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Sommaire Electrophorse Spectrochimie Dosages Chromatographie

MTHODES PHYSIQUES DE SPARATION ET D'ANALYSE ETMTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLCULES

C-Techniques spectroscopiques
5-SPECTROMETRIE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN) 5-1-La RMN et l'analyse structurale
Cette technique, qui utilise les proprits de rsonance des atomes placs dans un champ magntique, est particulirement puissante.

Le principe consiste (1) utiliser un champ magntique pour orienter les "spins" nuclaires des atomes, (2) exciter ces spins par une onde radio la frquence de rsonance, ce qui fait basculer certains spins, (3) aprs l'excitation, les spins reviennent leur tat initial, mais ceci n'est pas instantan : cette relaxation dpend d'une composante appele spin-rseau (interaction des spins avec les autres atomes) et d'une composante spin-spin (interaction entre les spins). Le spin nuclaire se dfinit comme la rsultante des moments cintiques (= rotation sur eux-mmes) des protons + neutrons (= nuclons) d'un atome. A ce spin nuclaire est associ un nombre quantique I. La RMN concerne essentiellement les noyaux avec un nombre de spin = 1/2 (1H, 13C, 19F, 31P). Cette mthode permet, condition de disposer d'une substance parfaitement pure et en quantit suffisante, d'aboutir la dtermination complte des structures avec en particulier la strochimie des liaisons entre atomes. Il est possible d'utiliser la RMN du proton (1H-RMN), celle du carbone (13C-RMN) ou celle du phosphore (31P-RMN). La faible abondance du 13C dans la nature (1% environ) fait que la RMN du carbone est peu sensible. La RMN du proton analyse les composs dissous dans un solvant deutri (afin que les signaux du solvant n'interfrent pas avec ceux de la molcule tudier). Le compos doit tre d'abord lyophilis dans un solvant deutri (D2O) afin d'liminer tout rsidu de solvants de HPLC, puis est analys dans l'appareil pendant une priode allant de quelques heures quelques jours. L'appareil fonctionne par accumulation successive de spectres individuels qui sont ensuite moyenns afin d'amliorer le rapport signal/bruit. Ceci permet d'obtenir des spectres valables avec de faibles quantits d'chantillon. Le spectre contient un certain nombre de signaux correspondant aux diffrents protons de la molcule et il convient alors de l'interprter. Dans un champ magntique de 10000 Gauss (Bo), les protons rsonent une frquence trs proche de 42,6 MHz. Selon leur environnement, les protons diffrent et ils rsoneront cette frquence pour un champ magntique (B) lgrement infrieur. On exprimera cette diffrence (trs faible) en ppm du champ Bo, selon la relation :

Le signal d'un proton est donc caractris par son dplacement chimique d (exprim en ppm de la valeur du champ magntique), qui dpend essentiellement de la nature de l'atome qui le porte (carbone, azote ou oxygne le plus souvent) et des autres substituants ports par ce dernier et les atomes adjacents : la prsence de substituants comme des -OH, =O, ou celle de liaisons insatures (C=C) affectent de faon caractristique la valeur du dplacement chimique. Par ailleurs, les protons ports par un mme carbone ou des atomes adjacents vont prsenter des couplages, qui vont se traduire par une multiplicit du signal : le couplage avec un autre proton se traduit par la formation d'un doublet (avec deux protons d'un triplet etc.) et la largeur de ce doublet (exprime en Hertz) dpend de la valeur des angles didres entre les liaisons C-H La mesure des constantes de couplage permet donc de dfinir la fois le nombre des voisins et la strochimie de la molcule.

L'application classique de la RMN concerne la dtermination des structures molculaires, qui seront dcrites avec la strochimie exacte (ex. strodes, oses, oligosaccharides,). L'utilisation de techniques de RMN deux dimensions ( 1H-1H ou 13C-13C) permet d'"clater" le spectre et facilite grandement l'identification des protons ou des carbones coupls. L'analyse en couplage 1H-13C permet d'tablir la correspondance entre les protons et les atomes de carbone. Ces approches ncessitent toutefois des temps d'accumulation nettement plus longs, mais les progrs raliss au cours des dernires annes on largement abaiss le seuil des analyses (ex. 10 g pour un strode) L'analyse de petites molcules (poids molculaire < 10 3) est relativement aise. Il n'en va pas de mme avec des molcules plus grosses, bien que ceci devienne depuis peu possible. Les outils actuels (appareils haut champ dots de moyens informatiques puissants pour le traitement des signaux) permettent de s'attaquer la structure tridimensionnelle de protines en solution (un grand avantage par rapport la cristallographie aux rayons X) pour des poids molculaires allant jusqu' 30 kDa. Les structures en a-hlice ou en feuillet-b se traduisent par des relations de proximit (= par des couplages) entre protons qui sont caractristiques de chacun de ces tats. Il est possible galement d'analyser des interactions entre deux molcules (ligand-rcepteur, mtal-acide nuclique,). La RMN permet donc actuellement des tudes conformationnelles des macromolcules biologiques.

5-2-La RMN in vivo


C'est une mthode non invasive et non traumatique qui donne accs un certain nombre de paramtres : elle permet par exemple la mesure du pH intracellulaire (mesure du dplacement chimique des ions phosphate), l'identification de composs organiques et la mesure de leurs concentration, l'tude cintique de leur mtabolisme Elle permet des tudes sur des tissus, voire sur l'animal entier (souris, rat) plac dans un systme de contention adquat. Diverses molcules sont ainsi accessibles, comme par exemple : les composs phosphors (nuclotides - ADP, ATP, UDPG -, ions phosphate, esters phosphates - composs de la glycolyse, cratine-P -, phospholipides - phosphatidyl-choline, phosphatidylthanolamine -, acides amins - alanine, glutamine -, neuromdiateurs - GABA,

5-3-L'imagerie RMN
Cette mthode utilise en pratique la RMN de l'eau, constituant de loin le plus abondant de la matire vivante. Les caractristiques des protons de l'eau (en termes de temps de relaxation) varient selon les tissus et leur tat hydrique. La mthode repose donc sur les diffrences d'tat hydrique des tissus qui donnent des signaux diffrents. Ces signaux sont enregistrs selon des "plans de coupe" et les diffrences de temps de relaxation apparaissent comme des diffrences de contraste de l'image, trs prcise. On peut rgler les appareils pour visualiser les tissus mous ou au contraire

les systmes osto-articulaires. Il est possible de caractriser par cette mthodes diverses pathologies (inflammations, oedmes, tissus cancreux etc.).

Ren Lafont

Dernires modifications : 28 juin 2005 Tous droits rservs - Biologie et Multimdia - Universit Pierre et Marie Curie UFR de Biologie