Cre Sapiens 04

CReSAPIENS
Revista de divulgacin cientfica del CReSA

Nmero 4. Julio 2013
panorama
Aproximacin a un diagnstico
noticias
Un caf con...
la opinin del experto
CReSA & the city: un blog de todos, para todos
Alberto Allepuz: pelendose entre ordenadores en Barcelona
Nuevas tcnicas moleculares, del Jursico a la televisin de papel

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CReSAPIENS Revista de divulgacin cientfica del CReSA
sumario
Editorial ................................ NOTICIAS .................................. panorama Aproximacin a un diagnstico ...... Marina Sibila Qu sabemos de Millones de copias del ADN en pocas horas ................................... Tuija Kekarainen Aislamiento e identificacin de bacterias ................................ Ana Mara Prez Aislamiento e identificacin de virus ....................................... Rosa Rosell Pruebas diagnsticas basadas en la respuesta inmunitaria ........ Sonia Pina Evolucin tecnolgica de los diagnsticos en sanidad animal ........................... Albert Bensaid Un caf con .................... Alberto Allepuz
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SUMARIO
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Hemos descubierto ........ Elisabet Rodrguez
Futuros investigadores Comunicacin cientfica: otra opcin de futuro tras el postgrado .......................... 22 Paula Lpez hablan las escuelas Importancia del diagnstico para controlar enfermedades ...... Ciencia a la vista Ciencia es invertir en el futuro pero quin la paga? .................... Joaquim Segals Lo que no vemos Los hongos colonizadores ........... La Opinin del experto Nuevas tcnicas moleculares, del Jursico a la televisin de papel ............... Jos Ignacio Nez DiccioCReSA ......................... si quieres saber ms CReSA Training Programs: compromiso con la formacin ......
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editorial
CReSAPIENS
Revista de divulgacin cientfica del CReSA
llegar a recomendar la toma de muestras para poder realizar la analtica laboratorial pertinente.
Editor Elisabet Rodrguez Gonzlez COMIT editorial Albert Moiss Bensaid Elisabet Rodrguez Gonzlez F. Xavier Abad Morejn de Girn Fernando Rodrguez Gonzlez Ignacio Badiola Siz Joaquim Segals Coma Jordi Casal Fbrega Llilianne Ganges Espinosa Mara Montoya Gonzlez Mariano Domingo lvarez Natlia Maj Masferrer Paula Lpez Monteagudo Virginia Aragn Fernndez foto portada CReSA DISEO Y MAQUETACIN Ondeuev.net IMPRESIN Rubens Grup Grfic Depsito Legal: B-13.146-2011
EDITORIAL
La segunda es una fase deductiva, de aplicacin de conocimientos previos que permiten establecer la causa de la problemtica. Esta fase solamente es posible si se interpretan correctamente los datos obtenidos en la fase inductiva, con lo que se necesita una formacin especfica y extensiva en la materia, medicina en el ejemplo indicado.
Dr. Joaquim Segals Coma

Director del CReSA joaquim.segales@cresa.uab.cat
Este contexto permite explicar de forma muy evidente que cuando un mdico (o veterinario) solicita un anlisis laboratorial para poder confirmar u orientar un diagnstico, se presupone que alguien tiene que haber desarrollado, validado y aplicado las mencionadas tcnicas diagnsticas. sta es precisamente una ms de
Qu me pasa, doctor?
conocimiento que trascienden substancialmente al individuo/a que la formula. De hecho, lo que estamos esperando con la respuesta a esta pregunta es que nos formulen el diagnstico de una problemtica determinada. Diagnosticar significa averiguar la causa o causas de algo, siendo este conocimiento el que va a permitir establecer una potencial solucin al problema. Para este diagnstico se necesitan dos fases bien definidas. La primera es una fase inductiva, de investigacin. Se intenta responder a qu, cmo, cundo, cuanto, donde, quin/es y cul es la naturaleza del problema a solucionar. Poneos en situacin tenis un problema respiratorio con tos, malestar general, dolor de garganta y mucosidad! El mdico correspondiente os empieza a formular preguntas: Desde cundo tiene este problema?, Alguien ms de su familia lo padece?, Cmo se inici?, Dnde le duele exactamente?, etc. Es un proceso bsicamente descriptivo donde est recopilando una serie de sntomas clnicos que permitirn orientar a la posible causa de este problema de salud. Lgicamente, en esta fase de investigacin no solamente hay preguntas y respuestas, sino que tambin suele darse el llamado examen clnico, es decir, investigar al paciente y sus sntomas y posibles lesiones asociadas. Es ms, en algunos casos se puede
on toda probabilidad habis odo esta pregunta o la habis formulado a un mdico muchas veces. La simpleza de la cuestin oculta unas capacidades tcnicas y de
las actividades que el CReSA desarrolla en el mbito de la sanidad animal, poniendo a punto nuevas tcnicas y aplicando aquellas necesarias para el diagnstico de mltiples enfermedades que afectan a los animales. En este cuarto nmero de CReSAPIENS podris ver como los autores de los trabajos os quieren acercar al apasionante mundo de las tcnicas diagnsticas y lo que podemos esperar de ellas. Ya veris que la analtica laboratorial no es solamente un papel con unos resultados, sino el resultado del esfuerzo de unos profesionales cuyo objetivo es ayudar en el establecimiento de un diagnstico certero! Finalmente, como en ediciones anteriores, agradecer pblicamente el apoyo econmico de empresas del sector veterinario para que os podamos hacer llegar una nueva edicin de CReSAPIENS. Igual es una frase retrica, pero espero que aprendis mucho mientras la disfrutis leyendo!
Fundaci Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA. Edifici CReSA. Campus de la UAB 08193 Bellaterra (Barcelona) Tel. 935813284. Fax 935814490 www.cresa.cat Para cualquier cuestin o sugerencia sobre CReSAPIENS, contactar con: cresapiens@cresa.uab.cat
noticias
CReSA & the city: un blog de todos, para todos
ecientemente se ha puesto en marcha el blog del CReSA, un blog corporativo dirigido al pblico en general. En CReSA & the city os informaremos sobre nuestras, exposiciones, revistas, cursos, ideas, opiniones, proyectos
de investigacin, y sobre otras muchas actividades que organizamos y que os pueden interesar. Sin tecnicismos, sin complicaciones. Un blog de todos nosotros para todos vosotros. Esperamos que nos sigis y que nos recomendis. Nuestro xito depende de vosotros. www.cresa.cat/blogs/sociedad/
El CReSA ofrece un nuevo servicio de citometra
Curso de epidemiologa organizado por la FAO y el CReSA
e trata del nico servicio de Catalunya que dispone de un citmetro FACSAria I (BD) en condi-
ciones de Bioseguridad de nivel 3 (NBS3), adems de un servicio de citometra en los Laboratorios de Bioseguridad de nivel 2 (NBS2). La citometra de flujo es el anlisis de las caractersticas de clulas mediante la medida automatizada de las propiedades particulares de las clulas. Esta tecnologa tiene aplicaciones en numerosos campos de las ciencias de la vida. Con este nuevo servicio, el CReSA refuerza su cometido de continuar ofreciendo herramientas y actividades de soporte a la comunidad cientfica y a la industria. www.cresa.es/serveicitometria
l Curso avanzado de anlisis, representacin espacial e infe-
terrnea de Sanidad Animal (REMESA): Mauritania, Marruecos, Argelia, Tnez, Libia, Italia, Espaa y Egipto.
rencia de datos de vigilancia veterinaria tuvo lugar en Barcelona durante la semana del 3 al 7 de diciembre de 2012. Organizado por el CReSA y la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO), el curso cont con la participacin de un total de veinte profesionales de servicios veterinarios de pases pertenecientes a la Red Medi-
Colaboraciones con la Red de Salud Animal del Caribe (CaribVET)
as ltimas contribuciones del CReSA con el grupo de trabajo de enfermedades infecciosas de CaribVET han sido el aislamiento y caracterizacin
genmica completa de los virus de influenza pandmica H1N1/2009 de granjas de cerdos de Cuba y la deteccin molecular de torque teno sus virus. CaribVET es una red de colaboracin entre los servicios veterinarios, laboratorios, institutos de investigacin y organizaciones regionales e internacionales para mejorar la colaboracin entre la salud animal y la salud pblica veterinaria en todos los pases y/o territorios del Caribe. www.caribvet.net
noticias
Visita al CReSA por parte de centros tecnolgicos
Un paso ms hacia una vacuna frente a la peste porcina africana
nvestigadores del CReSA han demostrado que es posible proteger a los cerdos frente al virus de la
peste porcina africana (VPPA). Son las conclusiones de un estudio publicado en la revista PLoS One. Desde su entrada en Georgia en el ao 2007, el virus se expande sin demasiado control por pases colindantes. La ausencia de una vacuna eficaz frente al VPPA dificulta an ms el control de la enfermedad. As pues, resulta totalmente necesario obtener una vacuna eficaz y segura frente a la PPA. Argilaguet et al. DNAVaccination partially protects against African swine fever virus lethal challenge in the absence of antibodies. PLoS One. 2012;7(9):e40942.
l pasado 10 de diciembre, un grupo de miembros de los centros asociados ACTec (Associaci Catalana de Tecnologia) realizaron una visita al
CReSA, en Bellaterra. Estas visitas se enmarcan en la iniciativa conjunta entre la Associaci Catalana dEntitats de Recerca (ACER) y la ACTec, por la que se visitan los centros de investigacin para detectar posibles colaboraciones entre entidades. www.acer-catalunya.org
Una nueva vacuna contra la tuberculosis en humanos se prueba por primera vez en cabras
cin frente a la tuberculosis utilizando como modelo experimental la cabra domstica. La vacuna, denominada AdAg85A, ha sido diseada por investigadores de McMaster University (Canad) para prevenir la tuberculosis en humanos, y actualmente se halla en fase I de ensayos clnicos. El estudio, realizado por investigadores del CReSA, abre una nueva va para el estudio de nuevos tratamientos. Prez de Val et al. Goats Primed with Mycobacterium bovis BCG and Boosted with a
nvestigadores del CReSA han realizado el primer estudio de vacuna-
Recombinant Adenovirus Expressing Ag85A Show Enhanced Protection against Tuberculosis. Clin Vaccine Immunol. 2012;19(9):1339-47.
El consejero de Agricultura, Ganadera, Pesca, Alimentacin y Medio Natural visita el CReSA
l pasado mes de octubre, el Honorable Sr. Josep Maria Pelegr, consejero de Agricultura, Gana-
dera, Pesca, Alimentacin y Medio Natural (DAAM) realiz una visita institucional a las instalaciones del CReSA acompaado de representantes del DAAM, del Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentries (IRTA) y de la Universitat Autnoma de Barcelona (UAB). Los asistentes resaltaron la importancia de disponer de un centro de excelencia de estas caractersticas en Catalunya, desde el punto de vista sanitario (salud y bienestar del ganado), social (seguridad y calidad alimentaria, prevencin de zoonosis) y econmico (dado que la ganadera es una actividad de gran importancia en Catalua).
panorama
Aproximacin a un diagnstico
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panorama
El proceso diagnstico consta de varias etapas y termina con la implantacin de medidas de control de la enfermedad. La primera fase de este complejo proceso es la observacin y descripcin de los sntomas o signos clnicos Dra. Marina Sibila Vidal
Investigadora marina.sibila@cresa.uab.cat
cin del agente causal de los signos clnicos observados mediante tcnicas de laboratorio. La seleccin de estas tcnicas se realizar en funcin de la naturaleza de los signos clnicos, el diagnostico presuntivo, de las muestras remitidas, y del objetivo del diagnstico (intervencionista o epidemiolgico). As pues, es muy importante adjuntar en la remisin de las muestras una historia clnica del caso en cuestin. Esta historia clnica debe describir cules son los signos clnicos observados, nmero de animales afectados y tratamiento administrado hasta la fecha. Las muestras se pueden tomar de animales vivos (sangre, orina, heces, hisopos) o de animales muertos (necropsias o bajas) pero siempre teniendo en cuenta el objetivo del diagnstico. Las tcnicas de laboratorio se pueden clasificar en funcin de lo que nos permiten detectar. Es decir, si nos permiten observar las lesiones provocadas por dicha infeccin, detectar el agente
que sufre el paciente (diagnstico presuntivo). Los sntomas (subjetivo) son las percepciones o cambios en el estado de salud que el paciente puede describir. Como en veterinaria e entiende como diagnstico, el resultado/s o conclusin/es de las pruebas realizadas para nuestros pacientes no pueden describir como se encuentran, hablaremos siempre de signos clnicos (objetivo), es decir, observaremos y destacaremos aquellos hallazgos anormales en el estado de salud de los animales. Si con la observacin, categorizacin (gravedad) y clasificacin (descripcin) de los signos clnicos, no tenemos informacin suficiente para llegar a una conclusin, deberemos continuar con la segunda etapa del proceso diagnstico, la determina-
Investigadora del CReSA. Sus lneas de investigacin abarcan estudios sobre epidemiologa molecular, desarrollo de modelos experimentales, desarrollo de herramientas diagnsticas y estudios de eficacia vacunal en diversos patgenos porcinos.
identificar la causa de una enfermedad/ patologa. Esta causa puede tener un origen infeccioso o no infeccioso. Los factores no-infecciosos son muy variables tales como condiciones ambientales, aspectos nutritivos, condiciones de manejo, enfermedades genticas, enfermedades congnitas, intoxicaciones Por otro lado, los factores infecciosos son microorganismos que causan la infeccin, ya sean virus, bacterias, hongos o protozoos. Cuando el agente no es microscpico sino macroscpico (parsitos) hablaremos de infestacin. En el presente artculo nos centraremos en las tcnicas de laboratorio que se utilizan para diagnosticar las enfermedades infecciosas en los animales de produccin. El abordaje habitual de este proceso diagnstico se realiza en la mayora de casos, de forma poblacional (por lote, corral o granja). Esto implica que las muestras para el diagnstico se deben tomar de individuos representativos de la poblacin afectada.
Toma de muestras en una granja de cerdos.
El proceso diagnstico consta de varias etapas y termina con la implantacin de medidas de control de la enfermedad
causal de la enfermedad o de la infeccin, o detectar la respuesta inmune derivada de esta infeccin. La histopatologa es la herramienta diagnstica que nos permite identificar y describir las lesiones presentes en un animal. Para realizar el anlisis histopatolgico se requieren muestras de la zona lesionada de animales vivos (biopsia) o muertos (necropsia). Para cumplir con el carcter representativo
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recipientes estriles. Las principales tcnicas bacteriolgicas que se utilizan para realizar un diagnstico son el cultivo microbiolgico, la tincin de Gram y las pruebas bioqumicas, que nos permitirn aislar, observar la morfologa y clasificar las bacterias en funcin de sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas. Las tcnicas virolgicas son aquellas herramientas diagnsticas que nos permiten aislar e identificar virus. Estos microorganismos son parsitos intracelulares que para multiplicarse de las muestras, es aconsejable realizar
Muestra de tejido teida mediantes tcnicas histolgicas para su observacin al microscopio.
informacin de la presencia del patgeno en las lesiones observadas. Sin embargo, en la mayora de las ocasiones la histopatologa no es suficiente para llegar a un diagnstico definitivo y es un primer paso de un diagnstico diferencial que se debe completar con otras herramientas diagnsticas. Hay tres tipos de tcnicas que nos permiten detectar u observar el agente causal de la enfermedad: tcnicas bacteriolgicas, tcnicas virolgicas y tcnicas de biologa molecular. Las tcnicas bacteriolgicas
utilizan la maquinaria de replicacin de una clula hospedadora. Es por ello que para el aislamiento de estos microorganismos se necesitan clulas vivas que permitan al virus replicarse. Para este cultivo in vitro se pueden utilizar varios soportes biolgicos, siendo los cultivos celulares los ms comnmente utilizados. Una vez se ha realizado el aislamiento vrico, se debe comprobar y cuantificar este crecimiento vrico. Para ello, se utilizan distintas tcnicas laboratoriales tales como, valoracin del efecto citoptico (ECP), inhibicin de la hemoagluti-
la necropsia de 3-4 animales no tratados en la fase aguda de la enfermedad. Las muestras recogidas durante este proceso, se sumergen en formol, permitiendo de esta forma la fijacin y conservacin de los tejidos. Tras un cierto tiempo en fijacin, estas porciones de tejido se cortan muy finamente (micras) y se tien con sustancias que permiten, mediante un microscopio, la observacin y diferenciacin de las clulas y/o tejidos. En algunas enfermedades, la mera observacin de las lesiones nos permitir diagnosticar el agente etiolgico causante de dichas lesiones. En ciertas ocasiones, aparte de la tincin estndar utilizada en las tcnicas histolgicas (hematoxilina/ eosina), se requiere la utilizacin de tinciones histolgicas especiales que nos ayudaran a identificar ciertos agentes causales muy especficos. Por otro lado, tambin podemos recurrir a la deteccin de antgenos o genoma del agente causal en porciones de tejidos fijados en formol mediante tcnicas como la inmunohistoqumica (IHQ), inmunofluorescencia o la hibridacin in situ (HIS). Esta combinacin (histologa ms deteccin de antgenos o genoma) es muy til ya que nos da
Para realizar el anlisis histopatolgico se requieren muestras de la zona lesionada de animales vivos (biopsia) o muertos (necropsia)
son aquellas que nos permiten aislar e identificar las bacterias implicadas en una enfermedad. Para realizar este tipo de tcnicas, se requieren muestras frescas procedentes de animales sin tratamiento antibitico. Estas muestras se deben recoger en nacin (IHA), inmunofluorescencia (IF), inmuperoxidasa (IP), reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Estas tcnicas virolgicas aunque son suficientes para llegar a un diagnostico definitivo, son costosas, laboriosos, caras y lentas. Es por este motivo, que
PANORAMA
estas tcnicas se utilizan en aquellos casos en que es necesaria la identificacin y caracterizacin del virus causante de una infeccin/enfermedad. Las tcnicas de biologa molecular son aquellas tcnicas de laboratorio que nos permiten detectar de forma directa y especfica el cido desoxirribonucleico (ADN) o cido ribonucleico (ARN) del patgeno. As pues, estas herramientas diagnsticas se pueden utilizar para la deteccin de cualquier tipo de agente infecciosos (bacterias, virus, hongos o protozoos) a partir de una gran variedad de muestras (sangre, suero, hisopos, tejidos, orina, heces, ). Sin embargo, hay que tener en cuenta que estas tcnicas detectan la presencia de un patgeno pero no proporcionan informacin sobre la capacidad de multiplicacin/replicacin de dicho patgeno. Estas tcnicas son especficas, sensibles, rpidas y en su mayora automatizables. Sin embargo, son econmicamente ms costosas que las tcnicas tradicionales de laboratorio. La tcnica molecular ms utilizada en diagnstico es la PCR. Esta tcnica se basa en la amplificacin del ADN del patgeno y posterior deteccin. A partir de esta tcnica se han desarrollado otras tcnicas moleculares tales como la PCR multiplex (deteccin de varios patgenos en un solo ensayo), PCR cuantitativa (deteccin y cuantificacin del ADN patgeno presente en una muestra), secuenciacin (identificacin y caracterizacin del material gentico) Adems existen tambin tcnicas moleculares que se basan en la deteccin del material gentico mediante hibridacin. As por ejemplo tenemos la HIS (deteccin del ADN en tejido) o los chips de ADN microarrays (hibridacin del ADN en una superficie slida).
Pruebas bioqumicas en laboratorio de bacteriologa.
Finalmente, las tcnicas serolgicas son aquellas que nos permiten detectar la respuesta inmune (anticuerpos) desarrollada por el animal debido a un contacto previo con un antgeno determinado. Adems de conocer si el animal ha estado en contacto con un antgeno en concreto, ciertas tcnicas serolgicas proporcionan informacin sobre la temporalidad de la
de origen materno (inmunidad maternal) de aquellos producidos de forma activa por el animal. De igual manera, tampoco podremos diferenciar (en la mayora de los casos) los anticuerpos generados en respuesta a una infeccin de los generados tras una vacunacin. La muestra utilizada por excelencia en estas tcnicas es suero sanguneo pero tambin se pueden detectar anticuerpos en otras muestras tales como calostro, leche, saliva o lavado traqueo-bronquial. La tcnica serolgica ms utilizada hoy en da en los laboratorios de diagnstico es el ELISA (deteccin de anticuerpos especficos mediante una reaccin enzimtica colorimtrica). Entre todos los tipos de ELISA existentes, el ELISA indirecta es la variedad ms frecuentemente utilizada. Adems de el ELISA, hay otras herramientas diagnsticas como la IHA, IF, fijacin del complemento y neutralizacin viral que proporciona informacin a distintos niveles pero siempre como eje central la deteccin de la respuesta inmune.
La tcnica serolgica ms utilizada hoy en da en los laboratorios de diagnstico es el ELISA

infeccin (mediante la deteccin de diferente inmunoglobulinas [IgM o IgG]) o de la cantidad de anticuerpos generados frente a este antgeno (ttulos serolgicos). En la mayora de ocasiones la tcnicas serolgicas no nos permitirn diferenciar los anticuerpos
Para sacar el mximo partido a la informacin derivada de estas herramientas diagnsticas, es muy importante la interpretacin de los resultados. Para ello, debemos contextualizar los resultados con otros parmetros tales como caractersticas de las tcnicas diagnsticas utilizadas (sensibilidad y especificidad), calidad y representatividad de la muestras remitidas, condiciones de manejo de la granja, interaccin entre patgenos, tratamiento aplicados en la granja. En conclusin, el diagnstico a nivel poblacional de las enfermedades infecciosas es un proceso complejo que en la mayora de casos requerir la utilizacin de varias tcnicas de laboratorio.
qu sabemos de...
Millones de copias del ADN en pocas horas

Para la amplificacin se sintetizan dos oligonucletidos cortos de modo que tienen secuencia idntica a los extremos del segmento de ADN que el investigador quiere amplificar, de este modo se unen correctamente a Dra. Tuija Kekarainen
Investigadora del CReSA tuija.kekarainen@cresa.uab.cat
copias del segmento de ADN deseado. A travs de ciclos repetitivos es posible obtener millones de copias del ADN en unas pocas horas. Para la reaccin se necesita una mquina que automticamente calienta y enfra las muestras segn los ciclos. El producto del PCR puede ser identificado por su tamao mediante gel en electroforesis, que es lo ms utilizado en analtica (Figura 2). La PCR tiene amplia aplicacin. En medicina veterinaria es ms utilizada para detectar agentes infecciosos o para cribar enfermedades genticas especficas. Tiene aplicaciones en epidemiologa molecular y evolucin,
la cadena del ADN (Figura 1). Estos oligonucletidos se denominan cebadores o primers. En los puntos de contacto, la polimerasa puede empezar a leer el cdigo gentico a travs n 1993, Kary Mullis y Michael Smith fueron premiados con el Nobel por su condel cual dos nuevas cadenas dobles de ADN se forman. A continuacin la muestra se calienta, lo que hace que las hebras se separen de modo que puedan ser ledas de nuevo. El procedimiento se repite una y otra vez, doblando en cada paso el nmero de
Investigadora del CReSA, responsable de la investigacin de los virus del cerdo como circovirus porcino y torque teno virus.
tribucin en el desarrollo de la tcnica de PCR, que hoy en da es uno de las tcnicas ms aplicadas en el anlisis de cidos nucledos. La PCR est basada en la capacidad de la polimerasa de ADN de sintetizar una cadena nucleotdica nueva, complementaria a la cadena molde. Con la PCR es posible replicar segmentos de ADN varios millones de veces.
Figura 1. Principio de amplificacin de cido nucleico por PCR.
La PCR est basada en la capacidad de la polimerasa de ADN de sintetizar una cadena nucleotdica nueva
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y tambin es una potente herramienta en investigacin. Hoy en da la PCR es la tcnica estndar para la deteccin especfica, rpida y sensible de los patgenos vricos y bacterianos en muestras clnicas. Su potencial est basado en la sensibilidad y posibilidad de diagnosticar patgenos que no se pueden cultivar. Sin embargo, la PCR no es til para detectar patgenos de los que carecemos de informacin gentica para el diseo previo de cebadores especficos. La PCR tampoco distingue la capacidad de replicacin de microbios (que en ocasiones puede tener importancia), ya que se limita a detectar la presencia del cido nucledo. Por ejemplo, la resistencia bacteriana a los antibiticos es preferible mostrarla mediante el cultivo de bacterias en presencia del antibitico, aunque tambin existe la posibilidad de examinar los genes responsables del desarrollo de dichas resistencias. Sin embargo la PCR tiene varias ventajas sobre las tcnicas tradicionales basadas en anticuerpos, que miden la respuesta inmune del animal a un patgeno. En particular, las pruebas de PCR son capaces de detectar la presencia de agentes patgenos antes que los mtodos basados en anticuerpos porque la aparicin de stos tarda semanas. La deteccin del patgeno en los estados iniciales de la infeccin puede significar un tratamiento ms temprano. Por otro lado la alta sensibilidad de la PCR hace que se pueda detectar un microbio cuando se encuentra en cantidad inferior a la que causa la enfermedad, es decir, durante una infeccin subclnica. Diagnsticos ms sofisticados pueden descubrir
Investigadora observando un gel de electroforesis en el ordenador. Figura 2. Analtica de producto de PCR en gel electroforesis. M=marcador de tamao. En las muestras 1 a 7 se ha amplificado el patgeno, es decir, estas muestras pertenecen animales infectados. En las muestras 8 a 10 no se ha amplificado el patgeno, es decir, estas muestras pertenecen animales no infectados con este patgeno.
Las pruebas de PCR son capaces de detectar la presencia de agentes patgenos antes que los mtodos basados en anticuerpos
rpidamente el origen de un virus o diferenciar entre un virus proveniente de una vacuna y el de la infeccin vrica natural. Las tcnicas de PCR se pueden utilizar para estudios de la propagacin de la infeccin, y as seguir la expansin de enfermedades infecciosas a travs de continentes o pases. Los investigadores pueden elucidar los modos, rutas y velocidad de transmisin del patgeno. Adems, la PCR se puede utilizar para investigar los genes involucrados en patogenicidad y virulencia de organismos infecciosos. Este tipo de investigacin podra conducir a una mejor compresin de las infecciones, permitir la diferenciacin de las cepas patgenas y no patgenas o ayudar en el desarrollo de nuevas vacunas.
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Aislamiento e identificacin de bacterias

poder ser aisladas ni identificadas (cerca del 90% de las bacterias son no cultivables). Algunas bacterias son beneficiosas para los seres vivos, intervienen en los procesos digestivos, por ejemplo, y otras son patgenas y proAna Mara Prez de Rozas
Investigadora del CReSA ana.perezderozas@cresa.uab.cat
Agar chocolate polivitex (PVX). Los medios slidos te permiten ver todas las colonias diferentes que podemos encontrar en una muestra, mientras que cultivos en caldo se utilizan cuando tenemos un cultivo purificado de una bacteria: Trypticase Soy Broth (TSB), Brain Heart Infusion (BHI). En el caso de un estudio de investigacin o de un contrato en el que estamos trabajando con determinadas bacterias, e incluso cuando el veterinario de campo enva con la muestra un historial clnico y sus sospechas de la posible enfermedad del animal, usaremos medios especficos de enriquecimiento y/o selectivos. Estos medios nos ayudan mediante diversas sustancias que hacen que se favorezca el crecimiento de la bacteria que buscamos y se inhiban otras. Para el aislamiento de Escherichia coli utilizaremos el Agar MacConkey (Mac-A), para Enterococcus spp. el KF Streptococcus Agar (KFSA), para Salmonella spp. el medio Xilosa-Lisina-Tergitol 4 (XLT4), etc. En estos medios, observamos si tenemos o no la bacteria que buscamos, generalmente con una reaccin de color. Para trabajar con bacterias hay cumplir con tres aspectos fundamentales: tener un cultivo puro, para lo cual, mediante estras por agotamiento obtenemos colonias aisladas; otro es saber si las bacterias son Gram positivas o Gram negativas (segn tengan o no un de-
ducen enfermedades. Cuando en un organismo se produce una disbiosis, es decir, un cambio en las cantidades de los microorganismos beneficiosos por alguna causa externa, se produce as bacterias son organismos unicelulares de pocas micras de tamao y de su estudio se Como centro de sanidad animal, al laboratorio del CReSA nos llegan muestras de animales de varios orgenes procedentes de granjas, de un proyecto de investigacin o de un contrato. Generalmente, son de origen porcino, aviar, bovino y cuncola. tambin enfermedad.
Investigadora de CReSAIRTA. Trabaja con bacterias con mtodos tradicionales y tambin con tcnicas moleculares. Realiza estudios de resistencias a antibiticos y de salud intestinal.
encarga la bacteriologa. Las bacterias se pueden encontrar en todas partes, incluso en condiciones ambientales muy extremas, y son muy abundantes: en un gramo de tierra puede haber hasta 40 millones, y en un mililitro de agua dulce, un milln. Las bacterias intervienen en muchos procesos biolgicos pero la gran mayora son todava desconocidas al no
Aislamiento
Dependiendo de la procedencia de la muestra, podemos actuar de dos maneras utilizando los medios de cultivo que tenemos a nuestro alcance.
Los medios de cultivo generales (slidos o lquidos) son muy ricos en nutrientes y permiten la multiplicacin de las bacterias
Cuando llegan muestras de campo sin un historial clnico concreto y no sabemos qu puede tener la muestra hay que sembrar medios de cultivo muy ricos para que puedan crecer todo tipo de bacterias. Los medios de cultivo generales (slidos o lquidos) son muy ricos en nutrientes y permiten la multiplicacin de las bacterias. Estos medios son, por ejemplo, Agar Sangre (AS), Trypticase Soy Agar (TSA) o
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micas y la lectura es bastante subjetiPlaca de cultivo de bacterias en agar sangre (fuente: CDC library).
va. Adems, no siempre la secuencia numrica obtenida corresponde a una identificacin. En el CReSA disponemos de un sistema totalmente automatizado cuyos resultados se obtienen de forma totalmente objetiva. Es el sistema VITEK (Biomerieux, Francia) que trabaja con un soporte semejante a una tarjeta de crdito con 64 pocillos (pruebas bioqumicas y controles) que en unas horas te da la identificacin, tambin mediante un cdigo numrico, de una
terminado tipo de pared bacteriana, lo que constituye la separacin bsica de las bacterias en dos grandes bloques de caractersticas diferentes); y por ltimo, tambin es muy importante saber qu tipo de atmsfera necesitan para vivir, as las bacterias pueden ser aerobias (crecen en una atmsfera normal), anaerobias (su atmsfera necesita mayor concentracin de CO2 y casi nada de O2) y microaerfilas (crecen con unas determinadas concentraciones de CO2 y de O2, 10% y 5%, respectivamente). A partir de los primeros cultivos (primoaislamiento) separamos las diferentes colonias (frecuentemente, en un medio rico, se obtienen cultivos mixtos). La diferenciacin se hace por morfologa, tamao, color, clonando una vez, es decir que nuestro cultivo puro partir de una sola colonia (esto slo puede realizarse una vez) sembrando cada una por separado.
sus caractersticas morfolgicas, tamao y color, y ver sus caractersticas bioqumicas. Hay pruebas de tipo enzimtico directo: las ms frecuentes son la oxidasa y la catalasa. Otras se basan en el anlisis de diferentes vas metablicas: fermentacin de azcares: glucosa, sacarosa, etc. Otras se centran en la liberacin de diferentes sustancias: hemolisinas, toxinas, etc. Antiguamente, la identificacin bioqumica se haca utilizando bancos de tubos con las diferentes pruebas bioqumicas. Era un trabajo muy lento porque las pruebas se iban realizando segn los resultados obtenidos con anterioridad y los cultivos son siempre al menos de 24h. Actualmente hay sistemas ms o menos sistematizados para hacer todo esto. Uno de los ms extendidos es el sistema API, que consiste en unas galeras de pruebas que, con lectura de los cambios de color de las pruebas, se obtiene una secuencia de nmeros que corresponden a una determinada especie bacteriana. El problema del API es que son pocas pruebas bioquLas pruebas bioqumicas permiten identificar las bacterias con las que se trabaja.
lectura que realiza el aparato cada 15 minutos de la densidad ptica de cada pocillo. El nico requerimiento es tener un cultivo puro y saber si la bacteria es Gram positiva o negativa porque el tipo de tarjeta que se usa es diferente (diferentes pruebas en cada caso). Finalmente, el conocimiento del genoma de diferentes bacterias ha permitido en los ltimos aos el desarrollo de herramientas moleculares que permiten identificar y cuantificar mltiples especies bacterianas, incluso en condiciones de no viabilidad.
Identificacin
Una vez tenemos el cultivo puro debemos hacer una tincin de Gram para saber a qu grupo pertenece. A partir de aqu hay que ver de cada colonia
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Aislamiento e identificacin de virus

Los cultivos celulares han sido fundamentales para el desarrollo de la virologa al permitir la replicacin y estudio posterior de los virus. Algunos datos histricos de los cultivos celulares: Wilhem Roux en 1885 mantuvo cRosa Rosell Bellsola
Investigadora del CReSA rosa.rosell@cresa.uab.cat
lulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das; Roux y Jones en 1916 emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar clulas de embriones de pollo, mando una capa fina de clulas que se llama monocapa celular. Esta crece en un medio de cultivo rico en nutrientes (albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc.) y en condiciones de temperatura, pH, CO2 y humedad controlada. Entre los sistemas de cultivos celulares ms utilizados tenemos: Cultivos primarios: se obtienen a partir de clulas disgregadas de un tejido original tomado de un rgano de un animal recin sacrificado. Conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, clulas diploides, su crecimiento in vitro es limitado (1-5 subcultivos). El estar ms cercanas a las clulas que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad que las hacen ms idneas para los aislamientos primarios de cepas virales que las lneas celulares continuas. Lneas celulares continuas: estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron, son clulas heteroploides. Pueden proceder de clulas tumorales o de un proceso de transformacin por mtodos fsicos-qumicos de un cultivo primario; crecen de manera indefini-
Investigadora CReSA/ Departament dAgricultura Ramaderia, Pesca, Alimentaci i Medi Natural de la Generalitat de Catalunya (DAAM). Responsable del diagnstico de enfermedades vricas de declaracin obligatoria por encargo del DAAM e investigadora de la lnea de investigacin en Pestivirus.
os virus son unos parsitos intracelulares estrictos ya que carecen de estructura celular,
estableciendo el primer cultivo celular; en 1952. Grey y col. establecen la primera lnea celular continua, las renombradas clulas HeLa y en 1955 Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos nutritivos de las clulas en cultivo. Las clulas pueden crecer en suspensin o de manera adherente. Algunas clulas viven de forma natural sin adherirse, como las que existen en el torrente sanguneo. Otras necesitan una superficie, como la mayora de clulas derivadas de tejidos slidos. Para la propagacin de los virus, los cultivos celulares ms usados son los cultivos en monocapa que consisten en una capa de clulas que crecen adheridas a la superficie del recipiente. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa por accin de una enzima (tripsina) y/o un agente quelante, que rompen el cemento intercelular que separa las clulas, para luego transferir la suspensin celular obtenida a un recipiente en donde las clulas se adhieren y multiplican for-
tampoco tienen un metabolismo pro-
pio y necesitan una clula hospedadora para poder multiplicarse utilizando para este fin la maquinaria celular. Para aislar un virus de origen animal es preciso disponer de clulas vivas para su replicacin. El origen de las clulas puede ser a partir de animales de experimentacin (el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigacin es deseable disponer de hospedadores ms manejables) o de huevos embrionados de gallina, utilizados mayoritariamente para el aislamiento y produccin de virus aviares como influenza, Newcastle, etc. Pero los cultivos celulares son el mtodo ms ampliamente utilizado para el aislamiento y propagacin de virus, y constituyen una herramienta bsica de aplicacin fundamental en el diagnstico viral ya sea mdico o veterinario.
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Hemoadsorcin
La tcnica de hemoadsorcin se basa en la capacidad de los glbulos rojos de determinada especie animal de unirse a protenas virales que tienen capacidad hemoaglutinante. Si se dispensa glbulos rojos a una monocapa de cultivo celular infectada con virus es posible observar microscpicamente la adherencia de los mismos a clulas que contienen virus. Por medio de esta tcnica, es posible demostrar la infeccin por aquellos virus que presentan protenas hemoaglutinantes.
nantes mediante anticuerpos especficos frente a un virus determinado. Cuando se enfrenta un virus desconocido a un suero especfico, stos se unen impidiendo la hemoaglutinacin (provocando la IHA). Esta tcnica es utilizada para tipificar (identificar) virus con capacidad hemoaglutinante. Tanto la lectura del ECP como de las tcnicas serolgicas de IF y IP necesitan observadores entrenados que determinen correctamente lo que es positivo o negativo.
Tcnicas moleculares
da. Las lneas celulares continuas permiten disponer de un stock ilimitado de clulas idnticas ya sean congeladas o en crecimiento en botella de cultivo para el diagnstico, investigacin, produccin de vacunas, etc. Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica entre el husped y el virus, por lo que es imprescindible en los laboratorios virolgicos disponer de una amplia variedad de lneas celulares con el fin de poder asumir el aislamiento y la identificacin de los virus.
Identificacin del virus de la peste porcina clsica mediante la tcnica de inmunoperoxidasa.
Hemoaglutinacin
La hemoaglutinacin es uno de los mtodos indirectos ms comunes para cuantificar partculas virales en suspensin. Un virus hemaglutinante es capaz de aglutinar glbulos rojos (GR) de determinada especie animal. Por ejemplo para titular virus de Newcastle obtenido de huevos embrionados inoculados se utilizan GR de gallina; para titular virus hemorrgico del conejo se utilizan GR humanos.
Aunque el aislamiento de virus se considera como tcnica gold standard, hoy en da con el desarrollo de nuevas tcnicas de biologa molecular, el cultivo ya no es la tcnica ms sensible. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en una reaccin enzimtica mediante la cual se amplifica selectivamente una secuencia especfica de ADN o ARN del virus. Con esta tcnica es posible en pocas horas obtener un resultado especfico de deteccin de virus tanto de las muestras obtenidas a partir de aislamientos en cultivos celulares infectados, as como tambin de muestras clnicas directamente. Aunque las nuevas tcnicas desarrolladas para la deteccin de virus hayan desplazado por su rapidez y sensibilidad el aislamiento de virus mediante los cultivos celulares, estos siguen siendo imprescindibles para poder aislar (elaboracin de ceparios) y multiplicar los virus para las tcnicas de sueroneutralizacin, la produccin de vacunas virales, determinacin de actividad antiviral, desarrollo de tcnicas diagnsticas utilizadas en la deteccin de un agente en particular, estudios estructurales y bioqumicos de los virus.
Inmunofluorescencia (IF) e inmunoperoxidasa (IP)

Deteccin de clulas infectadas mediante anticuerpos especficos o antisueros generados contra un determinado virus. El anticuerpo o antisuero est marcado con una molcula fluorescente (isotiocianato de fluorescena, IF) o con un enzima (peroxidasa, IP). La lectura, mediante un microscopio, permite observar que las clulas infectadas con el virus muestran fluorescencia (tcnica de IF) o estn teidas de marrn (tcnica IP).
Tcnicas de valoracin del crecimiento vrico en los cultivos celulares

Efecto citoptico (ECP)
El efecto citoptico son cambios degenerativos especficos (prdida de morfologa, contraccin celular, inclusiones citoplasmticas, formacin de sincitios, lisis celular, etc.) observados por microscopia en una lnea celular como consecuencia de la replicacin de un virus.
Inhibicin de la hemoaglutinacin (IHA)

La IHA se fundamenta en el bloqueo de las protenas virales hemoagluti-
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Pruebas diagnsticas basadas en la respuesta inmunitaria

pecializadas (respuesta celular) que llevan a la produccin de anticuerpos (respuesta humoral) encargados de interactuar y eliminar el invasor. Los anticuerpos son detectados en el suero (componente lquido de la Dra. Sonia Pina Pedrero
Investigadora del CReSA sonia.pina@cresa.uab.cat
de ser una clula o una bola de ltex y forman un cogulo que es fcilmente visible. La activacin y fijacin del complemento constituye un importantsimo mecanismo efector del sistema inmune, que facilita la eliminacin en particular de bacterias y parsitos. El sistema complemento es un conjunto de protenas del suero, que interaccionan entre s y con los anticuerpos fijados a microorganismos que llevan a la destruccin de estos ltimos. Para el diagnstico, se utilizan glbulos rojos y antisueros capaces de destruirlos (hemolticos) mediante el complemento. Si a esta mezcla se aade en exceso un microorganismo y anticuerpos que lo reconocen, el complemento ser utilizado por este nuevo complejo y no por el constituido con glbulos rojos. La lectura del ensayo es la inhibicin de la hemolisis.
sangre) unos 5 a 7 das despus de la infeccin y pueden persistir durante varios meses. Esta propiedad es utilizada en los ensayos serolgicos que son determinantes para establecer el
Investigadora de CReSA-IRTA en la lnea de infecciones respiratorias bacterianas, y en la lnea de patogenia y profilaxis de infecciones por Asfivirus.
os animales y seres humanos estn en contacto diariamente con una multitud de microor-
diagnstico clnico de un gran nmero de enfermedades infecciosas. Los anticuerpos reconocen estructuras diferentes, llamadas antgenos, presentes en microorganismos. Varios tipos de tcnicas permiten detectar la respuesta humoral. Hay cinco tipos fundamentales de pruebas serolgicas: la reaccin de precipitacin, de aglutinacin, de fijacin del complemento, de inmunofluorescencia y el enzimoinmunoanlisis (ELISA): La reaccin de precipitacin se basa en la formacin, en medio lquido, de
ganismos, parsitos, bacterias, virus, hongos Algunos de ellos son beneficiosos o al menos inocuos, y otros producen infecciones que pueden ser mortales. Pero el organismo posee un sofisticado sistema defensivo llamado sistema inmunitario capaz de reconocer y eliminar estos microorganismos. El reconocimiento inmunitario produce una activacin de clulas es-
Esquema de tres anticuerpos capaces de distinguir a tres tipos de antgenos. La forma de los epitopos del antgeno se ajustan como piezas de rompecabezas en los extremos de la Y del anticuerpo correspondiente.
grandes agregados de microorganismos (preferentemente inactivados) y anticuerpos, especficos de estos microorganismos, presentes en el suero. Estas precipitaciones son ms visibles en el ensayo de Ouchterlony, donde anticuerpos y antgenos difunden radialmente en placas de agar. En la prueba de aglutinacin el antgeno o el anticuerpo se fijan a una partcula de gran tamao que pue-
Los anticuerpos reconocen estructuras diferentes, llamadas antgenos, presentes en microorganismos
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Con la posibilidad de hacer anticuerpos monoclonales, dirigidos hacia una parte muy concreta (eptopo) de un antgeno, se han podido desarrollar ELISA de competicin, mejorando grandemente la especificidad de estos ensayos. En general, el anticuerpo monoclonal est ligado a una enzima y compite con anticuerpos del paciente reconociendo el mismo eptopo. Los resultados con este ensayo se expresan en porcentajes de competicin. En el ELISA tipo sandwich, destinado a detectar la presencia de antgenos en fluidos biolgicos, se recubre el pocillo con un primer anticuerpo contra el antgeno. Posteriormente se aplica la muestra problema en la que se puede encontrar el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus se incuba con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado y la lectura se efecta como previamente En las pruebas de inmunofluorescencia los sueros de pacientes son detectados por conjugados, ellos mismos ligados a molculas fluorescentes que permiten observar fcilmente la reaccin con el antgeno en el interior de tejidos o sobre clulas. Esta tcnica requiere el uso de microscopios acoplados a una fuente de luz capaz de excitar la molcula fluorescente. ELISA es el acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas). Actualmente, es la tcnica ms utilizada para el serodiagnstico de enfermedades infecciosas. Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten o detectar anticuerpos dirigidos hacia un antgeno particular, o detectar antgenos presentes en fluidos biolgicos. Se aprovecha la capacidad de ciertos plsticos transparentes en adsorber protenas para fabricar placas de ensayo en formatos fcilmente manejables y adaptados a aparatos llamados lectores de ELISA. En el ELISA indirecto se detecta la presencia en sueros de anticuerpos especficos. Las placas se recubren con un antgeno (previamente purificado o enriquecido), y se incuban con la muestra problema (suero) que puede contener anticuerpos contra el antgeno. Posteriormente se aade un anticuerpo secundario (llamado conjugado), previamente ligado a una enzima, y reactivo contra el primero. Finalmente, la lectura del ensayo se efecta aadiendo un substrato colorimtrico (cromgeno) que al ser degradado por la enzima produce un color determinado. La intensidad de la reaccin, leda por el lector de ELISA es proporcional a la cantidad de anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente.
Tcnica de ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA).
se ha descrito. Las clulas sanguneas, en especial los linfocitos reaccionan especficamente contra microorganismos o fragmentos de ellos. Esta estimulacin resulta a menudo en la excrecin de molculas inmunomoduladoras como el interfern-gamma. Los ensayos derivados de respuestas celulares son utilizados para el diagnstico de enfermedades cuyos agentes causales inducen pocos anticuerpos. Este es el caso de la tuberculosis. El ensayo se divide en dos fases, la primera es de estimulacin de linfocitos de memoria sanguneos (que ya han estado en contacto previamente con el agente patgeno), la segunda fase es la deteccin del interfern-gamma en el suero. El interfern gamma se pone en evidencia mediante un ELISA sandwich con dos anticuerpos especficos.
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Evolucin tecnolgica de los diagnsticos en sanidad animal

cionalmente entre los laboratorios de referencia, proveyendo reactivos estndar para los fabricantes encargados de comercializar kits. Desde 1990, la mejora de la especificidad y fiabilidad de estos kits han pasado por Dr. Albert Bensaid
Investigador del CReSA albert.bensaid@cresa.uab.cat
la utilizacin de tcnicas de ingeniera gentica dando lugar a produccin industrial de antgenos recombinantes. Por otra parte, la utilizacin de substratos quimioluminescentes adapta-
Investigador del CReSA, responsable del subprograma de investigacin del CReSA en enfermedades vricas transfronterizas.
esde su creacin en 1924, uno de los grandes retos de la Organizacin Mundial de
dos a detectores fotnicos de nueva generacin ha permitido incrementar la sensibilidad y limites de deteccin de los ELISA. A partir del siglo XXI, con el surgimiento de las nanotecnologas, se estudian nuevos formatos de ensayos de diagnostico. El objetivo es detectar mltiples agentes patgenos o anticuerpos a partir de pequeos vol-
menes de lquidos biolgicos. Tanto nanotubos de carbono como nanopartculas de oro sirven de soporte primario para el enlace de biomolculas, por ejemplo. Las nanopartculas metlicas acopladas con antgenos o anticuerpos son la base para la realizacin de biosensores. Cuando estas nanopartculas interactan especficamente con un producto presente en un fluido biolgico se produce un impulso elctrico, que se mide con captores de electrones.
Sanidad Animal (OIE) ha sido y es impedir que las enfermedades animales se extiendan de un pas para otro sin limitar, por lo tanto, el movimiento de animales o productos crnicos. Los flujos comerciales se aumentan certificando que los animales son libres de enfermedades transmisibles, evitando as costosas medidas de cuarentena. A travs de sus centros colaboradores, la OIE ha sido uno de los mayores impulsores del desarrollo tecnolgico de mtodos de diagnstico aplicados a la sanidad animal. Desde 1970, y con la posibilidad de hacer anticuerpos monoclonales, casi todas las enfermedades con mayor impacto econmico tienen un ensayo de diagnstico basado sobre un ELISA de competicin. Estos ensayos son permanentemente validados interna-
Los flujos comerciales se aumentan certificando que los animales son libres de enfermedades transmisibles
En los prximos aos, deberan entrar en fases de validacin una nueva generacin de ensayos serolgicos con mayor rapidez de ejecucin. No obstante, el precio de estos diagnsticos no est an al alcance de servicios o laboratorios veterinarios de todos los pases. Por otra parte, en los ltimos 30 aos, los mtodos de deteccin de cidos nucleicos de los microorganismos,
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de fluorescencias en los termocicladoVeterinarios examinando el ganado de pequeos ganaderos en Mali.
de robustez (reproducibilidad, sensibilidad, especificidad etc) entre diferentes laboratorios de referencia. No hay antagonismo entre pruebas de diagnostico serolgicas o moleculares, sino complementariedad. La confirmacin de positividad de estos dos tipos de ensayos permite confirmar muy a menudo un diagnstico sin efectuar el aislamiento del agente patgeno u otras pruebas serolgicas como las seroneutralizaciones, ms largas y a veces costosas. La rapidez de un diagnstico condiciona la actuacin de los servicios veterinarios y por lo tanto la extensin de una enfermedad. En el pasado, se desarrollaron kits de diagnstico de campo, es decir ensayos rpidos que no requeran el uso de aparatos sofisticados. Al ser de poca sensibilidad, animales infectados podran no ser detectados, y estos kits tuvieron poca utilidad. Sin embargo, la miniaturizacin de los aparatos acoplados a medios de comunicacin eficientes (envo de los resultados primarios a laboratorios especializados) dejan entrever nuevas posibilidades para el futuro de estos kits porttiles.
res, se ha podido medir en tiempo real las reacciones de amplificacin de los cidos nucleicos. Estas PCR en tiempo real permiten no simplemente una mejora en la rapidez de ejecucin del ensayo sino aumentar la especificidad y cuantificar la carga del organismo patgeno en las muestras biolgicas. Se puede decir que actualmente estas herramientas son universalmente utilizadas no solo para el diagnstico de enfermedades infecciosas sino tambin para evaluar la eficacia de tratamientos profilcticos. El futuro de las tcnicas moleculares reside seguramente en la mejora tecnolgica y en la democratizacin de las secuenciaciones en masa de cidos nucleicos a partir de muestras biolgicas o ambientales. Si bien actualmente se utilizan en investigacin para la caracterizacin de nuevos agentes patgenos, para la deteccin de variantes genticos de estos agentes o para evaluar la complejidad en microorganismos de muestras variadas, el proceso de validacin de estas nuevas tcnicas deber franquear las pruebas
N.Denormandie / OIE
al ganar fiabilidad, han sido progresivamente integrados en los laboratorios de diagnstico. A mediados de los aos 1980, el descubrimiento de la tcnica de PCR, fue el punto de inflexin para el desarrollo de tcnicas moleculares aplicables al diagnstico. Como para las tcnicas serolgicas, la ingeniera gentica de las enzimas de polimerizacin de cidos nucleicos y la calidad creciente de los reactivos utilizados en estos ensayos han permitido el desarrollo de estndares internacionales. A la par, la evolucin tecnolgica de los termocicladores, aparatos que permiten la realizacin de las PCR, los han hecho un poco ms asequibles y con mayor capacidad de procesamiento de muestras. A principio del siglo XXI, con la aparicin de nuevas molculas fluorescentes capaces de marcar los cidos nucleicos y la inclusin de detectores
Cra de cerdos ibricos en Crdoba, Espaa.
A.Thiermann / OIE
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Alberto Allepuz: pelendose entre ordenadores en Barcelona

Entrevistamos a Alberto Allepuz, investigador de CReSA-UAB, que nos explica su trayectoria profesional y la tendencia de los ltimos aos de abordar cada vez ms los problemas sanitarios de una manera integral, en un ambiente de trabajo multidisciplinar y colaborativo.
Cmo iniciaste tu carrera profesional? Estudi veterinaria en la Universidad de Zaragoza y me licenci en 1999. En mis inicios trabaj en Aragn, en la campaa de saneamiento de bruDr. Alberto Allepuz Palau
Investigador alberto.allepuz@cresa.uab.cat
desarrollo al 100% en el subprograma de epidemiologia del CReSA. Exactamente, en qu trabajis en el subprograma de epidemiologa? En este subprograma tenemos una nica lnea que se llama epidemiologa veterinaria. Dentro de esta lnea trabajo sobre todo en temas relacionados con la vigilancia de enfermedades, estudios de factores de riesgo, de distribucin geogrfica de enfermedades y de investigacin de brotes. En todo tipo de especies animales? Anteriormente estuve trabajando en porcino, de hecho hice la tesis con una enfermedad que afecta a los cerdos (virus de Aujeszky) pero actualmente estoy trabajando en dos proyectos de rumiantes, en uno sobre la epidemiologa de la tuberculosis bovina en Espaa y en otro sobre lengua azul en Europa. Adems de ello, tambin colaboro en el servicio de asesoramiento que se le da al Departament dAgricultura, Ramaderia, Pesca, Alimentaci i Medi Natural desde el CReSA, actualmente en lo relacionado con tuberculosis bovina y brucelosis ovina. Explcanos qu herramientas sueles utilizar para tus estudios En epidemiologa trabajamos mucho con el ordenador (a veces demasiado)
celosis, y en la vacunacin y desparasitacin de ovejas. Te quedaste en Aragn? Todo lo contrario. Despus de eso, pas unos meses en Inglaterra tra-
Profesin: Veterinario Otra profesin soada: De pequeo siempre quise ser periodista Una pelcula: Gran Torino o el Padrino muy recomendables Una msica: Que no d dolor de cabeza, cualquier cosa excepto la msica mquina Un libro: Con Sin noticias de Gurb de Eduardo Mendoza pas un buen rato Un personaje: En este pas hay muchos personajes (no sabra decidirme!) Un lugar: Los Pirineos Completa la frase: La investigacin...: ... est cada vez peor
bajando en el brote de fiebre aftosa en Newcastle (al norte del pas) y cuando termin me qued un tiempo ms trabajando en la campaa de tuberculosis, esta vez en el sur del pas (en Worcester). Ms tarde, a travs de una ONG march unos meses a Per para colaborar en un proyecto de sensibilizacin sobre leishmaniosis. En noviembre del 2002 aterric en Barcelona. Y cul es tu experiencia desde tu llegada a Barcelona? Desde entonces he combinado la investigacin con la docencia, como asociado al principio y ayudante despus, hasta que consegu leer la tesis doctoral en julio del 2008. Actualmente tengo un incierto contrato de profesor con la UAB (como lector que finaliza este ao) y la investigacin la
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y las herramientas que empleo son programas de anlisis estadstico, de simulacin y de visualizacin de datos (como son sistemas de informacin geogrfica). Y con bases de datos, se supone Por supuesto tambin toca pelearse con bases de datos, aunque personalmente todava no me he peleado con los programas de manejo de grandes bases de datos y de momento con Excel y Access he tenido suficiente. En las ocasiones en las que tengo que ir a buscar los datos lo que utilizo son cuestionarios epidemiolgicos, es decir, encuestas en las que se recogen datos que consideramos de inters para el estudio. Cmo se relaciona tu trabajo de epidemiologa con el diagnstico de las enfermedades? Si bien en epidemiologia existen herramientas desarrolladas para evaluar la capacidad que tienen las pruebas diagnsticas de detectar animales enfermos o sanos, la epidemiologia no se centra tanto en el diagnstico de las enfermedades si no en tratar de comprender cmo se transmiten entre animales y cmo se podran prevenir o controlar. Cules son las nuevas tendencias de futuro en epidemiologa? Quizs la tendencia ms clara de los ltimos aos sea la aplicacin del concepto de One Health mediante el cual se
El Dr. Allepuz trabaja en un proyecto sobre lengua azul en Europa, una enfermedad vrica que afecta a los rumiantes domsticos y salvajes. Tras el anlisis de los datos recogidos se puede evaluar la distribucin del riesgo de enfermar en un mapa.
intenta abordar los problemas sanitarios de una manera integral; combinando la salud humana y animal junto con los problemas ambientales y condicionantes econmicos y sociolgicos. Y la colaboracin debe ser importante En este sentido, una tendencia de futuro es el trabajar cada vez ms de forma multidisciplinar y colaborar entre veterinarios, mdicos, bilogos, estadsticos, matemticos, informticos, socilogos, economistas, etc. Se desarrollan herramientas nuevas? El rpido desarrollo de la tecnologa (potentes ordenadores, distintos tipos de aplicaciones, etc.) ha generado que cada vez haya herramientas de anlisis ms potentes. Por ello, las tcnicas de minera de datos (trabajo con grandes volmenes de datos) y de complejos modelos matemticos y estadsticos que tratan de predecir y explicar el comportamiento de las enfermedades estn en auge, y parece que en los prximos aos la tendencia es que se sigan desarrollando.
Debe ser muy complejo trabajar con tantos datos As es. En algunas ocasiones, da la sensacin que los mtodos que se estn desarrollando superan la calidad de los datos que hay disponibles, y por ello tambin hay una tendencia a mejorar la calidad de los registros. Esto se ve reflejado en el desarrollo de aplicaciones que facilitan su recogida. Y a pesar de parecer contradictorio con el desarrollo de nuevos y ms sofisticados mtodos de anlisis, tambin se ve una tendencia a poner los pies en el suelo y a intentar aplicar los diferentes mtodos epidemiolgicos a la prctica veterinaria diaria. Y se est consiguiendo? Pienso que este desarrollo se est viendo facilitado por la existencia cada vez ms de mejores registros a nivel de granja a la vez que por el desarrollo de aplicaciones y programas libres (gratuitos) que facilitan su uso. Se estn buscando metodologas que sean aplicables (y tiles) por los veterinarios clnicos e investigadores que estn trabajando en este campo.
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hemos descubierto
Dra. Elisabet Rodrguez Gonzlez

Responsable de Comunicacin elisabet.rodriguez@cresa.uab.cat
Desarrollo y validacin de un novedoso ensayo de PCR en tiempo real para la deteccin del virus de la peste porcina clsica
Prez LJ y cols. JVirol Methods. 2011 Jun;174(1-2):53-9.
Responsable de Comunicacin del CReSA. Diseo y coordinacin de las actividades de promocin del centro y de las acciones de divulgacin cientfica y de la innovacin, dirigidas tanto al sector agropecuario como al pblico general.
Identificacin de posibles cepas virulentas de Haemophilus parasuis a partir de una PCR multiplex para detectar autotransportadores asociados a virulencia (vtaA)
Alexandre Olvera y cols.Vet J. 2012 Feb;191(2):213-8. Haemophilus parasuis es, adems de un microorganismo comensal del tracto respiratorio superior de los cerdos, el agente etiolgico de la enfermedad de Glsser. Se han identificado genes de los autotransportadores trimricos (vtaA) en H. parasuis y se han dividido en tres grupos segn la secuencia del dominio translocador. Se realiz una PCR multiplex para diagnosticar H. parasuis a nivel de especie y para diferenciar posibles cepas virulentas. Cuando se realiz en muestras de campo, la PCR confirm la existencia de una alta prevalencia de H. parasuis en los cerdos de granja convencionales y demostr que al menos la mitad de los animales era portadora de posibles cepas virulentas. Esta PCR multiplex se podra utilizar para evitar la introduccin de cerdos que portan cepas virulentas de H. parasuis en granjas que no estn afectadas por la enfermedad de Glsser. Sin embargo, se precisa de ms estudios interlaboratorios para validar la PCR multiplex, principalmente su valor predictivo para determinar los aislados virulentos. La peste porcina clsica (PPC) es una enfermedad viral extremadamente contagiosa que causa prdidas econmicas importantes en la produccin porcina mundial. Debido a la rpida propagacin del virus (VPPC) y a la variabilidad de los signos clnicos, se necesitan mtodos rpidos y precisos para la deteccin y el control del virus. En el artculo se describe el desarrollo y evaluacin de una novedosa tcnica de PCR en tiempo real para la deteccin y la cuantificacin del VPPC utilizando SYBR Green y un anlisis acoplado a la curva de fusin. El anlisis de 108 homogeneizados de tejido y de muestras de sueros provenientes de cerdos infectados con VPPC de forma natural o experimental, incluyendo muestras de cerdos no infectados, mostr que la PCR era altamente sensible y especfica para el diagnstico rpido de la PPC.
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hemos descubierto
Presencia de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en animales domsticos y en roedores Deteccin y seguimiento de Flavivirus TRANSMITIDOS por mosquitos en Espaa entre 2001 y 2005
Carles Aranda y cols.Vector Borne Zoonotic Dis. 2009 Apr;9(2):171-8. Bibiana Peralta y cols.Vet Microbiol. 2009 May 28;137(1-2):66-73. La hepatitis E humana es una enfermedad endmica en muchos pases en vas de desarrollo.Varios estudios han indicado que el virus de la hepatitis E (VHE) puede ser un agente zoontico. Estudios recientes han mostrado que hasta el 97% de las explotaciones porcinas estudiadas en algunos pases europeos, entre ellos Espaa, tienen cerdos seropositivos al VHE. En el presente estudio hemos desarrollado y aplicado un ELISA basado en la protena truncada de la cpside (ORF2) a partir de una cepa de genotipo 3 para cribar los indicios serolgicos de infeccin por VHE en diversas especies de animales domsticos. La seropositividad en las poblaciones Entre 2001 y 2005, se capturaron y analizaron 72.895 hembras de mosquito durante la estacin de mayor abundancia. Se clasificaron en 4.723 grupos y se observ que pertenecan a 20 especies de Culicidae. El objetivo del estudio era, directamente a partir de los homogenatos de los vectores, detectar ARN de arbovirus en el caso de los gneros Alphavirus, Flavivirus y Phlebovirus. El estudio formaba parte de una investigacin general que trata sobre la trasmisin de arbovirus en cuatro de los humedales ms importantes de Espaa, que se encuentran en las provincias de Gerona, Barcelona, Tarragona y Huelva. No se encontr ARN de arbovirus patgenos conocidos. Sin embargo, 111 grupos de mosquitos dieron resultado positivo a Flavivirus, el nico gnero detectado. Las secuencias de flavivirus identificadas eran diferentes de los flavivirus trasmitidos por mosquitos conocidos, no obstante, eran muy cercanas al virus Kamiti River o al virus cell fusing agent, virus detectados solamente en mosquitos de los que se desconoce su importancia a nivel de sanidad animal y salud pblica. de cerdos estudiadas fue del 71,4%. La seroprevalencia del VHE en rumiantes domsticos fue muy baja o nula, mientras que en los gatos fue alta. Adems, este estudio muestra la importancia de adoptar criterios estrictos en el serodiagnstico, ya que diferentes antgenos pueden presentar diferentes comportamientos.
Un nuevo mtodo es capaz de diferenciar cinco agentes virales en cerdos

Prez LJ y cols. J Virol Methods. 2012 Jan;179(1):233-41. Es frecuente que los cerdos presenten mltiples infecciones virales a causa de unas condiciones de produccin intensivas. En este estudio se describe el desarrollo de un novedoso sistema mltiple de PCR en tiempo real con SYBR Green I que permite la deteccin simultnea y la diferenciacin del circovirus porcino 2 (CVP2), el parvovirus porcino (PVP), el herpesvirus porcino 1 (HVP1) y los torque teno sus virus 1 y 2 (TTSuV1 y TTSuV2) en cerdos. El sistema fue capaz de diagnosticar a los cinco agentes vricos con una alta sensibilidad y especificidad. Adems, los resultados de los ensayos fueron un 100% congruentes con los resultados previos basados en PCR especfica para cada agente y realizados con muestras de campo. El sistema mltiple de PCR en tiempo real se calific como sensible y los resultados de las pruebas fueron 100 % congruentes con los resultados previos basados en una PCR especfica que se llev a cabo con muestras de campo. Este mtodo podra ser una herramienta til en los estudios epidemiolgicos y para el control de estas enfermedades.
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futuros investigadores
Comunicacin cientfica: otra opcin de futuro tras el postgrado

una etapa de tu vida en la que te enriqueces como persona. Ves que eres una pequea porcin de un equipo, pero que tu trabajo es necesario para que el grupo de investigacin al que perteneces funcione adecuadamente. Paula Lpez Monteagudo
Estudiante de postgrado paula.lopez@cresa.uab.cat
est interesado en saber que avances se estn llevando a cabo en su propia universidad, en su ciudad, en su pas o incluso a nivel mundial? Aprender a comunicar a cualquier nivel es una asignatura que, en muchos casos, los cientficos tienen pendiente. En la mayora de ocasiones los cientficos se limitan a comunicar sus avances nicamente dentro del mbito de la ciencia y descuidan el hecho de que la sociedad tambin puede estar interesada en conocer sus descubrimientos. Por suerte esta situacin de incomunicacin est cambiando y cada vez la ciencia y la sociedad se acercan un poquito ms. Se est apostando por la expansin del conocimiento a todos los niveles y esto est haciendo que la figura de comunicador cientfico comience a entrar en juego, y quin mejor que alguien que ha estado en el mundo de la ciencia como investi-
A medida que el tiempo va pasando vas aprendiendo a plantear y planear experimentos que tienen como fin resolver determinadas incgnitas. Adquieres la
Estudiante de Postgrado del CReSA. Su trabajo se centra en el desarrollo de vacunas frente a la peste porcina africana.
n el momento en el que tenemos que tomar una decisin que afectar a nuestro futuro el
capacidad de interpretar los resultados obtenidos y aprendes a como comunicarlos dentro del mbito de la ciencia mediante seminarios, exposiciones en congresos o a travs de la escritura de artculos en revistas cientficas. Pero, qu hay del inters que estos
miedo nos invade. Acertar con el camino elegido es nuestro deseo, pero nunca sabemos con certeza si nuestra decisin acabar siendo la acertada o no. Este miedo fue el que yo sent cuando acab la carrera de Biologa y decid que los prximos 4 aos de m vida iba a pasrmelos en un laboratorio como estudiante de Postgrado. A da de hoy estoy llegando al ecuador de mi doctorado y s que la decisin que tom fue la adecuada. Aunque el hecho de realizar un postgrado implica una gran especializacin en un tema muy concreto, la formacin que recibes durante este periodo es muy amplia y variada. Adquieres gran cantidad de conocimientos tericos acerca del tema en el que eliges especializarte, pero adems es
descubrimientos pueden despertar en el pblico en general? no puede ser que alguien que no est vinculado con el mundo de la investigacin
Aprender a comunicar a cualquier nivel es una asignatura que, en muchos casos, los cientficos tienen pendiente
gador para hacer asequible al pblico toda esta informacin? Creo que durante nuestra formacin doctoral deberamos aprender a comunicar nuestros avances en diferentes mbitos y a diferentes niveles, de modo que, una vez finalizado el doctorado, la comunicacin cientfica represente una opcin ms en nuestra lista de posibilidades laborales de futuro.
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hablan las escuelas
Importancia del diagnstico para controlar enfermedades

Autora: Dra. Llilianne Ganges Espinosa
Interpretand o un artcu cientfico. lo V isi investigado n de futuros res
os textos que mostramos a continuacin han sido extrados de algunos de los artculos de opinin sobre la investigacin en sanidad animal realizados
por los estudiantes que visitan el CReSA a travs de la iniciativa Escolab.
Le el ao pasa do un artculo en la web ElRefe rente.es que de cientficos de los ca que un gru Estados Unido po de s haba desarro llado un tipo de con clulas qu e resisten la inf gatos fosforesce eccin de un vir ntes us que causa lado, el artculo el sida felino. Po deca que, se cre r otro e que, los result los gatos tanto ados del estud como las perso io pueden ayud nas. Esto sera ar genial, pero es ao que lo le y te artculo ya ha desde entonce ce un s no he vuelto a or de ningn del SIDA, ni en avance frente humanos ni en al virus felinos ni en nin guna otra espe tratamiento ten cie. Adems, e dra el mismo efecto secund ste ario en humano fosforescente? s? Nos volvera A m, personalm mos verdes ente, me cues ta muchsimo de creer Diana
y Marc (17 a os)
de la Somos conscientesntrol de las co importancia del enfermedades
graes muy importante ya que es infecciosas en animales sta o El control de enfermedad inge la de s trav a s a humano ar multitud de contagios cias a sta se pueden evit o productos agrarios tratamientos con animales
(16 y 17 aos) Susana y Christopher
ollos de Desarr herramientas para sticas n g dia enfermedades r de medipreveni desarrollo
Me apasionan la ingeniera gentica y los desarrollos moleculares. Sern conscientes los gobiernos?
Si llego a poder dedicarme a la inves tigacin en algn momento me gusta ra que fuera en el campo celular y molecular. Me despiertan inters la biologa y la gentica molecular y la ingeniera porque, desde mi punto de vista, son la base para conseguir la erradicacin de enfermedades, profila xis contra los virus y el control de los vectores y de las infecciones, por ejemplo. Me sorprenden noticias como una que he ledo ltimamente, que hace que el inter s en este campo y que la admiracin por los proyectos y por los que se dedican crezc an. La noticia trataba sobre el desar rollo de nuevas tecnologas en reas tales como el DNA recombinante y la biologa molec ular, que han permitido un gran avance en la produccin de vacunas ms segur as y libres de infectividad residual. Noticias as son buenas de escuchar y espero que con el paso de los aos la inversin por parte de las administraciones y de los gobie rnos correspondientes crezca y no todo lo contr ario. Es futuro y conocimiento.
n del ientas contribuci las herram estacar la d e d a h cunas, de va Se y o os tic i controlar prevenir, como antib do poder camentos iti s m te n er p se re an siempre p tico que h rmedades de diagns fe a en ar ), p le es ib de animal (en lo pos ara la cra solucionar trabajan p n riesgo u e u a q s on p lo ara al su y caras p mida, lo cu cio de co or comer ri te os p el a lud pblic para la sa
aos) Oriol (17 Xavier y
Annimo (16 aos)
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ciencia a la vista
Ciencia es invertir en el futuro pero quin la paga?
estas alturas existen pocas dudas en relacin a que la investigacin cientfica supone una
Si la pregunta del ttulo se refiere a quin financia la investigacin independiente (no sujeta a los intereses especficos de las empresas de desarrollo de productos), entonces las fuentes de financiacin seran las convocatorias nacionales e internacionales (bsicamente Europeas en nuestro caso), as como el mecenazgo. El impacto global de ste ltimo es, no obstante, an muy limitado. la prdida no repercute en el momenDicho de otra manera, el grueso de la financiacin cientfica acaba procediendo de las administraciones pblicas, o sea, de nuestros propios bolsillos como ciudadanos. Pero esta situacin est lamentablemente asociada a la reparticin del dinero existente entre las partidas presupuestarias de los gobiernos correspondientes. Qu quiere decir esto? Ni ms ni menos que la financiacin de la ciencia est a expensas de los recortes presupuestarios que estn aplicando nuestros gobernantes actualmente. Y ello se ha traducido en que los recursos econmicos pblicos destinados a la investigacin en Espaa han vuelto a niveles de hace 7 aos atrs, despus de llegar a un pico mximo en 2009. Si la ciencia es progreso y futuro, es evidente de que, con estas acciones, estamos comprometiendo nuestro futuro como pas. Perder centros de investigacin e investigadores/as no es perder algo que podamos recuperar maana; la recuperacin en estos mbitos lleva aos y
El micromecenazgo es la cooperacin colectiva, llevada a cabo por personas que forman una red para conseguir dinero u otros recursos.
inversin para un pas. No obstante, es una inversin a largo plazo que no da frutos palpables hasta despus de unos aos de realizarla. Existen ejemplos en muchos pases desarrollados donde su propia economa se ha revalorizado gracias a los avances cientfico-tecnolgicos, tales como Alemania, Suecia, Estados Unidos, Japn o Corea del Sur. En estos pases ha habido una poltica cientfica decididamente orientada al desarrollo y al conocimiento, y definitivamente han apostado por inversiones pblicas importantes en este mbito. Otras fuentes de financiacin como podra ser el mecenazgo o el micro-mecenazgo (cada vez ms en boga) han ido tomando un mayor protagonismo para poder llevar a cabo iniciativas cientfico-tcnicas que de otra manera no se daran. Ejemplos internacionales seran la Fundacin de Bill y Melinda Gates, que ha financiado un nmero importante de proyectos para el desarrollo de mtodos de control de enfermedades, o aqu en Espaa la Fundacin Cellex, que ha financiado mltiples proyectos, entre ellos en el campo de la fotnica recientemente. Finalmente, existira financiacin empresarial de una ciencia ms aplicada con el objetivo de desarrollar productos que acaben siendo comercializados y que puedan generar beneficios econmicos a las empresas que realizan estas investigaciones.
Dr. Joaquim Segals Coma

Director del CReSA joaquim.segales@cresa.uab.cat
to en que se produce, sino que es una prdida con claras consecuencias para el futuro. Es ms, luego tambin habra que preguntarse por qu hemos invertido tanto dinero en la formacin de estas personas? Al fin y al cabo, la formacin de estas personas tambin se ha financiado con dinero pblico y se acaban beneficiando esos pases con visin cientfico-tecnolgica que acaban fichando a los investigadores/as de nuestro pas. Se puede polticamente recortar lo que corresponda, pero no se debera recortar el futuro de un pas en su conjunto!
Director del CReSA y Profesor Titular del Departamento de Sanidad y Anatoma Animales de la UAB. Investigador en el rea de las enfermedades vricas porcinas, especialmente en infecciones por circovirus porcino tipo 2 (PCV2).
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lo que no vemos
Los hongos colonizadores
Granuloma mictico en un pulmn de pollo. Tincin de PAS (Periodic Acid-Schiff). Esta tincin colorea intensamente la pared polisacrida de los hongos y permite la deteccin rpida de los hongos en los tejidos (x 50 m).
CReSA / N. Maj
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Nuevas tcnicas moleculares, del Jursico a la televisin de papel

ficacin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR (Polymerase chain reaction). El descubrimiento de la PCR dio lugar a la concesin de un premio Dr. Jos Ignacio Nez Garrote
Investigador del CReSA ignacio.nunez@cresa.uab.cat
termociclador. Las PCR multiplex que permiten incluir distintos patgenos en un solo ensayo, o las PCRs anidadas y semianidadas, entre otras. Paralelamente asociado al desarrollo de las tcnicas de amplificacin, se ha producido un avance en los dispositivos, basados en nuevos sistemas de deteccin de seales como los sistemas integrados miniaturizados que combinan la preparacin del cido nuclico
Nobel, adems de constituir el fundamento cientfico para la realizacin de la pelcula Parque Jursico, donde se amplificaba por esta tcnica el ADN de los dinosaurios. La amplificacin
Investigador del CReSA responsable de la lnea de investigacin sobre el papel de los microRNAs en las infecciones vricas del cerdo.
unque hoy da resulta impensable, hasta hace poco ms de una dcada no era reconocido
se realiza con la ayuda de un equipo llamado termociclador y se visualiza mediante geles de agarosa. As resulta muy rpido, fcil y preciso identificar virus, bacterias, u otros patgenos. La PCR en tiempo real es una tcnica de PCR que amplifica y simultneamente cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificacin. Para ello emplea reacciones similares a la PCR convencional pero adiciona una sustancia marcada con un fluorforo. Esta reaccin se realiza en un termociclador con sensores para medir fluorescencia, que excitan el fluorforo a la longitud de onda apropiada y miden la tasa de generacin de una o ms copias del de una muestra de partida y la amplificacin mltiple de distintos cidos nuclicos para distintos patgenos de una forma rpida, sensible y especfica. Las tcnicas moleculares que basan la amplificacin del cido nucleico en mtodos isotrmicos (como el LAMP PCR) al no requerir el uso de aparatos termocicladores, si se emplea un mtodo de deteccin de los productos amplificados por fluorescencia, se pueSe han desarrollado mltiples variantes a partir de la PCR convencional, como la amplificacin isotrmica LAMP PCR, que no requiere de un aparato den trasladar por ejemplo a una granja, obteniendo el resultado de forma muy rpida al lado de individuo enfermo pen side, sin necesidad de transportar las muestras al laboratorio.
un diagnstico mediante tcnicas moleculares por la Organizacin Mundial de Sanidad Animal. Las tcnicas moleculares aplicadas al diagnstico estn basadas principalmente en la deteccin especfica del material gentico de los patgenos, ya sea cido desoxirribonucleico (ADN) o cido ribonucleico (ARN). Inicialmente se basaron en la deteccin por hibridacin con el cido nucleico, que rpidamente fue desplazada por la amplificacin del cido nucleico mediante la tcnica de ampli-
El descubrimiento de la PCR dio lugar a la concesin de un premio Nobel
En la pelcula Parque Jursico el ADN de los dinosaurios se amplificaba por PCR.
cido nucleico especfico sin necesidad de hacer geles de agarosa.
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tores, que permiten obtener gran cantidad de informacin y a un coste cada vez ms reducido. La aplicacin de esta tecnologa al diagnstico permite incluso identificar nuevos agentes patgenos y nuevos virus todava no descritos. Dentro de la siguiente generacin de tecnologa de secuenciacin, todava en proceso de desarrollo, se incluye aquella que utiliza nanoporos, que no son otra cosa que orificios muy pequeos realizados en superficies biolgicas (nanoporos proteicos), o en nuevos materiales como el grafeno, que se puso de moda en 2010 cuando se concedi el Nobel de qumica a dos investigadores por el descubrimiento de sus propiedades, 100 veces ms fuerte que el acero y ms delgado que lar que pueden dar informacin del Dentro de las tcnicas basadas en la hibridacin de cidos nuclicos, un avance importante consisti en el desarrollo de la tecnologa de microarrays conocidos como chips de DNA. Se basan en la unin de fragmentos de DNA a una superficie slida (vidrio, plstico o silicio) que hibridan con la muestra problema identificando el patgeno presente en la misma. Un ejemplo de enfermedad en la que este chip tiene una mayor aplicacin es el diagnstico del virus influenza, puesto que permite la deteccin, subtipado y caracterizacin del virus de forma rpida. La secuenciacin del cido nucleico, esto es, el conocimiento de la disposicin de las bases que componen el ADN, constituye la caracterizacin ms detallada que se puede hacer de un organismo. Acoplada la tcnica de secuenciacin rpida a la amplificacin especfica por PCR permite realizar un diagnstico preciso e inequvoco, igualmente permite realizar estudios de epidemiologa molecuActualmente se han desarrollado nuevas tcnicas de secuenciacin masiva, como la basada en la pirosecuenciacin o en el empleo de semiconducEn la actualidad, las tcnicas moleculares se estn imponiendo como la mejor opcin; esto es especialmente significativo en los casos en los que el aislamiento vrico en cultivo celular o origen de un brote, de la eficacia de las vacunas utilizadas, de la evolucin viral, etc. Esta herramienta ha sido de gran valor para el diagnstico y control de muchas enfermedades en todo el mundo como la fiebre aftosa, la peste porcina clsica, la gripe, el SIDA, la hepatitis C, entre otras. Tambin permite estudiar, por ejemplo, resistencia a frmacos o escapes a la vacunacin, analizando las mutaciones que se producen como respuesta frente a estos.
Los termocicladores realizan los ciclos de temperatura necesarios para amplificacin del ADN.
cualquier slido, que entre otras aplicaciones se estudia su utilizacin para obtener pantallas de TV flexibles como el papel. En ambos casos, si se hace atravesar una molcula de cido nucleico por el nanoporo, acoplado a un sistema de deteccin electrnica capaz de cuantificar una diferencia en el voltaje debido a la partcula que atraviesa el poro, se puede conocer la composicin de bases, esto es, la informacin gentica. De esta forma se podr detectar molculas individuales a tiempo real sin la necesidad de amplificarlas.
La secuenciacin del cido nucleico constituye la caracterizacin ms detallada que se puede hacer de un organismo
el cultivo de bacterias resulta complicado de realizar, como en el caso del circovirus porcino. Otra de las ventajas es que evita la manipulacin de agentes vivos, lo que es especialmente relevante en agentes infecciosos que causan problemas de salud grave o cuantiosas prdidas econmicas.
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dicciocresa
DiccioCReSA
Autora: Dra. Llilianne Ganges Espinosa
Agente quelante
Sustancia que forma complejos con iones de metales pesados. A estos complejos se los conoce como quelatos, palabra que proviene de la palabra griega chele que significa garra.
Cultivo
Biol. y Med. Mtodo de obtencin de microorganismos, clulas o tejidos mediante siembras controladas en medios adecuados.
Pirosecuenciacin
Tecnologa de determinacin de secuencia de ADN a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante el proceso de emisin de luz condiciones de temperatura ambiente o baja (luminiscencia).
Anticuerpo
Biol. y Med. Sustancia producida en el organismo animal por la presencia de un antgeno, contra cuya accin reacciona especficamente. Anticuerpo monoclonal: anticuerpo especfico frente a un nico antgeno.
Fluorforo
Tambin llamado fluorocromo, es un componente de una molcula que hace que sta sea fluorescente.
Sembrar
Biol. Poner microorganismos, clulas o tejidos en un medio de cultivo adecuado para su multiplicacin.
Inmunomodulador
Sustancia que modifica (puede aumentar o disminuir) la capacidad del sistema inmune de ejercer una o ms de sus funciones, como la produccin de anticuerpos, el reconocimiento antignico, o la secrecin de mediadores inflamatorios.
Sincitio
En medicina, es una especie de amasijo celular formado por clulas fusionadas.
Antgeno
Biol. y Med. Sustancia que, introducida en un organismo animal, da lugar a reacciones de defensa, tales como la formacin de anticuerpos.
Termociclador
Aparato que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reaccin en cadena de la polimerasa de amplificacin de ADN.
Biomolcula
Molcula constituyente de los seres vivos. Los seis elementos qumicos o bioelementos ms abundantes en los seres vivos con los que se crean todo tipos de biomolculas son el carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno, fsforo y azufre.
Interfern
(Del ingl. interferon, der. de to interfere, intervenir, interferir). Bioqum. Glicoprotena sintetizada por clulas infectadas por virus, que inhibe la multiplicacin de estos.
Lisis celular
Rompimiento de la membrana celular que est compuesta por fosfolpidos que separan el contenido celular del ambiente extracelular.
Biosensor
Instrumento para la medicin de parmetros biolgicos o qumicos. Suele combinar un componente de naturaleza biolgica y otro fsico-qumico.
Nanopartcula
Partcula microscpica con una dimensin menor de 100 nm.
Complemento
Biol. Conjunto de protenas plasmticas que actan mediante reaccin en cascada y se fijan finalmente sobre la pared de clulas ajenas al organismo como las bacterias, a las que destruye.
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si quieres saber ms
CReSA Training Programs: compromiso con la formacin
os CReSA Training Programs son cursos y programas de formacin organizados por el
Agrupaciones de defensa sanitarias Sociedades cientficas Centros de educacin secundaria
CReSA a peticin de administraciones y empresas. Estos programas versan sobre temas relacionados con las competencias y conocimientos de los investigadores del centro: bacteriologa, virologa, inmunologa, entomologa, epidemiologa, investigacin y desarrollo, patologa, diagnstico, bioseguridad, control y erradicacin de enfermedades, etc. Los cursos pueden ser en lnea o presenciales (en el CReSA o en las instalaciones designadas por el solicitante) y se pueden impartir en cataln, castellano o ingls. Paso 1 El solicitante contacta con el CReSA y plantea sus necesidades de formacin: objetivos, temas a tratar, nmero de asistentes y perfil, etc. Paso 2 El CReSA estudia la propuesta y elabora un programa preliminar, que incluye agenda, contenidos, ponentes y presupuesto. Paso 3 El solicitante aprueba la propuesta y se acuerdan las fechas de la formacin.
Cmo funcionan?
Los programas de formacin se disean de forma personalizada, en funcin de las necesidades del demandante, por lo que se adaptan la temtica, los formadores y la duracin a cada curso. Para ello, los pasos a seguir son los siguientes:
A quin van dirigidos?

La oferta formativa se dirige a veterinarios, bilogos, productores, tcnicos de laboratorio, periodistas cientficos, estudiantes y otros profesionales relacionados con las ciencias de la salud, que pertenecen tanto al sector pblico como al sector privado: Administraciones o entidades pblicas Universidades Centros de investigacin Empresas y cooperativas agroalimentarias Empresas farmacuticas Empresas biotecnolgicas Organizaciones de investigacin por contrato (CRO) Asociaciones de productores
Para ms informacin sobre los CReSA Training Programs: Elisabet Rodrguez Gonzlez Responsable de Comunicacin elisabet.rodriguez@cresa.uab.cat Tel.: 935814564
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Edifici CReSA. Campus UAB. 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Valls) Spain. Tel. (+34) 93 581 32 84 Fax (+34) 93 581 44 90 e-mail: cresa@uab.cat www.cresa.cat
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