2.4. Preparaciones para microscopia 2.4.1.

Tipos de preparaciones para la observacin microscpica La observacin microscpica constituye la primera etapa del estudio de los microorganismos y tambin del diagnstico microbiolgico ya que permite conocer algunas caractersticas de los microorganismos, como ser: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc. Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los microorganismos, de las cuales en el laboratorio son fciles de realizar las siguientes: 1. Observacin de bacterias vivas: a) en fresco b) con fondo oscuro c) gota pendiente 2. Observacin de bacterias muertas: a) con tincin simple b) con tincin diferencial c) con tincin especial d) ETC 3. Observacin microscpica de hongos a) Observacin en fresco b) Preparaciones fijas c) Tcnica del microcultivo 1. Observacin de bacterias vivas a) Observacin en fresco. Este mtodo de examen permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfologa que producen las tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos. Consiste en suspender el microorganismo a observar en un lquido y depositar una gota de la suspensin sobre un portaobjeto sobre el cual a la vez se coloca un cubreobjeto, luego se procede a la observacin microscpica. b) Observacin microscpica en fondo oscuro . Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa. Para la observacin se sustituye el condensador de Abb por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se le emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.

c) Gota pendiente. Para tal observacin se utiliza un portaobjeto cavado. En el borde de la excavacin se deposita una fina pelcula de vaselina; luego, en un cubreobjeto se deposita una pequea gota de suspensin bacteriana y ste se coloca sobre la excavacin del portaobjeto. La vaselina impide la penetracin de corrientes de aire y permite la adhesin del cubreobjeto al portaobjeto. 2. Observacin de bacterias muertas El procedimiento es el siguiente: primeramente se procede a extender las bacterias a observar; para ello, stas se suspenden en un lquido y se extiende una gota de la suspensin sobre los dos tercios distales de un portaobjeto con la ayuda de un asa. Luego se procede a la fijacin por medios qumicos o fsicos. El medio qumico consiste en colocar en contacto el material extendido con una sustancia qumica. Ejemplo: alcohol metlico, ter, etc. En el medio fsico el extendido se expone al calor. Una vez extendida y fijada la muestra, se realiza la tincin que consiste en dejar actuar sobre ella colorantes de uso microbiolgico. El usar esta ltima tcnica tiene la ventaja que permite que las clulas bacterianas se observen ms claramente despus de teidas y adems, puede proporcionar informacin de propiedades qumicas de stas. 3. Observacin microscpica de hongos a) Observacin en fresco - Deposite una gota de agua sobre un portaobjeto y posteriormente con una aguja o asa con hilo de platino, proceda a sacar el hongo (micelio, esporas, etc.) del sustrato en el cual el microorganismo se est desarrollando. - Separe suavemente el micelio en la gota de agua sobre el portaobjeto ayudndose con otra aguja. - Coloque el cubreobjeto sobre la gota de agua en un ngulo de 45 y djelo caer sobre sta asegurndose que no queden burbujas. - Observe al microscopio. b) Preparaciones fijas Se procede de manera similar a las preparaciones en fresco, pero en vez de utilizar agua se utiliza lactofenol u otro producto qumico para fijar la preparacin. Posteriormente, si es necesario, se procede a sellar con cutex los bordes del cubreobjeto y se observa al microscopio. Esta tcnica permite conservar por un largo tiempo las preparaciones en el laboratorio. c) Tcnica del microcultivo

Esta tcnica se utiliza en micologa para el estudio de ciertas estructuras de los hongos que son muy frgiles y se deterioran fcilmente, al ser obtenidas para su observacin a partir de un macrocultivo (comn y corriente). La tcnica consiste en una placa de Petri estril en cuyo interior se encuentran: un portaobjeto, cubreobjeto, tubo de vidrio en U y papel filtro. Sobre el portaobjeto se deposita en forma asptica, un trocito del medio de cultivo a utilizar (se corta con un sacabocados). Luego se siembra el hongo en estudio pasando el asa con el hilo de platino en la periferia superior del medio de cultivo, a continuacin se cubre con el cubreobjeto estril y se agrega al fondo de la placa agua destilada estril (cmara hmeda); finalmente se incuba a la temperatura deseada. Despus de 3-4 das se retira en forma cuidadosa el cubreobjeto al cual se ha adherido el hongo y se monta sobre un portaobjeto para observar en fresco, o realizar una preparacin permanente.