Clonacin Molecular

La clonacin molecular podra, definirse como la tcnica mediante la cual se produce copias idnticas del material gentico deseado, utilizando para ello clulas (clonacin celular o in vivo), o PCR (clonacin acelular o in vitro). Ambas tcnicas pueden utilizarse conjuntamente en un solo proceso de clonacin. El principio de clonacin molecular, se basa en la insercin de un fragmento de DNA forneo (Reina 2000) en un hospedero de clonaje molecular (Silva,1999) por medio de un vector de clonaje, como por ejemplo un virus o un plsmido (Moreira Mendes, 1998). Una vez que el fragmento de DNA forneo se ha introducido en el hospedero hace que ste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo (Bohinski,1991, Greene Rao, 1999). Y comienza el proceso de clonaje molecular, dando como resultado la replicacin y/o la expresin del gen o los genes introducidos. (Madigan et al, 1998). En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones a todo nivel. Se aplica esta tcnica para la produccin de vacunas (Klug Cummings, 1999), para la produccin de protenas, aminocidos, ribonucletidos (Hashimoto Ozaki, 1999) y la produccin de vacunas de ADN para algunas enfermedades (Griffiths et al, 1998, Klug Cummings, 1999), en el campo mdico. La clonacin molecular en plantas y animales tambin ha provisto la mejora de ciertas especies hacindolas ms resistentes o introduciendo ciertas caractersticas de otros individuos para mejorarlas (Madigan et al, 1998, Klug Cummings, 1999). Otra aplicacin de la clonacin molecular bastante reciente, es la produccin de microorganismos transgnicos para procesos de bioremediacin de hidrocarburos (Keasling Bang, 1998, Timmis Pieper, 1999, Pieper Reineke, 2000; Coates Anderson, 2000), metales pesados como el mercurio (Chen Wilson,1997, Sayler Ripp, 2000).
Para efectos prcticos se puede describir la clonacin molecular en siete pasos (figura 1):

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Obtencin del cido nucleico de inters. Amplificacin del gen de inters mediante PCR. Escogencia del vector de clonacin. Corte con enzimas de restriccin. Ligacin con DNA ligasa. transformacin de la clula anfitriona. Deteccin y seleccin de los clones.

Figura 1 pasos para la clonacin molecular. 1. Obtencin y purificacin del cido nucleico. La obtencin y purificacin del cido nucleico, depende del tipo de rgano y/o microorganismo que requerimos. De acuerdo a ello, se utilizan tcnicas de fraccionamiento y/o lisis celular. Para la purificacin del material gentico, puede utilizar mtodos convencionales, como la utilizacin disolventes orgnicos (fenol, cloroformo o ambos) kit comerciales para la purificacin de RNA o DNA de acuerdo a la necesidad. 2. Amplificacin mediante PCR. El PCR puede definirse como una tcnica invitro que permite la amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA, o indirecta de un RNA (a travs de DNA complementario), como requisito indispensable es necesario conocer la secuencia de una parte de la regin del material gentico, para poder crear los primers necesarios, que permitan la amplificacin del gen a estudiar. Las caractersticas principales de estos primers son: - Que contengan dentro de s, una secuencia de nucletidos que sea reconocida por las enzimas de restriccin, para realizar posteriormente la digestin enzimtica. - Que sean especficos para el gen a amplificar. A travs de programas especiales, se crean los primers (primer3), y se analiza su especificidad (Blast), uniones inespecficas (gen runner), digestin virtual (restriccionmmaper3), etc.

3. Escogencia del vector de clonacin. Vector de clonacin Los vectores de clonacin permiten la unin de los fragmentos de DNA extrao a su propio DNA por medio de sitios de restriccin compatibles, sin afectar su replicacin, por medio de un proceso de recombinacin (Madigan et al, 1998, Moreira Mendes,1998, Klug Cummings, 1999) El vector es el vehculo que transporta el gen o genes de inters al hospedero, que normalmente es una bacteria o una clula eucariota viva. Una vez dentro la clula, el vector se multiplica produciendo varias copias idnticas del gen que transporta (Moreira Mendes, 1998). Para que un vector pueda utilizarse en la tecnologa de clonacin molecular, debera ser fcilmente recuperable de la clula hospedadora, adems de no producir daos. Las caractersticas principales que contiene un vector de clonacin son las siguientes 1- Origen de replicacin ( ori c ): necesario para la replicacin del vector dentro del organismo hospedador. 2- Promotor: Sitio de unin de RNA polimerasa, (regula la transcripcin). 3- Terminador: Sitio de terminacin de la trascripcin. 4- Sitio de unin a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traduccin. 5- Sitio de clonado (polilinker, mltiple cloning site): Regin del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restriccin. 6- Factor de seleccin: Codifica el/o los marcador/es de seleccin que permite diferenciar clulas transformadas. 7- Operador: Regin del ADN a la cual se une una protena reguladora. Actualmente, se usan diferentes tipos de vectores, los cuales pueden ser para clonacin y/o expresin, estos ltimos deben contener un promotor. Los principales vectores utilizados son: los plsmidos, los bacterifagos y cromosomas artificiales de bacterias (BACs) y de levaduras (YACs), entre otros (Madigan et al, 1998, Klug Cummings, 1999).

Figura 2 Caractersticas de un vector de clonacin

.Plsmidos Los plsmidos son molculas de DNA bicatenario de pequeo tamao ( 2-5 kb.) de forma circular de carcter extracromosmico que tienen la capacidad de replicarse autnomamente (20-50 x divisin celular). Adems de transportar los genes de inters (permiten incorporar mximo 10kb), los plsmidos transportan otros genes que le confieren propiedades importantes al hospedador, como ser la resistencia a ciertos antibiticos, los cuales son utilizados como marcadores de seleccin (Madigan et al, 1998, Klug Cummings, 1999). Poseen Dianas para diferentes enzimas de restriccin. (polilinker), Promotor y operador ( figura 4). Comercial mente existen gran variedad de plasmidos, que dentro de su estructura, contiene una secuencia especfica que quedara unida a la secuencia de la protena recombinante de inters formando un dimero proteico. Esta protena adicional le confiere caractersticas especiales, como la capacidad de ser secretada al medio exterior, ser purificada posteriormente por cromatografa de afinidad, producir un color especfico (unin a luciferazas), para el reconocimiento de la protena, entre otros. Cada una de estas caractersticas depende del plasmido utilizado.

Figura 4 plasmido con sus diferentes partes

Bacterifagos y fagos

Los virus ms empleados como vectores para DNA recombinante son los bacterifagos lambda y M13, por su facilidad de incorporar genes de otros individuos a su genoma . Este tipo
de vector facilita infeccin de las clulas hospedero, ya permite inyectar directamente el DNA al hospedero. La capacidad de transporte de DNA forneo por parte del bacterifago, depende,de si se ha manipulado genticamente eliminado partes de la informacin gentica no necesaria para la supervivencia del mismo, en este caso estaramos hablando de un bacterifago por sustitucin, el cual tiene una capacidad de 9 a 23 Kilo bases de DNA forneo. Por el contrario si el bacterifago contiene todo su genoma, estaramos hablando de un bacterifago por insercin, el cual tiene una capacidad para insertar DNA forneo de 10 kilo bases. En la figura 4 se observa Los pasos que se deben seguir para la clonacin de un fago.

Figura 5 pasos clonar DNA forneo en un bacterifago, fago. COSMIDOS Los cosmidos son un hbrido (quimeras) que contiene secuencias del fago ( )y el plasmido; el plasmido proporciona: origen de replicacin, sitios de restriccin, marcadores de seleccin

y el fago (), proporciona la secuencia cos. Dicha secuencia permite el empaquetamiento del material gentico dentro de la capside vrica (fago). El DNA forneo se une con la secuencia cos se empaqueta dentro de la capcide y penetra en la clula inyectada por el virus, pero una vez que est dentro, se comporta como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma del fago lambda se ha eliminado, la porcin de DNA forneo que se puede introducir es mucho mayor (puede transportar hasta 50kb de DNA), lo cual constituye una ventaja frente a los otros vectores. En la figura 6 se observan los pasos para producir un cosmido y clonar DNA .

Figura 6 produccin de un cosmido y clonacin de DNA. CROMOSOMA ARTIFICIAL BACTERIANO (BAC). Son Vector sinttico, derivados del plasmido F, o el fago P1, aceptan entre 100-300kb, Presentan Mayor estabilidad del material gentico ya que no se presentan reordenamientos internos son utilizados principalmente para la creacin de libreras genticas y anlisis de genomas eucariticos complejos. Estos cromosomas bacterianos artificiales poseen los genes de replicacin, y marcadores para la resistencia a antibiticos. CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA (YAC). Vector sinttico, que contienen 3 regiones cromosomicas: centrmeros, telmeros y origen de replicacin, acepta 0.2-1 Mb, contiene marcadores de seleccin, mltiple sitios de clonado. Es un vector adecuado para la creacin de libreras genticas. Se utiliza para clonacin en levaduras (clulas eucariotas). (Figura 7).

Figura 7.Clonacin dentro de un YAC. De acuerdo al tipo de protena, en algunos casos es necesario inducir la expresin de la misma, para lo cual algunos vectores de expresin cuentan dentro de su estructura con secuencias de nucletidos especficos denominados promotores que le confieren al vector la capacidad de expresar la protena en grandes concentraciones cuando se le adiciona al medio un inductor especfico como el IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside). Dicha sustancia se une al represor de los genes de la trascripcin, lo que permite que estos queden libres para expresarse y se genere grandes concentraciones de protena (figura 8).

Figura 3 mecanismo para la induccin y la produccin de protenas

4. ENZIMAS DE RESTRICCION

Las enzimas de restriccin, fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans (Stryer 1995). Estas son enzimas sumamente especficas que catalizan la hidrlisis de los enlaces fosfodister de los cidos nucleicos (Bohinski, 1991), si este corte ocurre en los ltimos residuos del polinucleotido se denominan exonucleasas, y si es a nivel de los nucletidos internos se denominan endonucleasas, adems, estas enzimas son capas de cortar ambas hebras del DNA en lugares especficos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los cidos nucleicos presenten metilacin (adicin de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte. La funcin de las enzimas de restriccin es de proteger al organismo de un DNA extrao. Cuando una porcin de DNA forneo ingresa a la clula, las enzimas de restriccin se encargan de degradarlo cortndolo en pequeos fragmentos, siempre y cuando ste no est modificado al presentar mutilacin.(Smith Wood, 1998). Las enzimas de restriccin trabajan nicamente sobre secuencias especficas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restriccin y producen dos tipos de corte: (1) corte con extremos cohesivos y (2) corte con extremos romos (Griffiths et al, 1998). Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo stas complementarias entre s, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porcin lineal a ninguno de los lados (figura 9).

Figura 9 extremos romos y cohesivos De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restriccin, se conocen dos tipos: las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restriccin, a una distancia que vara

aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombinante. Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia especfica, y son las ms empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisin. Las enzimas de restriccin de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisin del lugar de corte, pero se diferencian de stas en que slo cortan entre nucletidos del mismo tipo; por ejemplo entre dos adeninas. Los extremos cohesivos son los ms empleados en la construccin de DNA recombinante, puesto que al tener una porcin lineal "pegajosa" es ms sencillo que se produzca la unin con el DNA del hospedero, por complementacin de bases, dicha unin se produce por la intervencin de enzimas denominadas ligasas. Las enzimas de restriccin, se nombran con tres letras tomadas del genero y la especie de la bacteria, seguido de una letra mas, que identifica la variante antignica y finalmente un numero romano que determina el nmero de enzimas encontradas en la misma variante antignica (Cuadro 1). Nombre Bacteria origen Variante antigenica Variante enzimatica encontradas III HaeIII Haemophilus aegyptius EcoRI Escherichia coli RY 13 I BamHI Bacillus amyloliquefaciens. H I

Cuadro 1. Nombre de las enzimas de restriccin 5. ligacin. Despus del corte con las enzimas de restriccin, es necesario inactivarlas, para evitar cortes posteriores, cuando se esta realizando el hbrido ( DNA forneo, Vector ), Para esto se coloca la reaccin de digestin a 60C por 10 minutos, posteriormente, se realiza la reaccin de ligacin, usualmente con la enzima T4 DNA ligasa, dejando a baja temperatura (4C), toda la noche. 6. Transformacin de clulas anfitrionas El tipo de clula anfitriona depende principalmente del vector a utilizar y el tipo de proteina a expresar, las mas utilizadas son las siguientes: E.coli (procariota), levaduras (eucariota), HeLa, fibroblastos, clulas de rin de hmster, ovocitos de ratn (mamiferos), bacuolavirus (insectos ), Agrobacterium tumefaciens ( plantas). Una vez que es aislado el fragmento a ser transportado, se ha insertado en el vector y se ha seleccionado un hospedador adecuado, se debe proceder con la transformacin de la clula anfitriona, para que comience el proceso de clonacin de DNA. Para realizar el proceso de transformacin es necesario superar la membrana celular. Para superar esta barrera, se han diseado las tcnicas de transformacin a travs de sustancias,

que se encargan de abrir poros en la membrana o inducir la endocitosis por vas naturales (Reina, 2000), tambin se han diseado equipos como el electroporador y las pistolas de genes entre otros. Los mtodos se pueden dividir en: - Mtodo fsico-qumico: Clulas competentes - Mtodos fsico: electroporacin, microinyeccin y pistola de genes. - Mtodos qumicos: fosfato de calcio, dextrano, polietilenglicol (PEG) y lipoinfeccin. - Transfeccin: infeccin a travs de virus. Mtodo fsico-qumico (Clulas competentes). Mecanismo mediante el cual se permeabiliza la membrana formando poros. Al realizar cambios bruscos de temperatura que producen la despolarizacin de la membrana celular e incubar las clulas con CaCl2 (Cargado positivamente), el cual se une a la bicapa lipidica a travs de los fosfolipidos (cargados negativamente) Figura 10.

Figura 10 formacin de poros a travs de cloruro de calcio. Mtodos fsicos Son aquellos en los que se produce una introduccin mecnica del DNA, como la microinyeccin (Esta tcnica permite la introduccin de material ajeno a la clula mediante una micropipeta), la electroporacin; es una tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a las clulas durante un periodo de tiempo muy corto. Durante este tiempo las clulas despolarizan sus membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran las molculas (DNA), que se encuentran alrededor. La pistola de genes consiste en el Bombardeo de las clulas a travs de micropartculas que contiene el Material gentico. Las micropartculas utilizadas son Tungsteno u oro, estas en presencia de cloruro de calcio y espermidina, permiten que el ADN queda adherido. Una vez dentro del tejido, el ADN se desprende de las micropartculas debido a las modificaciones del entorno inico. (Figura 11).

Figura 11. Microinyeccin y Pistola de genes.

Mtodos qumicos son aquellos en los que se forman complejos para que la clulas sean capaces de aceptar o incorporar una cierta molcula a su citoplasma, por medio del mecanismo normal de endocitosis. Para esta finalidad se usan el fosfato de calcio, el DEAE dextrano y el mtodo de la lipofeccin, los dos primeros se unen al DNA formando complejos asimilables por la clula, mientras que la lipofeccin se basa en el recubrimiento de la molcula de DNA en un complejo de lpidos cationicos capaces de atravesar la membrana.(figura 12).

Figura 12. Mtodos qumicos de transformacin.

8. Deteccin y seleccin de los clones recombinantes. La deteccin de los clulas recombinantes depende de el tipo de vector utilizado y los marcadores que se han incorporado ha estos, se pueden considerar 3 tipos de mtodos de deteccin: -Mtodos de hibridizacin: deteccin de la secuencia de DNA clonado a travs de una sonda marcada. - Mtodos inmunoquimicos : deteccin de la protena codificada por el gen clonado, mediante un anticuerpo especfico. - Mtodos genticos o de seleccin genotpica: En ciertos casos, la expresin del propio inserto produce cambios apreciables en la clula anfitriona, que sirve para reflejar su clonacin con xito. Sin embargo la estrategia mas comn es la deteccin y seleccin basados en la presencia de genes marcadores en el vector: 1. Genes que codifican una protena detectable : Comnmente una enzima para la que se dispone de un sustrato conocido; por ejemplo la -galactosidasa (gen lacZ de E.coli), transforma el sustrato sinttico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol- -galactopiranosido) en un producto de color azul. (Figura 13 )

Fifura 13. Deteccin y seleccin de clones recombinantes. 2. Genes de resistencia a un antibitico: Codifican una protena que permita el crecimiento de la clula anfitriona en presencia de un determinado antibitico (-lactamasa capaz de degradar ampicilina). 3. Genes que complementan defectos nutricionales: En este caso se emplean cepas mutantes de las clulas anfitrionas que no pueden crecer en ausencia de un nutriente. Por ejemplo, levaduras que presentan un defecto en la biosntesis de triptofano, el vector clonado en estas, posee el gen TRP1 con lo que slo las clulas transformadas crecen sin triptofano en el medio.

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La revista: nmero 11 (Enero 2003) La revista: nmero 11 (Enero