivo frente a 5-LO. O composto 10a, no qual observou-se uma baixa densidade eletrnica sobre N2, deve ser ativo em relao a 5-LO mas inativo em relao a enzima COx. Os resultados obtidos nestes estudos47 antecipam a hiptese de que a modulao da carga residual sobre o tomo de nitrognio heteroaromtico pode determinar as propriedades inibidoras sobre COx/5-LO, permitindo o planejamento de inibidores seletivos de 5-LO. Outrossim, a conjugao de pro-

Figura 6. Bioformao da TXA 2 ( 13) e da TXB2 ( 14)a partir do cido araquidnico ( 11 ).

tromboxana A2 (TXA2, 13), uma substncia com meia vida de 3 minutos nas condies fisiolgicas e que se transforma em tromboxana B2 (TXB2, 14), um metablito estvel com perfil biolgico35 distinto (Fig. 6).

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A TXA 2 ( 13 ) um vasoconstritor potente no sistema cardiovascular e um indutor potente da agregao plaquetria e da reao de liberao plaquetria no sistema sangneo, atuando a nvel de receptores especficos. O PGH2 ( 12) possui um perfil farmacolgico semelhante ao da TXA2 (13 ) com propriedades agonsticas no receptor de TXA235. Nestes sistemas biolgicos a TXB2 (14) inativa. O receptor de TXA2

Figura 7. Estrutura dos prostanides U-46609 ( 15 ) e U-46619 (16), anlogos estveis de PGH2 (12 ) e TXA2 (13).

Figura 8. Representao esquemtica do stio receptor da tromboxana A2(TXA2, 13), a partir do receptor TP modelado por Yamamoto et al. 56, demonstrando a interao entre o receptor TP e a TXA2 ( 13).

(TP) comumente referido como receptor de TXA2 e PGH2 uma vez que estes icosanides produzem efeitos biolgicos semelhantes. De fato, anlogos estveis do endoperxido natural PGH2 (12) tais como U-44609 (15) e U-46619 (16) (Fig. 7) mimetizam os efeitos da TXA254 (13). Recentemente, a seqncia de aminocidos do receptor TP humano foi deduzida a partir da seqncia de nucleotdeos do clone de cDNA que o codifica, utilizando-se tecido de placenta humana e de um clone parcial, obtido a partir de uma cultura de clulas leucmicas megacariocticas humanas55. Acredita-se que o receptor TP pertena famlia de receptores acoplados protena-G (GPCR) por apresentar sete domnios transmembrnicos, uma caracterstica dos GPCR, e uma significativa homologia sequencial com o receptor de rodopsina, um membro desta famlia55,56. Estes conhecimentos permitiram que o receptor de TXA2 fosse modelado56 por mecnica molecular, com base em sua seqncia de aminocidos e na estrutura tridimensional da bacteriorodopsina, obtida por criomicroscopia eletrnica. Esta enzima tambm contm sete segmentos transmembrnicos, mas como apresenta pouca homologia seqencial com a rodopsina56, o modelo gerado deve ser usado com cautela, na falta da estrutura cristalogrfica. O stio do receptor assim modelado apresenta dois resduos de aminocidos, Arg295 e Ser201, separados por uma regio hidrofbica. A Arg295 parece interagir com a carboxila terminal da TXA255 (13) De fato, o ajuste da TXA2 (13) ao receptor modelado permite identificar as interaes entre o grupamento cido carboxlico terminal da TXA2 (13) e o resduo de Arg295, e entre a hidroxila allica em C-15 e o resduo de Ser201. Estes estudos, porm, no indicaram nenhuma interao envolvendo os tomos de oxignio do sistema bis-oxabiciclo[3.1.1]-heptano e outros resduos de aminocido do receptor (Fig. 8). A estrutura da TXB2 (14) (Fig. 6), o metablito estvel da TXA2 (13) que no possui propriedades agregantes plaquetrias, determinada por difrao de raios-X57, mostrou duas formas de cristalizao, denominadas e (Fig. 9, a e b) de conformao semelhante, exceto quanto orientao das cadeias 58, com a funo cido carboxlico terminal orientada em direes opostas. Neste estudo, foi sugerido que a estrutura da TXB2 (14) pode ser comparada com a da TXA2 (13) porque, apesar da TXB2 (14) ser inativa a nvel das plaquetas, a preferncia de ligao dos anis endocclicos so suficientemente diferentes para assegurar um reconhecimento molecular distinto entre estes dois prostanides57. O estudo de diversos agonistas e antagonistas do receptor

Figura 9. Estruturas cristalogrficas (a) e (b) da TXB2 ( 14)57.

de TXA2 (13) por FTIR em soluo diluda de CCl4, mostrou a formao de ligao hidrognio intramolecular em muitos deles59,60. Por exemplo, o composto U-46619 (16) (Fig. 7), um conhecido eficiente agonista do receptor TP, apresenta 80% das suas molculas na conformao estabilizada por ligao hidrognio intramolecular entre a carboxila e a hidroxila, formando um macrociclo de quinze membros, relativamente rgido59. Nestes estudos, o CCl4 foi usado como solvente porque sua constante dieltrica (=2,23 a 25oC) semelhante encontrada no interior das protenas. Os autores concluiram que embora a conformao predominante no deva ser a bioativa, porque compromete a funo carboxila, considerada um farmacoforo importante para as atividades agonista e antagonista, esta no deve diferir muito daquela determinada em CCl459,60. Este tipo de argumento no considera, entretanto, que

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o microambiente em que o agonista ou o antagonista interagem no receptor, isto , o stio receptor, formado por resduos de aminocidos diversos, que podem inclusive atuar como doadores ou aceptores em ligaes hidrognio, alterando a conformao da molcula. Este microambiente, portanto, no perfeitamente mimetizado por um solvente apolar incapaz de interagir com a molcula por ligaes hidrognio. Pelo contrrio, razovel supor que compostos contendo, simultaneamente, grupos doadores e aceptores de hidrognio, diludos em solventes apolares, formem, preferencialmente, ligaes hidrognio intramoleculares, desde que a geometria molecular o permita, e o fator entrpico no seja desfavorvel. De qualquer forma, como salientado no prprio trabalho59,60, o estudo conformacional da TXA2 (13) em soluo diluda de CCl4 pode ser til como subsdio para a modelagem da conformao atravs de clculos tericos, usualmente realizados com a molcula isolada, simulando o vcuo (=1) 59,60. Ezumi et al.61 tambm estudaram por mecnica molecular e orbitais moleculares (MNDO) a TXA2 (13) e o composto U46619 (16) dentre outros compostos, e assumiram que a conformao bioativa no deve diferir muito das conformaes mais estveis no estado gasoso. Estes autores propuseram duas conformaes bioativas para estes dois prostanides, uma envolvendo ligao hidrognio intramolecular, semelhante encontrada em CCl4, e outra, mantendo basicamente a geometria anterior, porm, com a carboxila do cido terminal e a hidroxila em C-15, opostamente orientadas61. Recentemente, foi proposto por mecnica molecular e orbitais moleculares um modelo espacial do stio farmacofrico do receptor de tromboxana A262, com base no estudo das conformaes mais estveis de cinco conhecidos antagonistas de receptor de TXA2. Nossos resultados sobre a anlise conformacional da TXA2 (13 ) pelo mtodo AM144,45,63,64, conseguiram classificar as conformaes obtidas para a TXA2 (13) em dois grupos distintos. Um, representado pela conformao 1 (Fig. 10, a), onde ocorre formao de ligao hidrognio intramolecular, como no caso do anlogo U-46619 (16)59,61, e o outro, representado pela conformao 2 (Fig. 10, b), na qual as cadeias e 58

esto relativamente afastadas e, tanto a carboxila do cido terminal como a hidroxila em C-15 esto orientadas em direes opostas, porm distintas daquelas propostas por Ezumi et al.61. Estes resultados foram obtidos a partir de um estudo de sobreposio molecular, no qual foram considerados o tomo de carbono C-1 da carboxila terminal, um dos tomos de oxignio do anel endoperxido ligado em C-9, e o tomo de oxignio da hidroxila em C-15 da estrutura da TXA2 (13) (Fig. 6), para a sobreposio dos pares de conformaes em anlise. As conformaes 1 e 2 da TXA2 (13), selecionadas por representarem conformaes distintas, foram sobrepostas, ento, s conformaes e da TXB2 (14) obtidas por difrao de raios-X57. As sobreposies da conformao da TXB2 (14) Tabela IV. Sobreposio das conformaes e da TXB2 (14) (por raios-X57) com as conformaes 1 e 2 da TXA2 (13) (por AM145), relacionando os desvios mdios obtidos pelo pareamento de trs tomos de cada estrutura: Conformaes sobrepostas TXB2 a a b b TXA2 1 2 1 2 Desvio mdio () da distncia entre 3 pares de tomos 3,3 0,8 2,7 0,6

com as conformaes 1 e 2 da TXA2 (13) apresentaram desvios mdios de 3,3 e 0,8 , respectivamente, enquanto que as sobreposies da conformao da TXB2 (14) com as conformaes 1 e 2 da TXA2 (13) apresentaram, desvios mdios de 2,7 e 0,6 , respectivamente (Tabela IV). Assim, as sobreposies obtidas com os melhores nveis de similaridade conformacional, ocorreram entre as conformaes ou da TXB2 (14) e a conformao 2 da TXA2 (13). Cabe ressaltar que a TXB2 (14) no apresenta atividade a nvel de receptor de TXA2 (13) e, portanto, a melhor sobreposio poderia ser desfavorvel para a conformao 2 da TXA2 (13). Entretanto, observando-se melhor a estrutura da TXB2, podese notar que o sistema oxacclico apresenta duas hidroxilas, conferindo elevada hidrofilia a esta regio da molcula, distintamente ao que ocorre na TXA2 (13). Como conseqncia, este autacide no deve ser reconhecido pelo receptor TP, muito provavelmente, devido a esta diferena de carter lipoflico ao nvel da sub-unidade estrutural complementar ao stio hidrofbico estereo-exigente do receptor TP62 e no porque apresentaria uma conformao inadequada. Os resultados destes estudos indicam que a conformao 2 pode representar a conformao bioativa da TXA 2 (13), possuindo como referncia, uma conformao similar da TXB2 (14), no estado slido, podendo ser ento utilizada como modelo farmacofrico no planejamento de novos antagonistas de rceptor TP45,63. Estudos de Nova Classe de Antagonistas do PAF Baseados no Sistema Prottipo Biciclo[3.3.0]-2-oxaoctano, como Isstero Cclico O fator de ativao plaquetria (PAF, 17) um mediador celular que foi inicialmente identificado como um estimulante da agregao plaquetria65 e como agente hipotensivo66. Posteriormente, foi reconhecido como ativador dos leuccitos polimorfonucleares, moncitos e macrfagos67 e como estimulante do aumento da permeabilidade vascular68, da broncoconstrio e do choque circulatrio69. Estes efeitos fisiolgicos esto relacionados a uma srie de estados patolgicos, tais como

Figura 10. Conformaes 1 (a) e 2 (b) da TXA2 (13) obtidas por AM145.

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a asma, isquemias cerebral, renal e do miocrdio, ulcerao gstrica, psorase e choque endotxico69. O composto 17 um fosfolipdeo de estrutura geral 1-Oalquil-2-acetil-sn-gliceril-3-fosfocolina70 (Fig. 11), possuindo

Figura 11. Estrutura do PAF (17), n = 15 ou 17.

Figura 14. Estruturas diastereoisomricas dos antagonistas (18a-d ) de 17 propostos como anlogos conformacionalmente restritos, baseados no biciclo[3.3.0]-2-oxaoctano.

predominantemente, nos neutrfilos humanos, grupamentos O-alquila lineares com 16 e 18 tomos de carbono71. O (R)enantimero consideravelmente mais ativo do que o (S)71. Sua bioformao ocorre na membrana celular em consequncia de diversos estmulos fsicos e qumicos externos. Receptores especficos presentes na membrana citoplasmtica de clulas-alvo, incluindo plaquetas, macrfagos, neutrfilos, leuccitos, eosinfilos, entre outros, atuam como mediadores das aes de 1772. Aps a clonagem e a determinao de sua sequncia primria, o receptor do PAF (PAFr) foi identificado como membro da famlia dos receptores celulares acoplados a protenas G73. Todavia, sua estrutura tridimensional permanece desconhecida. Tentativas foram feitas para modelar o PAFr74,75, mas os modelos resultantes ainda so muito imprecisos para explicar as sutis exigncias estruturais que resultam em elevada afinidade de seus agonistas e antagonistas76. Um modelo mais especfico de receptor76 foi desenvolvido usando a tcnica de Monte Carlo Salto de Boltzmann para explicar o binding da classe de antagonistas heterocclicos de nitrognio-sp2. Mais recentemente foi proposto, por Bures et al.77, um mapa

tratamento de patologias trombticas, decidimos desenvolver uma nova classe de derivados PAFant possuindo o sistema biciclo[3.3.0]-2-oxaoctano (18a-d) como anlogos estruturais de 17 conformacionalmente restritos (Fig. 14)78-81. Estas estruturas foram propostas supondo-se que a interao antagonista-PAFr principalmente de natureza entrpica, como tem sido sugerido para outros sistemas82,83. A reduo da flexibilidade molecular apresentada pelo sistema bicclico em relao ao esqueleto de glicerol de 17 resultaria em uma menor penalidade entrpica paga pelo antagonista ao se ligar ao receptor, compensando, pelo menos em parte, uma variao menos favorvel na entalpia do processo84. Os estudos de modelagem molecular destas substncias visaram definir, dentre os diastereoisomros passveis de sntese a partir do biciclo[3.3.0]-2-oxaoctano (i.e. 18a-d), o ismero com maior similaridade estrutural com o agonista. Os clculos foram executados com o Hamiltoniano AM1 do programa de orbitais moleculares semi-empricos MOPAC 6.0 85 em uma estao de trabalho IBM RISC System/600078-79. Como as estruturas descritas so compostas das mesmas unidades bsicas, empregamos como estratgia para economizar tempo de mquina a subdiviso das estruturas previamente otimizadas em 3

Figura 12. Mapa farmacofrico para antagonistas do PAF77.

farmacofrico (Fig. 12) para antagonistas do PAF (PAFant), desenvolvido a partir da estrutura tridimensional de cinco antagonistas potentes conhecidos de 17, de acordo com o concei-

Figura 13. Representao esquemtica dos antagonistas do PAF denitrognio quaternrio: X representa um isstero de fosfato e Y representa um isstero de ster69.

Figura 15. Representao esquemtica do procedimento de modelagem molecular usado para definir as estruturas de energia mnima. Os ngulos diedros em destaque foram avaliados conforme descrito no texto. A estrutura recomposta representada corresponde ao diastereoisomro 18c .

to de Farmer de um ligante com trs stios para uma alta afinidade antagonista-receptor62. A primeira classe desenvolvida de PAFant foi a dos antagonistas com nitrognio quaternrio, estruturalmente relacionados a 1769, representados esquematicamente na Fig. 13. No mbito dos interesses de pesquisas do LASSBio, particularmente a descoberta de novos compostos prottipos teis no

fragmentos (Fig. 15). Cada ngulo de toro do fragmento B foi varrido isoladamente entre 0o e 360o por incrementos de 20o. As estruturas de energia mnima encontradas nestas superfcies parciais de energia potencial (SEP) foram totalmente caracterizadas por suas matrizes de Hess. Os fragmentos de menor energia assim identificados foram recompostos nas estruturas originais (18a-d) e os ngulos ao

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redor das ligaes de juno foram avaliados independentemente entre 0o e 360 o por incrementos de 30o. Uma completa relaxao da geometria foi permitida nesta etapa e no foi observada nenhuma alterao significativa nos valores iniciais dos ngulos de toro previamente pesquisados. As estruturas de menor energia assim obtidas foram completamente reotimizadas (mtodo BFGS86-89) adotando-se uma norma de gradiente menor do que 0.1 kcal/( ou rad). Estas estruturas foram inequivocamente caracterizadas como mnimos de energia pela anlise de suas respectivas matrizes de Hess. Inicialmente, examinamos os derivados metlicos dos antagonistas propostos (18a-d, R=CH3). Para se avaliar as estruturas obtidas, utilizamos o mapa farmacofrico desenvolvido por Bures et al.77 para antagonistas de 17 (Fig. 12). Para comparao das estruturas 18 com o mapa da Fig. 12, escolhemos o grupamento metila como o equivalente da regio hidrofbica do stio receptor; o tomo de oxignio do sistema bicclico como o aceptor de ligao hidrognio, e o tomo de nitrognio piridnico como o N-aromtico. Apesar dos tomos de nitrognio das estruturas dos antagonistas envolvidos na gerao do mapa farmacofrico no possuirem carga positiva permanente, Tabela V. Dados de distncia e calor de formao (DHf) para os derivados metlicos dos antagonistas propostos ( 18a-d, R=Me). Para definio do cdigo dos antagonistas, veja a Fig. 14. N-R representa a distncia N aromtico-regio hidrofbica, X-R, a distncia aceptor de ligao H-regio hidrofbica e NX, a distncia N aromtico-aceptor de ligao H. Os nmeros em negrito esto de acordo com o modelo77. Estrutura N - R () X - R () N - X () Hf (kcal/mol) 18a 11,8 3,1 9,3 -289,5 18b 9,3 5,7 8,1 -287,5 18c 7,2 4,4 8,9 -290,54 18d 7,5 5,3 8,4 -289,84

como nos antagonistas que propusemos, Bures et al. sugerem que estes tomos podem estar na forma protonada ao interagir com o receptor77. Os resultados obtidos para (18a-d, R=CH3) encontram-se resumidos na Tabela V, juntamente com os calores de formao calculados (Hf). A anlise da Tabela V indica que as quatro estruturas tm energias semelhantes, o que sugere que estas so principalmente dependentes de interaes de curta distncia. Pode-se observar que nenhum dos derivados metilados dos antagonistas propostos 18a-d encaixa-se completamente no mapa

farmacofrico. No caso dos derivados 18b e 18d, a substituio da cadeia a na posio 3 do sistema bicclico coloca o tomo de nitrognio aromtico muito prximo do aceptor de ligao hidrognio. Por outro lado, as dificuldades do ajuste das estruturas 18a e 18c ao mapa localizam-se em ambas as distncias que envolvem a regio hidrofbica. Como estas distncias podem, em princpio, ser otimizadas pelo aumento da cadeia alqulica, decidimos avaliar o efeito da presena de cadeias mais longas nas estruturas 18a e 18c , buscando maximizar seus padres de ajuste ao modelo farmacofrico. As conformaes mais estendidas de quatro diferentes cadeias alqulicas (alila, propila, butila e hexila) foram substitudas no fragmento C. Aps otimizao, estes novos fragmentos foram ancorados aos fragmentos A e B e o ngulo de toro das ligaes de juno avaliado como antes. As estruturas de menor energia tiveram suas geometrias otimizadas e caracterizadas de acordo com os critrios adotados anteriormente. Os resultados encontram-se na Tabela VI. As distncias entre o nitrognio aromtico e o aceptor de ligao de hidrognio, naturalmente, permanecem de acordo com o modelo. Duas referncias diferentes podem agora ser adotadas para se avaliar as distncias que envolvem a cadeia alqulica: o seu limite superior (adotando o tomo de carbono mais distante) ou o seu centro de massa (adotando a distncia mdia entre os tomos de carbono mais prximo e mais distante). Adotando-se como referncia o centro de massa da cadeia alqulica, o derivado hexlico (18a, R=hex) se encaixa ao modelo. Nos derivados 18c, a configurao relativa cis das cadeias e coloca o nitrognio aromtico e a regio hidrofbica prximos demais, prejudicando seu ajuste ao modelo farmacofrico. Quando consideramos para comparao o limite superior da cadeia alqulica, os derivados 18c tambm no se ajustam ao mapa farmacofrico, mas, agora, praticamente todos os derivados 18a se ajustam. A distncia entre o aceptor de ligao hidrognio e a regio hidrofbica do derivado allico de 18a est ligeiramente abaixo do valor mnimo (5,1 ) correspondente no mapa; no derivado hexlico, esta distncia maior (10,69 ) do que o valor mximo correspondente do mapa (8,5 ), mas esta distncia reflete apenas os limite superior das estruturas modeladas. O PAFr deve provavelmente aceitar cadeias alqulicas maiores, j que a regio hidrofbica presente em 17 bastante longa. Estes resultados subsidiaram a sntese de derivados estruturalmente relacionados com 18a , ora em andamento no LASSBio90. CONCLUSES O uso integrado de conhecimentos tericos e experimentais, multidisciplinares, no estudo de problemas de interesse biol-

Tabela VI. Dados de distncia e calor de formao (DHf) para os derivados de cadeia longa dos antagonistas propostos (18a) e (18c). Para definio do cdigo dos antagonistas, veja a Fig. 14. N-R representa a distncia N aromtico-regio hidrofbica, X-R, a distncia aceptor de ligao H-regio hidrofbica e N-X, a distncia N aromtico-aceptor de ligao H. CM representa centro de massa e LS, o limite superior. Os nmeros em negrito esto de acordo com o modelo77. R distncia N-R (CM) N-R (LS) X-R (CM) X-R (LS) N-X Hf (kcal/mol) 18a 12,89 13,94 3,97 4,96 9,34 -269,3 alila 18c 7,45 7,77 5,67 6,89 8,86 -271,4 18a 12,92 13,99 4,09 5,10 9,25 -301,9 propila 18c 7,52 7,86 5,68 6,90 8,87 -302,9 18a 13,50 15,17 4,78 6,50 9,24 -308,7 butila 18c 7,74 8,33 6,34 8,24 8,88 -309,7 18a 14,64 17,44 5,95 8,83 9,25 -322,4 hexila 18c 8,51 9,81 7,57 10,69 8,88 -323,4

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gico incluiu, recentemente, a modelagem molecular assistida por computadores (CAMM computer-assisted molecular modeling ou CADD computer-aided drug design, Fig. 16). Metodologias tais como 3D-QSAR 91, tcnicas de qumica combinatria92,93, esta representando fontes de novo de estruturas-prottipo de um ligante enzimtico seletivo e antagonistas/ agonistas de bioreceptores, dentre outras tcnicas computacionais, representam estratgias modernas, essenciais ao planejamento racional de frmacos baseados na estrutura94. Estas no-

Figura 16. Gerao de compostos-prottipos por tcnicas de modelagem molecular.

vas metodologias so capazes de viabilizar a descoberta racional de drogas, baseada no paradigma de similaridade e complementaridade molecular, hoje empregado universalmente em laboratrios de pesquisa das indstrias farmacuticas para acesso a novos frmacos eficientes, seletivos e de uso mais seguro. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem as bolsas de ps-graduao de CRR (e-mail: rangel@aix143.iq.ufrj.br), MGA (e-mail: magaly@ aix143.iq.ufrj.br) e CMRS (e-mail: mauricio@aix143.iq.ufrj.br) e de pesquisa de EJB (e-mail: eliezer.b@unikey.com.br) e RBA (e-mail: bicca@iq.ufrj.br) das agncias financiadoras CNPq e CAPES. As correspondncias podem ser enviadas para Eliezer J. Barreiro, Laboratrio de Avaliao e Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio), Faculdade de Farmcia, UFRJ. CP: 68006, CEP: 21944-390, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Fax (021) 260-2299, (021) 280-1784, ramal: 220. REFERNCIAS 1. Este trabalho a contribuio nmero 14 do LASSBio, UFRJ. 2. Cohen, N. C., Blaney, J. M., Humblet, C., Gund, P. & Barry, D. C. J. Med. Chem. 1990, 33, 883. 3. Silverman, R. B. The organic chemistry of drug design and drug action. Academic Press, San Diego, 1992. 4. Eliel, E. L., Wien, S. H. & Mander, L. N. Stereochemistry of organic compounds . Wiley-Interscience, New York, 1994. 5. Cohen, N. D., Blaney, J. M., Howard, A. E. & Kollman, P. A. J. Med. Chem. 1988, 31, 1669. 6. Abraham, D. J. X-ray crystallografy and drug design. In: Perun, T. J. & Propst, C. L. (eds) Computer-aided drug

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