organismes pathognes mergents Vincent Thomas Mmoire prsent et soutenu publiquement le 11/05/2012 lUniversit Paris Sud-11, Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry pour lobtention de l Habilitation Diriger des Recherches devant le Jury compos de Pr Anne Collignon Pr Gilbert Greub Pr Yann Hchard Pr Yves Lvi Dr Jean-Yves Maillard Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 1/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Remerciements Merci Anne Collignon, Gilbert Greub, Yann Hchard, Yves Lvi et Jean-Yves Maillard de m'avoir fait l'amiti de bien vouloir faire partie du jury de ce mmoire d'HDR. Merci tous ceux qui ont particip de prs ou de loin la construction de ma carrire scientifique de microbiologiste, soit dans l'ordre chronologique : Jacky Fourniat et Sylvie Bouttier la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry (Laboratoire de Microbiologie Industrielle), Pierre Bourlioux, Anne Collignon et Hlne Bourreau la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry (Dpt Microbiologie), ainsi que Jol Dor et Violaine Rochet l'INRA de Jouy, Yves Lvi la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry (Dpt Sant Publique), ainsi que Jean-Franois Loret et Michel Jousset (Suez), et Thodore Bouchez (Cemagref Antony), Gilbert Greub et David Baud lhpital de Lausanne, Gerry McDonnell chez STERIS, ainsi qu'Emmanuel Comoy et Jean-Philippe Deslys au CEA de Fontenay et Romain Briandet l'INRA de Massy. Merci enfin tous ceux avec qui j'ai pu collaborer / changer au cours de ces annes, dont je ne citerai pas les noms de peur d'en oublier... Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 2/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Table des matires Chapitre 1 : Introduction................................................................................................................................................7 1.1- Curriculum vitae................................................................................................................................................7 1.1.1- tat civil.....................................................................................................................................................7 1.1.2- Adresse professionnelle...........................................................................................................................7 1.1.3- Titres universitaires...................................................................................................................................7 1.1.4- Parcours professionnel.............................................................................................................................8 1.1.5- Activits lies l'administration................................................................................................................8 1.1.6- Activits lies la recherche....................................................................................................................8 1.1.7- Encadrement scientifique.........................................................................................................................9 1.2- Liste des publications.....................................................................................................................................10 1.2.1- Revues comit de lecture....................................................................................................................10 1.2.2- Chapitres de livres..................................................................................................................................12 1.2.3- Confrences dans des congrs..............................................................................................................12 Chapitre 2 : Contexte de nos travaux.........................................................................................................................14 Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance des amibes la dsinfection............................................................18 3.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans les rseaux d'eau : de la source au point d'usage.........................................................................................................................................18 3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine de production d'eau potable ..................................................................................................................................20 3.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau d'eau hospitalier..........................................................................................................................................................22 3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis en uvre dans les rseaux...........................23 3.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection et implication dans la persistance des lgionelles................................................................................................23 3.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss dans les tablissements de soins ...................................................................................................................................25 3.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la rsistance des kystes drivs....................................................................................................................................................28 Chapitre 4 : Interactions amibes libres / micro-organismes ......................................................................................34 4.1- Les amibes libres de l'environnement : melting-pot du monde microbien...............................................34 4.2- Interactions des amibes avec de nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.................36 4.2.1- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Criblamydia sequanensis ...........................................................................................................................................................................38 4.2.2- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydia crassificans (25)................................................................................................................................................39 4.2.3- Publication : Implication de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Waddlia chondrophila dans les avortements chez la femme ..............................................................................................................39 4.2.4- Publication : Capacit de survie dans l'environnement des nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.............................................................................................................................40 4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries...........................................................................................43 4.3.1- Publication : Test de la virulence de diffrentes souches cliniques de Mycobacterium kansasii vis--vis d'Acanthamoeba castellanii..............................................................................................................................44 4.4- Interactions des amibes avec les virus NCLDV.............................................................................................45 4.4.1- Publication : Lausannevirus, un nouveau virus d'amibes.......................................................................47 Chapitre 5 : Perspectives............................................................................................................................................51 5.1- Synthse de nos travaux................................................................................................................................51 5.2- Perspectives / dveloppements envisags....................................................................................................51 5.2.1- Protozoaires de l'environnement : interactions avec l'cosystme biofilm.............................................52 5.2.2- Protozoaires de l'environnement : rle dans la slection et la dissmination de bactries pathognes ...........................................................................................................................................................................54 5.3.3- Protozoaires de l'environnement : amlioration des stratgies de contrle...........................................55 5.3- Collaborations en cours et envisages...........................................................................................................58 Rfrences bibliographiques......................................................................................................................................59 Rfrences fournies en annexe..................................................................................................................................64 Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 3/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Liste des Figures Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien.......................................................... Figure 2 : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales.... Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro- organismes rsistants aux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire.................................. Figure 4 : Diversit morphologique des amibes retrouves aux diffrentes tapes de potabilisation.......... Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead................ Figure 6 : Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches d'amibes...................................................................................................................................................... Figure 7 : Dtection des kystes permabiliss par le traitement SDS par marquage l'iodure de propidium.................................................................................................................................................... Figure 8 : Proportion des kystes marqus par l'iodure de propidium avant et aprs traitement SDS.......... Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique transmission des kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2...................................................................................................... Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au calcofluor..................................................................................................................................................... Figure 11 : Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage..................................................... Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souches d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG ou sur cellules HEp-2.......................... Figure 13 : Exemples d'changes d'information gntique entre micro-organismes intra-amibiens........... Figure 14 : Arbre phylogntique mettant en vidence les relations phylogntiques entre les gnes codant pour la sterol delta-7 reductase chez l'amibe Naegleria gruberi et chez les bactries intracellulaires affilies aux lgionelles et aux Chlamydiae......................................................................... Figure 15 : Arbre phylogntique des Chlamydiales bas sur la squence codant pour l'ARN ribosomal 16S.............................................................................................................................................................. Figure 16 : infection d'Acanthamoeba castellanii par Criblamydia sequanensis......................................... 16 19 20 21 25 26 28 29 29 30 31 33 35 35 37 38 Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 4/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis.................................. Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2............................. Figure 19 : volution du pourcentage d'amibes infectes et du nombre de bactries par amibe lors de l'infection d'Acanthamoeba castellanii par diffrents sous-types de Mycobacterium kansasii...................... Figure 20 : Arbre phylogntique de virus reprsentatifs du groupe des NCLDV (nucleocytoplasmic large DNA viruses)...................................................................................................................................... Figure 21 : Observation de Lausannevirus en coloration de Gimenez........................................................ Figure 22 : Observation de Lausannevirus en microscopie lectronique transmission............................ Figure 23 : droulement du cycle d'infection d'Acanthamoeba castellanii par Lausannevirus..................... Figure 24 : Nuage de points construit partir de l'emplacement dans le gnome des protines orthologues entre Lausannevirus et Marseillevirus...................................................................................... Figure 25 : Phylognie et rpartition des motifs d'histones trouvs chez Lausannevirus et Marseillevirus.. 42 42 45 46 47 47 48 49 50 Liste des Tables Table 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs aux diffrentes tapes de potabilisation.................... Table 2 : Effet des traitements de dcontamination base de gluataraldhyde sur les trophozoites amibiens..................................................................................................................................................... Table 3 : Effet de diffrents traitements de dcontamination sur les kystes amibiens................................ Table 4 : Pathologies associes aux nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia......... Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like............. Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like................................................ 22 27 27 36 41 41 Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 5/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Abrviations ADN : Acide dsoxyribonuclique ARNr : Acide ribonuclique ribosomique ATCC : American Type Culture Collection EPA : US Environmental Protection Agency GFP : Green Fluorescent Protein IP : iodure de propidium MALDI-TOF MS : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight mass spectrometry NCLDV : nucleocytoplasmic large DNA viruses NNA : Non-Nutrient Agar (agar non-nutritif utilis pour la culture des amibes sur Escherichia coli) NTM : non-tuberculous mycobacteria PCR : Polymerase Chain Reaction PYG : Proteose peptone, Yeast extract, Glucose (milieu utilis pour la culture axnique des amibes du genre Acanthamoeba) SDS : sodium dodecyl sulfate VIH : virus de l'immunodeficience humaine Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 6/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Chapitre 1 : Introduction 1.1- Curriculum vitae 1.1.1- tat civil Nom et prnom : THOMAS, Vincent Date et lieu de naissance : 23 mai 1973 Paris, 14me arrondissement Nationalit : Franais 1.1.2- Adresse professionnelle Laboratoire de Recherche de la socit STERIS SA Commissariat lnergie Atomique (CEA) 18, route du Panorama - 92265 Fontenay-aux-Roses FRANCE E-mails : vincent_thomas@steris.com (professionnel) ; vincethom2009@yahoo.fr (personnel) Tlphone : +33 1 46 54 85 57 (fixe), +33 6 75 74 00 16 (portable) 1.1.3- Titres universitaires 2000-2004 : Thse de doctorat en cologie Microbienne, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11 Sujet : cologie de Legionella pneumophila dans les rseaux de distribution deau potable Interactions biofilms/amibes valuation de lefficacit des traitements biocides. Travail sous forme de convention CIFRE entre le Laboratoire de Sant Publique Environnement de la Facult de Pharmacie (P r Yves Levi) et le Centre International de Recherche sur lEau et lEnvironnement du Groupe SUEZ (CIRSEE, Le Pecq). Diplm avec mention du Jury. Manuscrit tlchargeable l'adresse suivante : http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116971 1997-1998 : Diplme dtudes Approfondies en cologie Microbienne, Pathogense et Antibiothrapie, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11 Sujet : tude dune flore de barrire Clostridium difficile. Travail collaboratif entre le Dpartement de Microbiologie de la Facult (P r Pierre Bourlioux) et lINRA de Jouy-en-Josas (D r Jol Dor). 1991-1997 : Docteur en Pharmacie, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11. Filire Industrie, certificats de spcialisation en Bactriologie et Virologie. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 7/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 1.1.4- Parcours professionnel Depuis Mai 2006 : Responsable R&D, employ par la socit STERIS pour dvelopper et diriger un laboratoire de recherche en microbiologie hberg dans les locaux du CEA de Fontenay-aux-Roses. Responsable de cinq employs : un chercheur, deux techniciens et deux tudiants en thse. En charge de la coordination de plusieurs projets de recherche pour ltude de pathognes mergents et ltude de lefficacit des traitements biocides des vis--vis de nombreuses espces/souches de bactries, de protozoaires, de virus et de prions. Collaborations avec des laboratoires de R&D publics et privs en Europe et aux tats-Unis. Reprsentant scientifique de la socit STERIS dans divers congrs internationaux de microbiologie. Mai 2004 - Avril 2006 : Post-doctorat dans le laboratoire de Recherche sur les Bactries Intracellulaires, Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire de Lausanne, Suisse (D r Gilbert Greub). tude de lcologie des amibes et de leurs htes intracellulaires : lgionelles, mycobactries, chlamydia, nouveaux virus Installation du laboratoire, prise en charge de plusieurs projets de recherche en vue dune publication rapide de rsultats. Formation de plusieurs tudiants et techniciens. Rdaction de demandes de financement et de rapports dactivit. Novembre 1998 - Dcembre 1999 : Assistant de Recherche, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11. Dveloppement doutils molculaires (PCR, sondes spcifiques de dtection) pour ltude du devenir in vivo de ferments lactiques. Projet men au sein du Dpartement de Microbiologie (P r Pierre Bourlioux), en collaboration avec la compagnie Danone. 1.1.5- Activits lies l'administration Reprsentant de la socit STERIS au Conseil dAdministration de la Fondation de Recherche Alliance Biosecure (www.fondation-alliance-biosecure.org). Fondation reconnue dutilit publique qui lance une deux fois par an des appels projets dans le domaine de la comprhension et de la matrise du risque infectieux dans les produits biologiques. Participation la vie de la Fondation : dfinition des objectifs, budgets, appels doffre, suivi des projets financs 1.1.6- Activits lies la recherche Coordinateur du projet Plateforme Globale de Dcontamination labellis par le ple de comptitivit Medicen Rgion Ile-de-France : rdaction et prsentation du projet devant les membres du ple, coordination et suivi du projet (2007-2010). Ce projet dot dune subvention de 3,5 millions dEuros a fait intervenir plusieurs quipes de R&D publiques (INRA, CEA, AP-HP, INSERM) et prives (STERIS, LFB, Texcell, Genethon, Hutchinson Sant) . Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 8/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Participation des Comits de Pilotage de Thse : Thse de M elle Emilie Fouque lUniversit de Poitiers (quipe P r Yann Hchard, dmarrage en novembre 2010) : Mise au point dune stratgie innovante de matrise des amibes dans les biofilms Thse de M r Arnaud Bridier ralise lINRA de Massy (quipe D r Romain Briandet, 2008 - 2011) : tude de la formation de biofilms et de laction de traitements biocides sur ces biofilms Plus de 25 articles de recherche reviews pour des revues internationales avec comit de lecture depuis 2008. Reviewing de projets de R&D en rponse diffrents appels doffre. Organisation avec la Fondation Alliance Biosecure dun colloque Risques infectieux mergents lis aux biotechnologies : Principe de prcaution et Innovation qui sest tenu en juin 2010 au Ministre de la Sant. Participation des conseils scientifiques : CS du Colloque Rseau National Biofilm 2011. Nombreuses collaborations internationales en cours. 1.1.7- Encadrement scientifique Encadrement ( 75%) de la Thse de M elle Cline Coulon ralise doctobre 2007 mars 2011 sous forme de convention CIFRE entre STERIS et la Facult de Pharmacie (P r Anne Collignon). Titre : Amibes libres de lenvironnement : Rsistance aux traitements de dsinfection et interactions avec les Chlamydiales . Thse soutenue en avril 2011 avec la mention Trs Honorable et proposition un prix de Thse. Trois articles publis dans Journal of Clinical Microbiology , Journal of Eukaryotic Microbiology et FEMS Immunology and Medical Microbiology . Ces travaux ont aussi donn lieu la prsentation de cinq posters et une communication orale dans des congrs internationaux. Le manuscrit de la thse est tlchargeable l'adresse suivante : http://www.theses.fr/2011PA114806# Co-encadrement ( 25%) de la Thse de M me Anglique Egalon dbute en mars 2010 sous forme de convention CIFRE entre STERIS et le CEA de Fontenay-aux-Roses (D r Jean-Philippe Deslys), en partenariat avec l'INRA de Jouy-en-Josas (D r Human Rezaei). Titre de la Thse : tude des mcanismes sous-tendant linactivation des prions et application aux autres protines impliques dans les pathologies amylodes . Pas de publications ni de posters pour le moment. Encadrement ( 100%) du stage de Matrise de M elle Hedia Arfaoui (2006-2007, Universit Paris 7 Denis Diderot). Titre du mmoire : Dcontamination du matriel mdical: efficacit du traitement au peroxyde dhydrogne gazeux VHP STERIS . Ce travail a donn lieu la prsentation dun poster au congrs de la Socit Amricaine de Microbiologie (ASM) Boston en 2008. Encadrement ( 75%) du stage BN Forschung de M me Katia Herrera-Rimann (2005, Institut de Microbiologie de lhpital de Lausanne, Suisse). Thme de recherche : Interactions amibes-espces bactriennes rsistantes aux amibes. Ce travail a donn lieu la publication dun article dans Applied and Environmental Microbiology en 2006. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 9/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 1.2- Liste des publications 1.2.1- Revues comit de lecture Liens internet sur le document lectronique: cliquer sur les caractres bleus pour avoir accs au rsum de la publication correspondante, sur les caractres rouges pour avoir accs l'article au format pdf (articles en libre accs). Les publications pour lesquelles les copies figurent en annexe de ce mmoire sont indiques par la mention Publication en annexe. Publications lies aux travaux de DEA 1. Thomas, V., V. Rochet, H. Boureau, C. Ekstrand, S. Bulteau, J. Dore, A. Collignon, and P. Bourlioux. 2002. Molecular characterization and spatial analysis of a simplified gut microbiota displaying colonization resistance against Clostridium difficile. Microb Ecol Health Dis 14:203-210 Publications lies aux travaux de thse 2. Thomas, V., T. Bouchez, V. Nicolas, S. Robert, J. F. Loret, and Y. Lvi. 2004. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol 97:950- 963. Publication en annexe 3. Loret, J., S. Robert, V. Thomas, A. J. Cooper, W. F. McCoy, and Y. Lvi. 2005. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and legionella control. Journal of Water and Health:423-433 Publications lies aux travaux de post-doctorat 4. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2006. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environmental Microbiology 8:2125-2135. Publication en annexe 5. Thomas, V., K. Herrera-Rimann, D. S. Blanc, and G. Greub. 2006. Biodiversity of amoebae and amoebae- resisting bacteria in a hospital water network. Applied and Environmental Microbiology 72:24282438. Publication en annexe 6. Goy, G., V. Thomas, K. Rimann, K. Jaton, G. Prod'hom, and G. Greub. 2007. The Neff-strain of Acanthamoeba castellanii, a tool to test the virulence of Mycobacterium kansasii. Research in Microbiology 158:393-397. Publication en annexe 7. Corsaro, D., V. Thomas, G. Goy, D. Venditti, R. Radek, and G. Greub. 2007. ' Candidatus Rhabdochlamydia crassificans', an intracellular bacterial pathogen of the cockroach Blatta orientalis (Insecta: Blattodea). Syst Appl Microbiol 30:221-228 8. Baud, D., V. Thomas, A. Arafa, L. Regan, and G. Greub. 2007. Waddlia chondrophila, a potential agent of human fetal death. Emerg Infect Dis 13:1239-43. Publication en annexe Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 10/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 9. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2007. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst Appl Microbiol 30:572-9 10. Loret, J. F., M. Jousset, S. Robert, G. Saucedo, F. Ribas, V. Thomas, and G. Greub. 2008. Amoebae-resisting bacteria in drinking water: risk assessment and management. Water Sci Technol 58:571-577 11. Thomas, V., J. F. Loret, M. Jousset, and G. Greub. 2008. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology 10:2728-2745. Publication en annexe Publications lies aux travaux mens depuis 2006 12. Thomas, V., and G. McDonnell. 2007. Relationship between mycobacteria and amoebae: ecological and epidemiological concerns. Lett Appl Microbiol 45:349-57. Publication en annexe 13. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2009. Disinfection efficacy against parvoviruses in comparison to reference viruses. Journal of Hospital Infection 73:64-70 14. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Decontamination efficacy against Mycoplasma. Letters in Applied Microbiology 52:150155 15. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Virucidal activity of disinfectants against parvoviruses and reference viruses. Applied Biosafety: Journal of the American Biological Safety Association 15:165-171 16. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance of Acanthamoeba cysts to disinfection treatments used in health care settings. Journal of Clinical Microbiology 48:2689-97. Publication en annexe 17. Thomas, V., G. McDonnell, S. P. Denyer, and J.-Y. Maillard. 2010. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiology Reviews 34:231-259. Publication en annexe 18. Thomas, V., and G. Greub. 2010. Amoebae/amoebal symbionts genetic transfers: lessons from giant viruses neighbours. Intervirology 53:254-267. Publication en annexe 19. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, and R. Briandet. 2010. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 82:64-70 20. Bridier, A., D. Le Coq, F. Dubois-Brissonnet, V. Thomas, S. Aymerich, and R. Briandet. 2011. The spatial architecture of Bacillus subtilis biofilms deciphered using a surface-associated model and in situ imaging. PLoS ONE 6:e16177 21. Bridier, A., E. Tischenko, F. Dubois-Brissonnet, J. M. Herry, V. Thomas, F. Daddi-Oubekka, F. Waharte, K. Steenkeste, M. P. Fontaine-Aupart, and R. Briandet. 2011. Deciphering biofilms structure and reactivity by multiscale time-resolved fluorescence analysis. Advances in Experimental Medicine and Biology 715:333-49 22. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, G. Greub, V. Thomas, and R. Briandet. 2011. Dynamics of the action of biocides in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55:2648-54 Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 11/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 23. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Comparative biocidal activity of peracetic acid, benzalkonium chloride and ortho- phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection 78:208-213 24. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Resistance of bacterial biofilms to disinfectants: a review Biofouling 27:1017-32 25. Thomas, V., C. Bertelli, F. Collyn, N. Casson, A. Telenti, A. Goesmann, A. Croxatto, and G. Greub. 2011. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environmental Microbiology 13:1454-56. Publication en annexe 26. Coulon, C., M. Eterpi, G. Greub, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. Amoebal host-range, host- free survival and disinfection susceptibility of environmental Chlamydiae as compared to Chlamydia trachomatis. FEMS Immunology and Medical Microbiology - Accepted article - doi: 10.1111/j.1574-695X.2011.00919.x. Publication en annexe 27. Coulon, C., N. Deschamps, T. Meylheuc, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. The effect of in vitro growth conditions on the resistance of Acanthamoeba cysts. Journal of Eukaryotic Microbiology In Press. Publication en annexe 28. Fouque, E., M.-C. Trouilh, V. Thomas, P. Hartemann, M.-H. Rodier, and Y. Hchard. 2012. Cellular and molecular changes during encystment of free-living amoebae. Eukaryotic Cell - In Press. 1.2.2- Chapitres de livres 1. Thomas, V. 2012. Sensitivity and resistance of protozoa to biocides. In A. Fraise, Lambert, PA and Maillard, J-Y (ed.), Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization - 5th edition - In Press 2. Thomas, V. 2012. Ecology and diversity of amoebal symbionts and amoebal pathogens. In G. Greub (ed.), Free-living amoebae: an evolutionary crib for emerging pathogens In Press 1.2.3- Confrences dans des congrs 1. Thomas, V. 2006. La mesure et la prdiction de la virulence. Presented at the Colloque Ecomicth : "Lgionelles et lgionellose : Avances effectives et questions sensibles", Paris, France, 27 Octobre. 2. Thomas, V., and J. Mills. 2008. Amsco V-ProTM 1 A new low temperature sterilization system by STERIS. Presented at the 30rd CEFH meeting, Nantes, France, 8 April. 3. Thomas, V. 2011. La strilisation la vapeur sche H2O2. Presented at the 6me Forum du Dpartement Gnie Biomdical de lEcole Suprieure dIngnieurs de Luminy Marseille, France, 30 November. 4. Thomas, V. 2011. A review of new sterilization technologies. Presented at the XIXth CEDEST Meeting Albacete, Spain, 11-13 May. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 12/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 5. Thomas, V. 2011. Dveloppement et valuation de traitements biocides actifs contre les biofilms. Presented at the Colloque Adebiotech / Rseau National Biofilms: Gestion des biofilms, enjeux industriels, Romainville, France, 13 October. 6. Thomas, V. 2011. Amibes libres et pathognes intra-amibiens : le risque ne se limite pas aux lgionelles. Presented at the Colloque de l'Association Scientifique Europenne pour l'Eau et la Sant, Paris, France, 18 November. 7. De Broglie, V., and V. Thomas. 2011. Enhancing precompetitive research to increase safety of biological products in the field of emerging pathogens. Presented at the Ensuring Adventitious Agents Safety In Biologics, Munich, Germany, 18-19 October. 8. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance of amoebal cysts and trophozoites to disinfection treatments commonly used in healthcare settings. Presented at the ICAR 2010 meeting, Valladolid, Spain, 3-5 November. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 13/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Chapitre 2 : Contexte de nos travaux La matrise du risque infectieux au sein de diffrents environnements (hpitaux, industrie agroalimentaire) passe par une meilleure comprhension des diffrents cosystmes microbiologiques en place dans ces environnements. Ces deux dernires dcennies ont ainsi vu merg le concept de biofilm, communaut microbienne complexe constitue de multiples espces bactriennes interagissant entre elles (interactions mtaboliques, changes gntiques) et avec leur environnement. Ltude de ces biofilms a clairement mis en vidence leur importance dans un grand nombre de problmatiques ayant trait au risque infectieux : protection de micro-organismes pathognes vis--vis de traitements biocides, barrire biologique empchant limplantation de flores pathognes Les biofilms rencontrs dans lenvironnement sont complexes, composs de multiples espces bactriennes mais aussi de virus (phages) et de micro- organismes eucaryotes. Une meilleure matrise de la composition de ces biofilms, et notamment de leur colonisation par des micro-organismes pathognes, passe obligatoirement par une meilleure comprhension de lcologie de ces biofilms et de limpact des activits humaines (traitements biocides, pollutions) sur leur composition. Des travaux de plus en plus nombreux montrent que les amibes libres de lenvironnement jouent un rle central dans l'cologie de l'cosystme biofilm. Ce sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires dont les anctres sont apparus avant les organismes pluricellulaires. Elles sont ubiquitaires, se nourrissant de bactries quelles broutent la surface des biofilms (Fig. 1), et rgulent ainsi de manire importante les populations bactriennes de ces biofilms (47). Cependant de nombreuses espces bactriennes (mais aussi eucaryotes et virales) ont dvelopp la capacit de rsister ces phagocytes professionnels et peuvent tirer bnfice de l'interaction avec les amibes en rsistant la digestion intracellulaire et/ou en prolifrant de manire importante dans le trophozoite amibien (cellule en tat de croissance active). Or les mcanismes permettant la rsistance la digestion par les amibes sont frquemment similaires ceux permettant aux micro-organismes infectieux de rsister la digestion par les macrophages ; la consquence en est que les espces bactriennes qui ont dvelopp des mcanismes de rsistance la digestion par les amibes au cours de leur volution sont aussi potentiellement pathognes pour les organismes suprieurs, dont l'homme et les animaux. Ces similarits entre les mcanismes de virulence vis--vis des amibes et des eucaryotes suprieurs ont t largement dmontres pour l'espce bactrienne Legionella pneumophila (22) mais aussi pour Mycobacterium avium (23) et plus rcemment pour Salmonella enterica Typhimurium (72). Par ailleurs, parmi plus de 500 espces bactriennes pathognes pour l'homme et les animaux recenses par lagence amricaine de protection de lenvironnement (EPA), une revue exhaustive de la littrature nous a permis de dmontrer quau moins 20% sont capables de rsister aux amibes ((96), publication en annexe). Une fois lintrieur des amibes les bactries sont protges vis--vis de laction de traitements biocides utiliss dans les rseaux d'eau potable (chlore) qui sont peu efficaces vis--vis des trophozoites amibiens, et peuvent ventuellement se multiplier en grand nombre dans la cellule infecte (90). A titre d'exemple une amibe infecte par une lgionelle peut librer plus de 10 3 nouvelles bactries en quelques heures (18). Les amibes constituent donc une niche cologique dans laquelle des bactries potentiellement pathognes peuvent survivre, se multiplier, mais Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 14/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 aussi changer des informations gntiques : l'analyse des gnomes de micro-organismes capables de survivre dans les amibes dmontre clairement l'existence de ces changes gntiques entre bactries intracellulaires ainsi qu'avec l'hte amibien et avec certains types de virus capables d'infecter les amibes (59, 75, 92). Un degr supplmentaire de protection des micro-organismes intra-amibiens vis--vis des traitements biocides est apport par la capacit de certaines de ces espces bactriennes survivre dans les kystes amibiens. Ces kystes sont les formes de dormance dans lesquelles se diffrencient les amibes en raction diffrents stress, leur paroi contient notamment de la cellulose et ils sont extrmement rsistants aux tempratures leves, la dessiccation et diffrents types de traitements biocides (26, 96). En plus de nombreuses espces responsables dinfections nosocomiales (Legionella, mycobactries, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), de nombreuses espces bactriennes pathognes de premire importance dans le domaine des industries agro-alimentaires sont concernes par ces interactions avec les amibes (87, 96) : Survie dans les trophozoites pour diffrentes espces de Listeria (contest), diffrentes espces dAeromonas, Coxiella burnetii et Helicobacter pylori ; Survie et croissance dans les trophozoites pour Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157H7, Francisella philomiragia, Rhodococcus equi, Salmonella typhimurium ; Survie et croissance dans les trophozoites ainsi que survie dans les kystes pour Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (ainsi que la plupart des autres espces de mycobactries), Francisella tularensis, Shigella sonnei et Shigella dysenteriae. De nouvelles espces bactriennes considres comme pathognes mergents sont aussi capables de se multiplier en grand nombre dans les amibes : cest le cas notamment de nouvelles espces environnementales de Chlamydiales regroupes sous le terme Chlamydia-like qui sont aujourdhui considres comme responsables probables de pneumonies dtiologie inconnue et davortements spontans chez lhomme ainsi que d'avortements chez les bovins (9, 12, 55). Les amibes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de leau (94) et sont donc retrouves dans la plupart des rseaux deau domestique ou industrielle. Elles ont t isoles de plus de 90% des rseaux d'eau d'habitations (82), ainsi que des rseaux d'eau hospitaliers (93), de tours aro- rfrigrantes (67) Elles ont aussi t dtectes dans des levages de volaille (8), dans des rfrigrateurs (100), sur des surfaces de travail d'abattoirs (98), dans des sols potentiellement utiliss pour le pturage (amibes infectes par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis) (102) Il est donc de plus en plus vident que les amibes constituent les Chevaux de Troie du monde microbien, permettant la slection, la dissmination et la prolifration d'espces bactriennes pathognes via les rseaux d'eau (Fig.1). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 15/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien. 0 Les kystes (c) et les trophozoites (T) amibiens sont naturellement prsents dans les eaux de surfaces utilises pour la production d'eau potable, O les kystes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de l'eau, O une fois dans le rseau les amibes se dsenkystent et se nourrissent en ingrant les bactries des biofilms, O les bactries rsistant la digestion par les amibes peuvent ventuellement se multiplier dans les trophozoites et changer des informations gntiques entre elles et avec l'hte, O des quantits importantes de bactries ainsi que des vsicules remplies de bactries sont libres partir des amibes infectes, O en cas de stress environnemental les trophozoites peuvent former des kystes dans lesquels certaines espces bactriennes peuvent survivre (dmontr pour les lgionelles, les mycobactries, Vibrio cholerae et Francisella), 6 l'eau contamine peut servir de vecteur d'infection pour l'homme et l'animal par O inhalation ou ingestion de bactries libres, d'amibes infectes ou de vsicules charges de bactries, ou O par contamination de surfaces ou de sols qui contamineront par la suite l'homme et les animaux G. Illustration du biofilm adapte de Center for Biofilm Engineering, MSU-Bozeman 1996. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 16/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Plan de prsentation de nos travaux de recherche Afin de permettre une comprhension plus aise par le lecteur ces travaux ne sont pas repris dans leur ordre chronologique de publication. Dans un premier temps nous reprenons dans le chapitre 3 le cheminement dcrit dans la Figure 1 : tude environnementale de la diversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes depuis la source servant la production d'eau potable jusqu'au point d'usage dans les rseaux, et rsistance des kystes amibiens aux traitements de dsinfection mis en uvre dans ces systmes. Dans le chapitre 4, nous dcrivons plus prcisment les interactions des amibes avec de nouveaux microorganismes pathognes potentiels isols lors de nos tudes environnementales : nouvelles espces de Chlamydiae, mycobactries et nouveau virus. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 17/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance des amibes la dsinfection 3.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans les rseaux d'eau : de la source au point d'usage Durant notre post-doctorat ralis au sein de l'Institut de Microbiologie de l'Hpital de Lausanne, en Suisse, nous avons tudi l'cologie et la diversit des amibes dans diffrents types d'environnements, ainsi que leurs interactions avec diffrents types de micro-organismes. Nous avons adapt (34) une mthode de co-culture amibienne consistant ensemencer des chantillons environnementaux (eau filtre sur membrane, biofilms) sur des amibes provenant de l'American Type Culture Collection (souche Acanthamoeba castellanii ATCC 30010), et surveiller la prolifration ventuelle de micro-organismes dans les amibes inocules l'aide de diffrents outils (colorations non spcifiques, coloration de Ziehl pour les mycobactries, PCR spcifiques de lgionelles ou de Chlamydiae...) (Fig. 2). En cas de dtection de micro- organismes dans les co-cultures amibiennes, diffrentes stratgies taient mises en uvre pour isoler et purifier les micro-organismes : culture sur milieux spcifiques des mycobactries, culture sur milieux spcifiques des lgionelles, r-ensemencement en dilution limite sur A. castellanii ATCC 30010 L'objectif tait d'isoler de nouvelles espces bactriennes non dtectes par culture sur les milieux classiques : intracellulaires stricts non cultivables ou intracellulaires facultatifs qui, mmes s'ils sont cultivables, sont normalement masqus par la flore majoritaire. L'intrt de la mthode est donc double : limination de la flore majoritaire non pathogne qui est phagocyte et digre par les amibes, et slection de micro- organismes dont la capacit rsister la digestion et survivre dans les amibes pourrait ventuellement indiquer une pathognicit pour l'homme et/ou l'animal. La mthode a t applique deux types d'environnements particulirement critiques : usine de production d'eau potable partir de l'eau de Seine et eau du rseau de lhpital de Lausanne. Dans les deux cas les chantillons d'eau et de biofilms taient ensemencs sur la souche d'amibe A. castellanii ATCC 30010 et une recherche d'amibes indignes naturellement prsentes dans les chantillons tait ralise sur ces mmes chantillons afin de mieux prciser l'tendue de la colonisation et de la diversit amibienne dans ces environnements. Les bactries et les amibes taient identifies par PCR et squenage avec des amorces ciblant l'ARNr 16S et l'ARNr 18S, respectivement. Figure 2 (page suivante) : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales. Les chantillons taient traits afin : (1) d'isoler les amibes indignes naturellement prsentes dans les chantillons par ensemencement des chantillons concentrs sur gloses non-nutritives + Es coli et repiquages successifs des amibes dtectes, (2) d'isoler les micro-organismes rsistants aux amibes par ensemencement des chantillons concentrs et dcontamins (pH acide, pH basique, traitement la chaleur) sur la souche d'Acanthamoeba castellanii ATCC 30010. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 18/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine de production d'eau potable Rfrence (94), publication en annexe Les tudes ralises sur l'usine de production d'eau potable ont consist appliquer les mthodes de co-culture amibienne et d'isolement des amibes indignes sur des chantillons d'eau et de biofilms prlevs diffrentes tapes du procd de potabilisation (Fig. 3). Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro-organismes rsistants aux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire. 0 eau de rivire, O biofilm dpos sur le sable utilis pour la premire tape de filtration, O eau filtre sur sable, O eau traite par ozonation, O biofilm dpos sur les granules de charbon actif, O eau filtre sur charbon actif, 6 eau chlore, O eau en sortie d'usine et O eau potable prleve en diffrents points du rseau. Ces travaux, raliss en partenariat avec SUEZ et l'Institut de Microbiologie de Lausanne, avaient pour objectif de dterminer si les usines qui produisent l'eau potable partir d'eau de rivire sont colonises par les amibes, si oui quel niveau prfrentiel du processus de potabilisation et si les amibes sont finalement relargues dans l'eau potable. La recherche de pathognes par co-culture avait pour objectif d'tudier la distribution de nouvelles espces microbiennes ventuellement pathognes dans l'usine afin de permettre une meilleure connaissance de leur cologie, et donc une meilleure gestion du risque ventuel. Cinquante isolats amibiens indignes ont t cultivs, principalement partir de l'eau de rivire (19 isolats) mais aussi partir des biofilms dvelopps sur le lit de sable (tape 2, 15 isolats) (Fig. 4). Quatorze isolats ont t retrouvs aprs l'tape de filtration sur sable : 3 dans l'eau filtre sur sable (tape 3), 3 aprs l'tape d'ozonation (tape 4), 6 sur le biofilm dpos sur les granules de charbon actif (tape 5) et 2 dans l'eau filtre sur charbon (tape 6). De manire intressante la diversit amibienne changeait dans l'usine : alors que des amibes appartenant principalement aux genres Acanthamoeba, Naegleria et Vannella taient principalement retrouves dans la rivire et dans le biofilm sur sable (Table 1), on retrouvait ensuite principalement des Hartmannella et des Echinamoeba dans l'usine. Ces deux genres taient aussi prsents dans l'eau de rivire mais de faon minoritaire ; leur prvalence dans l'usine suggre que le processus de Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 20/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 potabilisation slectionne prfrentiellement les amibes appartenant ces genres (amibes de petite taille, souvent thermo-rsistantes). Aucune amibe n'a t retrouve en sortie d'usine mais cela est sans doute d aux faibles volumes d'eau et de biofilms prlevs plutt qu' une efficacit relle de la chloration sur les amibes car plusieurs tudes rapportent une efficacit limite du chlore sur les kystes amibiens (96). Concernant les bactries, quatre souches de bactries ont t retrouves partir des amibes indignes, dont une mycobactrie (M. mucogenicum) cultive partir d'une souche d'amibe (Echinamoeba) retrouve dans l'eau traite l'ozone. La co-culture des chantillons d'eau et de biofilm avec l'amibe A. castellanii ATCC 30010 a permis d'identifier 27 mycobactries (dont 8 dans l'usine aprs filtration sur sable) et 65 isolats bactriens appartenant diffrentes classes (dont 21 dans l'usine aprs filtration sur sable). Parmi ces 65 isolats figuraient notamment des lgionelles ainsi que deux espces de Chlamydiae environnementales (cf Chlamydiae plus loin): l'espce dj dcrite Parachlamydia acanthamoebae (retrouve partir de l'eau de rivire et du biofilm sur charbon actif) et le premier reprsentant d'un nouveau genre de Chlamydiales : Criblamydia sequanensis (isole partir de l'eau de rivire). Nous avons aussi dtect la prsence de petites particules colores en coloration de Gimenez dans une des co-cultures ralises partir de l'eau de rivire. Aucun ADN bactrien ne pouvait tre amplifi l'aide d'amorces universelles 16S ; ces particules se sont rvles tre un nouveau virus d'amibe que nous avons dcrit par la suite (cf Lausannevirus plus loin). Ces travaux ont donc clairement dmontr la prsence d'amibes et de bactries capables de crotre dans les amibes dans l'usine de potabilisation, surtout dans les chantillons de biofilms prlevs sur le filtre sable et sur le filtre charbon actif. Ces travaux, publis en 2008 (94) ont permis SUEZ de proposer une optimisation des procdures de rtro-lavage de ces filtres, ceci afin de rduire la colonisation par les biofilms, les amibes et les bactries potentiellement pathognes associes ces amibes. Par ailleurs ces travaux s'inscrivent dans des tudes visant promouvoir l'utilisation de membranes d'ultrafiltration en sortie d'usine afin d'viter le relargage de micro-organismes dans les rseaux de distribution. Figure 4 : Diversit morphologique des amibes retrouves aux diffrentes tapes de potabilisation. Amibes affilies aux genres Playtamoeba (A), Acanthamoeba (B, D et K), Vanella (C), Glaeseria (E), Hartmannella (F et I), Naegleria (G et H) et Echinamoeba (J) sur la base du squenage partiel du gne codant pour l'ARNr 18S. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 21/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Table 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs aux diffrentes tapes de potabilisation. Les isolats indiqus par les flches verte (Echinamoeba exundans) et rouge (Hartmannella vermiformis) prsentaient des squences d'ARNr18S identiques, suggrant qu'il pourrait s'agir de la mme souche retrouve tout le long du procd de potabilisation. 3.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau d'eau hospitalier Rfrence (93), publication en annexe Une tude semblable (et antrieure) celle dcrite ci-dessus a t entreprise l'hpital universitaire de Lausanne. Il s'agissait l aussi de prlever de l'eau et des biofilms dans diffrents services (ranimation, chirurgie...) et d'tudier la prvalence des amibes et la prsence de nouvelles espces bactriennes rsistantes aux amibes. L'tiologie des infections acquises l'hpital n'tant pas toujours connue, nous suspections que de nouveaux agents infectieux difficiles cultiver pourraient tre responsables d'une part de ces infections, notamment des pneumonies. La co-culture amibienne pourrait tre un bon moyen de dtecter ces nouveaux agents infectieux et c'est donc avec cet objectif que ces travaux ont t initis. Sur 200 chantillons analyss au cours de cette tude 13 ont t retrouvs coloniss par deux souches diffrentes de l'amibe Hartmannella vermiformis (dont une thermorsistante capable de croitre 44C, et l'autre prsentant un intron dans la squence codant pour l'ARNr18S), 1 par une souche d'Acanthamoeba polyphaga et 1 par une nouvelle espce amibienne non clairement identifie. Une souche indigne d' H. vermiformis tait colonise par L. pneumophila. Par ailleurs la co-culture des 200 chantillons avec la souche d'amibe A. castellanii ATCC 30010 a permis l'amplification sur glose de 125 isolats bactriens (42,3% des chantillons d'eau, 52,4% des biofilms prlevs sur les pommeaux de douches, 45,1% des biofilms prlevs sur les robinets d'eau). En particulier, 43 isolats de mycobactries ont t identifis (espce peu pathogne Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 22/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Mycobacterium gordonae majoritairement, mais aussi espces pathognes Mycobacterium kansasii et Mycobacterium xenopi), ainsi que 11 isolats de lgionelles (espce pathogne Legionella anisa majoritairement, ainsi que L. pneumophila). Les chantillons positifs pour des amibes indignes taient statistiquement plus frquemment coloniss par des lgionelles, ce qui avait dj t rapport dans la littrature, mais aussi par des mycobactries, dmontrant pour la premire fois une association cologique mycobactries-amibes. Ce dernier point tait important souligner lheure o les infections mycobactries atypiques (ou mycobactries croissance rapide) sont de plus en plus frquemment rapportes, avec une rsistance gnralement leve de ces mycobactries aux traitements antibiotiques ainsi qu certains types de biocides. Par ailleurs nous avons aussi isol de nouvelles espces bactriennes. Parmi elles une espce d'Alphaprotobactrie appartenant au genre Rhodoplanes a t retrouve dans 23 chantillons, suggrant une colonisation importante du rseau d'eau de l'hpital. Il est noter qu'une souche de Rhodoplanes phylogntiquement proche de celle isole dans notre tude a t rcemment implique pour la premire fois dans une infection fatale chez l'homme (105). Les autres souches isoles par co-culture amibienne comprenaient deux souches de Pseudomonas aeruginosa ainsi que de nombreuses Alphaprotobactries. Ces travaux publis en 2006 (93) sont frquemment cits dans les publications ayant trait la thmatique de la contamination amibienne des rseaux et aux relations mycobactries-amibes, ils ont contribu une meilleure connaissance de cette problmatique. 3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis en uvre dans les rseaux Sachant que les amibes sont prsentes dans les rseaux de distribution d'eau, la question se pose de savoir comment contrler le risque infectieux potentiel caus par les amibes et les bactries associes. Dans cette partie nous exposons plusieurs tudes entreprises afin de contribuer rpondre cette question. La premire tude porte sur l'efficacit des dsinfectants utiliss en faible concentration rsiduelle ou en traitement de choc pour traiter l'eau potable dans les rseaux. La deuxime tude porte sur l' efficacit des biocides utiliss pour traiter des matriels et des surfaces ventuellement en contact avec l'eau du rseau : surfaces de travail, matriels lavs dans des machines laver alimentes en eau de rseau par exemple. Enfin la troisime tude confirme l'importance cruciale des mthodes mises en uvre pour cultiver les trophozoites et produire des kystes amibiens, avec des sensibilits des kystes la dsinfection qui varient normment en fonction de ces mthodes. 3.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection et implication dans la persistance des lgionelles Rfrence (90), publication en annexe Nos travaux de thse ont port sur ltude de lactivit de traitements biocides couramment utiliss pour la matrise du risque infectieux dans leau potable. Ces traitements sont utiliss de faon relativement empirique et leur impact rel sur les diffrentes populations bactriennes et les amibes prsentes dans les biofilms sont peu ou mal connus. Ces travaux ont t mens en collaboration avec le centre de recherche Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 23/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 sur l'eau et l'environnement (CIRSEE) de la socit SUEZ, toute particulirement concerne par la problmatique de la colonisation des rseaux par les amibes et les lgionelles (L. pneumophila) qui constituaient l'poque et constituent aujourd'hui encore un problme majeur de sant publique (pidmies rptition dans plusieurs grandes villes franaises dont Paris pendant la coupe du monde de football de 1998, pidmie dans le tout nouvel hpital europen Georges Pompidou en 2000...). L'enjeu principal de l'tude tait de dterminer si certains traitements sont plus mme de contrler la prolifration des amibes et des lgionelles dans les rseaux, voire mme de les radiquer. Afin d'valuer l'efficacit de 6 traitements biocides diffrents nous avons d'abord mis en place un pilote reproduisant un rseau d'eau intrieur. Ce pilote comprenait 7 boucles parallles, avec pour chacune un bras principal en acier galvanis (circulation d'eau en continu) et un bras mort en cuivre (eau stagnante). Le pilote a d'abord t aliment avec de l'eau de rivire filtre sur sable, progressivement remplace par de l'eau du rseau pour permettre la colonisation par une flore microbienne reprsentative. Des systmes de coupons amovibles et de cartouches de billes de verre taient installs sur le pilote afin de permettre des prlvements de biofilms pour analyse qualitative et quantitative, respectivement. Lors de l'tape de colonisation nous avons dop la flore en lgionelles isoles partir du pilote. Une fois la flore stabilise nous avons valu l'action de 6 traitements diffrents (+1 boucle tmoin) sur la flore. Nous avons utilis des mthodes de quantification des diffrentes populations bactriennes (hybridation fluorescente in situ avec des sondes spcifiques de groupe, dtection en microscopie confocale et quantification par analyse d'images) et amibiennes (dnombrement) afin de mettre en vidence les changements de composition des populations induits par les traitements. Des mthodes dvaluation de la viabilit des populations bactriennes (marquage fluorescent Live/Dead coupl une dtection en microscopie confocale) ont aussi t utilises pour mesurer lefficacit biocide des traitements. Les rsultats obtenus ont clairement dmontr que si parmi les 6 traitements tests (chlore, dioxyde de chlore, monochloramine, ozone, ionisation cuivre-argent et lectro-chloration) le dioxyde de chlore paraissait tre le plus efficace pour contrler les prolifrations dans le bras mort, aucun traitement ntait en revanche capable dradiquer compltement les biofilms bactriens ainsi que les bactries du genre Legionella et les amibes associes aux biofilms. La plupart des traitements permettaient de diminuer de faon plus ou moins importante la flore totale ainsi que les lgionelles et les amibes dnombres sur glose mais leur interruption menait invariablement une r-apparition rapide de la flore, y compris les amibes et les lgionelles. Par ailleurs les amibes semblaient prolifrer sur les biofilms traits par certains biocides, se nourrissant de bactries mortes (Fig. 5). Ces travaux dmontrent donc que des traitements mal maitriss peuvent conduire une prolifration de ces micro-organismes eucaryotes et des pathognes associs dans les rseaux. Ces travaux ont t publis en 2004 (90). Ils ont contribu une meilleure comprhension de l'efficacit relative des biocides sur la flore des rseaux en conditions proches des conditions relles. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 24/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead. Le biofilm trait au dioxyde de chlore est majoritairement constitu d'une flore bactrienne morte (marquage IP) mais de nombreuses amibes sont prsentes (nombreuses tches jaunes, agrandies en B), suggrant un effet limit du traitement sur les amibes. 3.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss dans les tablissements de soins Rfrence (26), publication en annexe Suite deux revues exhaustives de la littrature portant sur l'efficacit des traitements biocides sur les protozoaires (88) et plus particulirement sur les amibes libres de l'environnement (96), nous avons constat qu'il existait des tudes valuant les traitements utiliss pour la potabilisation de l'eau ou pour la sanitisation des lentilles de contact (problme des kratite amibiennes) mais qu'il n'existait que trs peu de donnes sur les biocides couramment utiliss pour traiter les surfaces et les matriels l'hpital mais aussi dans l'industrie agro-alimentaire et l'industrie pharmaceutique. Or les amibes sont bien prsentes lhpital (cf tude ci-dessus l'hpital de Lausanne), et il semblerait que dans certains cas elles puissent coloniser des matriels mdicaux (74). Elles sont aussi prsentes dans les industries agroalimentaires o elles sont notamment suspectes de servir de vecteur d'infection des levages de volailles par les campylobactries (6, 7, 78). Nous avons donc initi des travaux visant dterminer quels biocides utiliss pour traiter les surfaces sont susceptibles d'tre efficaces contre les amibes sous forme de trophozoite (forme active) ou de kyste (forme dormante). Alors que la plupart du temps seule une deux souches sont testes dans les tudes d'efficacit des biocides sur les amibes nous avons utilis 9 souches diffrentes d'Acanthamoeba, dont 3 souches de collection et six souches isoles lors des tudes l'hpital et dans l'usine de potabilisation. L'efficacit des traitements a t value contre les trophozoites (forme active) et contre les kystes (forme dormante) en utilisant une simple mthode de mise en contact avec les produits tester suivie d'une neutralisation de l'activit du biocide et d'un ensemencement des amibes traites sur gloses non nutritives + Escherichia coli (les amibes se dveloppent en ingrant les bactrie, formant de vritables plages de lyse sur la couche d'E. coli). Concernant les trophozoites (Table 2), tous les biocides se sont rvls pleinement efficaces l'exception notable de la glutaraldhyde 2% (seule ou en formulation) qui mme aprs un temps de contact de 30 minutes ne permettait pas d'radiquer les amibes, certaines souches prsentant moins de 1 Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 25/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 log de rduction. Concernant les kystes (Table 3) nous avons mis en vidence leur rsistance une exposition la chaleur (55C) ainsi qu' de nombreux traitements (glutaraldhyde, eau de Javel 250 ppm, peroxyde d'hydrogne 7,5%) tandis que d'autres traitements taient nettement plus efficaces (peroxyde d'hydrogne en formulation, acide peractique...). Par ailleurs nous avons constat que la paroi des kystes des souches environnementales tait plus paisse que celle des souches de collection, et que ces souches environnementales taient plus rsistantes la dsinfection (Fig. 6). Parmi elles, les souches isoles de l'hpital de Lausanne taient les plus rsistantes. Ceci peut s'expliquer par la mise en uvre rgulire de traitements chocs de dsinfection la chaleur ou au chlore dans ces rseaux, et donc la slection de souches plus rsistantes. Ces travaux ont t publis en 2010 (26), ils ont permis de prciser l'efficacit relative des traitements biocides vis--vis des amibes, et de montrer que les souches de collection gnralement utilises dans ces essais sont peu reprsentatives des souches de terrain. Figure 6 : Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches d'amibes. Kystes obtenus partir de souches de terrain isoles partir d'eau de rivire (A) ou d'eaux de rseaux hospitaliers (B et C), et kystes obtenus partir de la souche de collection Acanthamoeba polyphaga CCAP 1501/18. Barre : 2 m. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 26/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 3.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la rsistance des kystes drivs Rfrence (27), publication en annexe Lors des travaux raliss en 2010 nous avons utilis des mthodes classiques de culture des amibes en milieu synthtique Peptone-Yeast-Glucose (PYG) suivies d'un enkystement en tampon Neff afin de produire les kystes soumettre aux traitements de dcontamination (65). Nous savions cependant que plusieurs auteurs ont rapport la formation de kystes relativement peu matures lorsque ces mthodes sont utilises, ceci d'autant plus si les souches d'amibes utilises ont t cultives pendant de nombreuses gnrations en PYG (14, 17, 46, 54, 68). Par ailleurs des travaux publis en 2009 indiquent que si les trophozoites amibiens sont cultivs sur couches de cellules HEp-2 plutt qu'en milieu PYG strile la virulence et la capacit d'enkystement sont ractives (53). A l'heure o les mthodes utiliser pour valuer l'efficacit des traitements de dsinfection sur les kystes amibiens sont en discussion (4), il nous a sembl intressant d'explorer la rsistance des kystes amibiens issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2, ceci afin de pouvoir ventuellement proposer cette mthode de culture dans les futures normes d'essais de cysticidie . Brivement, les amibes ont t : cultives en milieu PYG puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C, ou cultives sur cellules HEp-2 puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C. La fragilit relative des kystes produits suivant les deux mthodes a t value grce un double marquage calcofluor (marquage de la cellulose contenue dans la paroi des kystes) et iodure de propidium (IP, intercalant ADN ne pntrant que dans les kystes permabiliss) avant et aprs traitement SDS 0,5% pendant 10 min (Fig. 7 & 8). Cette premire caractrisation a permis de dmontrer que les kystes produits partir de trophozoites cultivs en milieu PYG sont gnralement plus fragiles, donc plus permabiliss par le traitement SDS et marqus en plus grande proportion par l'IP. Figure 7 : Dtection des kystes permabiliss par le traitement SDS par marquage l'iodure de propidium. Le marquage au calcofluor (bleu) et l'iodure de propidium (rouge) permet de distinguer les kystes permabiliss par le traitement SDS. La proportion de kystes marqus IP est gnralement plus importante chez les kystes produits partir de trophozoites cultivs en PYG, ceci aussi bien avant (A) qu'aprs (B) le traitement SDS. Chez les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 la proportion moins importante de kystes marqus IP avant (C) et aprs (D) traitement SDS traduit une moindre permabilit et une plus grande rsistance au SDS. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 28/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 8 : Proportion des kystes marqus IP avant (colonnes blanches) et aprs (colonnes grises) traitement SDS pour les kystes des 4 souches d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG ou sur cellules HEp-2. Des observations en microscopie lectronique transmission ont de plus permis de mettre en vidence un nombre important de vacuoles lipidiques dans les kystes issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 (Fig. 9) tandis qu'elles n'taient pas ou que peu prsentes chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG. Ces vacuoles lipidiques sont gnralement associes aux kystes matures (15). L'analyse en cytomtrie en flux des kystes marqus au calcofluor (reflet du contenu en cellulose) a confirm ces observations, avec une population htrogne constitue de kystes matures (contenu en cellulose lev) et immatures (contenu en cellulose moins lev) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG, tandis que les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 taient essentiellement matures (Fig. 10). Les observations ralises en microscopie lectronique balayage sur une souche d'Acanthamoeba ont confirm ces diffrences, avec des kystes matures (aspect pliss) et immatures (aspect arrondi) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG, et essentiellement des kystes matures chez les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 (Fig. 11). Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique transmission des kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2. De nombreuses gouttelettes lipidiques sont visibles dans le corps cellulaire. Barre : 2 m. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 29/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au calcofluor. Les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG sont constitus de deux populations : rgion A correspondant aux kystes immatures et B correspondant aux kystes matures. Les kystes issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 sont majoritairement constitus d'une population homogne de kystes matures (rgion C, la rgion D correspondant essentiellement des dbris cellulaires). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 30/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 11 : Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage. Les kystes matures (photos du haut) ont un aspect pliss (A) et une surface d'apparence granuleuse (B). Les kystes immatures (photos du milieu) sont arrondis (C) et prsentent une surface d'apparence fibreuse (D). Des kystes prsentant un aspect intermdiaire ont t observs dans les populations issues des trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 (photos du bas): apparence crnele (E) avec une surface fibreuse (F). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 31/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Les kystes produits partir de trophozoites cultivs suivant les deux mthodes ont par la suite t soumis des traitements de dcontamination. Les rsultats montrent clairement que les kystes issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 sont souvent plus, voire beaucoup plus rsistants certains traitements (Fig.12 page suivante): chaleur (65C), eau de javel dilue 0,25%, produit base de glutaraldhyde 2%, peroxyde d'hydrogne 7,5% et produit base d'orthophtalaldhyde 0,55% voient leur efficacit diminue de manire plus ou moins importante suivant les souches d'amibes considres. Le produit base d'acide peractique 0,2% conserve son efficacit. Ces rsultats sont mettre en perspective avec l'utilisation faite de certains de ces traitements sur le terrain. La glutaraldhyde est encore frquemment utilise comme dsinfectant de haut niveau dans certains pays europens et aux US ; d'autres auteurs avaient dj rapport une efficacit limite de cette molcule sur les kystes amibiens (43). Les donnes concernant l'efficacit de la chaleur varient d'une tude l'autre. Turner et al rapportent qu'une exposition 46C pendant 30 min est efficace contre les trophozoites, tandis qu'une exposition pendant 30 min 56C est ncessaire pour inactiver les kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts en tampon Neff (97). Aksozek et al rapportent qu'une exposition une temprature de 65C pendant plus de 5 min est efficace pour inactiver des kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts sur gloses non nutritives (3), tandis que Ludwig et al rapportent que des kystes de A. castellanii et A. polyphaga produits par enkystement en milieu PYG ne sont inactivs qu'aprs exposition 80C pendant 10 min (57). Inversement, des kystes d'une souche thermotolrante d'Acanthamoeba infects par L. pneumophila n'ont pas t inactivs aprs une exposition 80C pendant 10 min (83). La rsistance accrue des kystes la chaleur observe dans notre tude est un point important car des chocs thermiques 65C sont frquemment utiliss pour contrler la prolifration de L. pneumophila dans les rseaux d'eau (63). Une efficacit limite de ces chocs sur les kystes d'Acanthamoeba pourrait donc entrainer un risque accru de contamination des rseaux. Globalement, ces travaux confirment l'intrt de la mthode de culture des trophozoites amibiens sur cellules HEp-2 plutt qu'en milieu synthtique PYG, permettant d'obtenir des kystes plus matures contre lesquels les traitements de dcontamination peuvent tre tests de faon pertinente. Ils appellent d'autres tudes de validation afin de mettre en place des mthodes standardises d'valuation de l'efficacit des traitements sur les kystes. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 32/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souches d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG (colonnes noires) ou sur cellules HEp-2 (colonnes grises). > rduction maximale observable ; * diffrence significative avec P < 0,05 ; ** diffrence significative avec P < 0,001. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 33/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Chapitre 4 : Interactions amibes libres / micro- organismes Lors des tudes environnementales menes sur l'usine de potabilisation nous avons isol par co- culture amibienne deux micro-organismes d'intrt qui ont t tudis de manire plus approfondie par la suite, donnant lieu deux publications scientifiques. Par ailleurs nous avons particip plusieurs descriptions de nouvelles espces et des tudes visant dterminer la pathognicit de ces nouvelles espces. Nous nous sommes aussi intresss aux interactions amibes-mycobactries ainsi qu'aux changes de gnes entre micro-organismes intracellulaires (bactries et virus) et entre micro-organismes intracellulaires et htes amibiens. Ces travaux sont brivement rsums dans ce chapitre. 4.1- Les amibes libres de l'environnement : melting-pot du monde microbien Le concept d'amibes faisant office de melting-pot permettant l'change de gnes entre micro- organismes intracellulaires (bactries et virus) ainsi qu'entre micro-organismes intracellulaires et hte amibien a merg ces dernires annes (pour une revue, voir (59)). Dans une revue publie en 2010 nous avons cherch illustrer l'importance qu'ont eu et continuent avoir les changes dinformation gntique entre bactries, virus et protozoaires dans l'volution des micro-organismes ((92), publication en annexe). Nous avons expos de nombreux exemples tirs d'une littrature scientifique de plus en plus abondante concernant ce sujet : importance des Chlamydiae dans lapparition des cellules vgtales, transferts de gnes entre protozoaires et lgionelles, entre protozoaires et rickettsies, entre protozoaires et la bactrie symbionte d'amibes Ca Amoebophilus asiaticus, entre protozoaires et virus gants d'amibes (Fig. 13). Par ailleurs nous avons soulign la proximit phylogntique et/ou volutive de certaines espces bactriennes ou de certains virus trouvs chez les amibes avec d'autres espces bactriennes ou virus trouvs chez les insectes : par exemple les plus proches voisins phylogntiques de l'espce symbiotique d'amibes Ca Amoebophilus asiaticus sont les bactries symbiotiques d'insecte appartenant au genre Cardinium. Ces observations, encore trs prliminaires tant donn le faible nombre de gnomes de protozoaires disponibles pour le moment, permettent de construire des scenario volutifs sur la base de l'observation de transferts de gnes entre micro-organismes. Un exemple intriguant de transfert a t donn par Moliner et al (60) concernant l'change du gne codant pour la sterol delta-7 reductase. Les tudes initiales rapportaient la prsence de copies phylogntiquement proches de ce gne chez Legionella drancourtii, Coxiella burnetii et Protochlamydia amoebophila, suggrant que le gne avait t acquis partir de cellules de plantes par l'anctre des Chlamydiae, puis transmis aux intra-cellulaires d'amibes lors de co- infections Chlamydiae-lgionelles (60). En prenant en compte le gnome rcemment publi de l'amibe Naegleria gruberi ainsi que ceux d'autres espces de Chlamydiae et de lgionelles nous avons pu prciser qu'il s'agissait plus probablement d'un transfert d'un gne provenant d'une Naegleria vers une bactrie Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 34/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 intracellulaire d'amibes, suivi ensuite de transferts entre bactries intracellulaires d'amibes (Fig. 14). De manire intrigante, un gne codant pour une sterol delta-24 reductase a aussi t dtect chez Coxiella burnetii ; ce gne n'est pas dtect chez les lgionelles et les Chlamydiae mais son homologue le plus proche est l aussi prsent chez Naegleria gruberi (38). Figure 13 : Exemples d'changes d'information gntique entre micro-organismes intra-amibiens (adapt de (92)). 0 Entre les anctres des rickettsies et ceux des Chlamydiae, O entre le symbionte d'amibes Amoebophilus asiaticus et les Chlamydiae, les rickettsies, les lgionelles, Francisella et les mycobactries, O entre le symbionte d'amibes Amoebophilus asiaticus et le virus d'amibes Mimivirus, O entre les lgionelles et leur hte amibien, O entre les lgionelles et le virus d'amibes Mimivirus, O entre les virus NCLDVs et leurs htes eucaryotes, 6 entre le virus d'amibes Mimivirus et son hte amibien, O ente le virophage Sputnik et le virus d'amibes Mamavirus * NCLDV : nucleocytoplasmic large DNA viruses Figure 14 : Arbre phylogntique mettant en vidence les relations phylogntiques entre les gnes codant pour la sterol delta-7 reductase chez l'amibe Naegleria gruberi et chez les bactries intracellulaires affilies aux lgionelles et aux Chlamydiae (alignement squences acides amins avec le logiciel Muscle, arbre construit avec PhyML). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 35/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 4.2- Interactions des amibes avec de nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia En plus des espces classiques de Chlamydiae pathognes pour l'homme et l'animal (Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psitacci, Chlamydia felis, Chlamydia abortus, Chlamydia caviae, Chlamydia pecorum et Chlamydia muridarum), de nombreuses espces de Chlamydiae environnementales ont t dcrites ces dernires annes (Fig. 15). Ces espces appartiennent plusieurs familles : Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Rhabdochlamydiaceae et Waddliaceae. La plupart sont capables de croitre dans les amibes libres de l'environnement, certaines dans les cellules eucaryotes mammifres (dont les macrophages). Certaines espces peuvent aussi survivre dans les kystes amibiens. Du point de vue de la comprhension des mcanismes volutifs ayant donn lieu lmergence des organismes eucaryotes, de nombreux gnes de plantes trouvent leur plus proches homologues chez ces nouvelles espces de Chlamydiae, suggrant que des vnements symbiotiques impliquant notamment des Chlamydiae ancestrales et des cellules eucaryotes primitives ont donn naissance aux premires cellules de plantes. Par ailleurs la plupart de ces nouvelles espces intracellulaires obligatoires ont t associes diffrentes pathologies infectieuses chez l'homme et l'animal (Table 4). Des tudes srologiques et des tudes de dtection par PCR ont permis de les associer des bronchopathies et des pneumonies d'tiologie inconnue chez l'homme, ainsi qu' des avortements spontans chez l'homme et chez l'animal (42, 55). Table 4 : Pathologies associes aux nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia. Cette table est adapte de la revue du D r Greub publie en 2009 (38). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 36/64 Espce bactrienne Maladie/condition Preuve base sur Infections respiratoires basses Parachlamydia acanthamoebae Pneumonie d'origine communautaire Immunofluorescence, PCR & squenage Pneumonie d'aspiration Immunofluorescence, western blot Bronchite PCR & squenage Bronchiolite PCR temps rel Simkania negevensis Bronchiolite PCR, ELISA, culture Pneumonie chez les enfants Immunofluorescence Pneumonie chez les adultes ELISA Exacerbation de bronchopneumopathie obstructive chronique ELISA Protochlamydia naegleriophila Pneumonie d'origine communautaire Immunofluorescence directe, PCR temps rel spcifique, PCR & squenage Protochlamydia amoebophila Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage Waddlia chondrophila Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage Rhabdochlamydia porcellionis Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage Autres pathologies Parachlamydia acanthamoebae Arteriosclrose PCR & squenage, srologie Fausse couche Immunofluorescence, western blot Sclrose multiple PCR Waddlia chondrophila Fausse couche Immunofluorescence, western blot t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 15 : Arbre phylogntique des Chlamydiales bas sur la squence codant pour l'ARN ribosomal 16S. Les alignements ont t raliss avec le logiciel Muscle, l'arbre avec le logiciel PhyML (100 bootstraps). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 37/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Les travaux brivement rsums ci-dessous sont de plusieurs natures : isolement et description de nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia, exploration de la pathognicit potentielle de certaines de ces nouvelles espces et enfin capacit de survie de ces nouvelles espces dans l'environnement. Ces travaux contribuent tous une meilleure comprhension de l'cologie et de l'importance en sant humaine de ces nouvelles espces bactriennes. 4.2.1- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Criblamydia sequanensis Rfrence (91), publication en annexe Lors de notre tude sur l'usine de potabilisation nous avons isol et dcrit la nouvelle espce Criblamydia sequanensis partir d'un chantillon d'eau de Seine co-cultiv avec A. castellanii ATCC 30010. Cette espce est rapidement lytique pour les amibes infectes. Elle est capable d'infecter de nombreuses souches d'Acanthamoeba (Fig. 16B) mais nous n'avons pas pu mettre en vidence de croissance dans des amibes appartenant d'autres genres amibiens (Hartmannella, Naegleria...) ou dans des cellules mammifres (56, 91). Elle ne survit pas dans les kystes d'Acanthamoeba car les amibes infectes perdent leur capacit d'enkystement (28). La confirmation qu'elle reprsente bien un nouveau genre (voire une nouvelle famille) de Chlamydiae a t apporte par l'amplification, le squenage et l'analyse phylogntique de plusieurs gnes. Nous avons mis au point et valid une sonde spcifique d'espce ciblant l'ARNr 16S de C. sequanensis et l'avons utilise pour dtecter la bactrie dans les amibes. Cette nouvelle espce prsente une morphologie typique en toile la fin du cycle de rplication intra-amibienne (Fig.16A & 16D). Par ailleurs de nombreuses structures d'origine cellulaire remplies de bactries sont prsentes la fin de ce cycle d'infection (Fig.16C), ce qui n'est gnralement pas observ pour les autres Chlamydiae environnementales. L'quipe du D r Greub a rcemment dcrit une espce phylogntiquement proche : Estrella lausannensis, qui prsente des similitudes (morphologie en toile) mais aussi des diffrences importantes (spectre d'hte plus important) avec C. sequanensis (52, 56). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 38/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 16 : Infection d'Acanthamoeba castellanii par Criblamydia sequanensis. Page prcdente : (A) Kystes amibiens non infects (flches noires) et structures remplies de bactries (flches blanches) observs la fin du cycle d'infection ; (B) amibe infecte ; Ci-dessus : (C) zoom sur une structure remplie de bactrie observe en 3A ; (D) forme typique en toile de la bactrie la fin du cycle d'infection. Barres : 20 m (A), 2 m (B&C) et 0,2 m (D). De manire intressante, des tudes srologiques ralises chez des populations de patients souffrant de diffrents types d'infections respiratoires ont mis en vidence une association entre la pathologie asthmatique et une srologie positive Criblamydia (11). 4.2.2- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydia crassificans (25) Nous avons particip la description de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydia crassificans isole chez la blatte (25). Des tudes ultrieures ont montr que des bactries appartenant au genre Rhabdochlamydia pourraient tre responsables d'infections respiratoires chez les enfants et de naissances prmatures (srologies positives) (54). Par ailleurs des Rhabdochlamydia ont t dtectes par PCR sur des chantillons cliniques de patients souffrant d'infection respiratoire d'tiologie inconnue (44, 66). 4.2.3- Publication : Implication de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Waddlia chondrophila dans les avortements chez la femme Rfrence (13), publication en annexe L'espce Waddlia chondrophila a t isole pour la premire fois en 1990 d'un avorton de veau et l'association avec des avortements chez le btail a depuis t confirme par plusieurs tudes (31, 32, 45, Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 39/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 73). Nous avons pour notre part particip en 2007 une tude dmontrant que les femmes ayant subi des avortements spontans uniques ou rptition prsentaient de manire plus frquente des srologies positives Waddlia que les femmes ayant suivi une grossesse normale : 31,9% de femmes sropositives dans le groupe ayant subi un avortement spontan unique, 33% dans le groupe ayant subi plusieurs avortements spontans, et seulement 7,1% (P < 0,001) dans le groupe ayant suivi une grossesse normale (13). Il faut signaler que des tudes de sero-ractivit de diffrentes espces de Chlamydia et Chlamydia-like n'ont pas permis de mettre en vidence de raction croise entre W. chondrophila et les autres espces testes (20). Ces rsultats de srologie suggrent donc une pathognicit de l'espce W. chondrophila pour l'homme (13). Cette tude a depuis t complte par d'autres travaux mens par le D r Baud qui semblent confirmer la pathognicit vis--vis de l'homme (9, 10, 12, 40). Les mcanismes de cette pathognicit restent dcrire mais la capacit importante de W. chondrophila se multiplier dans de nombreux types cellulaires aussi bien amibiens que mammifres et ventuellement persister sous forme de corps aberrants ouvrent des pistes d'exploration. 4.2.4- Publication : Capacit de survie dans l'environnement des nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia Rfrence (28), publication en annexe Malgr les soupons de plus en plus importants concernant la pathognicit des bactries apparentes aux Chlamydia il n'existe que trs peu d'information quant la capacit de ces espces survivre dans l'environnement. Les quelques travaux publis ce sujet concernent essentiellement l'espce Simkania negevensis, dont Kahane et al ont montr qu'elle pouvait survivre au moins 7 jours dans de l'eau distille strile temprature ambiante (51). Des tudes rcentes rapportent aussi que Parachlamydia acanthamoebae (souche Bn9) peut survivre quelques jours l'tat sec sur une surface (37), et que les corps lmentaires (extra-cellulaires) de Protochlamydia amoebophila prsentent une activit mtabolique dtectable pendant plusieurs semaines (44). Inversement, quelques tudes rapportent une capacit trs limite de survie des bactries du genre Chlamydia l'tat libre dans l'environnement : quelques heures seulement pour Chlamydia pneumoniae (101). Il est donc tentant de spculer qu'une capacit de survie extra-cellulaire leve caractrise les Chlamydia-like par rapport aux bactries du genre Chlamydia. Dans cette tude nous avons explor la capacit de Waddlia chondrophila, Parachlamydia acanthamoebae (souches Bn9 et Hall coccus), Protochlamydia naegleriophila et Criblamydia sequanensis survivre : l'tat sec en prsence ou non de souillures organiques, en suspension en milieu pauvre (eau du robinet strilise par autoclavage) ou en milieu riche (bouillon PYG). Par ailleurs la capacit de ces espces se multiplier dans 11 souches d 'Acanthamoeba a t explore, ainsi que leur rsistance diffrents traitements de dsinfection (expositions ralises sur bactries en suspension, pendant un temps de contact de 10 min). L'espce Chlamydia trachomatis (souche L2/434/BU responsable de lymphogranulomatose vnrienne) a t utilise comme contrle dans tous ces tests. Les rsultats des tests de survie dmontrent clairement une capacit plus importante de survie des Chlamydia-like dans l'environnement en comparaison de C. trachomatis. Alors que cette espce est Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 40/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 gnralement indtectable (par infection de cellues HEp-2) ds la fin de la premire semaine d'incubation (Fig. 17), les Chlamydia-like survivent bien plus longtemps : 3 4 semaines l'tat sec en l'absence de souillures organiques, 3 7 semaines l'tat sec en prsence de souillures organiques, de 6 > 10 semaines en suspension dans de l'eau du robinet strile et gnralement > 10 semaines en milieu PYG (Fig. 17). Concernant les spectres d'hte (Table 5) il est intressant de noter que les deux souches de P. acanthamoebae ne prsentent pas exactement le mme spectre : la souche Bn9 n'est pas capable d'infecter les deux souches d'Acanthamoeba lenticulata tandis que la souche Hall coccus l'est. Par ailleurs de nombreuses vsicules (ou pseudo-kystes ?) sont observs la fin du cycle d'infection des amibes par C. sequanensis, mis part lors de l'infection des deux souches d' A. lenticulata qui semble nettement moins efficace. Enfin P. naegleriophila infecte efficacement toutes les souches amibiennes tandis que W. chondrophila prsente un spectre plus limit avec une infection rellement productive chez seulement deux souches d'amibes. Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like. a: nombreuses vsicules observes la fin du cycle d'infection. Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 41/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis. C. trachomatis (ligne en pointills), P. acanthamoebae souche Bn9 (carrs blancs), P. acanthamoebae souche Hall coccus (carrs noirs), P. naegleriophila (losanges noirs), W. chondrophila (triangles noirs) et C. sequanensis (ronds noirs) ont t schs en microplaques 96 puits en l'absence de souillures organiques (A) ou en prsence de srum albumine bovine + sang (B), ou suspendus en eau du robinet strile (C) ou en bouillon PYG (D). Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2. La dtection a t ralise l'aide du kit Bio-Rad Pathfinder (anticorps spcifiques) 7 jours aprs l'infection des amibes. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 42/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 L'infection des souches d'amibes par C. trachomatis n'a jamais donn lieu une prolifration bactrienne dans les amibes directement visible au microscope comme pour la plupart des Chlamydia-like. Par ailleurs l'utilisation de la PCR quantitative (50) n'a pas permis de mettre en vidence une augmentation du nombre de copies d'ADN de C. trachomatis lors de l'infection des amibes : ce nombre de copies restait gnralement relativement constant entre le premier jour et le douzime jour de l'infection. En revanche l'utilisation du kit de dtection in situ des C. trachomatis a permis de mettre en vidence la prsence de ces bactries dans les amibes infectes jusqu' 7 jours aprs l'infection (Fig. 18). Ce rsultat est intriguant est appel des explorations complmentaires. Des exprimentations similaires avec Chlamydia abortus ont mis en vidence une disparition rapide des bactries intra-amibiennes qui devenaient indtectables avec des anticorps spcifiques (104). En revanche l'tude de Essig et al semble dmontrer une survie, voire une faible multiplication de Chlamydia pneumoniae dans les amibes (33). Nos rsultats, combins au fait que certains auteurs ont rcemment rapports l'identification de bactries proches de C. trachomatis dans des amibes isoles de cornes infectes (48), peuvent laisser supposer que C. trachomatis est capable de survivre dans les amibes pendant une dure significative. Concernant enfin l 'effet des traitements de dsinfection sur les bactries extracellulaires (Table 6), l'observation la plus notable est la rsistance importante des Chlamydia- like la chaleur en comparaison avec C. trachomatis : la rduction de titre observe aprs exposition 55C pendant 10 min est de l'ordre de 0,5 Log10 pour Pa. acanthamoebae Bn9 et Pr. naegleriophila, de 1,5 2,0 Log10 pour W. chondrophila et P. acanthamoebae Hall coccus, et de 3,5 Log10 pour C. sequanensis. L'inactivation est complte pour C. trachomatis. Comme pour la rsistance des kystes amibiens la chaleur (cf paragraphe 3.2.3), cette apparente rsistance des Chlamydia-like la chaleur pose question car la chaleur est souvent utilise pour contrler les flores microbiennes dans les rseaux de distribution d'eau (63). 4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries Le genre Mycobacterium comprend un grand nombre d'espces pathognes pour l'homme, dont les plus connues sont Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae et Mycobacterium ulcerans responsables respectivement de la tuberculose, de la lpre et de l'ulcre de Buruli. Par ailleurs les espces regroupes sous l'appellation mycobactries non tuberculeuses (NTM en anglais) reprsentent un groupe d'espces diverses qui sont largement prsentes dans l'environnement et frquemment isoles des sols et des eaux (eaux de surface, eaux de rseaux). Ces espces sont responsables d'un nombre croissant d'infection respiratoires, cutanes et des tissus mous (19, 30, 103). Les NTM appartenant au complexe Mycobacterium avium, ainsi que les espces M. abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. fortuitum, M. kansasii et M. mucogenicum sont les plus frquemment isoles des patients. Les infections causes par ces espces sont souvent considres comme opportunistes mais la prsence ubiquitaire de ces bactries dans divers types d'eaux (y compris l'eau des rseaux hospitaliers) et la difficult qu'il y a traiter les infections qu'elles causent en font un problme majeur de sant publique. Les tudes rapportant la capacit des mycobactries survivre et / ou se multiplier dans les amibes libres de l'environnement sont de plus en plus nombreuses. Nous en avons fait une revue en 2007, dmontrant clairement que la plupart des espces de mycobactries pathognes, y compris M. leprae, sont capables de survivre voire de se multiplier dans les Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 43/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 trophozoites d'Acanthamoeba, et ventuellement de survivre dans les kystes (95) (publication en annexe). Les travaux d'Adekambi et al. (2006) rapportent notamment la capacit de 26 espces diffrentes de mycobactries survivre dans les kystes d'A. polyphaga, tant ainsi protges vis--vis de traitements de dsinfection au chlore (1). Les auteurs suggrent par consquent qu'il devient ncessaire de tester l'efficacit contre ces kystes amibiens infects des traitements biocides utiliss pour traiter les endoscopes. Par ailleurs, il semblerait que des mutations des gnes de porines confrant une rsistance accrue de certaines souches de M. chelonae aux traitements de dsinfection base d'aldhydes mais aussi de nombreux traitements antibiotiques pourraient aussi favoriser la survie intra-cellulaire (y compris intra- amibienne) des ces souches de mycobactries (76, 84). Enfin la multiplication intra-amibienne des mycobactries semble favoriser l'expression de gnes de virulences qui sont les mmes que ceux confrant une virulence accrue vis--vis de l'homme ou de l'animal (23, 29, 86). Un tableau relativement inquitant semble donc merger de ces diffrentes tudes : certains traitements de dsinfection couramment utiliss (aldhydes, mais aussi autres traitements?) pourraient slectionner des souches de mycobactries pathognes prsentant une rsistance plus leve aux antibiotiques et plus mme de survivre et de se multiplier dans les amibes, exacerbant ainsi l'expression de gnes de virulence favorisant l'infection de l'homme ou de l'animal. Cette description alarmiste est sans doute trs simplifie mais la plupart des tudes publies rcemment vont dans ce sens. Dans ce contexte, nous avons particip plusieurs tudes portant sur les interactions amibes mycobactries. 4.3.1- Publication : Test de la virulence de diffrentes souches cliniques de Mycobacterium kansasii vis--vis d'Acanthamoeba castellanii Rfrence (41), publication en annexe L'espce Mycobacterium kansasii est, avec M. avium, l'une des espces de mycobactries non tuberculeuses les plus frquemment responsables d'infections chez l'Homme. Cette espce est classe en plusieurs sous-types sur la base du gne hsp65 : le sous-type 1 est considr comme virulent car isol chez des patients immunocomptents ou immunodficients souffrant d'infections pulmonaires, le sous-type 2 est considr comme opportuniste car principalement isol de patients infects par le VIH et souffrant d'immunodficience, le sous-type 3 est gnralement considr comme commensal car isol de patients ne souffrant pas d'infection (85). La pathognicit des autres sous-types (4 7) reste dterminer. Dans ce contexte, nous avons tir parti de la prsence d'une large collection de souches de M. kansasii l'hpital de Lausanne afin de tester la virulence vis--vis des amibes de souches appartenant ces diffrents sous- types. Des souches appartenant aux sous-types 1, 3 et 6 ont t utilises pour infecter l'amibe Acanthamoeba castellanii ATCC 30010. Le suivi de l'infection a ensuite t ralis en effectuant des colorations de Ziehl-Neelsen permettant de rvler la prsence de mycobactries dans les amibes. Le pourcentage d'amibes infectes ainsi que la progression du nombre de bactries par amibe ont t relevs au fur-et--mesure de l'infection. Ces expriences relativement simples ont permis de mettre en vidence une plus grande virulence du sous-type 1, avec un nombre d'amibes infectes et un nombre de bactries par amibes plus importants que pour les sous-types 3 et 6 (Fig.19). Seule une souche appartenant au sous-type 3 prsentait un profil de virulence similaire celui des souches du sous-type 1 ; or cette souche tait la seule Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 44/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 souche considre comme virulente parmi les souches du sous-type 3, car isole partir de prlvements sanguins. Ces travaux semblent donc confirmer la pertinence du modle amibien dans l'tude de la virulence des mycobactries. Figure 19 : volution du pourcentage d'amibes infectes (A) et du nombre de bactries par amibe (B) en fonction des sous-types. La souche 142 est une souche de sous-type 3 considre comme pathogne car isole d'une hmoculture. 4.4- Interactions des amibes avec les virus NCLDV Les virus gants capables d'infecter les amibes ont suscit l'intrt de la communaut scientifique ces dernires annes. La description du Mimivirus et de son gnome par l'quipe du P r Didier Raoult Marseille a soulev de nombreuses questions et donn lieu des dbats passionns sur le rle de ces nouveaux virus dans les changes gntiques entre eucaryotes et bactries (cf Fig.13), et sur leur place ventuelle dans l'arbre volutif de la vie sur terre. En plus de ces questions volutives il a t propos que ces nouveaux virus puissent tre responsables d'infection chez l'homme, avec la description d'un cas de sroconversion positive Mimivirus lors de l'infection accidentelle d'un technicien de laboratoire (71). Quels que soient leur place relle dans l'arbre volutif et leur rle en tant qu'agents infectieux ces virus constituent un sujet d'tude passionnant. En plus de leur taille et de celle de leur gnome, proches de celles des plus petites bactries, ces virus prsentent de nombreuses particularits dont la prsence de nombreux gnes dorigines eucaryote et bactrienne dans leurs gnomes, donnant lieu des activits mtaboliques indites chez des virus. Ils appartiennent au groupe des virus NCLDV (nucleocytoplasmic large DNA viruses) comprenant notamment les Phycodnavirus (virus infectant des micro-algues marines), les Iridovirus (dont plusieurs sont des pathognes de poissons, d'amphibiens et de reptiles), les Asfarvirus (virus de la fivre porcine africaine) et les Poxvirus (nombreux pathognes humains et animaux) (Fig. 20). Ils sont supposs agir comme de vritables taxis permettant lchange de gnes entre les amibes et les bactries intracellulaires damibes (lgionelles, Chlamydia-like) et sont eux-mmes potentiellement infects par des virophages (Fig.13). Il faut noter que bien que dcrit chez les amibes Mimivirus est affili de faon Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 45/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 distante au groupe des Phycodnavirus. Par ailleurs deux nouveaux virus ont rcemment t affilis Mimivirus : le Cafeteria roenbergensis virus (CroV) qui infecte un protiste microflagell prdateur de bactries, et le Megavirus qui a t isol partir d'chantillons marins par co-culture sur amibes (5, 36). La nouvelle famille Megaviridae est donc propose, incluant Mimivirus et ces deux nouveaux virus (5). Plusieurs tudes mtagnomiques effectues sur milieu marin rapportent la prsence de gnes affilis Mimivirus, suggrant que les membres de la nouvelle famille des Megaviridae sont prsents de faon importante dans les ocans (24, 61, 62). Par ailleurs plusieurs photos de microscopie lectronique suggrent que des virus relativement gros prsentant une morphologie semblable celle de nombreux NCLDVs sont aussi prsents chez de nombreux autres micro-organismes eucaryotes, dont des parasites comme les Giardia ou les Blastocystis (79-81). Figure 20 : Arbre phylogntique de virus reprsentatifs du groupe des NCLDV (nucleocytoplasmic large DNA viruses). L'arbre a t construit partir d'un alignement de concatnats de 5 core protines du groupe 1 retrouves chez une vaste majorit de NCLDV : ATPase A32, protine majeure de capside, hlicase D5, ADN-polymrase B et facteur de transcription A1L/VLTF2. Les virus rcemment dcrits : Cafeteria roenbergensis virus (CroV) et Megavirus ne sont pas reprsents. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 46/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 4.4.1- Publication : Lausannevirus, un nouveau virus d'amibes Rfrence (89), publication en annexe Dans ce contexte, nous avons squenc et annot le gnome d'un virus isol partir d'une co-culture d'eau de Seine et que nous avons par la suite nomm Lausannevirus. Le virus a t dtect par hasard alors que nous ralisions des colorations de Gimenez pour dtecter des lgionelles infectant des amibes sur un chantillon de co-culture amibienne (cf 3.1.1) (Fig.21). La prsence d'un virus a par la suite t confirme en rinfectant des amibes avec un surnageant filtr 0,45 m afin de se dbarrasser des lgionelles et en prparant les amibes ainsi infectes pour des observations en microscopie lectronique transmission (Fig. 22). Figure 21 (ci-contre) : Observation de Lausannevirus en coloration de Gimenez. Les lgionelles co-infectant les amibes sont clairement visibles (flches vertes) tandis que les virus apparaissent sous forme de petits points (flches violettes). Barre : 10 m Figure 22 (ci-dessous) : Observation de Lausannevirus en microscopie lectronique transmission. Des particules virales pleines ou vides (A, flches noires et blanches, respectivement) peuvent tre observes dans de nombreuses vacuoles rparties dans le cytoplasme des amibes infectes (B). L'observation en coloration ngative rvle la prsence de plusieurs couches dlimitant un corps condens (C). Les usines virus dj dcrites pour d'autres virus (66) sont prsentes, elles contiennent de nombreux virus en cours de formation (flches blanches) et sont entoures de nombreuses mitochondries (D). Barres : 500 nm (A), 2 m (B), 40 nm (C), 2 m (D). Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 47/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Le virus a un diamtre d'environ 200 nm. Les essais d'infection de divers types de cellules semblent montrer que ce nouveau virus est spcifique de certaines amibes du genre Acanthamoeba (groupe T4) et qu'il est apparemment incapable d'infecter des cultures de cellules mammifres. L'infection des amibes est fulgurante, avec un effet cytopathique survenant en quelques heures seulement et une lyse des cellules infectes survenant en moins de 24 h (Fig. 23). Figure 23 : Droulement du cycle d'infection d'Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 par Lausannevirus. Le virus est rvl par des anticorps polyclonaux induits chez la souris, eux-mmes marqus secondairement par des anticorps anti-souris coupls FITC. Les amibes sont colores au bleu d'Evans. Lausannevirus n'est pas dtect durant la phase d'clipse qui a lieu 2 heures aprs l'infection. La lyse des amibes intervient 16 24h aprs l'infection. Barre : 10 m. Le squenage du gnome (346 kb, GC% 42,9) a permis de dtecter 450 gnes hypothtiques d'une taille moyenne de 716 bp, reprsentant 92,6% de la taille du gnome et codant pour des protines dont la taille varie de 44 1526 acides amins. Les analyses phylogntiques bases sur les core proteins du groupe 1 retrouves chez la grande majorit des NCLDV montrent que Lausannevirus est phylogntiquement proche de Marseillevirus dcrit en 2010 par l'quipe de Didier Raoult (Fig. 20). Parmi les 450 protines prdites chez Lausannevirus : 118 n'ont pas d'homologue dans les bases de donnes, 323 trouvent leur plus proche homologue chez Marseillevirus, 7 trouvent leur plus proche homologue ailleurs que chez Marseillevirus mais prsentent cependant des homologues chez Marseillevirus, 2 n'ont pas d'homologue chez Marseillevirus. De manire intrigante, alors que la majorit du gnome de Lausannevirus est colinaire de celle du gnome de Marseillevirus avec seulement quelques zones inverses, les premires 150 kilobases du gnome de Lausannevirus ne sont pas colinaires (Fig. 24). La rgion non-colinaire n'est pas particulirement enrichie en protines d'origine bactrienne, eucaryote ou phagique. Par ailleurs cinq rgions inverses sont clairement mises en vidence dans la partie colinaire du gnome (Fig. 24). Plusieurs familles de protines ont t identifies : famille de protines contenant des motifs MORN- repeats , endonuclases et srine/thronine protines kinases. Douze autres familles moins importantes sont quasi-exclusivement constitues de protines dont la fonction est inconnue, l'exception des ubiquitines. La doxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) est une core protine du groupe 2 retrouve chez la plupart des NCLDV (49). Son rle est d'hydrolyser le dUTP, gnrant ainsi du Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 48/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 dUMP utile la synthse des nuclotides base de thymidine tout en diminuant la concentration de dUTP qui pourrait tre incorpor par erreur dans l'ADN viral. Par ailleurs la dUTPase a t associe la capacit de certains virus NCLDVs se multiplier dans des cellules au repos (ne se multipliant pas) (21). Chez Lausannevirus la dUTPase est quasiment complte tandis que chez Marseillevirus elle est trs tronque et donc srement inactive. Les analyses phylogntiques suggrent que la dUTPase de Lausannevirus aurait pu tre acquise partir de bactries endosymbiotiques d'amibes telles que Ca Amoebophilus asiaticus. Il reste dterminer si ces diffrences dans les squences des deux protines rsultent dans des diffrences de mtabolisme et/ou de virulence entre les deux virus. Signalons enfin la prsence de deux intines chez les deux virus. Les intines sont des lments gntiques mobiles transcrits en mme temps que la protine hte mais qui sont ensuite exciss. Les intines situes dans les D6/D11-hlicases des deux virus sont trs semblables, tandis que celles situes dans les ribonuclotides reductases sont trs diffrentes. Ces diffrences peuvent ventuellement renseigner sur l'histoire volutive de ces deux virus. Figure 24 : Nuage de points construit partir de l'emplacement dans le gnome des protines orthologues entre Lausannevirus et Marseillevirus. Les gnes prsentant la mme orientation sur le brin d'ADN sont indiqus en bleu, ceux encods sur le brin complmentaire sont reprsents en rouge. La premire partie du gnome des deux virus est faiblement co-linaire tandis que la seconde partie est trs largement co-linaire, avec cependant 5 rgions inverses (flches). Par ailleurs nous avons mis en vidence chez les deux virus 3 gnes codant pour des doublets dhistones, avec deux singlets prsentant une homologie importante avec les histones H2A, un autre avec les H2B, un autre avec les H3 et enfin un dernier avec des histones dArchaebactries (Fig. 25). La prsence de ces doublets soulve de nouvelles questions car le codage de doublets dhistones par un mme gne na jusquici t mis en vidence que chez des Archaebactries. Par ailleurs certains auteurs proposent que des Archaebactries ancestrales (Thaumarchaeota, possdant aussi des gnes dhistones) pourraient avoir particip aux premiers vnements symbiotiques ayant finalement donn naissance aux Eucaryotes. Comme dans le cas des Chlamydia-like, ces nouvelles donnes apportent donc des lments qui peuvent contribuer llaboration de scenarii visant expliquer lhistoire volutive des Eucaryotes. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 49/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Figure 25 : Phylognie et rpartition des motifs d'histones trouvs chez Lausannevirus et Marseillevirus. Le gne LAU_0051 encode un domaine inconnu et un domaine prsentant une homologie avec les histones H2A ; le gne LAU_0386 encode un domaine prsentant une homologie avec les histones H2B et un domaine prsentant une homologie avec les histones H2A ; le gne LAU_0387 encode un domaine prsentant une homologie avec les histones archobactries et un domaine prsentant une homologie avec les histones H3. Cette rpartition en doublets (mme gne codant pour deux domaines histones diffrents) n'est retrouve que chez certaines archobactries. L'arbre phylogntique reprsente la position phylogntique des diffrents domaines d'histones prsents chez Lausannevirus et Marseillevirus. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 50/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Chapitre 5 : Perspectives 5.1- Synthse de nos travaux Ces travaux, ainsi que de nombreux autres travaux publis par d'autres quipes sur des thmatiques similaires, dmontrent clairement que : Les amibes libres sont prsentes dans la plupart des environnements hydriques naturels ou artificiels ; Certaines de ces amibes (genre Acanthamoeba) sont susceptibles de prsenter des rsistances trs leves certaines catgories de traitements de dsinfection. Cette rsistance trs leve concerne les kystes amibiens la plupart du temps, mais les trophozoites peuvent aussi tre trs rsistants vis-- vis de certains traitements (glutaraldhyde...) ; De nombreuses espces bactriennes pathognes connues sont capables de prolifrer en prsence et/ou l'intrieur des trophozoites amibiens, et certaines survivent dans les kystes : lgionelles, mais aussi mycobactries dont l'importance en sant humaine et animale est en constante augmentation ; La virulence vis--vis des amibes est corrle la virulence vis--vis des htes suprieurs ; Les changes gntiques entre micro-organismes intracellulaires et les cellules htes hbergeant ces micro-organismes sont frquents ; De nombreuses espces bactriennes pathognes mergentes sont aussi capables de prolifrer dans les amibes : c'est le cas des bactries apparentes aux Chlamydia, pour lesquelles les preuves directes ou indirectes de pathognicit vis--vis de l'Homme et/ou de l'animal sont de plus en plus nombreuses ; Certaines parmi ces espces pathognes mergentes prsentent des capacits importantes de survie l'tat libre dans l'environnement ; Par ailleurs les amibes hbergent aussi de nouveaux types de virus qui sont eux aussi susceptibles d'tre pathognes et qui prsentent des caractristiques morphologiques et gntiques tout fait remarquables. 5.2- Perspectives / dveloppements envisags Comme nous l'avons vu ci-dessus les amibes (et plus largement les protozoaires) sont prsents dans tous les cosystmes naturels (sols, rivires...) mais aussi artificiels (rseaux d'eau, surfaces de travail, rfrigrateurs, levages de volaille... ). Ces eucaryotes unicellulaires prsentent une rsistance trs importante de nombreux traitements de dcontamination utiliss couramment dans diffrentes activits, dont la production/distribution d'eau potable et l'industrie agro-alimentaire. Ils sont en interaction constante avec les biofilms et peuvent slectionner, protger et dissminer des micro-organismes pathognes avrs ou mergents. Malgr ce contexte de risque lev l'cologie des protozoaires dans les cosystmes Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 51/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 associs la production et la distribution d'eau potable mais aussi au conditionnement, la conservation et la distribution des aliments est peu tudie, et il n'existe que peu de travaux publis dans la littrature. Par consquent, il nous parat important d'tudier l'cologie des protozoaires dans les biofilms complexes mis en place et/ou impacts par les activits humaines. L'objectif est notamment d'viter les consquences nfastes d'une prolifration mal contrle des protozoaires dans ces cosystmes : slection de bactries pathognes intracellulaires au dtriment de la flore saprophyte non pathogne, facilitation d'changes de gnes de virulence et/ou de rsistance entre bactries intracellulaires pathognes, prolifration de ces agents pathognes dans l'cosystme, risque infectieux accru pour l'homme et les animaux et ncessit d'utiliser des concentrations importantes de biocides pour radiquer les micro- organismes slectionns. Notre projet de recherche court / moyen terme comporte trois parties principales. 5 .2.1- Protozoaires de l'environnement : interactions avec l'cosystme biofilm Les travaux regroups sous cette thmatique ont pour objectif une meilleure comprhension des interactions entre diffrents protozoaires frquemment rencontrs dans les environnements artificiels (eaux de surface et de rseaux, surfaces de travail des industries agro-alimentaires, aliments issus de l'agriculture...) et les biofilms prsents dans ces cosystmes. Devenir des protozoaires dans les biofilms : les espces et les souches bactriennes prsentes dans les biofilms ainsi que les diffrentes molcules produites par ces bactries (exopolysaccharides, ADN, toxines...) jouent un rle important dans l'implantation et la croissance des protozoaires, et notamment des amibes dans les biofilms (58). Actuellement, nous disposons d'une collection de plus de 40 souches d'amibes qui ont t isoles de diffrents environnements et que nous avons identifi par squenage de fragments de l'ADNr 18S. De nombreuses donnes ont dj t recueillies pour les souches appartenant au genre Acanthamoeba : rsistance aux traitements de dcontamination usuels, permissivit l'infection par des bactries pathognes et des virus d'amibes... La collecte de ces donnes sera complte pour des souches appartenant d'autres espces amibiennes : Hartmannella vermiformis et Naegleria spp, et ventuellement pour des souches de Tetrahymena. De nouvelles caractristiques seront ensuite explores pour toute la collection : mobilit et vitesse de prdation des trophozoites, hydrophobicit et adhsion des kystes diffrents types de surfaces (acier inox, cuivre, verre...), tolrance des trophozoites et des kystes certains stress (temprature, osmolarit, salinit...). Sur la base de ces rsultats, nous slectionnerons certaines souches de protozoaires et explorerons leur capacit coloniser et interagir avec diffrents types de biofilms modles composs d'une ou plusieurs espces bactriennes non pathognes. Les biofilms complexes pourront tre caractriss par utilisation de sondes spcifiques de groupes bactriens couples la dtection en microscopie confocale. L'objectif est ici de dterminer si certaines caractristiques propres aux souches de protozoaires permettent une meilleure implantation dans certains types de biofilms, ceci afin de mieux comprendre les mcanismes de l'implantation des protozoaires dans Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 52/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 ces biofilms. Les biofilms seront forms en modes statique (en microplaque) et dynamique ( flow cells ), puis les protozoaires seront inoculs afin d'tudier plusieurs paramtres : localisation des protozoaires dans les diffrents types de biofilms, effet des protozoaires sur la croissance bactrienne et sur l'architecture des biofilms, devenir des protozoaires une fois que le biofilm a t entirement consomm , dtachement ventuel des trophozoites ou des kystes pour coloniser d'autres parties du biofilm, formation ventuelle d'un nouveau biofilm bactrien une fois que les protozoaires sont enkysts, formation ventuelle de nouveaux trophozoites par les kystes qui seraient rests en place, et si oui quel stade de dveloppement du nouveau biofilm a lieu ce dsenkystement, consommation du biofilm nouvellement form, influence de ces cycles de prdation amibienne sur l'architecture du biofilm et la virulence des souches bactriennes vis--vis des protozoaires. Signaux de communication protozoaires-biofilms : Un point important de cette partie du projet sera l'tude des signaux qui dclenchent la diffrentiation des trophozoites en kystes et inversement des kystes en trophozoites. Ces signaux sont pour le moment peu connus. Or cette diffrentiation reprsente un paramtre critique qui doit tre mieux compris afin de permettre un meilleur contrle des populations protozoaires et des bactries pathognes associes dans les biofilms. Nous avons observ que les kystes amibiens se diffrencient beaucoup plus rapidement et en plus grandes proportions en prsence de bactries vivantes qu'en prsence des mmes bactries inactives la chaleur ou dans des milieux synthtiques (donnes non publies). Nous souhaitons donc explorer si des molcules scrtes par les bactries favorisent le dsenkystement. Nous produirons des kystes amibiens en utilisant diffrentes conditions exprimentales et nous observerons la vitesse de dsenkystement sur glose ensemences avec des mutants de souches de P. aeruginosa ou d'E. coli non pathognes pour les amibes. Deux types d'approches pourront tre envisages pour l'utilisation de ces mutants. Nous formulons l'hypothse que des molcules impliques dans les mcanismes de quorum sensing bactrien sont impliques. Dans un premier temps, des mutants dont les gnes codant pour les diffrentes protines impliques dans le quorum sensing auront t inactivs pourront donc tre construits afin de vrifier si leur capacit promouvoir le dsenkystement est modifie. Par ailleurs des molcules de quorum sensing purifies sont disponibles dans le commerce (homosrine lactones notamment) ; leur effet sur les cintiques d'enkystement et de dsenkystement des protozoaires pourra donc tre explor. Dans un deuxime temps, et en fonction des rsultats obtenus dans la premire srie d'expriences, nous pourrons produire des banques de mutants alatoires et tester la capacit de ces mutants promouvoir le dsenkystement. Llectrophorse bidimensionnelle couple des techniques de spectromtrie de masse permettant l'identification des protines (MALDI-TOF MS) seront utilises afin de dterminer l'identit des protines dont l'expression diffre entre les mutants prsentant une capacit plus ou moins importante promouvoir le dsenkystement. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 53/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 5.2.2- P rotozoaires de l'environnement : rle dans la slection et la dissmination de bactries pathognes Dans cette partie, nous nous intresserons de manire plus prcise aux interactions entre protozoaires et bactries pathognes dans l'cosystme biofilm. Des modles de laboratoire seront utiliss, et des outils permettant l'tude d'cosystmes rels seront dvelopps. L'objectif est de mieux comprendre le risque rel constitu par l'association protozoaires-bactries pathognes, ceci afin de permettre une meilleure gestion et une meilleure prvention de ce risque. Impact des protozoaires sur l'implantation et la prolifration des bactries pathognes dans les biofilms : Plusieurs espces bactriennes pathognes potentiellement rencontres dans diffrents types de biofilms pourront tre tudies dans cette partie, notamment Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, diffrentes espces de mycobactries... (16). Nous disposons dj d'une collection importante de souches pour plusieurs de ces espces, et d'autres souches pourront tre collectes en fonction des besoins. Pour chaque espce bactrienne, la pathognicit de diffrentes souches vis--vis de notre collection de protozoaires sera pralablement value en utilisant des essais de croissance intra-protozoaire et d'inhibition de la croissance des protozoaires sur glose (2, 35). Nous reprendrons ensuite les biofilms bactriens complexes dj utiliss dans le point prcdent et y ajouterons diffrentes proportions d'espces bactriennes pathognes marques avec un gne codant pour une protine fluorescente (GFP, mCherry...), ceci afin de suivre limplantation de ces espces dans le biofilm. De nombreuses souches fluorescentes de Listeria, de mycobactries et de Pseudomonas sont dj disponibles dans notre collection et d'autres pourront tre acquises ou construites si besoin. Une fois l'cosystme quilibr, nous introduirons diffrents protozoaires et observerons l'ventuelle invasion de ces protozoaires par les bactries pathognes, ainsi que l'volution des quantits et de la localisation des bactries pathognes dans les biofilms sous l'influence de la prdation par les protozoaires. Alternativement, des bactries pathognes issues d'une multiplication intra-protozoaire, ou mme des protozoaires pralablement infects par des bactries pathognes marques pourront tre introduits dans les biofilms afin d'observer l'implantation et l'volution de ces bactries dans l'cosystme, ceci en comparaison avec les mmes bactries issues d'une rplication sur glose. Nous suspectons en effet que la croissance intra-protozoaire pourrait avoir un effet important sur l'implantation et la localisation des ces bactries dans les biofilms car il a t dmontr dans le cas des lgionelles que leurs proprits de surface (hydrophobicit...) et leur mtabolisme sont largement modifis suite la croissance intracellulaire. Analyse mtagnomique de la flore eucaryote des biofilms associs diffrents cosystmes, et de la flore bactrienne associe ces eucaryotes : notion de virulome des cosystmes. La connaissance de la flore microbienne eucaryote unicellulaire associe aux biofilms est encore trs parcellaire. La prsence de diffrentes espces d'amibes libres phylogntiquement loignes (Heterolobosea, Amoebozoa...) est rgulirement rapporte, ainsi que la prsence de diffrentes espces de protozoaires cilis (Tetrahymena...). Cependant, et par analogie avec ce qui a dj t largement dcrit pour les bactries, il est trs probable que les mthodes classiques d'isolement des protozoaires sur diffrents milieux de culture ne permettent de recouvrer qu'une partie minoritaire de cette flore. Il nous semble donc pertinent d'utiliser les mthodes rcentes de mtagnomique afin de permettre une approche plus exhaustive de la flore eucaryote Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 54/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 de diffrents cosystmes : rseaux d'eau potable mais aussi surfaces de travail des ateliers dans l'industrie agro-alimentaire (industrie laitire et de fermentation notamment), eau de boisson des animaux dans les fermes d'levage, surface des lgumes verts issus de l'agriculture... En fonction des chantillons collects (eau ou autres liquides, biofilms), nous procderons diffrentes tapes prliminaires de concentration des micro-organismes eucaryotes unicellulaires. Les mthodes utilises devront tre pralablement valides sur des biofilms modles dops avec diffrentes espces de protozoaires. Des traitements enzymatiques (DNAse), chimiques (monoxyde d'azote) ou biologiques (phages) favorisant la dispersion des biofilms sans dtruire les protozoaires pourront tre explors. Par la suite une premire tape de concentration des micro- organismes eucaryotes unicellulaires pourra tre ralise l'aide de diffrentes techniques : filtration 5m permettant d'vacuer une partie de la flore bactrienne, centrifugation basse vitesse permettant de sdimenter les micro-organismes eucaryotes, sparation sur gradient Nycodenz ou Ludox (aprs calibration pralable avec des protozoaires de diffrentes tailles)... Enfin, la cytomtrie couple un tri des cellules sur des critres de taille et de marquage fluorescent (ADN, paroi cellulaire) pourra ventuellement tre utilise sur les chantillons pr-concentrs afin d'apporter une tape supplmentaire de concentration et de purification (nous avons dj utilis ces techniques pour trier diffrentes sous-populations amibiennes). Diffrentes approches pourront ensuite tre envisages pour traiter les micro-organismes eucaryotes ainsi concentrs en mtagnomique : utilisation d'amorces PCR universelles ciblant le gne codant pour l'ARNr 18S des eucaryotes, utilisation d'amorces PCR universelles ciblant le gne codant pour l'ARNr 16S des procaryotes, utilisation de techniques d'amplification non slective amplifiant n'importe quel type d'ADN prsent... Le but de ces expriences est de caractriser non seulement la flore protozoaire des cosystmes tudis, mais aussi la flore bactrienne ventuellement pathogne directement associe aux protozoaires et son virulome : gnes de virulence permettant la survie et la multiplication intracellulaire. Une fois valids, ces outils permettront d'tudier ces deux populations et le virulome associ dans des cosystmes modles ou rels soumis diffrents rgimes : composition physico-chimique varie (matire organique, minraux, acidit...), traitements biocides chimiques ou physiques rguliers ou occasionnels, pollutions, changements de tempratures... L'objectif principal est une meilleure comprhension de l'influence de ces facteurs sur la prolifration des protozoaires et des bactries pathognes associes, et donc sur le virulome prsent dans ces cosystmes. 5. 3.3- Protozoaires de l'environnement : amlioration des stratgies de contrle Dans cette troisime partie nous nous attacherons mieux comprendre l'effet des traitements biocides sur les protozoaires associs aux biofilms, mais aussi sur les virus d'amibes qui sont des rgulateurs importants des flores amibiennes. L'objectif est de dterminer quels sont les traitements biocides les plus pertinents pour contrler la flore protozoaire sans pour autant radiquer des lments essentiels de rgulation de cette flore. Effet des traitements de dsinfection sur la slection des protozoaires et des bactries pathognes : Quelques tudes rapportent l'effet global des traitements de dsinfection sur protozoaires (amibes principalement) et les biofilms. Cependant ces tudes sont souvent limites des conditions exprimentales bien dfinies et d'importantes questions restent explorer. Notamment, il semblerait que certains traitements Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 55/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 biocides pourraient slectionner des espces et/ou des souches bactriennes qui sont plus rsistantes ces traitements mais aussi plus mme de crotre dans les protozoaires (amibes) et par voie de consquence probablement plus pathognes pour l'homme et les animaux. Cela pourrait tre le cas par exemple pour les mycobactries non tuberculeuses : des tudes rcentes dmontrent que des souches prsentant des mutations des gnes codant pour les porines sont plus rsistantes aux biocides base d'aldhydes, plus mme de survivre la phagocytose et de se multiplier dans les amibes et dans les macrophages, et plus rsistantes diffrents traitements antibiotiques. Les amibes tant elles-mmes trs rsistantes aux biocides base d'aldhydes, y compris sous leur forme trophozoite, l'utilisation de tels biocides peut thoriquement avoir pour consquence une prolifration d'amibes et de mycobactries pathognes associes dans les rseaux. C'est un point extrmement important car, comme nous l'avons dj mentionn plus haut, les infections mycobactries non tuberculeuses sont en constante augmentation sans que l'on sache expliquer quelles modifications de l'environnement ont pu entraner ce changement d'pidmiologie. Le mme type de processus de slection par les traitements biocides pourrait tre luvre pour d'autres bactries pathognes. Dans ce contexte, nous souhaitons tudier l'volution d'cosystmes complexes sous l'effet de diffrents traitements biocides. La question est de savoir si certains traitements biocides peuvent promouvoir l'apparition de flores bactriennes pathognes en slectionnant des amibes (Acanthamoeba, Hartmannella) qui sont plus susceptibles l'infection par des bactries pathognes, alors que d'autres amibes (Willaertia...) qui sont elles capables de digrer les espces bactriennes pathognes sont inactives par ces traitements biocides. Diffrentes espces amibiennes dont le comportement vis--vis des bactries pathognes dans les biofilms aura dj t explor (cf ci-dessus) seront implantes dans des biofilms modles dops en bactries pathognes fluorescentes et l'cosystme sera soumis diffrents types de traitements biocides. Nous utiliserons des techniques d'imagerie confocale ainsi que des quantifications classiques sur gloses afin d'observer si les proportions relatives d'amibes et despces bactriennes pathognes augmentent pendant le traitement et lors de la recroissance du biofilm aprs l'interruption du traitement. Sensibilit de l'espce Hartmannella vermiformis aux traitements biocides : alors qu'un certain nombre d'tudes ont t publies propos de la sensibilit aux biocides des espces amibiennes appartenant au genre Acanthamoeba, il n'existe que trs peu de donnes concernant H. vermiformis. Seules quelques tudes rapportent une rsistance trs leve des kystes d'H. vermiformis au chlore et des tempratures leves. Hors nous avons montr que cette espce pourrait tre slectionne par les traitements mis en uvre lors de certains processus de potabilisation de l'eau, et plusieurs tudes confirment que cette espce est largement rpandue, voire mme prdominante dans les rseaux de distribution d'eau. Elle pourrait donc tre aussi largement prsente dans tous les systmes en contact direct ou indirect avec l'eau potable : canalisations, systmes d'arrosage et d'irrigation, surfaces des ateliers, bassins d'levage... Il a aussi t dmontr qu'H.vermiformis pouvait servir de Cheval de Troie pour L . pneumophila, P. aeruginosa, Francisella novicida... L'tude de l'efficacit des biocides sur les trophozoites et les kystes d' H. vermiformis est donc importante afin de mieux comprendre la distribution de cette espce dans les cosystmes soumis ces diffrents types de traitements biocides. Afin de raliser cet objectif nous utiliserons des mthodes simples de mise en contact des kystes d'une dizaine de souches d'H. vermiformis diffrentes avec les produits tester suivie d'une neutralisation et d'un dnombrement sur gloses Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 56/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 ensemences avec E. coli. Cette mthode est dcrite dans notre tude publie en 2010 dans Journal of Clinical Microbiology . Les souches prsentant des rsistances leves seront tudies de manire plus fine : microscopie lectronique, composition de la paroi des kystes Importance des virus d'amibes dans la colonisation des biofilms par les amibes et impact des biocides sur ces virus : De nouveaux virus infectant les amibes du genre Acanthamoeba ont rcemment t dcrits. L'infection des amibes susceptibles est trs efficace, entranant une inhibition de l'enkystement, un dtachement des amibes infectes et une lyse complte en 12 16h. Il est donc tout fait plausible que ces virus jouent un rle primordial dans la rgulation des flores amibiennes. A titre de comparaison, les populations de micro-algues marines (Emiliania huxleyi) qui sont capables de produire de vastes efflorescences alguales dans l'ocan (blooms visibles depuis l'espace) sont rgules par des virus appartenant au mme groupe que les virus d'amibes. L'tude des interactions amibes-virus est donc essentielle afin de permettre la comprhension de l'cosystme biofilm dans sa globalit, avec la cl une meilleure gestion des risques infectieux lis ces biofilms. Dans un premier temps, la capacit de survie extracellulaire des virus d'amibes sera tudie. En effet il n'existe que trs peu de donnes publies sur ce sujet. Il a seulement t rapport que l'un d'entre eux (Mimivirus) est capable de survivre en suspension en labsence d'amibes pendant plusieurs mois et qu'il est significativement rsistant diffrents stress tels que la chaleur et la dessiccation (70). Nous tudierons la capacit de survie extracellulaire de plusieurs virus en suspension dans diffrents milieux mais aussi l'tat sec sur diffrentes surfaces et en prsence de matire organique. L'effet des traitements biocides sur les virus d'amibes sera aussi tudi. Du fait de l'apparente incapacit des amibes infectes par les virus s'enkyster, ces virus ne peuvent pas tre protgs par les kystes amibiens. Les traitements biocides peuvent donc potentiellement avoir un impact important sur ces rgulateurs des populations amibiennes. Nous tudierons l'effet de traitements de dcontamination usuels sur ces virus, en utilisant les mthodologies classiques des tests de virucidie : mise en contact du virus avec le biocide, neutralisation et ensemencement des dilutions sries sur un hte cellulaire sensible l'infection. Nous chercherons dterminer quels sont les traitements biocides les plus efficaces pour contrler la prolifration des amibes (trophozoites et kystes) tout en permettant la survie des virus qui pourront rinfecter les amibes afin dviter leur prolifration aprs larrt du traitement biocide. L'cologie des virus dans les biofilms sera galement aborde. Des techniques de spectroscopie corrlation spatiale de fluorescence seront utilises afin d'tudier si ces virus gants (250 500 nm de diamtre) peuvent diffuser et s'implanter dans les biofilms. La survie des virus dans diffrents types de biofilms sera galement tudie, ainsi que l'impact des virus sur la flore amibienne en relation avec ces cosystmes complexes. Des biofilms comprenant plusieurs espces bactriennes seront constitus, inoculs avec des virus d'amibes puis par la suite avec diffrentes espces d'amibes. Nous suivrons l'volution de la flore amibienne en utilisant des mthodes d'ensemencement sur glose et/ou des mthodes d'hybridation des amibes avec des sondes spcifiques (sondes ciblant l'ARNr 18S par exemple). Enfin l'effet global des traitements biocides sur les virus, les biofilms et la flore amibienne associe sera tudi. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 57/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 5.3- Collaborations en cours et envisages L'quipe du Dr Romain Briandet (UMR763 INRA-AgroParisTech, Bioadhsion et Hygine des Matriaux, Massy) fait partie du ple Risques de l'Institut Micalis (MICrobiologie de l'ALImentation au service de la Sant humaine). Cette quipe a dvelopp une expertise importante dans l'tude des biofilms bactriens en relation avec les activits industrielles agro-alimentaires, et dans l'tude de l'effet des traitements biocides sur ces biofilms. Nous avons dj eu l'occasion de collaborer avec l'quipe du Dr Briandet dans le cadre d'un projet ple de comptitivit, avec six publications communes la cl. Les techniques utilises dans la caractrisation des souches bactriennes ainsi que dans l'observation et l'analyse des biofilms en microscopie confocale seront trs utiles la mise en uvre du projet. Les expriences de mtagnomique en vue de caractriser le virulome intra-protozoaires des cosystmes s'inscrivent dans le programme Mta-omiques des cosystmes microbiens du dpartement MICA de l'INRA. Ces analyses pourront tre ralises sur la Plateforme bioinformatique MIGALE du Centre INRA de Jouy. Nous avons aussi des collaborations de recherche en cours avec l'quipe du Dr Greub, situe l'hpital de Lausanne (Suisse). Cette quipe est spcialise dans l'tude des micro- organismes pathognes mergents en sant humaine et animale, elle travaille notamment sur les nouvelles Chlamydiae et les nouveaux virus d'amibes. L'quipe du Dr Greub pourra tre sollicite pour l'tude de facteurs de virulence particuliers issus des virulomes caractriss. L'tude des interactions protozoaires-mycobactries suscite un vif intrt aussi bien dans le domaine de la sant humaine que dans celui de la sant animale, il nous semble donc intressant d'approfondir cette thmatique notamment concernant l'espce M.avium sbsp paratuberculosis. Nous collaborons actuellement avec l'quipe du Dr Mary Jackson, du collge de mdecine vtrinaire et de sciences biomdicales de l'Universit du Colorado, localise Fort Collins (tats-Unis). Cette quipe s'intresse aux mcanismes de virulence de certaines espces de mycobactries, mais aussi aux mcanismes de rsistance aux biocides et leur survie dans l'environnement. A ce titre le Dr Jackson est trs intress par les relations mycobactries- amibes et souhaite dvelopper ce modle d'tude de la virulence dans son laboratoire. Concernant l'tude des diffrences de sensibilit des souches de protozoaires aux biocides, nous envisageons ventuellement de collaborer avec le Pr Yann Hchard, du Laboratoire de Chimie et Microbiologie de lEau de l'Universit de Poitiers (CNRS UMR 6008). Ce laboratoire utilise notamment des techniques de cytomtrie en flux couples des marquages de viabilit, ainsi que des techniques d'analyse de la composition de la paroi des kystes. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 58/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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2 0 1 2 Rfrences bibliographiques 1. Adekambi, T., S. Ben Salah, M. Khlif, D. Raoult, and M. Drancourt. 2006. Survival of environmental mycobacteria in Acanthamoeba polyphaga. Appl Environ Microbiol 72:5974-81. 2. Adiba, S., C. Nizak, M. van Baalen, E. Denamur, and F. Depaulis. 2010. From grazing resistance to pathogenesis: the coincidental evolution of virulence factors. PLoS One 5:e11882. 3. Aksozek, A., K. McClellan, K. Howard, J. Y. Niederkorn, and H. Alizadeh. 2002. Resistance of Acanthamoeba castellanii cysts to physical, chemical, and radiological conditions. J Parasitol 88:621- 3. 4. Anger, C., and J. M. Lally. 2008. Acanthamoeba: a review of its potential to cause keratitis, current lens care solution disinfection standards and methodologies, and strategies to reduce patient risk. Eye Contact Lens 34:247-53. 5. Arslan, D., M. Legendre, V. Seltzer, C. Abergel, and J. M. Claverie. 2011. Distant Mimivirus relative with a larger genome highlights the fundamental features of Megaviridae. Proc Natl Acad Sci U S A 108:17486-91. 6. Axelsson-Olsson, D., P. Ellstrom, J. Waldenstrom, P. D. Haemig, L. Brudin, and B. Olsen. 2007. Acanthamoeba-Campylobacter coculture as a novel method for enrichment of Campylobacter species. Appl Environ Microbiol 73:6864-9. 7. Axelsson-Olsson, D., L. Svensson, J. Olofsson, P. Salomon, J. Waldenstrom, P. Ellstrom, and B. Olsen. 2010. Increase in acid tolerance of Campylobacter jejuni through coincubation with amoebae. Appl Environ Microbiol 76:4194-200. 8. Bare, J., K. Sabbe, J. Van Wichelen, I. van Gremberghe, S. D'Hondt, and K. Houf. 2009. Diversity and habitat specificity of free-living protozoa in commercial poultry houses. Appl Environ Microbiol 75:1417-26. 9. Baud, D., G. Goy, M. C. Osterheld, N. Borel, Y. Vial, A. Pospischil, and G. Greub. 2011. Waddlia chondrophila: from bovine abortion to human miscarriage. Clin Infect Dis 52:1469-71. 10. Baud, D., and G. Greub. 2011. Intracellular bacteria and adverse pregnancy outcomes. Clin Microbiol Infect 17:1312-22. 11. Baud, D., C. Kebbi, J. P. Klling, and G. Greub. 2009. Seroprevalence of different Chlamydia-like organisms in an asymptomatic population. Clinical Microbiology and Infection:213-215. 12. Baud, D., L. Regan, and G. Greub. 2008. Emerging role of Chlamydia and Chlamydia-like organisms in adverse pregnancy outcomes. Curr Opin Infect Dis 21:70-76. 13. Baud, D., V. Thomas, A. Arafa, L. Regan, and G. Greub. 2007. Waddlia chondrophila, a potential agent of human fetal death. Emerg Infect Dis 13:1239-43. 14. Beattie, T. K., D. V. Seal, A. Tomlinson, A. K. McFadyen, and A. M. Grimason. 2003. Determination of amoebicidal activities of multipurpose contact lens solutions by using a most probable number enumeration technique. J Clin Microbiol 41:2992-3000. 15. Bowers, B., and E. D. Korn. 1969. The fine structure of Acanthamoeba castellanii (Neff strain). II. Encystment. J Cell Biol 41:786-805. 16. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, and R. Briandet. 2010. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 82:64-70. 17. Buck, S. L., R. A. Rosenthal, and B. A. Schlech. 2000. Methods used to evaluate the effectiveness of contact lens care solutions and other compounds against Acanthamoeba: a review of the literature. Clao J 26:72-84. 18. Buse, H. Y., and N. J. Ashbolt. 2012. Counting Legionella cells within single amoeba host cells. Applied and Environmental Microbiology. 19. Cassidy, P. M., K. Hedberg, A. Saulson, E. McNelly, and K. L. Winthrop. 2009. Nontuberculous mycobacterial disease prevalence and risk factors: a changing epidemiology. Clinical Infectious Diseases 49:e124-9. 20. Casson, N., J. M. Entenza, and G. Greub. 2006. Serological cross-reactivity between different Chlamydia-like organisms. J Clin Microbiol. Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 59/64 t e l - 0 0 6 9 4 4 1 8 ,
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