Cincias Veterinrias, 3 Congresso da SPCV 2005, Livro de Resumos Comunicao livre oral

Implementao de um mtodo simples e preciso para sexagem de embries bovinos

Carvalhais, I, Pimenta, J, Marques, CC, Baptista, MC, Vasques, I, Horta, AEM, Santos, IC, Marques, MR, Santos Silva, MF, Pereira, R.M Estaco Zootcnica Nacional, 2005-048 Vale de Santarm, Portugal. E-mail: rosalnp@hotmail.com O desenvolvimento de mtodos simples e precisos para a sexagem de embries pr-implantatrios importante para a optimizao do maneio reprodutivo bovino em programas de seleco e melhoramento. O objectivo deste trabalho foi implementar um mtodo de sexagem de embries bovinos por reaco em cadeia da polimerase (PCR) multiplex e avaliar a distribuio de machos e fmeas em funo da qualidade e idade dos embries produzidos. Ocitos bovinos aspirados de ovrios recolhidos no matadouro foram maturados e fertilizados in vitro (FIV = D0) para a produo de embries. Ao 7 e 8 dia de cultura (TCM199 + 10% soro + clulas da granulosa), os embries foram rnicromanipulados e recolhida uma bipsia para identificao do sexo. No PCR em Pit-stop foram utilizados dois pares de iniciadores: o primeiro par, adicionado apenas ao 7 ciclo, reconhece o DNA satlite bovino 1.715 (216 pb), sendo amplificado nas fmeas e nos machos. O 2 par amplifica um fragmento especfico do cromossoma Y (174 pb) apenas presente nos machos. A eficincia na determinao do sexo foi inicialmente testada com DNA genmico extrado a partir de sangue de bovinos de sexo conhecido e optimizadas as concentraes de DNA, dos iniciadores e de MgCl2 e as temperaturas de emparelhamento a utilizar na reaco. A preciso do mtodo foi avaliada por comparao do sexo diagnosticado em bipsias e respectivo embrio (n=l4) e em duas bipsias (n=20) do mesmo embrio. Esta preciso foi de 100 e 100%, respectivamente. A eficincia do mtodo para a sexagem dos embries (n=47), avaliada pelo nmero de embries com sexo identificado em relao ao nmero de embries biopsiados, foi de 93,6%, podendo o sexo dos embries ser determinado em 5 horas. A taxa de clivagem (embries clivados/ocitos inseminados) foi de 73,81,8% (mdiaEP) e de embries D7-8 (embries D7-8/ embries clivados) foi de 23,81,7%, no havendo diferenas significativas no sexo dos embries (: 41%, : 59%). O mtodo implementado simples, preciso, rpido e econmico, podendo ser utilizado para a sexagem de embries bovinos a transferir para vacas receptoras em fresco ou aps congelao.

[IA simple and precise method for bovine embryo sexing]

Simple and precise methods for embryo sexing are important for l management and genetic improvement of cattle production systems. A multiplex polymerase chain reaction (PCR)-based method for sex determination of bovine embryo biopsies was implemented. Sex ratio of in vitro produced embryos was also determined. Abattoir derived oocytes were matured and fertilized in vitro (IVF day = D0) for embryo production in a co-culture system (TCM199 + 10% serum + granulosa cell Day 7/8 embryos were biopsied for sex determination. The method utilizes two different sets of primers in the pit-stop PCR. The first pair, added only in the 7th cycle, recognizes the bovine specific satellite sequence (216 bp) that is amplified in both females and males. In addition, another pair of primers recognizes bovine Y chromosome-specific sequences (174 bp) that are amplified in males only. Accuracy of the sex determination was initially verified with genomic DNA obtained from bovine blood of known gender. DNA, primers and MgCl2 concentrations and annealing temperatures were also tested. Altogether, 47 blastocysts were used for sex determination. Accuracy of assays determined by comparing results from biopsies with those of embryos (n=14) and from two biopsies (n=20) of the same embryo was 100 and 100% respectively. Embryo sexing efficiency calculated as the number of embryos with identified sex per biopsied embryos was 93.6%. The sexing of a large series of embryos can be accomplished in 5 hours. Embryo production rates were 73.81.8% (meanEP) and 23.81.7% for cleavage and D7-8 embryo respectively, with an absence of significant effect on sex ratio of blastocysts (: 41%, 59%). Results demonstrate that the implemented technique is an economic, rapid and highly reliable method for sexing bovine embryos prior to fresh or post-thawed transfer into recipient cows.

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