La cromatografa es una tcnica de separacin y purificacin sumamente eficaz que constituye uno de los mtodos instrumentales ms efectivos y que

tiene una gran aplicacin en la industria y desde luego en el laboratorio de Anlisis Qumicos. Cromatografa El significado literal de la palabra cromatografa, es el de "escritura en color" Es un proceso fsico mediante el cual se logra la separacin de una mezcla de solutos en solucin. Es un mtodo de separacin basado en la diferente velocidad con la que se mueven los componentes de una mezcla cuando son arrastrados por un solvente a travs de un soporte Tipos de cromatografa Por los fenmenos en que se basan la cromatografa se divide en tres tipos:

Consiste en la separacin de sustancias por filtracin de una solucin a travs de una columna de adsorbente. o: Se basa en la afinidad diferencial de las molculas cargadas en solucin, por sustancias con carga inica.

La separacin de las sustancias se logra por migracin diferencial de los solutos. Existe otro tipo de cromatografa ms moderno que se basa en la presencia de un campo elctrico que se llama Electroforesis; tiene la importancia de que se aplica de manera muy frecuente en diferentes ensayos de Bioqumica e Inmunologa. De acuerdo a la FASE ESTACIONARIA que se utiliza, la cromatografa se clasifica en: Cromatografa de papel Cromatografa de columna Cromatografa en placa fina Cromatografa de liquidos Cromatografa de gases SISTEMA CROMATOGRAFICO La fase mvil es un solvente (ELUYENTE) que se usa para permitir el desplazamiento de los solutos sobre la fase estacionaria para lograr la separacin. Se pueden usar distintos solventes puros (agua destilada, alcohol, acetona, benceno, butanol, etc.) o bien se pueden usar mezclas de dos o ms solventes (agua-alcohol, benceno-tolueno, aguaacetona, etc.). La fase fija o estacionaria es un medio que funciona como soporte y sobre este se efecta el desplazamiento de los componentes de la mezcla. El soluto es la mezcla de sustancias slidas que se pretende separar. EJEMPLOS DE FASE FIJA O ESTACIONARIA SILICA GEL KISELGHUR(TIERRA DE DIATOMEAS) ALUMINA(OXIDO DE ALUMINIO) CELULOSA Y DERIVADOS(PAPEL) RESINAS DE CAMBIO IONICO POLIAMIDAS (PLASTICOS) SEMICRISTALINOS FASE LIGADA 1.- Soluto: es la muestra problema a separar purificar El significado literal de la palabra cromatografa, es el de "escritura en color" debido a que al aplicar la tcnica para obtener la separacin de los componentes del extracto de hojas en una columna empacada, quedaron a lo largo de stas, anillos de diferentes colores. La tcnica cromatogrfica en columna estudiada originalmente por Tswett tiene como principio el de adsorcin y el soporte cromatogrfico fase estacionaria un material finamente triturado y empacado en una columna de vidrio provista de una llave de paso en la parte inferior.

El material comnmente empleado como fase estacionaria es el carbonato de calcio, almidn y gel de slice, xido de magnesio y xido de aluminio; su seleccin depende de la naturaleza del soluto por separar. Funcin de cada uno de los componentes 1.- Soluto: Es la mezcla de sustancias slida que se pretende separar. El soluto puede ser una mezcla de aminocidos, resultado de la hidrlisis de una protena. La extraccin de los pigmentos de un vegetal etc. 2.- Fase mvil (solvente): Es un solvente que se usa para permitir el desplazamiento de los solutos sobre la fase estacionaria para permitir la separacin Se puede usar distintos solventes puros (agua destilada, alcohol, acetona, benceno, butanol, etc.) o bien se pueden usar mezclas de dos o ms solventes (por ejemplo: agua-alcohol, bencenotolueno, agua-acetona, etc. 3.- Fase fija o estacionaria: Es un medio que funciona como soporte y sobre este se efecta el desplazamiento de los componentes de la mezcla. Acta por adsorcin. La fase estacionaria en la cromatografa en papel, corresponde al papel filtro. En la cromatografa en capa fina corresponde a la capa de silica-gel colocada en placas de vidrio(a la fase estacionaria tambin se le conoce como adsorbente). LAS FUERZAS QUE ACTAN EN UN CROMATOGRAMA Y QUE PERMITEN SU DESARROLLO SON: VELOCIDAD DEL FLUJO DEL SOLVENTE. CADA SOLVENTE SE MUEVE A UNA DETERMINADA VELOCIDAD SOBRE LA FASE ESTACIONARIA, LO CUAL CONTRIBUYE A EFECTUAR LA SEPARACIN. EL EFECTO DE ADSORCIN. CADA COMPUESTO DE LA MEZCLA DE SOLUTOS, SOBRE LA BASE DE SUS PROPIEDADES FISICOQUMICAS, SE ADSORBE CON DISTINTA FUERZA, LO CUAL ORIGINA QUE SE MUEVA SOBRE LA FASE ESTACIONARIA A DISTINTA VELOCIDAD. SOLUBILIDAD DEL SOLUTO EN EL SOLVENTE CADA SOLUTO DE LA MEZCLA, GENERALMENTE, TIENE TAMBIN UNA DISTINTA SOLUBILIDAD EN EL SOLVENTE LO CUAL CONTRIBUYE A UNA MEJOR SEPARACIN. EFECTO DE PARTICIN O FRAGMENTACIN. LAS DISTINTAS PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS SOLUTOS DE LA MEZCLA, IMPLICAN QUE ESTA SE FRAGMENTE Y CON LOS FACTORES ANTERIORES SE LOGRA LA SEPARACIN. DETERMINACION DEL Rf (Relacin de Frentes) Rf = Relacin de frentes (adimensional) Fm= Frente de la mancha Fm= Distancia entre el centro de la mancha y la lnea de aplicacin de la muestra (cm.) Fs= Frente del solvente Fs= Distancia entre el frente del disolvente y la lnea de aplicacin de la muestra (cm.)

DETERMINACIN DEL Rf Para una determinada mezcla de disolventes y un tipo definido de papel, el valor Rf es caracterstico del soluto y virtualmente independiente de su concentracin en la muestra. La medicin de este tipo de valores permite hacer deducciones sobre las sustancias que pueden estar presentes en la solucin. Es decir de ser una tcnica preparativa se convierte en una tcnica cualitativa El valor del Rf esta sujeto a influencias como variaciones del papel, tipo y direccin del desarrollo, tamao y concentracin de la muestra, temperatura, presin, humedad relativa y aun la distancia recorrida por la mancha. Para una determinada mezcla de disolventes y un tipo definido de papel, el valor Rf es caracterstico del soluto y virtualmente independiente de su concentracin en la muestra. La medicin de este tipo de valores permite hacer deducciones sobre las sustancias que pueden estar presentes en la solucin. Es decir de ser una tcnica preparativa se convierte en una tcnica cualitativa

El valor del Rf esta sujeto a influencias como variaciones del papel, tipo y direccin del desarrollo, tamao y concentracin de la muestra, temperatura, presin, humedad relativa y aun la distancia recorrida por la mancha. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libres en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice. En la cromatografa de columna las molculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las molculas por la fase estacionaria o por la fase mvil. Si una molcula A tiene ms afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajar ms rpido que A. Existen muchos tipos de cromatografa de columna. En el laboartorio de hoy veremos tres tipos de ellas. A. Filtracin en gel: En esta las molculas son separadas por su tamao. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamao dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaos. Las molculas de igual o menor tamao que el poro entran a las esferas mientras que las molculas ms grandes pasan rpidamente por la columna. Las molculas de tamao intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las molculas salen en orden de tamao por el eludo El material que se escoja para la fase estacionaria depender del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamao. B. Intercambio inico: Se usa para purificar protenas. Separa molculas en base a su carga inica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las molculas de igual carga salen con el amortiguador. Las molculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las protenas adheridas se usa una solucin alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solucin de mayor concentracin de sal primero. Al subir la concentracin poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elucin, la sal va compitiendo con la protena por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende. La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catinico) o positiva (intercambio aninico). El tipo de empaque depender de qu queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la carga de la columna. C. Fase inversa: Esta es una cromatografa de interaccin en la que la fase estacionaria, con molculas hidrofbicas, interacta con molculas hidrofbicas en la muestra. La matriz conciste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraern a las molculas hidrofbicas de la muestra mientras que las hidroflicas salen con el amortiguador. Las molculas son eludas de la columna lavando con soluciones de distinta concentracin de alcohol o cualquier otro solvente no polar.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografia en capa fina (CCF) ,TLC (Thin layer chromatograhy) es una tcnica cromatogrfica. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente( por ejemplo silica gel)), placas , un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de absorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas . La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.