CP Filtração

NESTA SEO
Boletim n 032.10 Resp.: Dr Rosana M. Mastelaro Fone: (11) 3897-9772 e-mail: rosana@sindusfarma.org.br
Consulta Pblica n 39, de 29/04/10 DOU 30/04/2010 A Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso das atribuies que lhe confere o inciso IV do art. 11 e o art. 35 do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto n 3.029, de 16 de abril de 1999, e tendo em vista o disposto no inciso V e nos 1 e 3 do art. 54 do Regimento Interno aprovado nos termos do Anexo I da Portaria n 354 da ANVISA, de 11 de agosto de 2006, republicada no DOU de 21 de agosto de 2006, em reunio realizada em 26 de abril de 2010, considerando que responsabilidade da ANVISA a atualizao e reviso peridica da Farmacopia Brasileira; considerando o Processo de Reviso de Monografias da Farmacopia Brasileira e o desenvolvimento e reviso de mtodos gerais da Farmacopia Brasileira por instituies de ensino superior; considerando que devem ser observadas as especificaes de qualidade determinadas pela Farmacopia Brasileira, para fins de controle de qualidade, registro e anlises fiscais de produtos sujeitos ao regime de vigilncia sanitria; adota a seguinte Consulta Pblica e eu, Diretor-Presidente, determino a sua publicao: Art. 1 Fica aberto, a contar da data de publicao desta Consulta Pblica, o prazo de 30 (trinta) dias para que sejam apresentadas sugestes quanto s propostas de reviso e atualizao dos Mtodos Gerais da Farmacopia Brasileira, alm da incluso de novos mtodos descritos no Anexo I. Art. 2 Informa que os mtodos gerais descritos no Anexo I, estaro disponveis, na ntegra, durante o perodo de consulta no endereo eletrnico www.anvisa.gov.br, e as sugestes devero ser encaminhadas por escrito para o seguinte endereo: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria/DIMCB/Farmacopia Brasileira, SAI trecho 5 rea especial n 57, Bloco E, 1 Andar, Sala 4, Braslia/DF, CEP 71.205.050, ou Fax: (061) 3462 6791 ou e-mail: cp39.farmacopia@anvisa.gov.br. Art. 3 Findo o prazo estipulado no Art. 1, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria submeter Comisso da Farmacopia Brasileira as contribuies enviadas, para avaliao e os encaminhamentos devidos. DIRCEU RAPOSO DE MELO
Rua Alvorada, 1280 - CEP 04550-004 - So Paulo - SP - Brasil - Tel. +55 (11) 3897-9779 / Fax +55 (11) 3845-0742 E-mail: sindusfarma@sindusfarma.org.br - Site: www. sindusfarma.org.br
ANEXO I MTODOS GERAIS DA FARMACOPIA BRASILEIRA PREPARAO DE PRODUTOS ESTREIS ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DA HEPARINA NOS FATORES DE COAGULAO. ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DOS FATORES DE COAGULAO ATIVADOS. ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DO FATOR II DA COAGULAO HUMANA SANGUNEA. ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DO FATOR VII DA COAGULAO HUMANA SANGUNEA. ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DO FATOR IX DA COAGULAO HUMANA SANGUNEA. ENSAIO BIOLGICO DOSEAMENTO DO FATOR X DA COAGULAO HUMANA SANGUNEA.
X. PREPARAO DE PRODUTOS ESTREIS X.1. ESTERILIZAO E GARANTIA DE ESTERILIDADE X.1.1. ESTERILIZAO Esterilidade a ausncia de microrganismos viveis. Como a obteno da esterilidade de qualquer item isolado de uma populao submetida ao processo de esterilizao no pode ser garantida nem demonstrada, a esterilidade de um lote definida em termos probabilsticos por meio de um processo de produo adequadamente validado. A inativao de microrganismos por meios fsicos ou qumicos segue uma lei exponencial e, portanto, h uma probabilidade estatstica de que microrganismos possam sobreviver ao processo de esterilizao. Para um determinado processo, a probabilidade de sobrevivncia determinada pelo nmero, tipo e resistncia dos microrganismos presentes e pelo ambiente durante a esterilizao. O nvel de garantia de esterilidade de um processo de esterilizao o grau de garantia que o processo em questo esteriliza uma populao de itens, sendo expresso como a probabilidade de um item no estril naquela populao. O nvel de garantia de esterilidade de 106, por exemplo, indica a probabilidade de no mais que um microrganismo vivel em 1 106 itens esterilizados do produto final. O nvel de garantia de esterilidade de um processo para um determinado produto estabelecido por meio de estudos de validao apropriados e geralmente aceito que produtos injetveis submetidos esterilizao terminal ou dispositivos crticos estreis alcancem uma probabilidade de sobrevivncia microbiana de 106. Com produtos termoestveis, a abordagem freqente exceder o tempo crtico necessrio para conseguir a probabilidade de sobrevivncia microbiana de 10 6 (sobremorte). Contudo, para produtos termosensveis, a abordagem de sobremorte no pode ser empregada e o desenvolvimento do ciclo de esterilizao depende do conhecimento da carga microbiana do produto. O valor D, tempo de reduo decimal, o tempo em minutos necessrio para reduzir a populao microbiana em 90% ou 1 ciclo logartmico, a uma condio especfica, isto , para uma frao sobrevivente de 1/10. Portanto, onde o valor D de uma preparao de indicador biolgico de, por exemplo, esporos de Geobacillus stearothermophilus, de 1,5 minutos sob os parmetros totais de processo, isto , a 121 C, se for tratado por 12 minutos sob as mesmas condies, pode-se declarar que o incremento de letalidade de 8D. A aplicao deste incremento na esterilizao do produto depende da carga microbiana inicial. Assumindo que a carga microbiana do produto apresenta resistncia ao processo de esterilizao igual resistncia do indicador biolgico e que a carga inicial do produto de 102 microrganismos, o incremento de letalidade de 2D reduziria a carga microbiana a 1 (teoricamente 100) e, consequentemente, 6D adicionais resultaria em uma probabilidade de sobrevivncia microbiana
calculada de 10-6. Sob as mesmas condies, um incremento de letalidade de 12D pode ser usado como abordagem tpica para obteno da sobremorte. Geralmente, a probabilidade de sobrevivncia da carga microbiana presente no material, cujo processo de validao da esterilizao est sendo realizado, no a mesma do indicador biolgico. Para o uso vlido, portanto, essencial que a resistncia do Indicador Biolgico seja maior que aquela da biocarga do material a ser esterilizado, sendo necessrio assumir a situao de pior caso durante a validao. O valor D do indicador biolgico a ser empregado deve ser determinado ou verificado para cada programa de validao e tambm na ocorrncia de alterao deste programa. A determinao de curvas de sobrevivncia, ou abordagem de ciclo fracionado, pode ser empregada para determinar o valor D do indicador biolgico escolhido para o processo de esterilizao especfico. Esta abordagem tambm pode ser usada para avaliar a resistncia da biocarga do produto. Ciclos fracionados so utilizados para avaliar a reduo da contagem microbiana ou para alcanar frao negativa. Estes nmeros podem ser usados tanto para determinar a letalidade do processo sob condies de produo quanto para estabelecer ciclos de esterilizao apropriados. Um indicador biolgico adequado, tal como a preparao de Geobacillus stearothermophilus, tambm deve ser usado durante a esterilizao de rotina. Qualquer mtodo de carga microbiana utilizado para a garantia de esterilidade requer vigilncia adequada da resistncia microbiana do item para detectar quaisquer mudanas. X.1.2 MTODOS DE ESTERILIZAO Um mtodo de esterilizao tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macroscpica ou microscpica, saprfitas ou no, presentes no produto considerado, sem garantir a inativao de toxinas e enzimas celulares. O procedimento selecionado para atingir o nvel de garantia de esterilidade depende do conhecimento da natureza do material a ser esterilizado, do processo de esterilizao a ser empregado e das alteraes que podem ocorrer no material, em funo da esterilizao. O conhecimento do tipo, da quantidade e da fonte dos contaminantes nos produtos, antes da esterilizao, e a aplicao de mtodos para minimizar tal contaminao e preveni-la psprocessamento contribuem para assegurar o xito da esterilizao. Este captulo apresenta conceitos e princpios envolvidos no controle de qualidade de produtos que devem cumprir a exigncia de esterilidade e inclui descrio dos mtodos de esterilizao e instrues para processo assptico. X.1.2.1 MTODOS FSICOS X.1.2.1.1 ESTERILIZAO PELO CALOR O calor o agente esterilizante mais simples, econmico e seguro de que se dispe, contudo a sensibilidade dos diferentes microrganismos ao do calor bastante variada, sendo as formas esporuladas as mais resistentes. A eficincia na inativao dos microrganismos dependente da temperatura, tempo de exposio e presena de gua, pois na presena desta so exigidos menores tempo de exposio e temperaturas. A esterilizao pelo calor mido causa a coagulao das protenas celulares dos microrganismos, enquanto a esterilizao pelo calor seco se d em funo de processos oxidativos, os quais necessitam de altas temperaturas e longo tempo de exposio. Calor mido O processo de esterilizao empregando vapor saturado sob presso realizado em cmara denominada autoclave. O princpio bsico de operao a substituio do ar da cmara por vapor saturado. Para deslocar ar mais eficientemente da cmara e de dentro dos produtos, o ciclo de esterilizao pode incluir estgios de evacuao de ar e de vapor.
Para este mtodo de esterilizao, a condio de referncia para esterilizao de preparaes aquosas de aquecimento de no mnimo 121 C por pelo menos 15 minutos. Combinaes distintas de tempo e temperatura podem ser utilizadas, contanto que validadas e que demonstrem a eficcia do processo escolhido, proporcionando um nvel adequado e reprodutvel de letalidade quando operado rotineiramente dentro das tolerncias estabelecidas. So aplicados procedimentos e precaues de modo a atingir um nvel de segurana de esterilidade de 106 ou melhor. Combinaes de tempo e temperatura devem ser estabelecidas baseadas em fatores como natureza do material e sua termolabilidade, penetrabilidade do vapor no produto a ser esterilizado e outros parmetros definidos no processo de validao. Quando for utilizada temperatura de esterilizao diferente de 121 C, o conceito de F0 deve ser empregado. O F0 em uma temperatura particular diferente de 121 C, o tempo em minutos necessrio para fornecer a letalidade equivalente quela fornecida a 121 C durante um referido tempo. F0 uma medida da eficcia esterilizante, isto , o nmero de minutos de esterilizao trmica por vapor determinada temperatura fornecida a um recipiente ou unidade de produto num dado valor Z. Para garantir a eficincia do processo de esterilizao, a distribuio da carga na cmara deve ser feita de maneira a propiciar o contato do vapor com as regies de mais difcil acesso. Para materiais esterilizados por calor mido, aceitvel que se alcance uma probabilidade de sobrevivncia microbiana da ordem de 10-6. Para produtos termoestveis, o tempo necessrio para atingir a condio anterior pode ser excedido, resultando em sobremorte, o que no se aplica a produtos que possam sofrer alterao em funo da exposio excessiva ao calor. Nesta situao, o desenvolvimento do ciclo de esterilizao depende, especialmente, do conhecimento da carga microbiana presente no produto, que deve ser determinada em quantidade substancial de lotes do produto, anteriormente esterilizao. O valor D do indicador biolgico adequado usado, como Geobacillus stearothermophilus, deve ser avaliado no programa de validao e na ocorrncia de alguma alterao deste programa. Calor seco A esterilizao trmica por calor seco realizada em estufa com distribuio homognea do calor, que pode ser obtida por circulao forada de ar. Podem ser esterilizados artigos como vidros, metais, ps, vaselinas, gorduras, ceras, solues e suspenses oleosas e tecidos especiais. Este processo aplicado principalmente para materiais sensveis esterilizao por calor mido. Para este mtodo de esterilizao, a condio de referncia uma temperatura mnima de 160 C por pelo menos 2 horas. Combinaes distintas de tempo e temperatura podem ser utilizadas, contanto que validadas e que demonstrem a eficcia do processo escolhido, proporcionando um nvel adequado e reprodutvel de letalidade quando operado rotineiramente dentro das tolerncias estabelecidas. Um nvel de garantia de esterilidade de 10-12 considerado aceitvel para produtos termoestveis. Um exemplo de indicador biolgico para validar e monitorar a esterilizao por calor seco a preparao de esporos de Bacillus atrophaeus. O processo empregando o calor seco tambm pode ser usado para esterilizao e despirogenizao como parte integrante do processo de enchimento assptico, onde se requer temperaturas muito altas devido ao menor tempo de exposio ao calor. Os processos contnuos usualmente necessitam de um estgio de resfriamento anterior ao processo de envase. Em funo do menor tempo de exposio do material, o programa de validao deve abranger parmetros como a uniformidade de temperatura e o tempo de permanncia. O calor seco em temperaturas maiores que 220 C pode ser utilizado para a esterilizao e despirogenao de vidraria. Neste caso, um desafio com endotoxina bacteriana deve fazer parte do programa de validao, demonstrando uma reduo de no mnimo 3 ciclos logartmicos de endotoxina resistente ao calor, ou seja, testar materiais inoculados com no mnimo 1000 unidades de endotoxina bacteriana. O teste com lisado de Limulus pode ser usado para demonstrar que a endotoxina foi inativada a no mais do que 1/1000 da quantidade original, sendo que o remanescente de endotoxina medido para garantir a reduo de 3 ciclos logartmicos.
X.1.2.1.2. ESTERILIZAO POR RADIAO IONIZANTE As radiaes ionizantes so emisses de alta energia, sob a forma de ondas eletromagnticas ou partculas, que ao se chocarem com os tomos do material irradiado alteram sua carga eltrica por deslocamento de eltrons, transformando os tomos irradiados em ons positivos ou negativos. Quando estas radiaes atravessam as clulas criam hidrognio livre, radicais hidroxilas e alguns perxidos, os quais por sua vez podem causar diferentes leses intracelulares. As principais fontes de radiao so: raios alfa, beta, gama e raios X. Os dois tipos de radiao ionizante em uso so decaimento de radioistopo (radiao gama) e radiao por feixe de eltrons. Os produtos so expostos a uma radiao ionizante na forma de radiao gama de uma fonte radioisotpica adequada (por exemplo, cobalto 60) ou de um feixe de eltrons energizados por meio de um acelerador de eltrons. Alm da possibilidade do processamento a baixas temperaturas, o que permite a esterilizao de produtos termosensveis, a esterilizao por radiao ionizante possui vantagens como a baixa reatividade qumica e o fato de existirem poucos parmetros a serem controlados, sendo imprescindvel o controle da dose de radiao absorvida. A dose de radiao estabelecida para a esterilizao deve garantir o no comprometimento dos materiais a serem esterilizados. Para a radiao gama, a validao do processo inclui o estabelecimento da compatibilidade do material, o estabelecimento do modelo de carregamento do produto e o mapeamento de dose no recipiente de esterilizao, identificando as zonas de doses mxima e mnima de radiao, a definio do tempo de exposio e a comprovao da aplicao da dose de esterilizao requerida. Para irradiao por feixe de eltrons, devem ser controlados ainda voltagem, corrente, velocidade da esteira transportadora e dimenso de varredura do feixe de eltrons. Para este processo de esterilizao, a dose absorvida de referncia de 25 kGy, porm em algumas situaes h necessidade de seleo de uma dose maior ou menor. A dose escolhida deve oferecer um nvel de letalidade adequado e reprodutvel quando o processo operado rotineiramente dentro das tolerncias estabelecidas. Procedimentos e precaues devem ser aplicados para atingir um nvel de garantia de esterilidade de 106 ou melhor. Para validar a eficcia desta esterilizao, especialmente quando se utilizam doses menores, necessrio determinar a resistncia radiao da carga microbiana do produto. Padres de carregamento de produto especfico e a distribuio de doses mnimas e mximas absorvidas devem ser estabelecidos. As doses absorvidas so normalmente medidas atravs de dosmetros especficos, como suporte plstico padronizado que mostra intensificao da cor proporcional quantidade de radiao absorvida. A abordagem de ciclo fracionado fornece os dados utilizados para determinar o valor D10 do indicador biolgico, informao aplicada para extrapolar a quantidade de radiao absorvida para estabelecer uma probabilidade adequada de sobrevivncia microbiana. Atualmente, a dose se baseia na resistncia radiao da carga microbiana heterognea natural contida no produto a ser esterilizado. Os procedimentos de validao podem usar a exposio de produto inoculado, usando organismos resistentes, como Bacillus pumilus, ou exposio de amostras de produto acabado da linha de produo dose subletal de processo. O procedimento para seleo da dose de radiao baseado na avaliao da resistncia dos microrganismos constituintes da carga microbiana do produto a ser esterilizado, possibilita uma determinao mais representativa da resistncia desta ao se trabalhar com microrganismos com diferentes suscetibilidades radiao. Este procedimento exige a enumerao da populao microbiana em amostragem representativa de diferentes lotes de produto. Com o conhecimento da carga microbiana, a dose de radiao estabelecida baseando-se em tabela disponvel na literatura. Um outro mtodo que permite o estabelecimento da dose de radiao baseia-se no emprego de incrementos de doses de radiao at obter-se, no mximo, uma amostra positiva em 100 unidades irradiadas. Esta informao prov a base para extrapolao desta dose e obteno da dose de radiao. Avaliaes peridicas devem ser feitas para garantir que os valores estabelecidos continuam sendo efetivos (referncia: ISO 11137-1: 2006 - Sterilization of health care products - Radiation - Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices).
A eficincia do ciclo de esterilizao deve ser avaliada periodicamente pela determinao da carga microbiana do produto ou pelo emprego de indicador biolgico e pelo uso de dosmetros calibrados. X.1.2.1.3. ESTERILIZAO POR FILTRAO A filtrao empregada para esterilizao de solues termosensveis por remoo fsica dos microrganismos contaminantes. O material filtrante no pode liberar fibras ou materiais extraveis indesejveis para a soluo a ser filtrada, o que restringe a natureza do elemento filtrante a vidro, metal e polmeros. A montagem de um filtro consiste de uma matriz porosa inserida em um abrigo impermevel. A eficincia de um meio ou substrato filtrante depende do tamanho do poro do material, da adsoro de microrganismos sobre ou dentro da matriz do filtro e do mecanismo de peneira ou excluso. O efeito de excluso por tamanho funo da abertura (dimetro) dos poros, e a adsoro depende da composio, espessura do elemento filtrante e fluido que est sendo filtrado. O tamanho dos poros das membranas filtrantes estimado por valor nominal que reflete a capacidade da membrana do filtro de reter microrganismos representados por cepas especficas. A filtrao para fins de esterilizao normalmente realizada com membranas de graduao de tamanho de poro nominal de 0,2m, ou menor. Estas membranas de filtrao esterilizante, classificadas como 0,22m ou 0,2m, dependendo do fabricante, so capazes de reter 100% de uma cultura contendo 107 microrganismos de Brevundimonas diminuta ATCC 19146, por cm2 de superfcie de membrana filtrante, sob uma presso mnima de 30 psi (2,0 bar). O usurio responsvel pela escolha do filtro em funo da natureza do material a ser filtrado, que atenda necessidade do processo de esterilizao, devendo tambm determinar se os parmetros empregados na produo influenciaro a eficincia da reteno microbiana. Uma vez que a eficincia do processo de filtrao tambm influenciada pela biocarga da soluo a ser filtrada, importante a determinao da qualidade microbiana das solues antes da filtrao, bem como o estabelecimento de parmetros como presso, taxa de fluxo e caractersticas da unidade filtrante. O valor de reduo logartmica tambm pode ser utilizado para avaliar a capacidade de reteno da membrana filtrante. Por exemplo, um filtro de 0,2m, que pode reter 107 microrganismos de uma cepa especfica, ter um valor de reduo logartmica de no menos que 7, sob condies declaradas. As membranas filtrantes comercialmente disponveis incluem acetato de celulose, nitrato de celulose, fluorcarbonato, polmeros acrlicos, polister, policarbonato, cloreto de polivinila, vinil, nylon, polytef e ainda, membranas metlicas. Os filtros de membrana, por serem filmes polimricos, oferecem muitas vantagens e algumas desvantagens quando comparados aos filtros de profundidade como porcelana ou material sinterizado. Como boa parte da superfcie da membrana um espao vazio ou aberto, a correta montagem e esterilizao do filtro proporcionam a vantagem de uma alta taxa de fluxo. Uma desvantagem que, devido fragilidade da membrana, deve-se garantir a ausncia de ruptura durante a montagem, esterilizao ou uso. O sistema de filtrao deve ser testado antes e aps o processo de filtrao para garantir a manuteno de sua integridade durante o processo de filtrao. Testes tpicos de uso incluem o teste do ponto de bolha, o teste de fluxo de ar difusivo, o teste de reteno sob presso e o teste de fluxo progressivo. O teste de ponto de bolha consiste em teste no destrutivo, cuja denominao decorre da visualizao de bolhas aps a aplicao de uma determinada presso sobre o filtro. Como exemplo, aps a filtrao de cerca de dois litros de gua destilada estril, aplica-se presso constante de nitrognio, durante 5 minutos para membranas de ster de celulose de 0,2m. Para cada tipo de filtro h um valor limite de presso a ser suportado, sem que apresente a formao de bolhas, indicando a resistncia do material filtrante. Os testes devem ser correlacionados com a reteno de microrganismos. Testes adicionais realizados pelo fabricante do filtro, como o de desafio microbiano, no so normalmente repetidos pelo usurio.
X.1.2.2 MTODO QUMICO X.1.2.2.1. GS XIDO DE ETILENO A esterilizao por gs pode ser o mtodo de escolha para materiais que no resistem a altas temperaturas como no processamento por calor seco ou calor mido. O agente ativo geralmente empregado na esterilizao por gs o xido de etileno. Entre as desvantagens deste agente esterilizante esto suas propriedades mutagnicas, a possibilidade de resduos txicos nos materiais tratados e sua natureza altamente inflamvel, exceto quando em certas misturas com gases inertes. O processo de esterilizao geralmente realizado em uma cmara pressurizada projetada de forma semelhante autoclave, mas com caractersticas especficas como sistema para degaseificao aps a esterilizao e minimizao da exposio dos operadores ao gs. O programa de qualificao do processo de esterilizao com xido de etileno mais amplo que de outros processos de esterilizao, visto que alm da temperatura, devem ser controlados a umidade, vcuo/presso positiva e a concentrao de xido de etileno. importante determinar e demonstrar que todos os parmetros crticos do processo esto adequados no interior da cmara de esterilizao durante todo o ciclo. Como os parmetros de esterilizao aplicados aos produtos a serem processados so crticos, recomendvel o pr-condicionamento da carga para minimizar o tempo de exposio temperatura requerida. O programa de validao geralmente realizado empregando o produto inoculado ou produto simulado inoculado com preparaes apropriadas como esporos de Bacillus atrophaeus. Os indicadores biolgicos normalmente so empregados para estabelecer a probabilidade final de sobrevivncia microbiana usando o conceito de ciclo fracionado para se projetar um ciclo de esterilizao com xido de etileno, e devem ser usados em cargas do produto ou produto simulado, com cmara cheia. O indicador biolgico deve ser empregado no monitoramento de ciclos de rotina, alm do planejamento do ciclo de esterilizao por xido de etileno. Outro aspecto importante do planejamento do processo de esterilizao a definio do tipo de acondicionamento do material a ser processado e sua distribuio na cmara de esterilizao, devido limitada capacidade de difuso do xido de etileno em reas mais internas do produto. X.1.3 VALIDAO DO PROCESSO DE ESTERILIZAO A validao deve demonstrar de forma documentada que o processo de esterilizao estabelecido ir consistentemente fornecer produtos que atendam o nvel de garantia de esterilidade requerido. Os produtos esterilizados no processo validado devem atender as especificaes pr-determinadas e as caractersticas de qualidade relacionadas funcionalidade e segurana. Uma vez o processo validado, o mesmo dever ser revalidado periodicamente e aps alteraes de produto, equipamentos e processo, que possam comprometer o nvel de garantia de esterilidade especificado. Os principais elementos da validao so: Qualificao de Instalao, Qualificao de Operao e Qualificao de Desempenho. X.1.3.1. QUALIFICAO DE INSTALAO O plano de qualificao de instalao deve fornecer evidncia documentada que o equipamento e todos os itens auxiliares foram fornecidos, instalados e funcionam de acordo com as especificaes. Deve-se demonstrar que o equipamento de esterilizao, seus componentes, itens auxiliares e suprimentos, como vapor, gua e ar, foram corretamente projetados, instalados e calibrados. A fim de atender aos parmetros e limites recomendados para a esterilizao, necessrio o emprego de instrumentao apropriada para monitorar e controlar os parmetros crticos como temperatura, tempo, umidade, concentrao do gs esterilizante ou radiao absorvida. Estes instrumentos devem ser avaliados na qualificao de instalao.
A qualificao de instalao compreende os seguintes elementos: equipamento, instalao e funo. No que se refere ao equipamento e instalao, as especificaes do esterilizador, itens auxiliares e servios, os procedimentos operacionais, a localizao de instalao e a documentao devem ser previamente definidas e verificadas na qualificao de instalao, garantido sua conformidade. Para garantir a funo, deve ser verificado que o equipamento e os sistemas de segurana operacional funcionam de acordo com suas especificaes, os ciclos de operao esto de acordo com o definido e que no h evidncia de vazamento das utilidades ou esterilizador, quando aplicvel. Os procedimentos documentados para a qualificao de instalao devem especificar como cada elemento da qualificao planejado, realizado e revisado. A documentao que suporta a qualificao de instalao inclui descrio das caractersticas fsicas e operacionais do equipamento, seus componentes e servios. Desenhos e diagramas de processo e instrumentao devem ser verificados contra a configurao proposta e atualizados, quando necessrio. Sistemas de segurana aplicveis devem ser avaliados para garantir desempenho, qualidade e segurana dos equipamentos e operadores. A qualificao da instalao necessria para novos equipamentos ou quando o esterilizador existente substitudo ou re-alocado. A qualificao deve ser refeita a intervalos de tempo definidos, e ao menos parcialmente quando ocorrerem modificaes que possam alterar a eficcia do processo de esterilizao, como substituio ou reforma de equipamentos ou partes, modificaes nos suprimentos de processo e alterao em fonte radioativa X.1.3.2. QUALIFICAO DE OPERAO A qualificao de operao deve demonstrar que o equipamento instalado capaz de realizar o processo de esterilizao especificado dentro dos intervalos definidos. O intervalo de parmetros e os limites de operao devem ser estabelecidos na definio do processo. Antes da qualificao de operao, o estado de calibrao de toda instrumentao usada para monitorar, controlar, indicar e registrar deve ser confirmado. Para autoclaves e outros esterilizadores que empregam processo trmico, devem ser realizados estudos de distribuio do calor em diferentes posies considerando o tamanho da cmara e a carga. Deve-se confirmar que a cmara (vazia e cheia) opera dentro dos parmetros crticos em todos os seus principais locais. O nmero e posio dos termopares so determinados pelo tipo e configurao da carga, tamanho de equipamento, tipo de instrumento e ciclo empregado. Uma faixa aceitvel de temperatura na cmara vazia 1 C quando a temperatura da cmara 121 C. Para esterilizadores a xido de etileno, a umidade relativa, concentrao do gs e a temperatura devem ser monitorados por sensores distribudos em posies adequadas. Sistemas de segurana aplicveis devem ser testados. Softwares de controle devem ser validados e desafiados em condies de falha. A penetrao e distribuio da radiao ionizante na carga deve ser realizada e monitorada por dosmetros. A operao de qualificao de filtros esterilizantes feita atravs do teste de integridade dos filtros, medidas de presso diferencial e velocidade de fluxo. Como os fluidos esterilizados por membranas filtrantes podem ser expostos ao ambiente durante o processamento seguinte, o controle ambiental e a qualificao e/ou validao da rea de manuseio assptico devem ser parte integrante do processo de esterilizao por filtrao. X.1.3.3. QUALIFICAO DE DESEMPENHO A qualificao de desempenho deve demonstrar que o processo de esterilizao capaz de atingir repetidamente o nvel de garantia de esterilidade pr-determinado para as cargas definidas de produtos, que o equipamento opera consistentemente de acordo com critrios pr-determinados e que o produto atende os requisitos especificados de segurana, qualidade e desempenho. A qualificao de desempenho compreende avaliaes fsicas e microbiolgicas que demonstrem a eficcia e reprodutibilidade do processo de esterilizao, mantendo as caractersticas especificadas do produto.
Nos estudos fsicos devem ser considerados critrios como carga teste representativa do processo, embalagem idntica ao produto, pr-condicionamento, perfil de temperatura e temperatura no ponto de referncia, resposta de indicadores qumicos, integridade de embalagem, documentao, entre outros. A carga para esterilizao deve ser estabelecida e documentada, levando em considerao parmetros como configurao, distribuio, orientao, densidade, dimenso, composio do material, uso e tipo de paletes. O produto ou material com caractersticas similares ao produto (produto simulado) usado para a qualificao deve ter embalagem idntica ao produto e representar no mnimo o pior caso da carga de rotina de produo, ou seja, a configurao mais difcil de esterilizar. Critrios para reutilizao de carga devem ser definidos, sendo que as mesmas devem ser equilibradas s condies ambientais ou aeradas antes do reuso. Os dados gerados devem demonstrar a conformidade com os parmetros fsicos e qumicos aplicveis. A relao entre as condies de posies de monitoramento durante a qualificao e a rotina devem ser estabelecidas. A qualificao de desempenho fsica deve demonstrar a reprodutibilidade do processo com mnimo de trs (3) ciclos consecutivos para verificar o atendimento de todos os critrios de aceitao. A qualificao microbiolgica deve seguir requisitos especficos para cada agente esterilizante. Diferentes mtodos podem ser usados na validao do processo de esterilizao e incluem trs (3) categorias: processo baseado na inativao da carga microbiana natural (biocarga), processo combinado com base na inativao de microrganismo referncia e conhecimento da carga microbiana (biocarga e indicador biolgico) e processo conservativo baseado na inativao de microrganismo referncia (sobremorte ou overkill). Indica-se que o desafio microbiano seja executado nos parmetros mnimos de processo e deve garantir o nvel de garantia de esterilidade para todas as combinaes de carga, podendo usar o pior caso de produto representante das famlias. Para cada tipo de carga a ser esterilizada, a reprodutibilidade do processo deve ser demonstrada empregando pelo menos trs ciclos consecutivos. Os indicadores biolgicos usados devem ser posicionados no e/ou sobre o produto em localizao definida. A qualificao de desempenho deve ser repetida quando alteraes significativas forem propostas, como mudanas em desenho e embalagem do produto, configurao ou densidade de carga e equipamento ou processo de esterilizao. Os efeitos destas mudanas nos estgios de validao do processo de esterilizao devem ser avaliados. X.1.4. REVISO E APROVAO DA VALIDAO A reviso documentada dos dados de validao gerados nas qualificaes de instalao, operao e desempenho deve ser feita para confirmar a aceitabilidade do processo de esterilizao e definir a especificao do processo, incluindo parmetros e tolerncia. O estgio final do programa de validao requer a documentao dos dados de apoio desenvolvidos na execuo deste programa. X.2. INDICADORES BIOLGICOS O indicador biolgico definido como uma preparao caracterizada de microrganismo especfico que fornece uma resistncia definida e estvel a um determinado processo de esterilizao. Bactrias formadoras de esporos so os microrganismos reconhecidos como apropriados para emprego como indicadores biolgicos uma vez que, com exceo da radiao ionizante, estes microrganismos so significativamente mais resistentes aos processos de esterilizao que os microrganismos da carga microbiana natural do produto. Um indicador biolgico pode ser usado na qualificao de desempenho do equipamento de esterilizao e no desenvolvimento e estabelecimento do processo de esterilizao para um produto especfico. Os indicadores biolgicos so usados em processos de obteno de produto estril em seu recipiente final e na esterilizao de equipamentos, materiais e componentes de embalagem empregados no processo assptico. Os indicadores biolgicos podem ainda ser utilizados para monitorar ciclos de esterilizao em revalidaes peridicas e para avaliar a capacidade do processo usado na descontaminao de isoladores ou salas limpas.
X.2.1. TIPOS DE INDICADORES BIOLGICOS H pelo menos trs tipos de indicadores biolgicos, sendo que cada tipo incorpora uma espcie microbiana com resistncia conhecida ao processo de esterilizao. Um tipo de indicador biolgico inclui os esporos que so adicionados a um suporte ou carreador (disco ou tira de papel de filtro, vidro, plstico ou outro material) embalado de forma a manter a integridade e viabilidade do material inoculado. Os carreadores e embalagens primrias no devem conter qualquer tipo de contaminao qumica, fsica ou microbiolgica que possa comprometer o desempenho e estabilidade do indicador biolgico e no podem sofrer alterao em funo do processo de esterilizao submetido. Os carreadores e embalagens primrias devem resistir ao transporte e manuseio at o momento do uso e devem evitar a perda do inculo original durante o transporte, manuseio e armazenamento at o vencimento do perodo de validade. Outro tipo de indicador biolgico consiste de uma suspenso de esporos inoculada em unidades representativas do produto a ser esterilizado. Quando no for possvel o emprego do produto real, pode-se inocular um produto simulado, que difere do produto real em algumas caractersticas, mas se comporta de forma semelhante quando submetido s condies de teste ou de esterilizao. Uma suspenso de esporos de valor D conhecido deve ser utilizada para inoculao do produto real ou simulado, garantindo que quando do uso do produto simulado, este no comprometa a resistncia do indicador biolgico. A configurao fsica do produto a ser inoculado (real ou simulado) pode afetar a resistncia da suspenso microbiana inoculada. No caso de produtos lquidos recomendvel a determinao do valor D e valor z do indicador biolgico no produto lquido especificado. A populao, valor D, valor z onde aplicvel e tempo de destruio do microrganismo devem ser determinados. Valor z a elevao de temperatura em graus necessria para reduzir o valor D em 90% ou produzir a reduo de um ciclo logartmico na curva de resistncia trmica.O terceiro tipo o indicador biolgico auto-contido, apresentado de tal forma que a embalagem primria destinada para incubao aps a esterilizao contenha o meio de crescimento requerido para a recuperao do microrganismo. Neste caso, o sistema constitudo pelo indicador biolgico e o meio de crescimento do microrganismo deve ser resistente ao processo de esterilizao e deve permitir a penetrao do agente esterilizante. O valor D, tempo de destruio do microrganismo e o tempo de sobrevivncia devem ser determinados para o sistema e no somente para a tira ou disco de papel que contm os microrganismos. Aps a esterilizao, as tiras ou discos contendo os microrganismos so colocados no meio de cultura por manipulao. O indicador biolgico auto-contido tambm pode consistir de uma suspenso de esporos em um meio de cultura contendo corante que indica a presena ou a ausncia de crescimento aps a incubao. A resistncia do sistema auto-contido dependente da penetrao do agente esterilizante na embalagem, que deve ser controlada pelo fabricante por meio do desenho e composio do material que constitui a embalagem, ampola ou recipiente. O indicador biolgico auto-contido na forma de ampola pode ser incubado diretamente aps a exposio ao processo de esterilizao, nas condies especificadas. A ausncia ou a presena do crescimento microbiano determinada visualmente, a partir da mudana de colorao de um indicador incorporado ao meio ou pela turbidez decorrente do desenvolvimento do microrganismo; ou ainda, pelo exame microscpico do meio inoculado. O indicador biolgico auto-contido deve suportar o transporte e o manuseio durante o uso sem que ocorram quebras ou perda do inoculo original. Durante ou aps o processo de esterilizao, o material do qual constitudo o sistema autocontido no deve reter ou liberar qualquer substncia que possa inibir o crescimento de microrganismos sobreviventes. A capacidade promotora de crescimento dos microrganismos do meio de cultura aps exposio ao processo de esterilizao deve ser comprovada. X.2.2. Preparao do Indicador Biolgico Todas as operaes envolvidas na preparao de indicadores biolgicos devem ser monitoradas atravs de um sistema da qualidade documentado que permita a rastreabilidade de todos os materiais e componentes incorporados suspenso microbiana, o carreador inoculado ou o indicador biolgico. A preparao de suspenses estoque dos esporos dos microrganismos selecionados como indicadores biolgicos requer o desenvolvimento de procedimentos apropriados incluindo seu cultivo, coleta, purificao e manuteno. As suspenses estoque devem conter, predominantemente, esporos latentes (no germinativos) mantidos em lquido no nutritivo. O produto final fornecido pelos fabricantes (suspenso microbiana, carreador inoculado ou indicador biolgico) no deve conter microrganismo
10
diferente do microrganismo-teste em nmero suficiente que possa afetar o produto. O sistema para minimizar a presena de microrganismos diferentes do microrganismo-teste deve ser validado, monitorado e registrado. X.2.3. Seleo do Indicador Biolgico para o processo de esterilizao A escolha do indicador biolgico requer conhecimento de sua resistncia ao processo de esterilizao especfico para garantir que o sistema do indicador biolgico proporciona desafio maior que o da carga microbiana presente no produto. O uso eficiente dos indicadores biolgicos para desenvolvimento do ciclo, processo e validao ou para monitoramento do processo de esterilizao de rotina requer conhecimento do material a ser esterilizado incluindo seus componentes e material de embalagem. Apenas indicadores biolgicos reconhecidos e especificados nas monografias devem ser usados no desenvolvimento ou validao de um processo de esterilizao para garantir que o indicador biolgico selecionado propicie um desafio maior ao processo de esterilizao do que a carga microbiana presente no produto. Nos casos do uso de indicadores biolgicos com caractersticas diferentes daqueles comercialmente disponveis, pode-se cultivar microrganismos descritos em literatura cientfica para preparo de indicadores biolgicos. O usurio deve ser capaz de determinar os valores D e z para os indicadores domsticos. Quando indicador biolgico no comercial for utilizado, a populao, pureza e validade devem ser confirmadas para garantir a validade dos testes a serem realizados usando este indicador. Quando a definio do processo de esterilizao baseada na carga microbiana do produto, esta deve ser quantificada e as resistncias do indicador biolgico e da carga microbiana devem ser comparadas. O processo de esterilizao deve resultar em nvel de garantia de esterilidade de no mnimo 10-6. O mtodo de sobremorte (overkill) pode ser empregado no desenvolvimento do processo de esterilizao e, neste caso, devem ser feitas consideraes especficas relacionadas suposta resistncia usada no estabelecimento dos requisitos de letalidade do processo. Em geral, os processos de sobremorte so desenvolvidos com a suposio de que a carga microbiana igual a 106 microrganismos altamente resistentes. Um processo 12 D definido como o processo que prov letalidade suficiente para reduo de 12 ciclos logartmicos, equivalente a 12 vezes o valor D para microrganismos com resistncia acima da resistncia mdia dos microrganismos presentes na carga microbiana do produto. Ao assumir uma carga microbiana de 106 um processo de sobremorte resultar em uma probabilidade de no esterilidade menor que 10-6. O uso do processo de sobremorte e sua validao podem minimizar ou evitar a necessidade de quantificao e identificao da carga microbiana do produto. Para o processo de calor mido, esporos de cepas apropriadas de Geobacillus stearothermophilus esto disponveis comercialmente como indicadores biolgicos. Outros microrganismos formadores de esporos resistentes ao calor mido como Clostridium sporogenes, Bacillus atrophaeus e Bacillus coagulans tambm podem ser utilizados no desenvolvimento e validao de um processo de esterilizao por calor mido. Para a validao do processo de esterilizao via calor seco, podem ser empregados esporos de Bacillus atrophaeus spp. Durante a validao podem ser realizados estudos para avaliao da despirogenizao no lugar da inativao microbiana, uma vez que a taxa de inativao de endotoxinas bacterinas bem mais lenta que a inativao dos esporos de Bacillus atrophaeus. Na prtica, uma reduo da ordem de pelo menos trs ciclos logartmicos do nvel de endotoxina resulta em uma probabilidade de no esterilidade menor que 10-6. Para monitorar os processos de esterilizao empregando radiao ionizante, esporos de Bacillus pumilus tm sido usados apesar de no ser prtica usual. O mtodo de estabelecimento da dose de radiao mais empregado no usa indicadores biolgicos. Alguns microrganismos presentes na carga microbiana do material a ser esterilizado podem apresentar maior resistncia ao processo de esterilizao por radiao em comparao com os esporos de Bacillus pumilus.
11
Para o processo de esterilizao por xido de etileno so comumente utilizados esporos de subespcies de Bacillus atrophaeus var. niger, quando se emprega xido de etileno 100% ou diferentes misturas de gases. Tabela 1 Caractersticas exemplificativas de sistemas de indicadores biolgicos disponveis Comercialmente
X.2.4. AVALIAO DE DESEMPENHO X.2.4.1. Responsabilidade do Fabricante So responsabilidades do fabricante: determinao e fornecimento das caractersticas de desempenho do lote de indicador biolgico por meio de certificado de anlise que ateste a validade do desempenho declarado na embalagem do produto; definio do processo de esterilizao para o qual o indicador biolgico recomendado; caracterizao de cada tipo de indicador biolgico, usando condies padronizadas e equipamentos adequados; valor D e o mtodo pelo qual este valor foi definido; contagem microbiana; estabilidade da resistncia at a validade indicada no rtulo; condies de armazenagem, incluindo temperatura e umidade relativa; orientaes sobre o meio de cultura a ser empregado e as condies de recuperao dos microrganismos aps a exposio ao processo de esterilizao e seu descarte X.2.4.2.Responsabilidade do Usurio - Produtos Comerciais Quando um indicador biolgico adquirido comercialmente, sua adequao para uso em um processo de esterilizao deve ter sido estabelecida em estudos, a no ser que existam dados disponveis para confirmar o emprego do indicador em um processo especfico. O usurio deve estabelecer dentro de sua instituio, os critrios de aceitao para os lotes do indicador biolgico. Ao adquirir um indicador biolgico, este deve vir acompanhado de um certificado emitido para cada lote. Se o indicador biolgico for empregado de forma diferente daquela indicada pelo fabricante, o usurio deve proceder ao registro das condies de uso, das verificaes e do desempenho do indicador biolgico. Aps o recebimento de um lote de indicador biolgico, o usurio deve quantificar a carga de esporos por unidade e proceder verificao da morfologia e pureza dos microrganismos, confirmando pelo menos o gnero do microrganismo. As informaes referentes ao valor D, s condies de armazenagem, ao prazo de validade e estabilidade do indicador biolgico devem ser observadas e registradas. O usurio pode considerar a necessidade de auditar o valor D antes da aceitao do lote de indicador biolgico.
12
Para armazenamento por longo perodo, importante verificar o valor D e a estabilidade da contagem. No caso de armazenamento da suspenso de esporos, por perodo superior a 12 meses, sob condies documentadas, a confirmao da contagem e a comprovao da resistncia dos esporos devem ser realizadas, a menos que o desempenho de uma cultura anterior tenha sido validado aps longo perodo de armazenamento. Os resultados dos ensaios de resistncia e contagem de esporos devem estar dentro da faixa de aceitao estabelecida durante a aprovao do lote de suspenso de esporos. - Produtos no comerciais O usurio pode decidir cultivar microrganismos para desenvolvimento de indicadores biolgicos a serem empregados no desenvolvimento ou na validao de um processo de esterilizao. No caso do usurio tornar-se um produtor, as exigncias de desempenho do indicador biolgico devem ser satisfeitas. Se um sistema de indicador biolgico for empregado para o desenvolvimento de um novo processo de esterilizao ou validao de um processo j existente, os mesmos critrios de desempenho para produtos comerciais devem ser cumpridos. X.2.4.3- Preparao da Suspenso de Esporos Os registros da identificao das suspenses de esporos devem ser mantidos por produtores comerciais ou no comerciais e devem incluir informaes sobre a fonte da cultura inicial de microrganismos; a identificao; a rastreabilidade da cultura-me de esporos, a frequncia de subcultura; o meio de cultura utilizado para a esporulao; as mudanas ocorridas na preparao do meio; as observaes sobre contaminao da suspenso; os dados anteriores e posteriores ao choque trmico; os registros do uso da suspenso de esporos e a resistncia esterilizao (particularmente, valores D e z, onde aplicvel). X.2.5. USO DE INDICADOR BIOLGICO PARA VALIDAO Independente do processo de esterilizao a ser empregado, a populao inicial de microrganismos, a sua resistncia ao processo esterilizante e o local de inoculao do produto podem influenciar a taxa de inativao do indicador biolgico. Durante o processo de validao, vrios locais do produto devem ser inoculados com o indicador biolgico, garantindo o desafio tanto da embalagem quanto do produto nela contido, para que se possa garantir um nvel de garantia de esterilidade de 10-6 para o produto e para a embalagem. Pode ser necessrio, por meio de estudos laboratoriais, determinar se os componentes do produto so mais difceis de esterilizar do que, por exemplo, uma soluo ou medicamento nele contido. A fase de qualificao de desempenho do produto deve identificar os parmetros mais importantes do processo para inativao dos microrganismos nos locais mais difceis de esterilizar. A sobrevivncia do indicador biolgico consequncia da resistncia e tamanho da populao microbiana. Portanto, nem sempre um indicador biolgico com populao de 106 necessrio para confirmar um nvel de garantia de esterilidade de 106. O uso apropriado dos indicadores biolgicos para confirmar que os parmetros estabelecidos no processo de esterilizao garantem o nvel de segurana de esterilidade desejado. Na esterilizao por calor mido, o emprego do indicador biolgico confirma a letalidade determinada por parmetros fsicos. Indicadores biolgicos com valor D relevante e populaes substancialmente menores que 106 so adequados para validar muitos processos de esterilizao e descontaminao. importante que os usurios estejam capacitados para justificar cientificamente a escolha de um indicador biolgico. X.3 PROCESSO ASSPTICO Embora a esterilizao terminal de um produto embalado seja o procedimento que garanta riscos mnimos de contaminao microbiana na produo de um lote, existem classes de produtos que no podem ser esterilizados no seu acondicionamento final e que devem ser preparados empregando processo assptico. Este processo projetado de forma a prevenir a contaminao dos componentes estreis por microrganismos viveis, ou ainda, na fase intermediria da produo, quando algum componente deve ser fornecido isento de microrganismos. Um produto definido como processado assepticamente consiste de componentes que foram esterilizados por um dos processos de esterilizao
13
como, por exemplo, a filtrao, no caso de tratar-se de um lquido. No caso de material de acondicionamento constitudo por vidro, pode ser empregado o calor seco e, quando se tratar de material de acondicionamento polimrico, como tampas, pode ser utilizada a autoclavao ou xido de etileno. No processo assptico, o ambiente onde os insumos so manipulados e a etapa de enchimento assptico so considerados pontos crticos. As exigncias para um projeto adequado validado e que mantenha as condies necessrias para o processo assptico abrangem um ambiente livre de microrganismos viveis, onde a qualidade do ar seja garantida por equipamentos adequados, por pessoal treinado e paramentado de acordo com as exigncias do ambiente e por operao a ser realizada. O ambiente desejado pode ser obtido por meio da tecnologia de filtrao do ar que propicia o fornecimento do ar com a qualidade microbiana exigida. O planejamento da planta deve proporcionar um sistema de cascata de fluxo de ar com presso positiva maior, das reas mais crticas (asspticas) para aquelas de exigncia intermediria (reas de preparao) e finalmente, aquelas de menor exigncia de controle; e ainda, deve permitir a troca freqente do ar, alm do emprego de fluxo de ar unidirecional na vizinhana imediata do produto ou componentes expostos e o controle da temperatura e umidade (quando aplicvel). As instalaes devem incluir sistemas de isolamento primrio (prximo ao produto) e secundrio (onde o processo assptico realizado) atravs de barreiras fsicas. As superfcies, como paredes e teto, devem ser lisas permitindo a sanitizao freqente. Os vestirios devem ter espao adequado para o pessoal e armazenamento das vestimentas estreis. O treinamento do pessoal, quanto paramentao, deve abranger o uso correto das vestimentas como, macaces, luvas e outros itens que propiciem a cobertura da superfcie do corpo. Todo o processo de sanitizao deve ser documentado. A certificao e a validao do processo e instalaes asspticas so realizadas por meio da confirmao da eficincia dos sistemas de filtrao, pelos procedimentos de monitoramento microbiolgico do ambiente e pela simulao de enchimento assptico do produto, empregando meio de cultura estril. O monitoramento da instalao assptica deve incluir o exame peridico de filtro ambiental, o monitoramento de rotina de material particulado e vivel e o enchimento simulado com meio de cultura estril. X.4. SALAS LIMPAS E AMBIENTES CONTROLADOS ASSOCIADOS Esta seo apresenta questes relacionadas ao processamento assptico de produtos com o estabelecimento, manuteno e controle da qualidade microbiolgica de salas e zonas limpas. Inclui a classificao desses ambientes controlados com base nos limites de contagem de partculas; no programa de avaliao microbiolgica para ambientes controlados; no treinamento de funcionrios; nos fatores crticos no projeto e implementao de um programa de avaliao microbiolgica; no desenvolvimento de um plano de amostragem; no estabelecimento de nveis microbiolgicos de alerta e ao; nas metodologias e equipamentos usados para amostragem microbiolgica; nos meios de cultura e diluentes usados; na identificao de isolados microbiolgicos e na avaliao operacional por meio do envase de meio de cultura (media fill). Media fill um teste para simulao das operaes asspticas em que o produto substitudo por um meio de cultura e serve para assegurar que os processos utilizados so capazes de produzir produtos estreis. H mtodos alternativos para avaliar e controlar o estado microbiolgico de salas e zonas limpas, com variedade de equipamentos e mtodos para amostragem microbiolgica. A aplicao imprpria de amostragem e anlises microbiolgicas pode causar variabilidade significativa e potencial para contaminao inadvertida. Meios de cultura, dispositivos de amostragem e mtodos aqui mencionados servem como referncia. Um grande nmero de produtos estreis fabricado por processamento assptico, que depende da excluso de microrganismos da linha de processamento e, portanto, a preveno da entrada dos microrganismos em recipientes abertos durante o envase e a carga microbiana do produto e do ambiente de fabricao so fatores importantes relacionados ao nvel de garantia de esterilidade destes produtos.
14
X.4.1. CLASSIFICAO DE SALAS LIMPAS E AMBIENTES CONTROLADOS ASSOCIADOS Sala limpa a sala na qual a concentrao de partculas em suspenso no ar controlada; construda e utilizada de maneira a minimizar a introduo, gerao e reteno de partculas dentro da sala, na qual outros parmetros relevantes, como, por exemplo, temperatura, umidade e presso, so controlados conforme necessrio.A classificao de limpeza do ar de salas e zonas limpas, por meio da anlise de concentrao de partculas em suspenso no ar, regulada pela norma ABNT NBR ISO 14644-1 Salas limpas e ambientes controlados associados Parte 1: classificao da limpeza do ar. Este documento se aplica a partculas suspensas no ar dentro de um ambiente controlado, mas no pretende caracterizar a natureza vivel ou no vivel das partculas. A aplicao dessa norma tem sido usada por fabricantes de salas e zonas limpas para orientar a construo, a preparao e a manuteno destas instalaes. Contudo, no fornece relao entre o nmero de partculas no viveis e a concentrao de microrganismos viveis. A indstria farmacutica se preocupa com a contagem de partculas viveis e, no caso de produtos injetveis, h preocupao adicional com a contagem de partculas totais. A justificativa de que, quanto menor o nmero de partculas presentes em uma sala limpa, menos provvel que microrganismos carreados pelo ar estejam presentes, aceitvel e orientativo no projeto, na construo e na operao de salas e zonas limpas. A Tabela 2 descreve as classes de limpeza de ar de acordo com a norma ABNT NBR ISO 14644-1, que est baseada em limites de partculas com tamanhos de 0,1 a 5m. A Tabela 3 mostra a relao entre os diferentes sistemas de classificao de salas limpas. aceitvel que, se um menor nmero de partculas estiverem presentes na sala limpa ou ambiente controlado, a contagem microbiana sob condies operacionais ser menor, desde que no haja mudanas no fluxo de ar, na temperatura e na umidade. Salas limpas so mantidas sob um estado de controle operacional com base em dados dinmicos (operacionais). Tabela 2. Classes de limpeza do ar para partculas em suspenso, selecionadas para salas e zonas limpas
Tabela 3. Comparao entre os diferentes sistemas de classificao de limpeza de ar.

OMS e EEC (GMP) Classe A Classe B Classe C Classe D Estados Unidos (habitual) Classe 100 Classe 100 Classe 10,000 Classe 100,000 ISO 5 ISO 5 ISO 7 ISO 8 ISO
15
X.4.2. PROGRAMA DE AVALIAO MICROBIOLGICA PARA SALAS LIMPAS E AMBIENTES CONTROLADOS ASSOCIADOS O monitoramento de partculas totais em suspenso no ar em salas e zonas limpas no fornece informao sobre o contedo microbiolgico do ambiente. A limitao bsica dos contadores de partculas que normalmente medem partculas de 0,5m ou maiores e os microrganismos carregados pelo ar no so clulas que flutuam livremente, no esto sozinhas e freqentemente se associam com partculas de 10 a 20m. Contagens de partculas, bem como, contagens microbianas dentro de salas e zonas limpas, variam com as atividades conduzidas durante a amostragem e a sua localizao. O monitoramento do ambiente para partculas no viveis e microrganismos importante porque ambos so necessrios para alcanar as exigncias relativas ao material particulado e esterilidade estabelecidas para os produtos. Programas de monitoramento microbiolgico para salas e zonas limpas devem avaliar a efetividade das prticas de limpeza e desinfeco que podem ter impacto sobre a carga microbiana do ambiente. O monitoramento microbiolgico normalmente no identifica e quantifica todos os contaminantes microbianos presentes nos ambientes; porm, o monitoramento de rotina deve fornecer informao suficiente para se certificar de que o ambiente esteja operando dentro do estado de controle adequado. O monitoramento microbiolgico ambiental e a anlise de dados realizados por pessoas qualificadas permitem que o estado de controle seja mantido em salas e zonas limpas. O ambiente deve ser amostrado durante operaes normais para permitir a coleta de dados significativos e a amostragem microbiana deve ocorrer quando os materiais estiverem na rea, as atividades de processamento estiverem ocorrendo e todos os funcionrios estiverem em operao no local. O monitoramento microbiolgico de salas e zonas limpas deve incluir a avaliao microbiolgica ambiental,, do ar comprimido que entra na rea crtica, das superfcies, dos equipamentos, dos recipientes, dos pisos, das paredes e das vestimentas das pessoas. O objetivo do programa obter estimativas representativas da carga microbiana do ambiente e, uma vez compilados e analisados, quaisquer tendncias devem ser avaliadas por pessoas treinadas. importante rever resultados ambientais com base em freqncia especificada, bem como rever resultados por perodos prolongados para determinar se h tendncias presentes. Tendncias podem ser visualizadas atravs de quadros de controle estatstico que incluem nveis de alerta e de ao. O controle microbiolgico de ambientes controlados tambm pode ser avaliado com base nos dados de tendncia. Relatrios ou resumos peridicos devem ser emitidos para alertar o responsvel pela rea. Quando o nvel microbiolgico especificado para um ambiente controlado for excedido, uma reviso da documentao e investigao deve ocorrer. A investigao deve incluir a reviso da documentao de manuteno da rea; da documentao de desinfeco; dos parmetros fsicos ou operacionais inerentes, tais como, mudanas na temperatura ambiental e umidade relativa e o estgio de treinamento dos funcionrios envolvidos. Em seguida investigao, as aes adotadas podem incluir o reforo no treinamento das pessoas para enfatizar o controle microbiolgico do ambiente; a amostragem adicional em freqncia aumentada; a desinfeco adicional; os testes adicionais de produto; a identificao do contaminante microbiano e sua possvel fonte e a reavaliao e revalidao dos atuais procedimentos operacionais padronizados, se necessrio. Com base na reviso da investigao e nos resultados dos testes, o significado do nvel microbiolgico excedido e a aceitabilidade das operaes ou produtos processados sob aquela condio podem ser definidos. Toda investigao e justificativa das aes devem ser documentadas e fazer parte do sistema de gerenciamento da qualidade. Sala e zona limpa so definidas por certificao de acordo com a norma aplicvel, sendo que os parmetros avaliados incluem integridade de filtros, diferenciais de presso e velocidade, padres e mudanas do ar. Um exemplo de mtodo para conduzir o teste de desafio de partculas para o sistema consiste em aumentar a concentrao de partculas no ambiente atravs de fumaa no entorno de reas de trabalho crticas e visualizar os movimentos do ar. A presena de vrtices e zonas turbulentas podem ser visualizadas e o padro de fluxo de ar pode ser finamente ajustado para eliminar ou minimizar efeitos indesejveis. Esta avaliao feita sob condies de produo simuladas; porm, com equipamentos e funcionrios no local.
16
O teste e a otimizao apropriados das caractersticas fsicas da sala limpa ou ambiente controlado so essenciais antes da concluso da validao do programa de monitoramento microbiolgico. A garantia de que o ambiente est operando adequadamente e de acordo com suas especificaes dar maior garantia de que a carga microbiana do ambiente ser apropriada para processamento assptico. Esses testes devem ser repetidos durante a certificao de rotina da sala ou zona limpa e sempre que alteraes consideradas significativas forem feitas na operao, tais como, mudanas no fluxo de pessoas, processamento, operao, fluxo de material, sistemas de manipulao de ar ou layout de equipamentos. X.4.3. TECNOLOGIAS ALTERNATIVAS PARA PROCESSO ASSPTICO Devido forte correlao entre o envolvimento e interveno humanos e o risco potencial para contaminao de produto no envase assptico, sistemas de produo onde pessoas so removidas das zonas crticas tm sido implementados, empregando, portanto, estratgias avanadas de processamento assptico, com requisitos reduzidos de monitoramento ambiental de partculas viveis e no-viveis. Seguem algumas definies de sistemas usados para reduzir a taxa de contaminao no processo assptico: Barreiras: dispositivo que restringe o contato entre o operador e o campo assptico fechado pela barreira. Barreiras no podem ser esterilizadas e nem sempre possuem sistemas de transferncia que permite a passagem de materiais para dentro ou fora do sistema sem exposio ao ambiente ao redor. H diferentes tipos de barreiras, desde cortinas de plstico em zonas crticas at barreiras rgidas em equipamentos, que podem incorporar elementos como suporte de luvas e porta de transferncia. Sopro/Enchimento/Selagem (Blow/Fill/Seal): este sistema combina o sopro do recipiente com o envase do produto e a selagem em um nico equipamento. Do ponto de vista microbiolgico, a sequncia de formao do recipiente, envase do produto estril e a formao e aplicao do selo so obtidos assepticamente em uma operao ininterrupta com exposio mnima ao ambiente. Estes sistemas existem h muitos anos e mostram taxas de contaminao menores que 0,1%. Isoladores: tecnologia usada para dupla proposta, de proteger o produto da contaminao do ambiente e pessoas durante envase e fechamento e de proteger pessoas de produtos txicos ou deletrios durante sua produo. Esta tecnologia baseada no princpio de colocar materiais previamente esterilizados, como recipientes, produtos e tampas, em um ambiente estril, que permanecem estreis durante toda operao, uma vez que pessoas ou componentes no-estreis no esto dentro do isolador. A barreira do isolador uma barreira absoluta que no permite trocas entre ambientes protegidos e no protegidos. Isoladores podem ser fisicamente selados contra a entrada de contaminantes externos ou pode ser efetivamente selados pela aplicao contnua de sobrepresso. Manipulao de material por funcionrios realizada atravs de luvas ou vestimentas completas ou parciais. O ar que entra no isolador passa atravs de um filtro HEPA ou ULPA e a exausto de ar normalmente passa por um filtro HEPA. Vapor de perxido de hidrognio ou cido peractico normalmente so usados para esterilizao das superfcies ou ambiente interno. A esterilizao do interior dos isoladores e todo contedo so normalmente validados para um nvel de garantia de esterilidade de 10-6. A introduo de equipamentos, componentes e materiais pode ser feita de diversas maneiras, como uso de autoclave de porta dupla, introduo contnua de componentes atravs de uma esteira que passa por tnel de esterilizao ou uso de um sistema de doca. necessrio monitorar a integridade, calibrao e manuteno do isolador. Os requisitos para os ambientes controlados adjacentes a estas novas tecnologias usadas no processamento assptico dependem do tipo de tecnologia usada. Equipamentos de Sopro/Enchimento/Selagem que limitam o contato do operador com o produto podem ser instalados em um ambiente controlado, especialmente se alguma interveno do operador possvel durante a produo.
17
Sistemas de barreiras requerem alguma forma de ambiente controlado. Em funo dos numerosos tipos e aplicaes, os requisitos para o ambiente adjacente podem variar. As estratgias de desenho e operao para o ambiente onde circulam estes sistemas devem ser desenvolvidas pelos produtores usando um critrio lgico e racional e a capacidade do sistema de fornecer produtos estreis deve ser validada de acordo com critrios pr-estabelecidos. Em isoladores, o ar entra atravs dos filtros integrais de qualidade HEPA, ou melhor, e seu interior tipicamente esterilizado com um nvel de garantia de esterilidade de 10-6. Portanto, isoladores que contm ar estril no trocam ar com o ambiente ao redor e so livres de operadores humanos. Entretanto, quando o isolador est em um ambiente controlado, o potencial de produto contaminado reduzido na eventualidade de um vazamento nas luvas ou vestimentas. A extenso e escopo do monitoramento microbiolgico ambiental dependem do sistema utilizado. Produtores devem balancear a freqncia da amostragem ambiental que requer interveno humana, com os benefcios acumulados pelos resultados do monitoramento. Uma vez que barreiras so desenhadas para reduzir a interveno humana, sistemas de amostragem remotos devem ser usados em substituio a interveno de pessoas. Em geral, uma vez que a validao estabeleceu a eficcia da barreira, a freqncia de amostragem para monitorar o estado microbiolgico da rea de processamento assptico pode ser reduzida quando comparada freqncia de um sistema clssico de processo assptico. Sistemas de isoladores requerem freqncia menor de monitoramento microbiolgico. O monitoramento contnuo de partculas totais pode fornecer garantia de que o sistema de filtrao de ar dentro do isolador est funcionando adequadamente. Mtodos tradicionais para amostragem microbiolgica quantitativa do ar podem no ser suficientes para testar o ambiente dentro do isolador. Experincias com isoladores indicam que, sob condies normais de operao, vazamento ou rompimento nas luvas representam o maior potencial para contaminao microbiolgica, o que requer testes freqentes de integridade das luvas e monitoramento das superfcies das luvas. O monitoramento no freqente de superfcies dentro do isolador deve ser avaliado e pode ser benfico. X.4.4. TREINAMENTO DE FUNCIONRIOS Produtos processados assepticamente exigem muita ateno aos detalhes, disciplina rigorosa e superviso estrita das pessoas, a fim de manter o nvel de qualidade ambiental apropriado para a garantia de esterilidade do produto final. O treinamento de todos os funcionrios que trabalham em salas e zonas limpas crtico. Este treinamento tambm importante para as pessoas responsveis pelo programa de monitoramento microbiolgico, uma vez que a contaminao da rea de trabalho pode ocorrer inadvertidamente durante a amostragem microbiolgica, por uso de tcnicas imprprias. Em operaes altamente automatizadas, o monitoramento pode ser realizado por pessoas que tm contato mais direto com zonas crticas dentro da rea de processamento. O monitoramento dos funcionrios deve ser conduzido antes e depois do trabalho na rea de processamento. O gerenciamento da instalao deve garantir que todas as pessoas envolvidas em operaes nas salas e zonas limpas conheam princpios microbiolgicos relevantes, incluindo princpios bsicos do processamento assptico e a relao dos procedimentos de fabricao e manipulao com fontes potenciais de contaminao do produto. Tambm devem ter conhecimento sobre princpios bsicos de microbiologia; fisiologia microbiana; desinfeco e limpeza; seleo e preparao de meios de cultura; taxonomia e esterilizao, de acordo com o envolvimento dos funcionrios no processo. As pessoas envolvidas na identificao microbiana requerem treinamento especializado nos mtodos laboratoriais aplicveis. Treinamento adicional no gerenciamento dos dados ambientais coletados deve ser fornecido. Conhecimento e compreenso dos procedimentos operacionais padro aplicveis so crticos, especialmente aqueles relacionados com as medidas corretivas que so tomadas quando as condies ambientais exigirem. A compreenso das polticas de adeso s exigncias regulatrias e a responsabilidade de cada indivduo relativas s boas prticas de fabricao devem ser parte integrante do programa de treinamento, bem como treinamento sobre como conduzir investigaes e analisar dados.
18
O controle da contaminao microbiana associada com as pessoas um dos elementos mais importantes do programa de controle ambiental. A contaminao pode ocorrer a partir da disseminao de microrganismos por indivduos, particularmente aqueles com infeces ativas e, portanto, apenas indivduos saudveis devem ser autorizados a acessar ambientes controlados. A boa higiene pessoal e ateno cuidadosa nos detalhes dos procedimentos de paramentao assptica so itens importantes. Os funcionrios apropriadamente paramentados devem ser cuidadosos em manter a integridade de suas luvas e aventais durante todo o perodo de permanncia.nos ambientes controlados. Como o programa de monitoramento ambiental no capaz de detectar todos os eventos do processamento assptico que poderiam comprometer a qualidade microbiolgica do ambiente, estudos peridicos de envase de meio de cultura ou simulao de processo so necessrios para garantir que os controles operacionais apropriados e treinamento sejam efetivamente mantidos. X.4.5. PROJETO E IMPLANTAO DO PROGRAMA DE CONTROLE MICROBIOLGICO AMBIENTAL responsabilidade do fabricante, desenvolver, iniciar, implantar e documentar um programa de monitoramento microbiano ambiental que seja capaz de detectar um curso adverso nas condies microbiolgicas a tempo de permitir aes corretivas significativas e efetivas. imperativo que o programa seja feito sob medida para as condies e instalaes especficas. Um meio de cultura de crescimento microbiolgico geral como o meio de digesto de casena de soja, deve ser adequado na maioria dos casos. Este meio pode ser suplementado com aditivos para contornar ou minimizar os efeitos dos agentes desinfetantes ou de antibiticos, se usados ou processados nestes ambientes. A deteco e quantificao de leveduras e fungos devem ser consideradas. Meios geralmente aceitos so tais como sabouraud, sabouraud modificado ou gar inibidor de fungos. Outros meios validados para promover o crescimento de fungos podem ser usados, tal como Agar digesto casena de soja. Em geral, a anlise de anaerbios obrigatrios no realizada na rotina, a no ser que condies ou investigaes exijam. A capacidade dos meios de cultura selecionados para detectar e quantificar os microrganismos anaerbios ou micro-aerfilos deve ser avaliada. A seleo de tempo e temperatura de incubao feita uma vez que os meios apropriados tenham sido selecionados. Tipicamente, temperaturas de incubao nos intervalos de 22,5 2,5 C e 32,5 2,5 C tm sido usadas com tempos de incubao de 72 e 48h, respectivamente. Os processos de esterilizao usados para preparar meios de cultura para o programa ambiental devem ser validados e devem ser examinados para esterilidade e promoo de crescimento. Os meios devem ser capazes de manter o crescimento quando inoculados com menos de 100 UFC. O programa de controle ambiental deve incluir identificao e avaliao dos locais de amostragem e validao dos mtodos de amostragem microbiolgica do ambiente. X.4.6. PLANO E LOCAIS DE AMOSTRAGEM Durante a fase inicial ou preparao de uma sala limpa ou outro ambiente controlado, locais especficos para amostragem de ar ou de superfcies devem ser determinados. Deve-se considerar a proximidade do produto e se o ar e as superfcies esto em contato com um produto ou superfcies sensveis dos sistemas de fechamento dos recipientes. Tais reas devem ser consideradas crticas, requerendo mais monitoramento do que as reas sem contato com o produto. Em uma operao de envase de produto parenteral, reas de operao incluiriam tipicamente o fornecimento de tampas para o recipiente, rotas dos recipientes abertos e outros objetos inanimados que os funcionrios manipulam rotineiramente. A freqncia de amostragem depender da criticidade dos locais especificados e o tratamento subseqente recebido pelo produto depois de ter sido assepticamente processado. medida que intervenes manuais durante a operao e o potencial de contato pessoal com o produto aumentam, a importncia relativa do programa de monitoramento ambiental tambm aumenta. O monitoramento ambiental mais crtico para produtos que so processados assepticamente do que para produtos que sofrem esterilizao terminal. A determinao e quantificao de microrganismos resistentes ao tratamento de esterilizao so mais crticas do que o monitoramento microbiolgico dos ambientes
19
circundantes de fabricao. Se o ciclo de esterilizao terminal no se basear no conceito do ciclo de sobremorte, o valor do programa de carga microbiana anterior esterilizao crtico. Os planos de amostragem devem ser dinmicos com freqncias de monitoramento e localizaes ajustados com base no desempenho de tendncia. apropriado aumentar ou diminuir a amostragem com base neste desempenho. X.4.7. LIMITES MICROBIOLGICOS DE ALERTA E AO EM SALAS E ZONAS LIMPAS Os princpios e conceitos de controle de processos estatsticos so teis para estabelecer nveis de alerta e ao e para reagir a tendncias. O nvel de alerta no monitoramento microbiolgico ambiental aquele nvel de microrganismos que mostra um significado potencial a partir de condies de operao normais. Exceder o nvel de alerta no necessariamente a base para a ao corretiva definitiva, porm deve pelo menos levar a uma investigao de acompanhamento documentada que pode incluir modificaes no plano de amostragem. O indicativo de ao em monitoramento microbiolgico ambiental aquele nvel de microrganismos que quando excedido requer acompanhamento imediato e, se necessrio, ao corretiva. Nveis de alerta se baseiam normalmente em informaes histricas obtidas de operaes de rotina do processo em um ambiente controlado especfico. Em uma instalao nova, estes nveis geralmente se baseiam na experincia anterior de instalaes e processos similares; e, dados obtidos no decorrer de vrias semanas Esses nveis so normalmente reexaminados para adequao a uma freqncia estabelecida. Quando os dados histricos demonstram condies melhoradas, estes nveis podem ser modificados para refletir as condies. Tendncias que mostram uma deteriorao da qualidade ambiental requerem ateno para determinar a causa atribuvel e para instituir um plano de ao corretiva, a fim de trazer as condies de volta aos nveis esperados. Contudo, uma investigao deve ser implementada, e uma avaliao do impacto potencial sobre o produto deve ser feita. X.4.8. METODOLOGIAS E EQUIPAMENTOS USADOS PARA MONITORAMENTO AMBIENTAL Microrganismos viveis no ar podem influenciar a qualidade microbiolgica dos produtos fabricados em salas e zonas limpas. A quantificao destes microrganismos pode ser afetada por instrumentos e procedimentos utilizados para realizar os ensaios e sempre que mtodos ou equipamentos alternativos so utilizados deve-se verificar a equivalncia geral dos resultados obtidos. H diferentes formas de monitoramento de tipos de equipamentos disponveis para quantificar microrganismos viveis, incluindo amostradores de sedimentao, de impacto e centrfugos. A seleo e adequao do mtodo a ser utilizado responsabilidade do usurio. O mtodo que utiliza as placas de sedimentao amplamente utilizado, simulando a exposio do produto contaminao ambiental, tendo como vantagens simplicidade operacional e baixo custo. Fornece informaes qualitativas sobre o ambiente de exposio por tempo prolongado, porm, no permite a avaliao quantitativa dos nveis de contaminao microbiana de ambientes crticos. Na monitorao ativa emprega-se amostradores de ar mecnicos nos quais a limitao o tamanho da amostra de ar que est sendo testada, pois o nvel de microrganismos no ar de um ambiente controlado normalmente reduzido e um grande volume de ar deve ser testado para que o resultado seja preciso e exato, o que muitas vezes no prtico. Para demonstrar que as contagens microbianas presentes no ambiente no esto aumentando depois da amostragem, a mesma pode ser estendida para determinar se o tempo de amostragem um fator limitante para obter uma amostra representativa. H equipamentos capazes de amostrar altas taxas de volume de ar, mas deve-se considerar a ruptura do fluxo de ar em reas crticas ou a criao de turbulncia que possam aumentar a probabilidade de contaminao.
20
Amostradores centrfugos demonstram seletividade para partculas maiores e, portanto, o uso destes equipamentos pode resultar em contagens maiores de partculas no ar. Ao usar estes amostradores, deve-se considerar seu efeito na linearidade do fluxo de ar na zona controlada onde posicionado para a amostragem. A utilizao de sondas remotas requer que seja determinado se o tubo extra usado no tem efeito adverso na contagem de partculas viveis, pois este efeito deve ser eliminado, ou um fator de correo deve ser usado para os resultados obtidos. X.4.9. METODOLOGIAS E EQUIPAMENTOS USADOS PARA MONITORAMENTO DE PARTCULAS VIVEIS EM SUPERFCIES A amostragem de superfcies de equipamentos, de reas e de funcionrios um componente do programa de controle microbiolgico de ambientes controlados. Para minimizar a ruptura de operaes crticas, normalmente a amostragem realizada no final das operaes. A amostragem pode ser feita usando placas de contato ou swab. O monitoramento realizado normalmente nas reas que entram em contato com o produto e em reas adjacentes. Placas de contato com gar nutriente so usadas para amostrar reas planas e so incubadas em temperatura adequada para quantificao de partculas viveis. gar especfico pode ser usado para quantificar fungos, esporos, etc. O swab empregado em superfcies irregulares, especialmente em equipamentos. O swab colocado em um diluente adequado e a estimativa de contagem microbiana feita plaqueando uma alquota apropriada em agar nutriente especfico. A rea a ser amostrada usando swab definida usando um molde de tamanho apropriado estril, em geral entre 24 a 30 cm2. O resultado dado por placa de contato ou por swab. X.4.10. MEIOS DE CULTURA E DILUENTES PARA AMOSTRAGEM E QUANTIFICAO DE PARTCULAS VIVEIS Os meios de cultura e diluentes usados para amostragem e quantificao de microrganismos em salas e zonas limpas dependem dos procedimentos e equipamentos usados. O gar casena de soja o meio slido normalmente usado, mas h diferentes meios e diluentes disponveis para diferentes propostas. Meios alternativos devem ser validados para a proposta usada. Quando se usa desinfetantes ou antibiticos na rea controlada, deve-se considerar o uso de meios com agentes inativantes apropriados. X.4.11. IDENTIFICAO DE ISOLADOS MICROBIANOS O programa de controle ambiental inclui um nvel apropriado de identificao da flora obtida na amostragem. O conhecimento da flora normal das salas e zonas limpas importante para definir o monitoramento da rea e mtodos de recuperao e para avaliar a eficcia dos mtodos, procedimentos e agentes de limpeza e desinfeco. A informao obtida pelo programa de identificao pode ser til na investigao de fontes de contaminao, especialmente quando os limites de ao so excedidos. A identificao de microrganismos isolados de reas crticas importante. X.4.12. AVALIAO OPERACIONAL DO ESTADO MICROBIOLGICO DE PRODUTOS ENVASADOS ASSEPTICAMENTE Salas e zonas limpas so monitoradas por um programa de monitoramento ambiental apropriado. Para garantir carga microbiana mnima, informao adicional na avaliao do estado microbiolgico do ambiente pode ser obtida por meio do teste de envase assptico de meio de cultura ( media fill). O teste de media fill empregado para avaliar o processamento assptico usando meio de cultura estril no lugar do produto. Resultados satisfatrios de media fill demonstram a adequao da linha para a fabricao do produto. Um media fill aceitvel demonstra a adequao da da linha para a fabricao do produto. Entretanto, outros fatores so importantes, como construo das reas, monitoramento ambiental e treinamento de pessoas. Quando um processo assptico desenvolvido e instalado, necessrio qualificar o estado microbiolgico do processo, realizando no mnimo 3 media fill consecutivos. Os problemas no desenvolvimento do programa de media fill a serem considerados compreendem
21
procedimentos do envase do meio; seleo do meio; volume de envase; tempo e temperatura de incubao; inspeo de unidades envasadas; interpretao de resultados e possveis aes corretivas requeridas. Uma vez que o media fill realizado para simular o processamento assptico de um produto, importante que seja realizado em condies normais de produo. Isto inclui nmero mximo de pessoas e uso de todas as etapas e materiais usados no processo de produo normal. Durante a conduo do media fill, intervenes pr-documentadas conhecidas devem ser planejadas durante as corridas normais de produo, como troca de bicos de envase, componentes de fixao, etc. Alternativamente, para adicionar uma margem de segurana, uma combinao de condies possveis pode ser usada e exemplos incluem paradas freqentes; reparos no esperados; troca de filtros, etc. A qualificao de um processo assptico deve ser feita para todos os produtos e para cada linha. Desde que a geometria do recipiente (como tamanho e abertura) e a velocidade da linha sejam fatores que so variveis. A combinao apropriada destes fatores, preferencialmente nos extremos, devem ser usados na qualificao. Uma anlise racional dos produtos usados deve ser documentada. Recomenda-se que o media fill seja realizado para cobrir todos os turnos de produo para linha/produto/combinaes de recipientes para qualificao inicial e revalidaes peridicas. O programa de media fill deve simular prticas de produo em tempos prolongados e pode ser realizado no final do turno de produo. Meios de cultura ricos podem ser usados, como caldo de soja casena. Aps o processamento assptico do meio de cultura, estes devem ser incubados a 22,5 2,5 C ou 32,5 2,5 C, por no mnimo 14 dias. Se duas temperaturas forem usadas para a incubao das amostras de meio de cultura, estes devem ser incubados no mnimo 7 dias em cada uma delas. Aps incubao, as amostras devem ser inspecionadas para crescimento. Isolados devem ser identificados para gnero e, quando possvel, para espcie a fim de propiciar a investigao das fontes de contaminao. Pontos crticos na realizao do media fill so nmero de recipientes para qualificar o processo assptico, nmero de unidades enchidas para o media fill, interpretao de resultados e implementao de aes corretivas. Normalmente 3 corridas de media fill so usadas para qualificao inicial ou incio de uma rea para demonstrar consistncia na linha de envase assptico. O nmero mnimo para demonstrar a taxa de contaminao de no mais que 0,1%, critrio de aceitao para corrida de media fill, de no mnimo 3.000 unidades. Plantas pilotos que preparam pequenos lotes podem usar nmero menor de unidades. Uma vez que os funcionrios so uma fonte crtica de contaminao em salas limpas, documentao visual pode ser til para verificar correlao de atividades de produo com eventos de contaminao. X.5.PROCEDIMENTOS DE LIBERAO Deve ser estabelecido um programa de garantia da qualidade que descreva em detalhes os passos e a documentao requerida para a liberao da carga ou lote. A liberao dos produtos esterilizados depender de liberao convencional. A Farmacopia Brasileira est comprometida a desenvolver trabalhos que disciplinem a questo da liberao paramtrica, devendo o assunto ser abordado em prximas edies. DOSEAMENTO DA HEPARINA NOS FATORES DA COAGULAO A heparina dosada sob a forma de um complexo antitrombina III (AT) via inibio da atividade do Fator Xa da coagulao. Na mistura reativa mantido um excesso de AT para garantir uma concentrao constante do complexo heparina-AT. O Fator Xa neutralizado pelo complexo heparinaAT e o Fator Xa residual hidrolisa um substrato cromognico peptdico especfico libertando um cromforo. A quantidade do cromforo inversamente proporcional atividade da heparina. Substrato cromognico para o Fator Xa. Substrato cromognico especfico do Fator Xa tal como: o cloridrato de N-benzoil-L-isoleucil-L-glutamil-glicil-L-arginina-4-nitro-anilida. Reconstitua de acordo com as instrues do fabricante.
22
Tampo de diluio. Soluo de tris(hidroximetil)aminometano a 6,05 g/l. Se necessrio, ajuste para pH 8,4 com cido clordrico. Soluo problema. Dilua a amostra com o tampo de diluio de modo a obter uma soluo que supostamente contenha 0,1 U.I. de heparina por mililitro. Soluo de referncia. Dilua a preparao de referncia da heparina com o tampo de diluio de modo a obter uma soluo que contenha 0,1 U.l. de heparina por mililitro. As condies descritas so aplicveis s placas de microtitulao. Se o ensaio realizado em tubos, ajuste os volumes de modo a manter as propores na mistura. Pouco tempo antes do ensaio, colocar todas as solues a 37C em banho Maria. Distribua numa srie de poos 20 l de plasma humano normal e 20 l de soluo de antitrombina III. Juntar aos poos uma srie de volumes (20 l, 60 l, 100 l e 140 l) da soluo problema ou da soluo de referncia e completar o volume de cada poo com 200 l utilizando o tampo de diluio (0,02-0,08 U.I. de heparina por mililitro na mistura reativa final). Mtodo do ponto de equivalncia. Transfira 40 l de cada poo para uma segunda srie de poos, juntar 20 l da soluo do Fator Xa bovino e incubar a 37C durante 30 segundos. Juntar 40 l de soluo do substrato cromognico do Fator Xa a 1 mmol/l e incubar a 37C, durante 3 min. Parar a reao diminuindo o pH com um reagente apropriado tal como uma soluo a 20 % (V/V) de cido actico glacial e mea a absorbncia a 405 nm (V.2.14.). O tempo de reao geralmente da ordem de 3 minutos a 15 minutos, mas so toleradas certas variaes se elas permitirem melhorar a linearidade da curva dose/resposta. Mtodo cintico. Transfira 40 l de cada poo para uma segunda srie de poos, juntar 20 l da soluo bovina do Fator Xa e incubar a 37C durante 30 segundos. Juntar 40 l da soluo do substrato cromognico do Fator Xa a 2 mmol/l, incubar a 37C e determinar a velocidade de clivagem do substrato procedendo leitura contnua da variao de absorbncia a 405 nm (V.2.14) permitindo, assim, calcular a velocidade inicial de clivagem do substrato. Esta velocidade deve ser proporcional concentrao residual do Fator Xa. Verificar a validade do ensaio e calcular a atividade da heparina da amostra pelos procedimentos estatsticos aplicveis aos ensaios biolgicos (VI.). DOSEAMENTO DOS FATORES DA COAGULAO ATIVADOS Se a amostra contiver heparina, determine a quantidade existente, como se indica no ensaio da Heparina (V.5.2.6.), e neutralize-a juntando sulfato de protamina (10 g de sulfato de protamina neutralizam 1 U.I. de heparina). Com a soluo tampo de tris (hidroximetil) aminometano de pH 7,5, prepare diluies a 1/10 e 1/100. Coloque uma srie de tubos de poliestireno em banho Maria a 37C. Introduza em cada tubo 0,1 ml de plasma pobre em plaquetas e 0,1 ml de uma diluio apropriada de reagente de cefalina ou de uma preparao fosfolipdica que atue como substituto de plaquetas. Deixe em repouso durante 60 s e junte a cada tubo 0,1 ml de uma das diluies e para o tubo de ensaio em branco 0,1 ml da soluo tampo. Junte imediatamente a cada tubo 0,1 ml de uma soluo de cloreto de clcio a 3,7 g/l, previamente aquecida a 37C, e determine o intervalo de tempo entre a adio da soluo de cloreto de clcio e a formao do cogulo, esta determinao realizada nos 30 min que se seguem primeira diluio. O ensaio s vlido se o tempo de coagulao do ensaio em branco for de 200 a 350 s. DOSEAMENTO DO FATOR II DA COAGULAO SANGUINEA HUMANA O doseamento do Fator II da coagulao humana realizado aps ativao especfica em Fator IIa. O Fator IIa calculado comparando a sua atividade em um substrato cromognico peptdico especfico com a mesma atividade do padro internacional ou de uma preparao padro calibrada em unidades internacionais (U.I.). A Unidade Internacional do Fator II corresponde atividade de uma dada quantidade do padro internacional, que constitudo por um concentrado liofilizado do Fator II da coagulao sangunea. A correspondncia entre a Unidade Internacional e o padro internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade.
23
O mtodo de doseamento cromognico inclui 2 etapas sucessivas: ativao do Fator II por ao do veneno de cobra; e a clivagem enzimtica de um substrato cromognico pelo Fator IIa que liberta um cromforo quantificvel por espectrofotometria. Em condies de doseamento apropriados, existe uma relao linear entre a atividade do Fator IIa e a clivagem do substrato cromognico. REAGENTES Ativador especfico do Fator II proveniente do veneno da vbora Ecarina . Protena obtida a partir do veneno da vbora Echis carinatus ativa especificamente o Fator II. Reconstituir a preparao seguindo as instrues do fabricante. Uma vez reconstituda, conservar a 4C e utilizar no espao de 1 ms. Substrato cromognico para o Fator IIa. Substrato cromognico especfico do Fator IIa como: dihidrocloridrato de H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-arginina-4-nitroanilida, 4-toluenosulfonil-glicil-prolilLarginina- 4-nitroanilida, H-D- ciclohexilglicil--aminobutiril-L-arginina-4-nitroanilida, D-ciclohexilglicilL-alanilarginina- 4-nitroanilida-diacetato. Reconstituir seguindo as instrues do fabricante. Tampo de diluio. Soluo contendo 6,06 g/l de tris(hidroximetil)aminometano, 17,53 g/l de cloreto de sdio, 2,79 g/l de cido (etilenodinitrilo) cido tetractico e 1 g/l de albumina bovina ou de albumina humana. Acertar, se necessrio, o pH para 8,4 com cido hidroclordrico. TCNICA Soluo problema. Diluir a amostra no tampo de modo a obter uma soluo contendo 0,015 U.I. de Fator II por mililitro. Preparar, pelo menos, mais 3 diluies desta soluo no tampo de diluio. Soluo padro. Diluir a soluo padro no tampo de modo a obter uma soluo contendo 0,015 U.I. de Fator II por mililitro. Preparar, pelo menos, mais 3 diluies desta soluo no tampo de diluio. Colocar todas as solues a 37C num banho-maria, pouco tempo antes do ensaio. As condies descritas aplicam-se s placas de microtitulao. Se o doseamento realizado em tubos, ajustar os volumes de modo a manter as propores na mistura. Introduzir 25 l das diferentes diluies da amostra e da soluo padro, numa srie de poos da placa de microtitulao mantida a 37C. Juntar em cada poo 125 l do tampo de diluio e 25 l de Ecarina e incubar durante exatamente 2 minutos. Juntar em cada poo 25 l de substrato cromognico do Fator IIa. Proceder leitura da velocidade de variao da absorbncia em 405 nm (V.2.14) e continuar durante 3 minutos de modo obter a velocidade mdia de variao da absorbncia. Se no for possvel uma leitura contnua, determinar a absorbncia em 405 nm em intervalos consecutivos apropriados, por exemplo, de 40 em 40 s. Construir o grfico linear dos valores de absoro em funo do tempo e calcular a velocidade mdia de variao da absorbncia. A partir dos valores individuais encontrados para cada diluio do padro e da amostra, calcular a atividade da amostra e verificar a validade do doseamento pelos mtodos estatsticos habituais (VI.). DOSEAMENTO DO FATOR VII DA COAGULAO SANGUINEA HUMANA O doseamento do Fator VII da coagulao realizado pela determinao da sua atividade biolgica como um cofator na ativao do Fator X pelo Fator VIIa / Fator tecidular em presena de ons de clcio e de fosfolipdeos. A atividade de uma preparao do Fator VII calculada por comparao das quantidades respectivas desta preparao e do padro internacional ou de uma preparao de referncia determinada em unidades internacionais que so necessrias para obter uma velocidade de formao do Fator Xa num meio de reao contendo as diferentes substncias que intervm na ativao do Fator X. A Unidade Internacional da atividade do Fator VII corresponde atividade de uma dada quantidade do padro internacional que atualmente constitudo por um plasma liofilizado. A correspondncia entre a unidade internacional e o padro internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade. O mtodo de doseamento cromognico comporta duas etapas sucessivas: a ativao do Fator X, sob a ao do Fator VIIa, numa mistura reativa contendo o fator tecidular fosfolipdeo e o on clcio e a lise enzimtica de um substrato cromognico pelo Fator Xa que liberta um cromforo quantificvel por
24
espectrofotometria. Em condies apropriadas de doseamento, existe uma relao linear entre a velocidade de formao do Fator Xa e a concentrao do Fator VII. O esquema seguinte resume o princpio do doseamento:
As duas etapas utilizam reagentes disponveis no mercado originrio de diversos fornecedores. Embora a composio destes reagentes possa variar ligeiramente as suas caractersticas essenciais so descritas nas especificaes que se seguem. REAGENTES A mistura reativa de fatores da coagulao contm especialmente protenas purificadas de origem humana ou bovina especificamente o Fator X, a tromboplastina e Fator tecidular fosfolipdico e um ativador do Fator VII. Estas protenas so parcialmente purificadas e no contm impurezas capazes de interferir na ativao do Fator VII ou do Fator X. O Fator X est presente em quantidade tal que a sua concentrao final, fora da etapa de ativao, seja de 10-350 nmol/l, de preferncia de 14-70 nmol/l. A tromboplastina utilizada pode ser de origem natural (crebro de boi ou coelho) ou sinttica. A tromboplastina utilizada para a determinao do tempo de Quick diluda de 5 a 50 vezes numa soluo tampo de maneira que a concentrao final de Ca2+ seja de 15-25 nmol/l. A etapa final de formao do Fator Xa conduzida numa soluo contendo albumina humana ou bovina a uma concentrao em que no ocorram perdas na adsoro e convenientemente tamponada a pH compreendido entre 7,3 e 8,0. O Fator VII o nico Fator que limita a formao do Fator Xa na mistura de incubao final e nenhum dos constituintes reativos da mistura tem o poder de induzir por si s a formao do Fator Xa. A segunda etapa consiste na quantificao do Fator Xa formado na etapa precedente, no meio de um substrato cromognico especfico do Fator Xa. Este substrato geralmente um peptdeo curto derivado de 3 a 5 cidos aminados ligados a um grupamento cromforo. A ciso deste grupamento e do substrato peptdico promove um deslocamento da atividade cromofrica para um comprimento de onda que permite a sua quantificao por espectrofotometria. O substrato geralmente dissolvido em gua e utilizado numa concentrao final de 0,2-2 nmol/l. Pode igualmente compreender os inibidores apropriados impedindo o prosseguir da formao do Fator Xa (adio de iodeto). TCNICA Reconstitua o contedo de uma ampola da preparao de referncia e da amostra juntando uma quantidade de gua pretendida e uma vez reconstitudas utilize-as no espao de uma hora. Juntar s preparaes reconstitudas a quantidade de pr-diluente necessria para obter solues a 0,5-2,0 U.I. do Fator VII por mililitro. Preparar as diluies seguintes da preparao de referncia e da amostra com uma soluo tampo isotnica sem agente de quelao, contendo 1 % de albumina humana ou bovina, e de preferncia tamponada para pH 7,3-8,0. Faa de cada uma das duas preparaes pelo menos 3 diluies separadas independentes. De preferncia em duplicado. A concentrao destas diluies em Fator VII ajustada de modo que a concentrao final seja inferior a 0,005 U.I./ml.
25
Preparar igualmente um testemunho contendo o conjunto dos constituintes da mistura reativa com exceo do Fator VII. Todas as diluies so preparadas em tubos de plstico e utilizadas durante a 1 hora. Etapa 1. A cada uma das diluies, obtidas a partir da preparao de referncia e da amostra, juntar um volume apropriado do reagente de coagulao pr-aquecido (ou de uma mistura dos seus constituintes separados), misturar e incubar a 37C em tubos de plstico ou poos de uma microplaca. A concentrao dos diferentes constituintes durante a formao do Fator Xa como a especificada em Reagentes. Deixar desenvolver a reao de ativao do Fator X durante um tempo apropriado; o trmino da reao acontece de preferncia antes que a concentrao em Fator Xa tenha atingido o seu nvel mximo, a fim de que a curva dose-resposta apresente uma linearidade satisfatria. O tempo de reao igualmente escolhido de modo que a condio de linearidade da curva de produo do Fator Xa em funo do tempo seja satisfatria. geralmente da ordem de 2 a 5 min, mas so admissveis certas variaes se permitirem melhorar a linearidade da curva dose-resposta. Etapa 2. Parar a reao de ativao por adio de uma mistura reativa contendo o substrato cromognico. A velocidade de lise do substrato, que proporcional concentrao do Fator Xa determinada com o auxlio de um espectrofotmetro pela variao da absorbncia num comprimento de onda apropriado. Pode determinar-se a absorbncia continuamente, o que permite calcular a velocidade inicial de lise do substrato, quer interrompendo a reao de hidrlise ao fim de um tempo apropriado, baixando o pH com um reagente apropriado tal como o cido actico a 500 g/l de C2H4O2 ou uma soluo tampo citratada de pH 3 (1 mol/l). Ajustar o tempo de hidrlise de modo que a condio de linearidade de formao do cromforo em funo do tempo seja satisfatria. Este tempo geralmente da ordem dos 3 a 15 min, mas so toleradas certas variaes se permitirem melhorar a linearidade da curva dose-resposta. Verifique a validade da titulao e calcule a atividade da preparao problema pelos procedimentos estatsticos aplicveis aos ensaios biolgicos (VI.). DOSEAMENTO DO FATOR IX DA COAGULAO SANGUNEA HUMANA Determina-se a atividade da amostra comparando a quantidade da amostra necessria para reduzir o tempo de coagulao de uma mistura de prova que contm as substncias, alm do Fator IX, necessrias para a coagulao do sangue, com a quantidade de uma preparao de referncia, avaliada em unidades internacionais, necessria para obter o mesmo efeito. A Unidade Internacional corresponde atividade de uma determinada quantidade do padro internacional constitudo por um concentrado liofilizado do Fator IX da coagulao sangunea. A equivalncia em unidades internacionais do padro internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade. Reconstitua respectivamente a amostra e a preparao de referncia de acordo com as indicaes do rtulo e utilize imediatamente. Quando aplicvel, determinar a quantidade de heparina presente (V.5.2.6.) e neutralize-a juntando sulfato de protamina (10 g de sulfato de protamina neutralizam 1 U.I. de heparina). Dilua a amostra e a preparao de referncia com soluo tampo de imidazol de pH 7,3 de modo a obter solues com 0,5 a 2,0 U.I. por mililitro. Com uma mistura de 1 volume de soluo de citrato de sdio a 38 g/l e 5 volumes de soluo tampo de imidazol de pH 7,3, preparar uma srie de diluies compreendendo 1/10, 1/20, 1/40 e 1/80. Estas diluies so preparadas com preciso e so utilizadas imediatamente. Utilizar, por exemplo, tubos de incubao mantidos em banho Maria a 37C. Introduza em cada tubo 0,1 ml de substrato de plasma SR e 0,1 ml de cada uma das diluies da preparao de referncia e da amostra. Juntar em cada tubo 0,1 ml de uma diluio apropriada de reagente cefalina ou substituto de plaquetas SR e 0,1 ml de uma suspenso de 0,5 g de caulin leve SR em 100 ml de soluo de cloreto de sdio a 0,9 % (p/V) e deixar em repouso durante cerca de 10 min, inclinando os tubos regularmente. Juntar a cada tubo 0,1 ml de soluo de cloreto de clcio a 7,4 g/l. Com o auxlio de um cronmetro, determine o tempo de coagulao, isto , o intervalo de tempo entre o momento da
26
adio do cloreto de clcio e a 1 indicao da formao de fibrina que se observa visualmente ou com aparelhos apropriados. Calcular a atividade utilizando o procedimento estatstico aplicveis aos ensaios biolgicos (V.I.). Para assegurar que no existe contaminao aprecivel do substrato de plasma pelo Fator IX, realizar um ensaio em branco utilizando, em vez da amostra, um volume correspondente de uma mistura de 1 volume de soluo de citrato de sdio a 38 g/l e 5 volumes de soluo tampo de imidazol de pH 7,3. O ensaio s vlido se o tempo de coagulao determinado no ensaio em branco estiver compreendido entre 100 e 200 s. DOSEAMENTO DO FATOR X DA COAGULAO SAGUINEA HUMANA O doseamento do Fator X da coagulao humana realizado aps ativao especfica em Fator Xa, que calculada por comparao da sua atividade em clivar um substrato cromognico peptdico especfico com a mesma atividade do Padro Internacional ou de uma preparao de referncia aferida em Unidades Internacionais. A Unidade Internacional do Fator X corresponde atividade de uma dada quantidade do Padro Internacional que constitudo por um concentrado liofilizado do Fator X da coagulao sangunea humana. A correspondncia entre a Unidade Internacional e o Padro Internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade. O mtodo de doseamento cromognico inclui 2 etapas: ativao do Fator X sob ao do veneno de cobra, seguida de clivagem enzimtica de um substrato cromognico pelo Fator Xa que liberta um cromforo quantificvel por espectrofotometria. Em condies de doseamento apropriados, existe uma relao linear entre a atividade do Fator Xa e a clivagem do substrato. REAGENTES Ativador especfico do Fator X proveniente do veneno da vbora de Russel (VVR). Protena obtida a partir do veneno da vbora de Russel (Vipera russelli) que ativa especificamente o Fator X. Reconstituir a preparao seguindo as instrues do fabricante. Uma vez reconstituda, conservar a 4C e utilizar no espao de 1 ms. Substrato cromognico para o Fator Xa. Substrato cromognico especfico do Fator Xa tal como: dihidrocloridrato de N--benziloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina-4-nitroanilida, hidrocloridrato de Nbenzoil- L-isoleucil-L-glutamil-glicil-L-arginina-4-nitroanilida, metanosulfonil-D-leucil-glicil-L-arginina4- itroanilida, acetato de metoxicarbonil-D-ciclohexilalanil-glicil-L-arginina-4-nitroanilida. Reconstituir seguindo as instrues do fabricante. Tampo de diluio. Soluo contendo 3,7 g/l de tris(hidroximetil)aminometano, 18,0 g/l de cloreto de sdio, 2,1 g/l de imidazol, 0,02 g/l de brometo de hexadimetrina e 1 g/l de albumina bovina ou de albumina humana. Se necessrio, ajustar para pH 8,4 com cido hidroclordrico. TCNICA Soluo problema. Diluir a amostra no tampo de modo a obter uma soluo contendo 0,18 U.I. do Fator X por mililitro. Preparar, pelo menos, mais 3 diluies desta soluo no tampo de diluio. Soluo padro. Diluir a preparao padro no tampo de modo a obter uma soluo contendo 0,18 U.I. do Fator X por mililitro. Preparar, pelo menos, mais 3 diluies desta soluo no tampo de diluio. Pouco tempo antes do ensaio, colocar todas as solues num banho-maria a 37C. As condies descritas aplicam-se s placas de microtitulao. Se o doseamento realizado em tubos, ajustar os volumes de modo a manter mistura.
27
Introduzir 12,5 l das diferentes diluies da amostra e da soluo padro numa srie de poos de uma placa de microtitulao mantida a 37C. Juntar em cada poo 25 l de VVR. Incubar durante exatamente 90 s. Juntar em cada poo 150 l do substrato cromognico do Fator Xa , diludo 6 vezes no tampo de diluio. Proceder leitura da variao de absorbncia em 405 nm (V.2.14) e continuar durante 3 min de modo a obter a velocidade mdia de variao da absorbncia. Se no for possvel uma leitura continua, determinar a absorbncia em 405 nm com intervalos consecutivos apropriados, por exemplo, 40 s. Construir o grfico linear dos valores de absorbncia em funo do tempo e calcular a velocidade mdia de variao da absorbncia. A partir dos valores individuais encontrados para cada diluio do padro e da amostra, calcular a atividade da amostra e verificar a validade da aferio pelos mtodos estatsticos habituais (VI.).
28

CP Filtração

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

CP Filtração

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

NESTA SEO

Tabela 3. Comparao entre os diferentes sistemas de classificao de limpeza de ar.

Das könnte Ihnen auch gefallen