Coprocultivo

1 OBJETIVO
Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las vas gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas.

2 - FUNDAMENTO
La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios ( Bacteroides, bcilos gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de medios selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del mundo. Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con mayor facilidad. Debe anotarse, en el examen macrocpico la presencia de sangre, moco o helmintos en la inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios as como en medios selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separacin de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entricas comunes. Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en la muestra como son las pruebas bioqumicas.

3. MATERIAL

Agua destilada Gradilla Tubos de ensayo Asa de siembra desechable y normales

Hisopo Papel de filtro Pipetas de vidrio Medios de cultivo Pinzas metlicas Alcohol Algodn graso Vaso de precipitado Mechero Bunsen Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Cubeta de tincin Pinzas de madera Frasco lavador

3.2 Reactivos:

Medios de cultivo para aislamiento:

agar sangre agar Mc Conkey Agar entrico Hektoen (HK)

Medios para pruebas bioqumicas:

- Agar Christensen - KIA

Colorantes para tincion de Gram: lugol, cristal violeta, fucsina bsica, alcohol Lugol o Negro sudn

3.3 Muestras:
Muestra: heces de adulto.

4. PROCEDIMIENTO
El procedimiento fue el siguiente:

1. Recogida de la muestra Preparacin o indicaciones del paciente: Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas. a. para nios/as Para bebs y nios pequeos que usan paales: Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el envoltorio plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen con el fin de obtener una muestra mejor. b. para adultos Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para recoleccin de la muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se coloca la muestra en un recipiente limpio.

B. Condiciones para la toma de muestras Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de algodn. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1 ml de un lquido conservador, o bien, depositar en ste el hisopo rectal. Muestra de heces de 12 o 24 hrs. Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la muestra en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir un volumen igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial. C. Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio. - Evitar contaminacin por material no estril. - Uso de contenedores y medios de transporte apropiados. - Etiquetar muestra adecuadamente. - Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

2. Examen macroscpico de la muestra

Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin digerir.

3. Examen y en fresco.
Observacin en el microscopio: lugol- fresco: En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos y colocamos un cubre encima. Se realiza una dilucin en un tubo de ensayo con una pequea cantidad de heces

recogida con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le aade un poco de agua destilada, se agita un poco y se obtiene una gota de esta dilucin. Dicha gota la colocamos en un portaobjetos y aadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para su posterior observacin al microscopio. Otro mtodo de observacin es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el lugol por el negro sudan. Esta tincin est indicada para la observacin de grasa. Prueba de parasitologa: Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parsitos. En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatologa como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores clicos, elevacin de eosinfilos en sangre u otros sntomas. En el examen de parasitologa se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega una gota de lugol. Con un bote de muestra colocar una gasa y aadir 50 ml de suero fisiolgico para poder filtrar dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que observaremos con una gota de lugol aadida para poder observar mejor.

4. Realizacin de medios de cultivo y siembra 1. Medios de cultivo utilizados y su utilidad.

Recipiente ml/gr Autoclavar en el que se Utilidad vierte aislamiento de bacilos Gram negativos, aerobios Agar Mac y anaerobios facultativos. Conkey 25/1.25 Si Placa diferencia bacterias que utilizan o no, lactosa. Aislamiento Medio diferencial para aislamiento y Agar diferenciacin de gramentrico negativos entricos 25/75.1 No Placa Hektoen (Salmonella y Shigella spp) diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Identificar bacterias que Agar hidrolizan urea, tales como 25/0.6 Si Tubo Christensen Proteus spp., otras Pruebas enterobacterias y bioqumicas estafilococos. determinar si un Microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, KIA 25/1.45 Si Tubo produce gas o cido Medios

sulfhdrico. Para la realizacin del medio Christensen, le aadimos 50ml al medio con la tcnica de barry, para realizar la prueba de la ureasa.

6. Siembra e inoculacin de placas

Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la ayuda de un asa de siembra, tomando una pequea cantidad de incculo de las heces, previamente diluido en suero, teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo ms aspticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la estufa en un periodo de 24-48 horas.

1. Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas

macroscpicamente y al microscopio.
Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamao, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para que aparezcan las colonias tambin puede tener valor en la identificacin. Las caractersticas de las colonias tampoco ofrecen un diagnstico por si solas, pero dirigen los esfuerzos hacia un grupo ms o menos amplio de microorganismos. Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo muy caracterstico. 1.

Examen microscpico

Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa de Petri y se obtiene una pequea muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en un porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la muestra lo podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y cuidando de no quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera. A continuacin se procede a teir la muestra. Tincin azul de metileno: El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el porta por el mechero varias veces. Luego se tie con el azul de metileno cubrindola entera. Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se proceder a observar en el microscopio con aceite de inmersin y en el objetivo de 100x. Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. As: Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal. Se trata por tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella. ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la infeccin puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas

(Vibrio cholerae). Para realizar la tincin de Gram: Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca despus en la cubeta para proceder a teirla. Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de lugol, 30 seg y 1 min de fucsina bsica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante adems del alcohol y se deja secar. Esta tincin nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram segn sea la composicin de su pared y apreciar visualmente su forma y organizacin. 1. Realizacin de pruebas bioqumicas

Prueba KIA Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-24 horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin de gas y de cido sulfhdrico. B-GALACTOSIDASA Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la realizaremos preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo donde aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de ONPG. Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado. OXIDASA Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce cambiando de color. CATALASA Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si produce o no burbujas. UREASA Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una incubacin a 37C con un cambio de color del indicador.

5.RESULTADOS

EXAMEN MACROSCOPICO DIRECTO DE LA MUESTRA

Cantidad: 13.20 Color: marrn oscuro Olor: fecaloideo Consistencia: dura y consistente Forma: cilndrica Presencia de: - moco: no - sangre: no - pus: no - fragmento de carne: no - fragmento de fcula: si - trozos de mucosa epitelial: no - falsas membranas: no

OBSERVACIN MICROSCOPIO EN FRESCO Y CON LUGOL - En fresco: Morfolgicamente se observan microorganismos Bacilos. - Lugol: Se observa almidn tiido de un suave color lilceo. No se observan parsitos. EXAMEN MORFOLGICO DEL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS CULTIVADAS MACROSCPICAMENTE Y AL MICROSCOPIO
- Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente y al microscopio: 1. Agar sangre: Colonias redondas, borde entero, circular, color blanquecino. 2. Christensen: Colonias redondas, circular, convexa. 3. Kia: Se observa produccin de cido en todo el tubo, burbujas, agrietamiento e incluso desplazamiento del medio. 4. McConkey: Colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y en caso de que fueran colonias sin color sera el caso contario. 5. Hecktoen: No creci nada en este medio en 24 horas puede ser debido a un periodo de incubacin insuficiente o a la siembra con inoculo muy diluido.

TINCIONES

Con la tincin de Gram detectamos el tipo de bacteria que es, gracias a la diferenciacin de su morfologa.

Observacin morfolgica AZUL DE METILENO AGAR SANGRE - Se observan diferentes agrupaciones de cocos: cocos, diplococos, ttrada,

estreptococos, estafilococos. McCONKEY - Se observa agrupaciones de bacilos teidos de azul por el azul de metileno. CHRISTENSEIN - Se observan agrupaciones de cocobacilos teidos de azul por el azul de metileno. TINCION DE GRAM CHRISTENSEIN - Se observan agrupaciones de cocobacilos Gram +. McCONKEY - Se observan agrupaciones de bacilos Gram , algunos presentan puntos de color azul en la zona terminal del bacilo. Esto puede ser debido a que se estuvieran dividiendo por lo que al romperse la capa externa de peptidoglicano se pudo teir con el colorante de violeta de genciana. Tambin pueden ser restos de este mismo colorante al realizar la tincin. AGAR SANGRE - Se observan cocos gram negativos ( rosados) en su mayora, pero tambin se pueden observan algunos color azul del colorante violeta de genciana. BACTERIAS ENCONTRADAS EN EL INTESTINO GRUESO DE HUMANOS. Incidencia Incidencia BACTERIAS BACTERIAS (%) (%) Bacteroides fragilis 100 Escherichia coli 100 Bacteroides 100 Salmonella enteritidis 3-7 melaninogenicus Bacteroides oralis 100 Salmonella typhi 0.00001 Lactobacilos 20-60 Klebsiella species 40-80 Clostridium perfringens 25-35 Enterobacter species 40-80 Clostridium septicum 5-25 Proteus mirabilis 5-55 Pseudomonas Clostridium tetan 1-35 3-11 aeruginosa Bifidobacterium bifidum 30-70 Peptostreptococcus Comn Staphylococcus aureus 30-50 Peptococcus Oderado Streptococcus faecalis 100 Methanogens Comn
CUADROS DE RESULTADOS
MICROORGA-NISMO Escherichia coli MEDIO DE CULTIVO Mac conkey Agar sangre Agar sangre Agar sangre TINCION DE GRAM Bacilos Gram Cocos, diplococos y estreptococos gram + Cocos y racimos Gram + Coco Gram + TINCION DE AZUL DE METILENO Bacilos Cocos, diplococos y estreptococos Cocos y racimos cocos

Peptostreptococcus Peptococcus Streptococcus

faecalis
MICROORGANISMO PRUEBAS BIOQUIMICAS
B-GALACTOSIDASA OXIDASA KIA CATALASA UREASA

Peptostreptococcus Peptococcus Streptococcus faecalis

Escherichia coli

A/ A, G +

6.CONCLUSIN
Hemos llegado a la conclusin que en la muestra de heces no se ha encontrado ningn microorganismo patgeno ya que por las pruebas realizadas hemos deducido que los microorganismos existentes en la muestra son los habituales que presenta la flora intestinal, como es Escherichia coli , ya que creci en el medio McConkey con la morfologa caracterstica de la E. coli,( color rosado) basndonos tambin en la tincin de Gram donde aparecen en forma de Bacilos Gram y que da positivo en la prueba de la B-galactosidasa, adems de dar negativo en la prueba de la oxidasa, lo que nos hace sospechar que es una enterobacteria dado que estas siempre son oxidasa negativa. Las especies de Peptostreptococcus son organismos comensales en humanos, que viven predominantemente en la boca, la piel, el aparato digestivo y el excretor, y componen una parte de la flora intestinal bacteriana. Sospechamos que est presente en la muestra ya que creci como es normal en el Agar Sangre con colonias blanquecinas y siendo una de las colonias que observamos con la tincin de Gram tenan forma cocoide en cadenas cortas, en parejas o individualmente siendo Gram +. El Peptococcus, al igual que el peptostreptococcus crece de la misma manera en agar sangre y al tomar una colonia diferente observamos que la distribucin morfolgica era diferente ya que aparecan formando racimos o solos. Y por ltimo creemos que tambin se encuentra entre los microorganismos el Enterococcus faecalis, ya que tambin creci en el Agar Sangre y en la tincin de gram fueron cocos gram positivos distribuidos en cadenas o pares.