TECNICAS DE LABORATORIO

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TCNICAS DE LABORATORIO

TECNICAS DE LABORATORIO SOLUCIONES: Concentracin Cantidades, unidades y dimensiones El Sistema Internacional de Unidades (SI) fue creado en 1960 por la Conferencia General de Pesos y Medidas para estandarizar las unidades de medida basadas en el sistema mtrico. De esta manera, SI permite la comunicacin entre cientficos de diferentes disciplinas y diferentes pases sin la necesidad de conversin de unidades de medida. El conocimiento de las cantidades, unidades y dimensiones es esencial para comprender cmo se llevan a cabo los clculos biomoleculares. Una cantidad es una propiedad medible de un sistema definido (masa, temperatura, energa). Una unidad es una cantidad de un tamao definido que se utiliza como referencia para otras cantidades del mismo tipo (kilogramo, mol). Una dimensin es una cantidad fsica descripta por el producto de smbolos con los exponentes apropiados (m3, mol/dm3). Reglas bsicas para el uso correcto de unidades y dimensiones Indicar todos los valores con sus correspondientes unidades; la relacin de valores que tienen las mismas unidades se deben indicar sin unidades ya que las mismas se cancelan. Sumar o restar slo aquellos valores que tienen las mismas unidades. No se deben hacer comparaciones de valores con diferentes dimensiones. Se debe asignar a una determinada variable las mismas unidades a travs de todos los clculos. Multiplicar o dividir unidades cuando se dividen o multiplican valores; luego incluir el producto o cociente de las unidades con el resultado calculado. Multiplicar o dividir unidades en cada paso de un clculo; no esperar hasta el final del clculo para deducir cuales sern las unidades finales. La pendiente de una curva tendr las dimensiones de y dividida por aqullas de x. Multiplicar valores tabulados o graficados por 10 o el mltiplo ms adecuado para evitar trabajar con nmeros muy grandes o muy pequeos. Las dimensiones del lado izquierdo de una ecuacin deben ser iguales a aqullas del lado derecho. El anlisis de las unidades despus de cada paso de un clculo permite detectar errores cometidos durante el clculo.

Los resultados deben informarse slo con los dgitos significativos Los clculos llevados a cabo en computadoras habitualmente rinden resultados con 10 o ms dgitos. Sin embargo, la inclusin de tantos dgitos no implica que esos resultados sean ms precisos. Para evitar la confusin de los colegas, los informes cientficos deben incluir los resultados de clculos slo con los dgitos que son significativos. Los dgitos significativos en una medicin son aquellos que pueden obtenerse con cierta precisin de un determinado aparato.

TECNICAS DE LABORATORIO Unidades de concentracin En SI, el uso de mol l-1 y las unidades relacionadas se acepta para la expresin de concentraciones sobre la base de cantidades de sustancia por unidad de volumen. Un mol se define como la cantidad de sustancia que contiene las entidades elementales equivalentes a los tomos presentes en 0.012 kg de carbono-12. Se ha demostrado experimentalmente que 0.012 kg de carbono-12 contienen 6.02217 x 1023 tomos. Este nmero es el nmero de Avogadro y se utiliza para definir el mol de cualquier unidad elemental tal como tomo, molcula, in, protn o electrn. Un mol puede ser tambin definido como el equivalente del peso molecular (ms correctamente a la masa molecular en g) de una sustancia. Por lo tanto, el peso de una sustancia (su masa) y moles pueden ser interconvertidos como se muestra en las siguientes ecuaciones: nmero de moles peso molecular = = peso en g peso molecular

peso en g nmero de moles

Concentracin molar, mol l-1, el nmero de moles por litro (M) puede expresarse como una funcin de las cantidades relativas de acuerdo a las siguientes relaciones: Molaridad, M = moles de soluto 1 litro solucin Nmero de moles = volumen en l x moles l-1 Peso en gramos = nmero de moles x Peso molecular Peso molecular = peso en g nmero de moles

Equivalentes y normalidad no se recomiendan en SI, sin embargo son todava de uso comn. Normalidad, N = nmero de equivalentes 1 litro de solucin Nmero de equivalentes = normalidad x volumen en l Las concentraciones frecuentemente se expresan como porcentaje peso/volumen (% p/v) y se define como el peso del soluto en gramos por 100 ml de solucin. De manera similar el porcentaje peso/peso (% p/p) se define como el peso de soluto en gramos por 100 g de solucin y el porcentaje volumen/volumen (% v/v) se define como el volumen de un lquido activo (soluto) disuelto en un segundo lquido para dar 100 ml de solucin. ppm: partes por milln meq: milequilaentes

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Un principio muy simple para entender las diluciones La cantidad total de soluto en la solucin concentrada es igual a la cantidad total de soluto en la solucin diluida; sin embargo, la concentracin (C) de soluto es menor en la solucin diluida que en la solucin concentrada. V1 . C 1 = V 2 . C2 AGUA, CONTROL CIDO-BASE Y ELECTROLTICO El control de las propiedades cido-base es importante en bioqumica El pH de ls soluciones es importante en bioqumica por dos razones principales. Primero, el correcto funcionamiento de las biomolculas depende en un grado importante del control de pH. Segundo, cambios de pH tan pequeos como de 0.1 0.2 unidades pueden causar disturbios metablicos en ciertas clulas, tejidos u rganos. Debido a la sensibilidad al pH de muchas molculas, el control del pH es tambin importante para el xito de muchos procedimientos utilizados en los laboratorios. Esto incluye la separacin, purificacin y ensayo de actividades biolgicas de muchas biomolculas. Por ejemplo, diferentes cromatografas, electroforesis, la medicin de actividades enzimticas y ultracentrifugacin, todos requieren el uso de soluciones buffer. ESPECTROFOTOMETRIA Los mtodos pticos para analizar muestras cuanti y cualitativamente se pueden dividir en dos grupos: 1) mtodos en que la muestra emite radiacin por s misma (Ej.: reaccin biolgica de xido reduccin en lucirnagas) 2) mtodos en los que se usa una fuente externa de radiacin que incide sobre la muestra. La radiacin incidente puede ser absorbida (anlisis espectrofotomtrico) o dispersada (fluorescencia). La luz emitida es caracterstica de cada sustancia con o sin cambio en la longitud de onda. La espectrofotometra es utilizada principalmente en bioqumica para determinar la concentracin de un soluto en una solucin, identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorcin. Adems, se pueden seguir las reacciones catalizadas por una enzima midiendo espectrofotomtricamente la aparicin de producto o la desaparicin del sustrato. La concentracin de soluciones de compuestos conocidos se determina cuantificando la absorcin de la luz a una o ms longitudes de onda conocidas. Cuando un rayo de luz atraviesa un medio homogneo de espesor b, en el cual hay especies absorbentes que estn en una concentracin c, parte de la luz es absorbida y parte transmitida. Para una determinada longitud de onda (radiacin monocromtica) la relacin entre luz incidente (Io) y la luz transmitida (I) est dado por la ley de Lambert-Beer: T (transmitancia) = I / I0 = 10-.c.b Se define absorbancia (A) como: A = log T-1 = log Io / I = .c.b

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Tambin se designa A como " densidad ptica", esta magnitud vara de cero para I = Io (absorcin nula) hasta para I = 0 (absorcin total). La constante k es el coeficiente de extincin (o absortividad).Es una caracterstica intrnseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus unidades dependen de las utilizadas para c y b: b: ancho de la cubeta (camino ptico de la solucin) c : concentracin .coeficiente de extincin molar coeficiente de extincin molar especfico cm M (g/l) M-1 cm-1 1 g-1 cm-1

Si la radiacin incidente no es monocromtica, la ley de Lambert-Beer no se cumple estrictamente. Toda sustancia absorbe luz. Cuando se mide absorbancia en funcin de la longitud de onda se observan picos relativamente agudos en longitudes de onda caractersticas de la sustancia en estudio. As, compuestos desconocidos pueden ser identificados por su espectro de absorcin en el UV, IR o Visible. El anlisis qumico fotomtrico se basa en general en la medicin de la cantidad de luz absorbida por una solucin coloreada Si la sustancia es incolora se puede transformar en un compuesto coloreado mediante una reaccin qumica conveniente. La existencia de un color se debe a la absorcin en la regin visible del espectro. Por ej. Las hojas son verdes porque la clorofila absorbe el rojo y el violeta y refleja la mayor parte del amarillo, verde y azul. Este espectro incluye no solamente el campo visible sino tambin el campo de longitud de ondas largas del IR y cortas del UV. Casi todas las sustancias absorben en el UV, las pocas que no lo hacen se usan como solventes, agua, etanol, metanol, etc. Regiones del espectro electromagntico: Rayos X UV lejano UV cercano Visible Infrarrojo 0.01-15 nm 15-200 nm 200-400 nm 400-800 nm 800-2500 nm

TECNICAS DE LABORATORIO ESPECTROFOTOMETRO Instrucciones de manejo:

a) Colocar el filtro correspondiente a la longitud de onda deseada (7) b) Seleccionar la longitud de onda WAVELENGTH correspondiente con la rueda 5. c) Encender en posicin TRANS (1). d) Apretar ZERO SET y llevar a 0 con ZERO (2) manteniendo zero set apretado. e) Poner un tubo con H2O (volumen mnimo de medicin 3 ml) (6). f) Pasar 1 de TRANS a ABS y llevar a 0.000 de Abs con la rueda 100% T/0A (3). (Tiene rueda de macro y de micro). g) Medir la muestra. Muy importante: Cuando se va a poner el tubo de medicin se lo debe limpiar por fuera para eliminar las gotas de solucin que pudieran haberse derramado cuando se carg el tubo. Esto no solo dar lecturas equivocadas por incremento de los valores de extincin sino que provocar el deterioro del aparato. No solo las partes mviles y las fotoclulas son daadas por reactivos corrosivos, sino que entre los contactos de las mismas se pueden producir corrientes de la misma magnitud que las producidas por la luz. Esto ocurre an con muy poca humedad. Si por algn accidente se rompiera un tubo dentro del aparato avise inmediatamente. Como el instrumento es sensible a las vibraciones y los colores pueden ser inestables, es conveniente controlar el 0% T y el 100 % T cada tres mediciones. No olvide restar el blanco a todas las lecturas, salvo que haya llevado a cero el aparato con el blanco de reaccin. Para que un dato de absorbancia pueda ser utilizado en el clculo de concentracin debe estar dentro de la zona en la cual la curva es lineal, esto es, en el rango de concentraciones en el que se cumple la ley de Lambert-Beer. Para conseguir esto puede ser necesario diluir la muestra problema.

TECNICAS DE LABORATORIO AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE PROTENAS Algunas consideraciones generales: * Cualquier clula, tanto procariota como eucariota, contiene miles de protenas diferentes con un amplio rango de actividades biolgicas. La purificacin de una protena individual es una cuestin central para llevar a cabo el anlisis biolgico detallado de su estructura y funcin. No existe un nico procedimiento para poder aislar en forma pura cada una de las protenas, pero existen metodologas que permiten distinguir a las protenas en base a caractersticas estructurales y funcionales especficas. Seleccionando procedimientos apropiados y aplicndolos en una determinada secuencia, usualmente es posible obtener un alto grado de purificacin de la protena en estudio y un aceptable rendimiento. No existe un orden estndar en la aplicacin de los diferentes procedimientos para obtener ptimas purificaciones. Debido a las diferencias estructurales y funcionales entre protenas, una secuencia ideal para una protena puede no tener xito en la purificacin de otra protena. El conocimiento de las bases tericas de cada procedimiento permite al investigador elegir una secuencia inicial de tcnicas a aplicar para la purificacin. De todas maneras, la puesta a punto de un protocolo involucra experimentos de ensayo y error. Independientemente del esquema de purificacin elegido, es esencial tener presente que la mayora de las protenas son molculas excesivamente frgiles. La exposicin an a temperaturas moderadas (ejemplo, 37C) causa desnaturalizacin, por lo tanto, todos los pasos deben realizarse a bajas temperaturas (0-4C). Las protenas son tambin sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificacin se realizan en soluciones buffer y se evitan los pHs extremos. Equipamiento requerido: * Adems del equipamiento usual en la mayora de los laboratorios, tales como pHmetros, balanzas y agitadores magnticos, la purificacin de protenas requiere un equipamiento ms especializado. * A los efectos de minimizar la desnaturalizacin y protelisis algunos de los pasos de la purificacin deben llevarse a cabo a 4C. Se necesita un cuarto fro para llevar a cabo la dilisis, precipitaciones y cromatografas. Para almacenar muestras por perodos cortos se requiere hielo granizado, por lo tanto es necesaria una granizadora de hielo. Para almacenar muestras y buffers son necesarias heladeras (4C), freezers (-15C a -20C). En algunos casos, para preservar la actividad de muestras almacenadas es necesario conservarlas en freezer a -70C. * Espectrofotmetros que cubran un rango de 205 a 850 nm son esenciales para cubrir un amplio espectro de protenas. En algunos casos, la medicin de actividad de enzimas requiere contar con un registrador. * Algunas protenas especficas requieren equipamientos tales como contador de centelleo, lector de ELISA, HPLC, etc. * La electroforesis se utiliza habitualmente para evaluar la purificacin de una protena. Se requieren fuentes de poder y los diferentes equipos de electroforesis, segn el tipo de separacin a realizar. * Para extraer las protenas de su fuente son necesarios equipos de homogenizacin (se discutirn mas adelante). Para clarificar los homogenatos se necesitan centrfugas. Estas deben estar refrigeradas, y deben alcanzar fuerzas

TECNICAS DE LABORATORIO centrfugas de 15000 g y deben cubrir un rango de 100 ml a pocos litros. Son muy tiles adems, las centrfugas para tubos de 1.5 ml (Eppendorf) * Para las cromatografas se requieren, colectores de fracciones, monitores y registradores, bombas peristlticas y columnas de diferentes tamaos. El rango de tamao de diferentes columnas debe cubrir aquellos necesarios para intercambio inico y cromatografas de afinidad (relativamente cortas y gordas) y las que se usan para filtracin en gel (relativamente largas y finas). * Dentro del equipo ms especializado necesario para estudios especficos, se pueden mencionar los analizadores de aminocidos y secuenciadores de protenas, FPLC, HPLC, etc. Buffers: * En todos los pasos de una purificacin es necesario controlar el pH de la solucin para evitar la desnaturalizacin o inactivacin de la protena. * Los factores que se deben tener en cuenta para la eleccin de un buffer son los siguientes: + El pH deseado. + Si el buffer es aninico o catinico. Por ejemplo, para una cromatografa de intercambio aninico se debe usar un buffer catinico (por ejemplo, Tris y no fosfato) + Variacin del pH con la fuerza inica y la temperatura. + La reactividad qumica. Por ejemplo las aminas primarias como el Tris pueden interferir con el anlisis de protenas o pueden inhibir algunas enzimas. + Absorcin a 280 nm. Costo. Especialmente si se utiliza en grandes escalas. + Solubilidad. * Un "buen" buffer es biolgica y qumicamente no reactivo, no txico, no absorbe en la regin del UV y tiene una mnima dependencia con la temperatura y fuerza inica. Mtodos de extraccin: * Los primeros pasos en un procedimiento tpico de extraccin consisten en el lavado del tejido y la aplicacin de un mtodo de lisis. Luego una centrifugacin permite separar la protena soluble de las fracciones de membrana y de los restos celulares. Finalmente, la muestra de protena puede ser analizada, purificada o almacenada. * El tejido se lava con una solucin salina para eliminar trazas de material extracelular. * El extracto obtenido luego de la lisis se denomina homogenato. Habitualmente se centrfuga de 10 min a 15000 g a 1 hora a 100000 g. El sobrenadante se denomina extracto crudo y el pellet contiene la fraccin de membrana.

TECNICAS DE LABORATORIO * Las clulas animales estn rodeadas exclusivamente por la membrana plasmtica y mantenidas por el citoesqueleto. Por lo tanto no tienen la rigidez de las bacterias y levaduras. Esta fragilidad y su relativo gran tamao simplifican la lisis. * Las clulas vegetales tienen una pared compuesta por carbohidratos complejos insolubles, ligninas o ceras que rodean la membrana plasmtica. Microfibrillas de celulosa cubren la membrana y le dan cierta proteccin contra la ruptura, aunque el tamao las hace algo ms vulnerables. En las vacuolas hay compuestos fenlicos que se liberan durante la extraccin y que pueden inactivar protenas. Por lo tanto es esencial una extraccin muy rpida de la protena en inters. * Las bacterias tienen una pared celular constituda por un pptido glicano que le otorga fuerza y rigidez. Se utiliza frecuentemente lizosima en un medio isotnico para romper el pptidoglicano. * Homogenizacin: es una de las formas ms comunes de lisarlos tejidos blandos. Se puede llevar a cabo con una licuadora o con un homogenizador PotterElvenhjem. Es un mtodo rpido y relativamente poco daino para las protenas. Las principales precauciones que hay que tener se relacionan con la liberacin de proteasas de otros compartimientos celulares y con la liberacin de calor. * Sonicacin: un sonicador lisa tejidos generando vibraciones que causan ruptura mecnica de la pared celular. Se utiliza generalmente para bacterias. * French Press: este mtodo permite la lisis de las clulas sometiendo la muestra a alta presin e inmediatamente liberarla a presin atmosfrica. El rpido cambio de presin causa la ruptura celular. Se utiliza fundamentalmente para bacterias y levaduras. * Moler con arena: La molienda de clulas con abrasivos se utiliza frecuentemente para organismos unicelulares y tejidos vegetales. Los materiales son econmicos (mortero, arena u otro abrasivo). * Tratamiento enzimtico: la digestin de la pared celular con enzimas (lisozima, por ejemplo) se utiliza generalmente para microorganismos ya que las clulas en suspensin permiten un tratamiento relativamente uniforme. * Otros mtodos de lisis: + lisis de clulas animales en cultivo con detergentes. + Lisis por shock osmtico, sometiendo a las clulas a una solucin hipotnica. Se utiliza comnmente para glbulos rojos y otras clulas sin pared celular. + Lisis por congelado y descongelado: se puede lograr la lisis mediante la aplicacin de varios ciclos de congelado y descongelado. Este mtodo se puede aplicar si la protena es estable y resiste la desnaturalizacin. Se debe proteger contra la protelisis.

TECNICAS DE LABORATORIO Fraccionamiento subcelular: El fraccionamiento subcelular implica dos procesos: a- ruptura de la estructura celular b- separacin de las distintas centrifugacin diferencial. subestructuras con

El esquema tpico empleado para un fraccionamiento subcelular es el que se representa a continuacin: Precipitado a 1000 g: Es la fraccin nuclear cruda. Contiene ncleos y clulas sin romper. Precipitado a 10000 g: es la fraccin mitocondrial cruda. Contiene mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, etc. Precipitado a 100000 g: Es la fraccin microsomal. Contiene ribosomas, polisomas y microsomas (artificios formados a partir de la ruptura de estructuras membranosas como aparato de Golgi, membranas celulares, etc.) Sobrenadante de 100000 g: es el citosol. Est constituido principalmente por protenas solubles, RNA y otras molculas como aas, protenas, hidratos de carbono, sales, etc. No contiene estructuras membranosas. Figura: Centrifugaciones repetidas a velocidades progresivamente mayores fraccionarn los extractos celulares en sus componentes. En general cuanto menor es el tamao del componente subcelular tanto mayor ser la fuerza centrfuga necesaria para sendimentarlo. Los valores tpicos de los diversos pasos de centrifugacin mostrados en la figura son los siguientes: Vel baja: 1.000 veces la gravedad (g), 10 min. Vel media: 20.000 g, 20 min Vel. alta: 80.000 g , 1 hora Vel muy alta: 150.000 g, 3 horas

TECNICAS DE LABORATORIO Determinacin de la concentracin de protenas: * Muchas veces es til, aunque no esencial, determinar la concentracin total de * Es importante recordar que todos los mtodos empleados para la determinacin de la concentracin de protenas son semicuantitativos. La respuesta de las protenas, por ejemplo en el desarrollo del color en un ensayo espectrofotomtrico, vara con la composicin de aas y puede ser influenciado por la presencia de grupos prostticos no proteicos, tales como carbohidratos. De tal forma que, si bien la seroalbmina bovina (BSA) se utiliza universalmente como protena standard para las cuantificaciones, es preferible, cuando esto es posible, calibrar el ensayo usando una muestra de la protena purificada o una protena que rinda una coloracin similar. * Absorbancia a 280nm: La mayora de las protenas exhiben un mximo de absorcin a 280nm que se atribuye al grupo fenlico de la tirosina o al grupo indlico del triptofano. El coeficiente de extincin a 280 nm vara de protena en protena en el rango de 0.4 a 1.5 dependiendo de la composicin de aas. Existen casos extremos en el que el coeficiente de extincin es 0 (protenas que ligan calcio) y 2.5 (lisozima). Se trata, por lo tanto, de un mtodo poco preciso. Esta tcnica es relativamente poco sensible y requiere entre 0.05 y 2 mg de protena. Es particularmente sensible a las interferencias de otros compuestos que absorben a 280 nm, especialmente cidos nucleicos. La ventaja de ste mtodo es que es muy rpido y no destructivo, por lo tanto la muestra puede ser usada para otras determinaciones. Se requieren cubetas de cuarzo. * Mtodo de Biuret y Biuret: bajo condiciones alcalinas el in cobre (II) se une al nitrgeno del enlace peptdico de protenas y pptidos desarrollando una coloracin violeta con un mximo de absorcin a 540-560 nm. No da interferencia con aas libres y tiene poca dependencia de la composicin de aas. Ya que el reactivo de cobre reacciona con el enlace peptdico y no con las cadenas laterales de los aas la mayor desventaja del mtodo es su baja sensibilidad (1-10 mg/ml de protenas). Algunos buffers (Tris, por ejemplo) pueden interferir con la reaccin. * Se logra ms sensibilidad leyendo a 330 nm (rango 0,1-1 mg) * Mtodo de Lowry: es el mtodo ms utilizado. El fundamento del mtodo se basa en la reduccin del reactivo de Folin por la oxidacin de aas aromticos en una reaccin catalizada por cobre. La reaccin da una fuerte coloracin azul y es ms sensible que el mtodo de Biuret (0.1 a 1 mg/ml). La eaccin depende del pH (10-10.5). La reaccin tiene una moderada dependencia con la composicin de aas pero tiene muchos compuestos que interfieren (aas, buffers, lpidos, azcares, cidos nucleicos). * Mtodo de Bradford: Bajo apropiadas condiciones, los grupos acdicos y bsicos de las protenas interaccionan con grupos disociados de colorantes orgnicos para formar precipitados coloreados. En ste mtodo se utiliza el colorante Coomasie Blue G-250. La unin del colorante a la protena causa un cambio en el mximo de absorcin del colorante de 465 nm (rojo) a 595 nm (azul). Es un mtodo rpido y simple. Es muy sensible (5-100 g/ml). Tiene una significativa dependencia con la composicin de aas debido a la unin primaria a grupos bsicos (especialmente argininas) y a residuos aromticos.

TECNICAS DE LABORATORIO Eleccin de los mtodos de purificacin: * Hay numerosos mtodos de purificacin disponibles, aunque algunos se utilizan mucho ms frecuentemente que otros. A continuacin se mencionan algunos criterios para la aplicacin de una determinada secuencia de los mtodos. a) Los primeros pasos en un esquema de purificacin son frecuentemente aquellos que tienen menor poder de resolucin tales como la precipitacin con sulfato de amonio o para algunas protenas, la desnaturalizacin por calor. Estos mtodos tienen la ventaja de reducir notablemente la cantidad de protena total en la muestra. Los mtodos de alta resolucin pero baja capacidad (ejemplo isoelectroenfoque) se aplican en la parte final del esquema de purificacin, cuando la cantidad de protena total es baja y las protenas contaminantes estn en muy bajas concentraciones. b) En general es ms eficiente utilizar una serie de mtodos que exploten propiedades fsicas y funcionales de las diferentes protenas, ms que una serie de mtodos que exploten las mismas propiedades. As, cuando se utilizan tcnicas cromatogrficas, se debe incluir al menos un fraccionamiento por peso molecular (filtracin en gel) y al menos un paso de fraccionamiento por carga (cromatografa de intercambio inico). c) Durante la cromatografa es comn sacrificar algo de rendimiento para aumentar la pureza. En otras palabras, no hay que tratar de recuperar toda la protena en estudio si esto significa incluir cantidades relativamente grandes de protenas contaminantes. d) Algunas tcnicas, en particular SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes), isoelectroenfoque y geles bidimensionales, no se emplean comnmente como mtodos preparativos para la purificacin de protenas, sino que usualmente se emplean para analizar el progreso de la purificacin. Son tcnicas analticas de gran resolucin. Procedimientos experimentales: Desnaturalizacin por calor: La purificacin de protenas se lleva a cabo habitualmente a bajas temperaturas ya que la mayora de las protenas son estables entre 0 y 4C. A medida que la temperatura se incrementa desde 0 a 37-40C su estabilidad decrece significativamente. Sobre los 40C la mayora de las protenas son altamente inestables, se desnaturalizan y usualmente precipitan. Sin embargo, cada protena individual difiere en la sensibilidad al calor. La estabilidad a la temperatura de una enzima se determina experimentalmente en extractos despus de la incubacin a diferentes temperaturas a varios tiempos. Si la protena en estudio es resistente a relativamente altas temperaturas, este tratamiento podr ser utilizado como paso de purificacin. Precipitacin con sulfato de amonio: La solubilidad de las protenas vara de acuerdo a la fuerza inica y por lo tanto de acuerdo a la concentracin de sales de la solucin. Se pueden observar dos efectos diferentes. A bajas concentraciones de sales, la solubilidad aumenta cuando se incrementa la concentracin de sales. Este fenmeno se denomina "salting-in". Sin embargo cuando la concentracin de sales aumenta mucho la solubilidad de las protenas decrece y en un punto determinado toda la protena precipita. Este fenmeno se denomina "salting-out". Las bases tericas del "Salting-out"

TECNICAS DE LABORATORIO son complejas pero un factor es probablemente la competencia entre la protena y los iones por el agua disponible. A altas concentraciones de sales, no hay suficientes molculas de agua disponibles para una completa solvatacin de las protenas y por lo tanto las interacciones protena-protena son predominantes sobre las interacciones agua-protena y ocurre la precipitacin. Ya que las protenas difieren marcadamente en su solubilidad a alta fuerza inica, salting-out es un procedimiento muy til para la purificacin de protenas. La precipitacin con sulfato de amonio se emplea frecuentemente como uno de los primeros pasos en el esquema de purificacin. Filtracin en gel: Un amplio rango de biomolculas pueden separarse sobre la base de sus diferencias de tamao y forma. Este procedimiento se conoce con el nombre de cromatografa de exclusin molecular o filtracin en gel. Se pueden utilizar una amplia gama de matrices formadas por bolitas porosas de material inerte y altamente hidratado. Las matrices comerciales ms comunes son Sephadex (bolitas de dextrano), Sepharosa y Bio Gel A (agarosa) y Bio Gel P (poliacrilamida). Cada matriz tiene un rango de de fraccionamiento que est determinado por el tamao del poro de las bolitas. As por ejemplo, Sephadex G-50 tiene un lmite de exclusin de 30.000, lo que significa que todas las protenas cuyo PM sea superior a 30.000 no podrn penetrar en el interior de las bolitas y sern eludas primero, en lo que se denomina volumen muerto de la columna. Las protenas de menor PM quedarn incluidas en la matriz. Cuanto menor sea su PM tendrn mayor facilidad para penetrar en el interior de gel lo que determinar un mayor nmero de intercambio y una menor velocidad de elusin. Se denomina volumen de elusin al volumen en el que eluye una protena en particular.

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Vo

Vo-Vt

Vt

Kav = Ve-Vo / Vt-Vo Kd = Ve-Vo / Vt-Vo-Vmatriz = Ve-Vo / Vi R = coeficiente de retencin = Vo-Ve

TECNICAS DE LABORATORIO Cromatografa de intercambio inico: una resina de intercambio inico es una matriz insoluble con grupos cargados unidos covalentemente. Se disponen comercialmente de matrices cargadas positiva y negativamente. Las matrices cargadas negativamente ligan iones cargados positivamente (cationes). Las resinas pueden ligar un tipo de catin pero, ante la presencia de un segundo tipo de catin lo desplazan o intercambian con el primero. De manera similar, las resinas de intercambio aninico estn cargadas positivamente y ligan (e intercambian) iones cargados negativamente. El fraccionamiento de protenas por columnas de intercambio inico depende de la diferencia en las cargas de las distintas protenas. La carga de una protena depende del nmero y tipo de grupos ionizables. Para cualquier protena al pH correspondiente a su punto isoelctrico no se unir a ningn tipo de intercambiador aninico. Por encima de ese pH la protena estar cargada negativamente y se unir a un intercambiador aninico. Por debajo de ese pH, estar cargada positivamente y se unir a un intercambiador catinico. Para eluir las protenas retenidas en la matriz se puede modificar el pH del medio o bien modificar la fuerza inica aumentando la concentracin de sales. Esta ltima es la condicin frecuentemente utilizada.

TECNICAS DE LABORATORIO Cromatografa de afinidad: este tipo de cromatografa es la ms especfica. La matriz es usualmente agarosa, poliacrilamida o dextrano, a la cual se une covalentemente un ligando especfico. La naturaleza qumica del ligando est determinada por alguna

propiedad especfica y conocida de la protena en estudio. En el caso de una enzima, el ligando elegido es generalmente el sustrato o un inhibidor o activador que se unen reversiblemente a la enzima. En teora, la cromatografa de afinidad permitira la purificacin de una protena en un nico paso. Sin embargo en la prctica esto casi nunca se logra, aunque el grado de purificacin que se alcanza es muy bueno. Desafortunadamente en muchos casos no se conoce ninguna propiedad de la protena en estudio o no se dispone de algn ligando que permita la preparacin de una columna de afinidad.
ELECTROFORESIS PAGE: cualquier in o grupo cargado si es sometido a un campo elctrico migra a una velocidad determinada. Ya que las protenas tienen una carga neta a cualquier pH diferente a su punto isoelctrico, ellas tambin migrarn y su velocidad de migracin depender de la densidad de carga (relacin carga/masa). A mayor relacin carga / masa mayor velocidad de migracin. El medio ms frecuentemente utilizado las para electroforesis es poliacrilamida. La poliacrilamida resulta de la polimerizacin de monmeros de acrilamida en cadenas largas y entrecruzamiento de estas cadenas por compuestos bifuncionales como la bis-acrilamida. Esta reaccin crea una matriz porosa con un tamao de poro controlado. La forma de controlar el tamao del poro es modificando la concentracin de acrilamida y bis-acrilamida. As, durante la electroforesis en geles de poliacrilamida, las protenas estn sometidas a un efecto de filtrado molecular, por el cual las protenas ms grandes migran ms lentamente en relacin a las protenas menores. Por lo tanto la separacin de protenas nativas en buffers no disociantes depende tanto de la carga como de la masa de protena. Aunque la electroforesis, en condiciones nativas o desnaturalizantes, es til en un nmero de situaciones, especialmente cuando se desea detectar una protena particular a travs de su actividad biolgica, en la mayora de los estudios se utilizan condiciones que disocian a las protenas en sus subunidades. El agente de disociacin mas frecuentemente utilizado es SDS (sodium dodecyl sulfate). La electroforesis en PAGESDS permite un rpido anlisis de la composicin de una mezcla de protenas y es extremadamente til para monitorear la pureza de la muestra durante su purificacin.

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Para el anlisis en PAGE-SDS, la muestra se desnaturaliza por calor a 100 C durante 2 a 5 min, en presencia de un exceso de SDS y 2--mercaptoetanol (para clivar los puentes disulfuro). Bajo estas condiciones, la mayora de los polipptidos se unen al SDS en una relacin 1.4 g de SDS por gramo de polipptido. Como consecuencia de esto el detergente le otorga a la protena una carga neta negativa que hace insignificante la carga intrnseca del polipptido. Ya que la distancia de migracin de los polipptidos es inversamente proporcional al log del peso molecular, la protena de inters puede ser identificada en el gel si se conoce el PM de las subunidades que la constituyen, o inversamente, puede determinarse el PM de cada subunidad.
Parmetros de purificacin: Tabla de Purificacin.

Muestra Homog. Paso de Purificacin (PP)

A: C:

Vol Protenas Protenas Actividad Actividad Actividad Purificacin Rendimiento Totales Total Especfica ml mg/ml mg U/ml U U/mg % A 1
A B C

Activdad total Masa de Protenas Actividad total PP Actividad total Homog

B:

Actividad especfica PP Actividad especfica Homog

TECNICAS DE LABORATORIO ESTRUCTURA DE PROTENAS Amino cidos - Notas claves Amino cidos Todas las protenas estn formadas por el mismo juego estndar de 20 aas. Un aa tpico tiene un grupo amino primario, un grupo carboxilo, un tomo de hidrgeno y una cadena lateral (grupo R) unidos a un tomo de carbono central (C). La prolina es la excepcin a esta regla por poseer un grupo amino secundario. Enantimeros Los 20 aas, excepto la glicina, tienen cuatro grupos diferentes ordenados tetradricamente alrededor del tomo de C y por lo tanto pueden existir en configuracin D o L. Estos dos enantimeros son imgenes especulares que slo pueden distinguirse sobre la base de su diferente rotacin de la luz polarizada en el plano. Slo los ismeros L se encuentran en las protenas.

Los 20 aas estndar tienen diferentes grupos R y muestran diferentes propiedades fsico-qumicas (polaridad, acidez, basicidad, aromaticidad, tamao, inflexibilidad conformacional, habilidad de formar puentes hidrgeno, habilidad de entrecruzamiento y reactividad qumica). Glicina (Gly, G) tiene un tomo de hidrgeno como grupo R. Alanina (Ala, A); valina (Val, V); leucina (Leu, L); isoleucina (Ile, I) y metionina (Met, M) tienen grupos R alifticos de diferentes estructuras, hidrofbicos y qumicamente inertes. Fenilalanina (Phe, F); tirosina (Tyr, Y) y triptofano (Trp, W) tienen grupos R aromticos de naturaleza hidrofbica. Prolina (Pro, P) tiene un grupo R aliftico unido al grupo amino (imino cido). Es conformacionalmente rgida. Cistena (Cys, C) tiene un grupo R que contiene azufre. Es un grupo R hidrofbico, altamente reactivo, que puede formar un enlace disulfuro con otro residuo de cistena. Arginina (Arg, R) y lisina (Lys, K) son aas bsicos con grupos R cargados positivamente, mientras que el grupo R de la histidina (His, H) puede estar cargado positivamente o sin carga a pH neutro. Acido asprtico (Asp, D); cido glutmico (Glu, E) tienen grupos R cidos, cargados negativamente a pH neutro. Asparagina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q) tienen amidas como grupos R. Serina (Ser, S) y treonina (Thr, T) tienen hidroxilos en sus grupos R. Todos estos aas son polares y sin carga y pueden formar puentes hidrgeno.
Datos tiles: * El -mercaptoetanol reduce las cistinas rompiendo los puentes disulfuro y el SDS otorga carga homognea a las protenas determinando que corran exclusivamente por su tamao. * PM promedio de un aminocido = 120; de la glucosa libre = 180; de la glucosa formando parte de la cadena = 162. * tripsina corta dejando libre el carboxilo de Arg y de Lys. * Quimotripsina corta dejando libre el carboxilo de Phe, Tyr y Trp. * Bromuro de ciangeno rompe enlaces peptdicos con carbonilo aportado por met. * Cistina = Cys (S-S)Cys

TECNICAS DE LABORATORIO Disociacin de grupos ionizables de aminocidos

GRUPO - carboxilo (Ct) - amino (Nt) - carboxilo (Glu,Asp) - amino (Lys) - OH fenlico (Tyr) - Imidazol (His) - Guanidinio (Arg) - Sulfidrilo (Cys)

aa libre 1.8-2.5 8.9-9.7 3.8-4.3 10.5 10.1 6 12.5 8.3

RANGO de pK En polipptido 1.8-2.5 7.5-8.5 3.0-4.7 9.4-10.6 9.8-10.4 5.6-7.0 11.6-12.6 9.4-10.8

CATALISIS BIOLGICA: ENZIMAS

Notas claves Termodinmica Energa de activacin y estado de transicin

Cambio en energa libre: La diferencia en el nivel de energa entre sustratos y productos se denomina cambio en la energa libre de Gibbs (G). Un G negativo indica que la reaccin es termodinmicamente favorable en la direccin indicada, mientras que un G positivo indica que la reaccin no es termodinmicamente favorable y requiere la entrada de energa para que la reaccin proceda en la direccin indicada.. Si el cambio en energa libre (G) de una reaccin es negativo, dicha reaccin puede ocurrir espontneamente. Una reaccin energticamente desfavorable es conducida frecuentemente por el acoplamiento a una reaccin energticamente favorable, como por ejemplo la hidrlisis de ATP.

Equilibrio qumico: Una reaccin qumica frecuentemente existe en un estado de equilibrio dinmico. La constante de equilibrio (K) define la relacin de las concentraciones de sustrato y productos en el equilibrio. Las enzimas no alteran el equilibrio sino que aceleran el logro del equilibrio aumentando la velocidad de las reacciones en ambos sentidos. Introduccin a las enzimas Catalizadores Sitio activo Especificidad por sustrato Clasificacin Medicin de actividad Isoenzimas. Cintica enzimtica Velocidad de la reaccin enzimtica. La actividad enzimtica se expresa comnmente como la velocidad inicial (V0) de la reaccin catalizada. Las unidades de V0 son umol min-1, que puede ser tambin representada por la unidad (U) o el katal (kat) (1 umol min-1 = 1U = 16.67 nanokat). El trmino actividad (actividad total) se refiere a las unidades totales de enzima en la muestra, mientras que la actividad especfica es el nmero de unidades por miligramo de protena (U mg 1).

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Relaciones entre diferentes concentraciones de sustratos y las velocidades de reaccin Relaciones entre diferentes concentraciones de la enzima y las velocidades de reaccin Efecto de la Temperatura y el pH sobre la velocidad de reaccin Modelo de Michaelis-Menten: Supuestos en los que se basa el modelo, significado de los parmetros de la ecuacin de Michaelis y su relacin con los parmetros que describen las siguientes ecuaciones:

V0 =

Vmax [S] Km + [S]

Lineweaver-Burk y la determinacin experimental de Km y Vmax Inhibicin enzimtica Inhibicin reversible e irreversible, competitiva y no competitiva. Caractersticas y anlisis de los parmetros cinticos Regulacin de la actividad enzimtica Regulacin feedback y molculas efectoras. En algunas vas metablicas, los productos finales son frecuentemente inhibidores feedback de las primeras etapas de la misma va para evitar la acumulacin de intermediarios y el uso innecesario de metabolitos y energa. Enzimas alostricas, propiedades: Modificaciones covalentes reversibles, Activacin proteoltica Sntesis y degradacin.
ESTRUCTURA DE HIDRATOS DE CARBONO Monosacridos y disacridos Notas claves Aldosas y cetosas Estereoismeros Estructuras cclicas Disacridos Derivados Nomenclatura Polisacridos y oligosacridos Notas claves Polisacridos Glucgeno Almidn Dextrano Celulosa Oligosacridos Mtodo de identificacin y secuenciacin

TECNICAS DE LABORATORIO Determinacin de azcar reductor

Uno de los problemas ms importantes en la investigacin bioqumica es la necesidad de contar con mtodos analticos adecuados. Los materiales biolgicos con los que se trabaja normalmente distan mucho de ser simples, lo que determina que los mtodos empleados para la determinacin de una sustancia en particular tengan en cuenta las probables interferencias. Uno de los mtodos analticos sumamente importante en la resolucin de muestras de azcares es la determinacin de azcares reductores. El tratamiento de glucosa con lcali diluido, rinde una mezcla en equilibrio de glucosa, fructosa y manosa. Esta reaccin tiene lugar con intervencin de formas enlicas intermediarias, llamadas enodioles (isomerizacin en el C1 y C2)
O C H H C C H OH OH H H H C C C OH OH OH H H C C C OH O OH

Aldosa

Enodiol

Cetosa

Isomerizacin de azcares por tratamiento con lcali.

Los azcares con el grupo carbonilo libre son los capaces de formar el enodiol intermediario en medio alcalino, y por ende son reductores ya que es ese intermediario la forma reactiva de los azcares en una reaccin de xido-reduccin. Uno de los mtodos ms utilizado para la determinacin de azcar reductor es el de SomogyNelson.En este mtodo se produce la reduccin del ion Cu2+ a Cu2O por accin de los azcares en medio alcalino y caliente. Luego por accin del Cu2O sobre el reactivo de Nelson (arsenomolbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Este complejo se determina espectrofotomtricamente a 540 nm. SECUENCIACIN DE OLIGOSACRIDOS Para analizar un oligosacrido se deben tener en cuenta los siguientes puntos: a) composicin de azcares. b) sitios de unin glicosdica. c) configuracin anomrica de los enlaces glicosdicos.
a) Composicin El primer paso en la secuenciacin es determinar la composicin de monosacridos. Para hidrolizar la cadena de oligosacridos se utilizan principalmente dos mtodos: 1) Se puede utilizar una solucin acuosa cida para liberar los monosacridos (ClH 2-4 N durante 3-6 horas a 100 C).Luego de la hidrlisis cida, los monosacridos liberados se transforman en derivados (acetatos) y se los analiza por cromatografa gaseosa con espectrometra de masas. 2) Un mtodo alternativo al mtodo anterior es utilizar cloruro de metilo anhidro, que es menos destructivo.

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b) Uniones glicosdicas

Otro paso importante en la secuenciacin de un oligosacrido es conocer el tipo de enlace entre cada monmero. Cada monosacrido est unido a uno de sus vecinos a travs del C1 anomrico y por otro tomo de C a otro monosacrido. En el caso de las cetosas la unin se hace a travs del C2. La posicin de las uniones glicosdicas se determina por metilacin exhaustiva. En esta reaccin se metilan los hidroxilos libres, es decir aquello que no estn involucrados en uniones.Luego el oligosacrido metilado se hidroliza para romper las uniones glicosdicas y los nuevos hidroxilos libres son acetilados.

H2 COH OH OH O

+ H3 COH H

H2 COH OH OH O

OH OH -D-glucopiranosa

OCH 3 OH Metil--D-glucopiransico (CH3)SO4 NaOH

(a) Metil a 2,3,4,6, tetra-O-metilD-glucopiransido (b) 2,3,4,6, tetra-O-metil-Dglucopiranosa

H COCH 2 3 (a) OMe MeO O OMe OMe

H CL

H2COMe (b) MeO OMe O OH OMe

diluido

c) Configuracin anomrica y secuenciacin

Para la secuenciacin se pueden utilizar mtodos enzimticos y qumicos. Para las determinaciones enzimticas se utilizan exoglicosidasas especficas para tipos de uniones y tipo de azcares. Para ello el oligosacrido se trata en forma secuencial con una serie de enzimas especficas para uniones y azcares. Cada enzima puede liberar los azcares terminales, dependiendo de la secuencia y del tipo de enlace ( y ). La informacin que se obtiene con el tratamiento de las exoglicosidasas se confirma por los anlisis de metilacin exhaustiva. La ventaja del uso de las exoglicosidasas es que es una tcnica muy sensible y debido a la especificidad de las enzimas es posible conocer en gran detalle la estructura de oligosacridos complejos
Accin del cido peridico

El cido peridico produce oxidacin de dioles vecinales, hidroxi vecinales y carbonilos vecinales. De acuerdo a los productos obtenidos se puede determinar el tamao del anillo (anillo de 6 C o 5 C), o el lugar de las ramificaciones. La accin del IO4H produce liberacin de cido frmico o formaldehdo, segn la estructura del azcar. El cido frmico liberado es titulado con NaOH para cuantificarlo. Los moles de cido frmico liberado dan una medida de los extremos no reductores que presenta el oligosacrido.

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1 1 mol oligosacrido

mol oligosacrido oxidado

3 moles cido frmico 1 mol fomaldehdo

En el caso particular de analizar un oligosacrido con enlaces 1 4 se obtendran los siguientes compuestos
H2 COH OH OH OH H2COH O O CH O O 3H C OH C O H O O OH H2COH O
C O H

H2 COH O OH O

H2 COH O OH O OH +7 HIO4 H2 COH O H O

H N

H2 COH OH
OH

O H

OH N C O O +1 HC C H O H O

C O

C O

+ 7 HIO3

Si las uniones fueran diferentes hay que analizar los sitios de accin del periodato y los productos obtenidos
Determinacin de la estructura de mono- di - y polisacridos Mtodo
Uso de enzimas especficas: Maltasa (uniones alfa) Emulsina (uniones beta) Reaccin con agua de bromo (Br2 /H2O) Reduccin de Cu 2+ o Ag + Metilacin exhaustiva Tratamiento con IO4H Hidrlisis cida (H+ /H2O) Estudio de las unidades Por separado

Informacin obtenida
Uniones alfa o beta Aldosa libre Azcar reductor Tamao del anillo (mono) N e identidad de unidades (di- y poli-)

Oxidacin de aldehdos libres Metilacin exhaustiva Sitios de unin entre unidades e hidrlisis. Tratamiento con IO4H _______________________________________________________________

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METABOLISMO ENERGTICO:

Los problemas propuestos para contribuir al conocimiento y comprensin del metabolismo energtico de clulas animales y vegetales se han organizado en cuatro guas que se detallan a continuacin. Finalizada cada una de ellas se recomienda al estudiante integrar los conceptos aplicados con los utilizados previamente dentro del bloque. Para realizar esta integracin se propone seguir el esquema de las figuras 1 y 2. Conocimientos y conceptos a utilizar para la resolucin de las guas de problemas: a- Estructura de Hidratos de carbono: mtodos para su anlisis b- Enlaces de alta energa: ATP, transporte de electrones: fosforilacin oxidativa, fotosntesis: Fase lumnica y fase oscura c- Ciclo de Krebs: reacciones de oxidorreduccin y coenzimas de nicotinamida, localizacin y funcin biolgica. Termodinmica, sistemas acoplados d- Gluclisis y Gluconeognesis: regulacin, balance energtico. Figuras 1, 2 y 3obtenidas de Molecular Cell Biology Albert y col. Figura 1

TECNICAS DE LABORATORIO Figura 2

Figura 3

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LPIDOS Estructura y funcin de los cidos grasos Notas claves Estructura y propiedades Nomenclatura Funciones Prostaglandinas

Introduccin Los lpidos son compuestos primarios en las clulas, donde funcionan como elementos estructurales de las membranas y de tejidos especializados como el nervioso, reserva energtica, activadores especficos de enzima, transportadores de restos carbohidratos en la sntesis de glicoprotenas y como reguladores de funciones orgnicas (vitaminas liposolubles o el grupo de hormonas esteroides). Con el nombre de lpidos se agrupan compuestos biolgicos qumicamente heterogneos caracterizados por la presencia, en su estructura, de compuestos parafnicos como son principalmente los cidos grasos o cadenas similares, que por su carcter hidrofbico les confieren la caracterstica solubilidad en solventes neutros /orgnicos) y la insolubilidad en agua. Tambin integran la estructura de distintos lpidos compuestos tan variables como el glicerol, aminoalcoholes (etanolamina), aminocidos (serina), cido fosfrico, monosacriodos y oligosacridos, que introducen en los lpidos grupos polares hidroflicos que les imparten propiedades qumicas y fsicas caractersticas. Con estructuras tan diferentes la solubilidad de los lpidos es muy variada ofreciendo las bases para su fraccionamiento.
Preparacin de extractos lipdicos 1) Extraccin: Debido a las caractersticas estructurales de los lpidos su extraccin de diferentes materiales biolgicos se realiza con mezclas de solventes orgnicos adecuadas. Un mtodo general para extraer lpidos de tejido hmedo consiste en el uso de la mezcla cloroformo:metanol en proporcin 2:1, seguido de una filtracin y posterior lavado. 2) Particin: La fraccin no lipdica se remueve particionando con un solvente polar. El filtrado obtenido se mezcla con 0,2 volmenes de agua o una solucin salina (Cl2Ca 0,003 N). Se obtienen entonces dos fases que se separan por centrifugacin . La fase superior con el material contaminante no lipdico se descarta y la fase inferior que contiene los lpidos se lava con una mezcla de solventes. Una vez obtenida la fraccin lipdica se procede a su concentracin por evaporacin del solvente bajo una atmsfera de nitrgeno. 3) Separacin: uno de los principales mtodos utilizados para separar e identificar las distintas clases de lpidos es la cromatografa en capa delgada (TLC). Con este mtodo se pueden separar sustancias hidrfilas y sustancias hidrfobas (lpidos).

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La TLC usa generalmente slica gel como adsorbente, esta fase fija se suspende en agua y deposita sobre placas de vidrio ( o metlicas o plsticas) que luego de secarse queda adherida como una capa delgada de 0,1 a 2 mm de espesor. El disolvente o fase mvil es en general una mezcla de solventes elegido de acuerdo a los lpidos que se vaya a separar. Se deja correr el cromatograma y los compuestos presentes en el extracto estarn a distintas distancias desde el origen. Esto depender de su estructura qumica, de la naturaleza del adsorbente y la composicin del solvente. Dado que los compuestos separados son incoloros, el cromatograma se revela con algn reactivo especial de manera de detectar las manchas. Se deben sembrar en el mismo cromatograma compuestos standard para comparar la posicin (Rf) de estos compuestos con las distancias de las manchas correspondientes a los compuestos del extracto. Rf : Relacin de frente: Movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente alcanzado por el solvente. Es una propiedad caracterstica y reproducible. d) Revelado: uno de los reactivos ms utilizado para revelar los lpidos es el vapor de iodo, debido a su propiedad de unirse a los dobles enlaces de los cidos grasos insaturados. (Aparecen manchas marrones sobre un fondo amarillo). FIG. 1 e) Densitograma: Una vez realizado el anlisis cualitativo del cromatograma se realiza su cuantificacin mediante un densitograma. Luego de identificar los compuestos se puede raspar la zona de la mancha del cromatograma y eluirla para su posterior cuantificacin.
Cromatografa de cido silcico Otra tcnica ampliamente usada para la separacin de los compuestos lipdicos de un extracto es la cromatografa en columna de cido silcico. Segn este mtodo los lpidos estn generalmente ms fuertemente adsorbidos a medida que la polaridad aumenta, desde hidrocarburos hasta los fosfolpidos. Para elurlos de la columna se va incrementando la polaridad del solvente. FIG 2 Cromatografa en fase gaseosa La cromatografa en fase gaseosa es particularmente apropiada para la separacin de gases y lquidos voltiles o slidos en estado gaseoso. se emplea para analizar cuali y cuantitativamente mezclas de cidos grasos de esteroles, de hidrocarburos as como de otros compuestos que son voltiles o pueden convertirse qumicamente en derivados voltiles. La cantidad de muestra necesaria para el anlisis est en el orden de los microgramos. Las separaciones son funcin distribucin diferencial de las molculas del soluto entre el flujo de gas inerte (nitrgeno, argn) que es la fase mvil y un slido o un lquido dispuesto sobre un slido que constituye la fase estacionaria. Los compuestos que van siendo separados abandonan la columna a determinados y diferentes tiempos (tiempo de retencin de cada componente) y son medidos a la salida de la columna por un detector. El detector ms empleado y de mayor sensibilidad es el detector de ionizacin de llama.

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Fig.1

Fig.2 TIPOS DE CENTRIFUGACIN

a) Centrifugacin diferencial: Se emplea comnmente como metodologa inicial para el aislamiento de fracciones celulares (mitocondrias, ncleos, etc.) b) Centrifugacin isopcnica diferencial de equilibrio: Separa las partculas por su densidad. Generalmente para la preparacin del gradiente se usan sales de metales pesados, como por ejemplo cesio o rubidio, si bien tambin puede utilizarse sacarosa. La muestra se mezcla homogneamente con una disolucin concentrada de CsCl. La centrifugacin de la misma produce un gradiente de concentracin de sal y por lo tanto un gradiente de densidad que se forma debido a la gran masa del in cesio. Entonces tiene lugar la redistribucin de las molculas en el gradiente y el campo centrfugo las lleva hacia una regin en la que la densidad de la disolucin es igual a su propia densidad de flotacin.

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c) Centrifugacin zonal: El principio se separacin es por el coeficiente de sedimentacin (S) de las partculas. Implica la formacin de una capa de la muestra en un gradiente de densidad lquido continuo. La muestra se somete a centrifugacin hasta que se haya efectuado la separacin deseada, esto es, antes de su sedimentacin completa, pero despus del tiempo suficiente para que las partculas se hayan trasladado por el gradiente para formar zonas o bandas discretas.

Centrfugas preparativas

a) De uso general mxima: 6.000rpm (6.000 g). Los rotores pueden ser de ngulo fijo o de ngulo mvil. Difieren solamente en su capacidad de carga (tubos de 10, 50 y 100 ml). b) De alta velocidad: velocidad mxima 25.000rpm (89.000 g). La cmara del rotor est refrigerada para eliminar el calor producido por la friccin entre el aire y el rotor. c) Ultracentrfuga preparativa: velocidad mxima 75.000rpm (510.000 g). Las cmaras del rotor estn a la vez refrigeradas y evacuadas para as minimizar la produccin de calor por friccin.

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MTODOS DE SECUENCIACIN Mtodo de Maxam y Gilbert (Mtodo Qumico): Este mtodo usa reactivos qumicos que reaccionan con bases especificas para romper el ADN preferencialmente en determinados nucletidos. Primeramente las cadenas de ADN se marcan radiactivamente en el extremo 5, y se separan (solamente una se va a secuenciar). Luego, la cadena a secuenciar se trata con cuatro reactivos qumicos diferentes que tienen la capacidad de cortar la cadena en uno o dos nucletidos especficos. El tratamiento no es exhaustivo, de manera que reacciona un solo residuo de la/s base/s susceptibles. Por consiguiente, en cada mezcla de reaccin, se generan un conjunto de fragmentos radiactivos. Finalmente, estos fragmentos son separados por tamao utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida. El revelado del gel por autorradiografa, permite visualizar las bandas radiactivas correspondientes a los distintos fragmentos, y a travs de ellos se va armando la secuencia.

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Mtodo de Sanger (Mtodo Enzimtico): En este mtodo se usa la enzima ADN polimerasa I para producir fragmentos de ADN de diferentes tamaos, que luego al ser separados mediante electroforesis, permite como en el mtodo qumico, leer el orden de los nucletidos. Se usa ADN de simple cadena como templado para la sntesis de cadenas de ADN complementarias usando como sustratos 23 dideoxinucletidos y los cuatro nucletidos normales. Los dideoxinucletidos se incorporan a la cadena de ADN, pero no permiten su elongacin posterior, dado que no pueden formar uniones fosfodister con el siguiente precursor. Se producen entonces, una serie de cadenas de ADN incompletas que terminan especficamente en el dideoxinucletido. Para determinar la secuencia se realizan por separado cuatro reacciones de sntesis de ADN, cada una con un nucletido finalizador de cadena diferente, sus productos de separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se detectan posteriormente por autorradiografa.

TECNICAS DE LABORATORIO TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

La Tecnologa del ADN recombinante constituye una mezcla de tcnicas, entre las que podemos citar: 1) Corte especfico del ADN mediante nucleasas de restriccin 2) Amplificacin y clonado del ADN que posibilita integrar un fragmento especfico de ADN en un elemento gentico de replicacin rpida (plsmido) para que pueda ser reproducido en bacterias o levaduras 3)Secuenciacin del ADN 4) Hibridizacin de los cidos nucleicos, que permite identificar secuencias especficas de ADN o ARN con gran exactitud, debido a la capacidad de los cidos nucleicos de unirse a secuencias complementarias. 1)Nucleasas de Restriccin Muchas bacterias producen estas enzimas, que son capaces de cortar al ADN en sitios determinados, ya que reconocen secuencias especficas de cuatro o seis nucletidos. Una nucleasa de restriccin determinada cortar cualquier doble hlice de ADN en una serie de fragmentos conocidos como fragmentos de restriccin. Muchas nucleasas de restriccin producen cortes escalonados, que dejan fragmentos cortos de una sola hebra en ambos extremos. Estos extremos se denominan "extremos cohesivos", ya que son complementarios con cualquier otro extremo producido por la misma enzima. Cuando los dos extremos se han unido gracias al apareamiento de bases complementarias, pueden sellarse por la accin de una enzima conocida como ligasa, que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de ADN. 2) Amplificacin y clonado del ADN La obtencin de fragmentos especficos de ADN para diversos fines (secuenciacin, clonado, expresin) se ha simplificado enormemente a partir del desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este proceso permite obtener grandes cantidades de ADN sin necesidad de clonar. La PCR requiere un par de cebadores que, por lo general, son fragmentos cortos de ADN sintetizados qumicamente (oligonucletidos) que tienen secuencias de nucletidos especficamente complementarias a aquellas en las hebras opuestas que flanquean la regin blanco. Estos cebadores definirn los extremos del segmento de ADN que se duplicar. La fuente original del molde o templado de ADN no tiene que estar altamente purificada y aun una cantidad muy pequea del templado puede servir como iniciador de la PCR. La muestra de ADN se calienta, permitiendo que las hebras complementarias se separen. Entonces se aaden los cebadores junto con una enzima polimerizante del ADN. Los cebadores se unen a las cadenas de una sola hebra durante la fase de enfriamiento, y la enzima polimerizante extiende al cebador a lo largo del resto del fragmento, creando molculas de ADN doble hebra. Entonces el proceso se repite, es decir se calienta la mezcla nuevamente y durante las sucesivas fases de enfriamiento, los cebadores sobrantes se unen a las hebras molde y se alargan mediante la enzima polimerizante para producir mas molculas de doble hebra. Tericamente, despus de 20 de estos ciclos una molcula sencilla de ADN puede amplificarse a un milln de copias. Con esta cantidad de ADN se pueden fabricar sondas, realizar secuencias, etc. Fragmentos de ADN procedentes de cualquier fuente tambin pueden ser amplificados mas de un milln de veces insertndolos en un plsmido o en un virus bacteriano (bacterifago) y luego cultivndolo en clulas bacterianas o de levaduras. Este proceso se denomina clonado del ADN. Los plsmidos son pequeas molculas circulares de

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ADN duplex que se presentan en forma natural en bacteria y levaduras, donde se replican como unidades independientes cuando prolifera la clula husped. Estos vectores a menudo confieren resistencia a antibiticos. Estas propiedades y su reducido tamao los hace muy tiles como herramientas de clonado y multiplicacin del ADN. Pueden ser cortados con enzimas de restriccin y luego se les puede ligar el fragmento de ADN que se desee clonar. Luego, las molculas hbridas (Vector + ADN insertado) se introducen nuevamente en bacterias que transitoriamente se han hecho permeables a las macromolculas. Solo algunas de las clulas tratadas incorporarn el plsmido. Estas clulas pueden seleccionarse mediante la resistencia a antibiticos que les habr conferido el plsmido, ya que slo estas clulas crecern en presencia de antibiticos. Al dividirse estas bacterias, tambin se replicar el plsmido, producindose as un enorme nmero de copias del mismo. ADNc Una estrategia alternativa al proceso anteriormente descrito consiste en empezar el proceso de clonado seleccionando slo aquellas secuencias de ADN que fueron transcriptas ( es decir, que produjeron ARN). Esto se lleva a cabo extrayendo el ARNm de las clulas y haciendo una copia de ADN de cada molcula de ARNm presente (la cual se denomina ADN copia o ADNc). Esto es posible gracias a la enzima transcriptasa reversa que cataliza el proceso de sntesis de una cadena complementaria de ADN sobre un patrn de ARN. Las molculas de ADNc de una sola hebra sintetizadas mediante la transcriptasa reversa pueden ser amplificadas por PCR (obtenindose una molcula doble hebra) o ser convertidas en molculas de ADNc doble hebra por la ADN polimerasa. Estos fragmentos pueden insertarse en los plsmidos y clonarse. Es posible construir plsmidos de tal manera que el ADNc clonado dirija la sntesis dentro de una clula de grandes cantidades de la protena codificada por el ADNc (recordar que se origin a partir de un ARNm). Se puede inducir a bacterias a producir cantidades enormes de protenas tiles como la insulina o el interfern. 3) Secuenciacin Es de suma utilidad conocer la secuencia exacta de un determinado fragmento de ADN, ya que partir de este dato se pueden fabricar oligonucletidos para amplificaciones por PCR o saber cuales enzimas de restriccin pueden ser tiles para clonar ese ADN. El mtodo ms usado en la actualidad es una variante del mtodo enzimtico ideado por Sanger. Gracias a la automatizacin de este proceso, y combinando varias tcnicas de Biologa Molecular se ha llegado a determinar la secuencia completa del genoma de varias especies, (entre ellas la humana). Todas las secuencias de genes conocidos forman parte de bancos de datos de libre acceso en Internet. Esto permite identificar secuencias desconocidas por comparacin con estos bancos, como as tambin obtener datos acerca de secuencias de inters. 4) Hibridizacin Las hebras complementarias del ADN, producto de su desnaturalizacin pueden formar de nuevo una doble hlice si se mantienen a 65C durante un perodo prolongado; proceso denominado hibridizacin del ADN. Se producen reacciones de hibridizacin similares entre dos cadenas cualquiera de cido nucleico de una sola hebra (ADN/ADN; ARN/ARN, ADN/ARN) siempre que tengan una secuencia de nucleotidos complemenaria. Puesto que la velocidad de formacin de la doble hlice est limitada por la velocidad a la que chocan dos cadenas complementarias de cido nucleico, es posible medir la concentracin de las molculas de ADN que presentan una secuencia particular de

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nucletidos a partir de la velocidad con que la preparacin del ADN en cuestin se hibridiza con una sonda de ADN clonado marcada radiactivamente de secuencia complementaria al ADN problema. Se trata de una prueba tan exacta que puede detectar incluso secuencias complementarias cuya concentracin sea una molcula por clula. A partir de estas mediciones se puede determinar el nmero de copias de la secuencia de ADN contenida en la sonda clonada que existen en el ADN de una clula. Tambin se pueden realizar estudios de hibridizacin con el ARN aislado de las clulas, para determinar si la secuencia de ADN que se ha clonado es una de las que se transcriben a ARN, y en caso afirmativo, cuantas copias del ARN se producen por clula y en que tipos de clulas y tejidos . Las sondas radiactivas de ADN clonado se utilizan ampliamente para localizar secuencias determinadas de cido nucleico en mezclas de fragmentos de restriccin de ADN separados por electroforesis sobre gel. Se realiza una copia del gel, transfiriendo todos los fragmentos de ADN a una membrana cargada (nitrocelulosa o nylon) mediante difusin, proceso denominado transfer. Luego, mediante autorradiografa, se identifican las localizaciones de los fragmentos que se hibridizan con la sonda de ADN radiactivo. Si el material contenido en la membrana es ADN, el estudio se denomina "Southern blot" Este proceso tambin puede realizarse sobre ARN. Si el material transferido a la membrana es ARN, el estudio se denomina "Northern blot" Estas denominaciones son independientes del tipo de sonda usada (ARN, ADN o ADNc) RADIACTIVIDAD Los tomos existentes en la naturaleza pueden dividirse en dos grupos: estables e inestables. Estables son aquellos que no cambian su identidad espontaneamente en el tiempo. Los tomos inestables pierden su identidad por transformacin en otros. La mayora de los elementos conocidos existen como mezclas de istopos, es decir tomos que contienen el mismo nmero de protones, pero no de neutrones. Se llama nucleido a una especie atmica que est definida por su masa, su carga nuclear y el estado energtico de su ncleo (combinacin particular de neutrones y protones). Cuando la combinacin es inestable con respecto a la desintegracin nuclear se los denomina radionucleido. Tanto los istopos estables como los radiactivos son utilizados en investigaciones biolgicas. Cmo se desintegran los nucleidos? El fenmeno mediante el cual el nucleido de un tomo se transforma espontneamente en otro, recibe el nombre de desintegracin radiactiva. En cada desintegracin radiactiva el ncleo pierde aproximadamente una milsima parte de su masa en forma de radiacin. Los nuevos elementos originados como productos finales del proceso de desintegracin suelen no ser radiactivos. Se pueden identificar tres tipos de radiaciones: alfa (), beta () y gama (). Rayos alfa: son ncleos de Helio, o sea tomos de Helio que han perdido sus dos electrones, adquiriendo una doble carga positiva. Los tomos recorren en el aire entre 3 y 7 cm antes de chocar con otros tomos que encuentran a su paso. Estas partculas son retenidas por una hoja de papel o una lmina de aluminio de 0,05 mm de espesor.

TECNICAS DE LABORATORIO Rayos beta: son electrones. Un neutrn nuclear se convierte en un protn nuclear y un electrn. la emisin de una partcula beta (electrn) resultar e un istopo estable con un N atmico mayor en una unidad y un peso atmico idntico al radioistopo original. 0 14 Ej.: 146 C -1 7N Las partculas son emitidas en una escala continua de energa desde cero hasta el valor mximo (E max). Dicho valor es caracterstico de cada radioistopo. Los rayos beta recorren distancias mayores que los alfa, tienen mayor poder penetrante que los anteriores ya que atraviesan fcilmente el papel y de acuerdo a sus energas, hasta unos mm del aluminio. Cuando las partculas beta atraviesan la materia, su energa se disipa principalmente por ionizacin y/o excitacin de los tomos con los que chocan. Estas interacciones se detectan con los contadores Geiger-Muller (ionizacin) y de centelleo (excitacin). Rayos gamma: son ondas electromagnticas como la luz visible o los rayos X pero de menor longitud de onda. Tienen valores discretos de energa y no es una escala continua. No vara ni el nmero atmico ni el msico. El nucleido simplemente sufre una transicin desde un estado ms alto de energa hasta uno ms bajo. Un rayo gamma no presenta carga y por lo tanto no ioniza directamente tomos en su trayectoria. Los rayos gamma son penetrantes y para detenerlos se precisa una pared gruesa de plomo o cemento. La mayora de los radioistopos usados en estudios bioqumicos son emisores beta y/o gamma. De los istopos producidos artificialmente los que se emplean ms frecuentemente son: 3 H, 14C, 24Na, 32P, 35S, 40K, 59F, 131I. Todos ellos emiten radiaciones de partculas beta cargadas negativamente y los istopos 24 Na, 59Fe y 131I emiten al mismo tiempo radiaciones gamma. La radiactividad es la transformacin atmica en la que un elemento se convierte en otro, con la emisin de radiaciones. La desintegracin radiactiva obedece a las leyes de la probabilidad y es independiente de influencias externas como presin, gravedad, temperatura, campos elctricos o magnticos y tratamientos qumicos. La intensidad de la radiactividades proporcional a la masa del nucleido

La actividad decrece con el tiempo y es caracterstica de cada nucleido

= constante de desintegracin radiactiva (tiempo1) N= nmero de tomos en el tiempo t - dN = nmero de tomos que decaen (desintegran por unidad de tiempo) dt

En cualquier momento dado, el nmero de tomos de un material radiactivo que se desintegran por unidad de tiempo es proporcional al nmero de tomos presentes en ese tiempo. A este valor se lo conoce generalmente como: actividad y es la velocidad de desintegracin de una fuente activa al tiempo t. Aunque es una constante de proporcionalidad su significado fsico puede verse rearreglando la ecuacin. por lo tanto Es decir que es la fraccin de tomos radiactivos que decaen por un incremento de tiempo. Integrando entre los lmites de N0 (nmero original de tomos radiactivos y N

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(nmero de tomos radiactivos a cualquier otro tiempo) y entre los lmites de t0 y cualquier otro tiempo t se obtiene:
N No

dN = - N

t to

dt

ln N = - t N0 2,3 log No = t N

ln No = t N

Periodo de semidesintegracin. Es el tiempo necesario para que el nmero inicial de tomos disminuya a la mitad. N = No / 2 t = ln No/N t1/2 = ln No/No/2 = ln2 = 0,693

Vida media: es el promedio de vida de sus tomos. = 1 La relacin entre el perodo de semidesintegracin y vida media es: t1/2 = 0,693 = 1,444 t1/2

Unidades de radiactividad. La unidad estndar de decaimiento radiactivo es el Curie (Ci). Se lo define como la cantidad de cualquier nucleido radiactivo en el cual el nmero de desintegraciones por segundo es 3,7x1010 Para la mayor parte de las aplicaciones biolgicas se necesita normalmente cantidades mucho menores de un Ci y se emplea el miliCurie (mCi) y el microCurie ( Ci) que equivalen a 10-3 y 10-6 Ci respectivamente. La unidad estndar de tiempo es el minuto, por lo tanto: 1 Ci=2,2x106 dpm. Normalmente la actividad se indica por cuentas detectadas por minuto (cpm) y no como desintegraciones por minuto (dpm), dado que es difcil determinar el nmero absoluto de dpm. Esto se debe a que la eficiencia de la mayora de los contadores es menor del 100%, es decir, solo detectan una fraccin del total. Para experimentos cuantitativos muy precisos el valor de cpm se convierte en dpm dividiendo por la eficiencia del contador. Actividad especfica. Los istopos radiactivos y los compuestos marcados radiactivamente con istopos, son por lo general isotpicamente puros. La abundancia relativa de un istopo se describe por su actividad especfica, que es una manera de designar la fraccin de molculas totales presentes que es radiactiva. Este valor se expresa generalmente como actividad (mCi o Ci) por milimol o micromol (mmlo o mol) o como Ci/gr, dpm/mol, cpm/ mol, etc. Dilucin isotpica. Los trazadores radiactivos pueden usarse para determinar la cantidad de una sustancia simple en una muestra, agregando a la misma una cantidad conocida del mismo

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compuesto "marcado" (radiactivo). As, el compuesto no marcado (fro) y el mismo compuesto marcado se mezclan sin que sea posible distinguirlos entre si. La actividad especfica de la solucin resultante se puede calcular mediante la siguiente frmula:

Donde: a2: actividad especfica en el diluyente + radiactivo agregado x1: masa radiactiva agregada x2: masa del diluyente (compuesto no marcado) z: actividad (cpm) del radiactivo agregado La actividad especfica del radiactivo agregado (a1) ser:

Luego, se reaisla una pequea cantidad del compuesto y se mide la radiactividad del mismo. De la actividad especfica del mismo y conociendo el nmero total de cuentas originariamente agregado, se puede calcular la cantidad del compuesto no marcado presente desde un principio en la mezcla.
Aplicaciones de radioistopos en biologa y bioqumica. Un gran nmero de los anlisis bioqumicos requieren la deteccin de cantidades mnimas (10-14 a 10-6 moles) de material. Ahora bien, las pruebas qumicas rara vez son sensibles a cantidades menores de 10-7 moles. Esta limitacin se ha superado por el desarrollo de una tecnologa de marcadores radiactivos, cuya extraordinaria sensibilidad en la deteccin de material marcado con istopos radiactivos ha permitido que los estudios con muchas sustancias en cantidades del orden de 10-12 moles sean de rutina. Adems el uso de radiactividad ha permitido el desarrollo de aproximaciones experimentales de gran alcance a diversos tipos de problemas. Estas aproximaciones emplean la tcnica de marcado doble, que permite el seguimiento de dos sustancias al mismo tiempo, la tcnica de un seguimiento de un pulso radiactivo y el anlisis de intercambio. En una molcula marcada al menos un tomo esta presente como radioistopo. Este radioistopo no modifica las propiedades qumicas de la molcula. Los radioistopos se pueden utilizar para seguir las actividades de molculas marcadas dado que estos tomos pueden detectarse cuando emiten partculas. Se encuentran disponibles comercialmente aminocidos y nucletidos marcados con 14C o 3H, as como cientos de intermediarios metablicos marcados. El 125I puede estar unido en forma enzimtica o qumica a una protena si afectar la macromolcula. La metionina marcada con 35S se utiliza para marcar protenas ya que posee una alta actividad especifica. La magnitud de la actividad especfica depende de la relacin de tomos inestables (potencialmente radiactivos) a tomos estables (no radiactivos), y de la probabilidad de decaimiento de los tomos inestables, indicado por su vida media. Existen principalmente dos mtodos para detectar la radiactividad incorporada. I) En la autorradiografa se marca una clula o componente celular y lego se cubre con una emulsin fotogrfica sensible a la radiacin. El desarrollo de la emulsin revela la distribucin del material marcado. Por ejemplo la incorporacin de 3H timidina identifica el ncleo como el mayor sitio de sntesis de ADN. En oposicin, la

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incorporacin de uridina marcada a ARN muestra este se sintetiza primero en el ncleo pero la gran mayora se localiza en el citoplasma. II) En los ensayos cuantitativos, las clulas se pueden marcar tanto in vivo como in vitro y sus componentes celulares se pueden aislar y purificar de diversas maneras. Se mide entonces la cantidad o tipo de radiactividad en estos componentes mediante un contador Geiger (para detectar iones producidos en un gas por las emisiones radiactivas) o por un contador de centelleo (que cuenta los flashes de luz generados por una sustancia fluorescente que absorbe la energa de la muestra radiactiva). A menudo se emplean una combinacin de tcnicas de marcado y bioqumicas, como por ejemplo el experimento de "pulso-caza" (pulse-chase) . En este caso el material radiactivo (el pulso) se aade nicamente durante un periodo muy corto de tiempo y luego se elimina por lavado, siendo substituido por molculas no radiactivas (caza). Tras diversos perodos de tiempo se toman muestras y en cada momento se identifica la forma qumica o la localizacin de la radiactividad. Ejemplo: se pueden crecer clulas en un medio de cultivo que contenga aminocidos marcados y se incorporan al pool general de aminocidos, que constituyen la fuente para la sntesis de protenas. La actividad especfica de los aminocidos en el pool alcanza un mximo en los primeros cinco minutos, sin embargo la acumulacin de radiactividad en las protenas comienza mas lentamente. Sin embargo si se agregan al medio aminocidos no marcados (caza), se frena en pocos minutos la incorporacin de radioactividad a la protena, debido al rpido equilibrio entre los aminocidos que estn dentro de la clula y los del medio de cultivo.