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Las enzimas son protenas

Catalizan reacciones qumicas necesarias para la sobrevivencia celular Sin las enzimas los procesos biolgicos seran tan lentos que las clulas no podran existir. Las enzimas pueden actuar dentro de la clula , fuera de sta, y en el tubo de ensayo.

ENZIMAS

E+S
E
1

ES EP
E E

E+P
E
2

La enzima disminuye la energa de activacin

Sin enzima Con enzima

Enzima - Catalizador
Tanto la enzima como el catalizador aceleran la velocidad de una reaccin qumica. Una enzima puede transformar 1000 molculas de sustrato/ segundo Las enzimas tienen 3 propiedades que los catalizadores NO tienen

E+S

La Ea de la hidrlisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la accin de las enzimas, acelerando la reaccin 1014 x El aumento de temperatura necesario para producir la reaccin no catalizada seria de 529C

E+P
Tiempo de la reaccin

Especificidad por el sustrato Se inactivan por desnaturacin Pueden ser reguladas

4

Las enzimas se unen a los reactivos (sustratos) reduciendo la energa de activacin Cada enzima tiene una forma nica con un sitio o centro activo en el que se une al sustrato Despus de la reaccin, enzimas y productos se separan. Las molculas enzimticas no han cambiado despus de participar en la reaccin

Las enzimas cumplen su papel cataltico gracias a: Fijacin estereoqumica complementaria del sustrato Transformacin cataltica del mismo En ambas funciones participan: Cadenas laterales de los aminocidos Grupos o molculas no proteicas: Grupos prostticos Iones metlicos Cofactores
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Los siguientes hechos: Especificidad de la reaccin enzimtica Carcter heterogneo de la catlisis enzimtica

Enzima

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo en la molcula de enzima, capaz de: Fijar especficamente al sustrato Transformarlo catalticamente.

Sustrato
Sitio activo

La unin del sustrato es muy especfica

Complementariedad geomtrica Complementariedad inicas Modelos: Encaje inducido Llave cerradura. Estado de transicin de cargas, uniones

Teoras de la accin enzimtica, 1

Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer) Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecfica, de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura. Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenmenos de la inhibicin enzimtica

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Teoras de la accin enzimtica, 2

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland) Tanto la enzima como el substrato sufren una alteracin en su estructura por el hecho fsico de la unin. Est mucho ms de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.

Teoras de la accin enzimtica, 3

Estabilizacin del Estado de Transicin La teora del Ajuste Inducido se ampla en la actualidad definiendo la accin enzimtica como Segn lo cual, el Centro Activo enzimtico es en realidad complementario no al substrato o al producto, sino al estado de transicin entre ambos.

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Una enzima puede unir dos sustratos en su sitio activo

Cintica Enzimtica

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Cintica Enzimtica
La cintica enzimtica es el anlisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimtica, que se evala a travs de la velocidad de la reaccin catalizada. Las variables ms importantes son: Concentracin de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores) pH Temperatura

Ella est basada en la medicin de la velocidad de reaccin. As en la reaccin: S Se tendr: E P

v=

dp ds = dt dt

La velocidad de reaccin (pendiente) disminuye continuamente a partir de un valor mximo inicial. Esto se puede deber a:
Desaturacin de la enzima concentracin del sustrato Inhibicin por el producto Desplazamiento del equilibrio, si la reaccin es reversible con sustrato, por disminucin de la

Inactivacin de la enzima por su inherente inestabilidad

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Baja concentracin de sustrato

Efecto de la concentracin de substrato

.
ALTA concentracin de sustrato SATURACION

. . . . .

. .
[s]
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Concepto de velocidad inicial

Una cintica hiperblica implica un proceso saturante:

[ ]

d[P] v = dt , t

Hay un nmero limitado de sitios en la enzima para fijar el sustrato; una vez que estn ocupados todos, por mucho que aumente la concentracin de sustrato, la velocidad permanecer constante tendiendo a un valor asinttico

s t
19

E+S

k+1 k-1

ES

k+2

E+P
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El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinmica del sistema

Hiptesis de Michaelis - Menten

E+S

k+1 k-1

ES

k+2

E+S E+P

k+1 k-1

ES

k+2

E+P

- La primera parte del mecanismo,

Sistema No admite solucin analtica. - Simulaciones numricas - Hiptesis que lo simplifiquen

E+S
k+2

k+1 k-1

ES

Tiene lugar mucho ms rpidamente que la segunda:

ES
21

E+P
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Hiptesis de Michaelis-Menten Equilibrio rpido

[ E ][ S ] es (e0 x)s Km = = = [ ES ] x x

Hiptesis de estado estacionario

Segn veamos en la simulacin numrica, hay un tiempo relativamente prolongado en el curso de la reaccin en el que la variacin de complejo [ES] es prcticamente igual a cero:

x=

e0 s Km + s

v = k+2 x
v= k +2 e0 s Km + s

V s v = max Km + s
23

dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0

A partir de esta expresin podemos llegar a obtener una expresin que nos da la velocidad para la concentracin de substrato

k +2 e0 = Vmax
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dx = 0 = k +1es ( k 1 + k +2 ) x dt

A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y Estado estacionario, llegamos a la ecuacin

k + 1es = k + 1 (e0 x )s = ( k 1 + k + 2 ) x
e0 s e0 s = k 1 + k +2 Km + s +s k +1

v=

Vmax * s Km + s

x=

V s v = max Km + s
Hiptesis de estado estacionario

La nica diferencia radica en el significado de Km: Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M. Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

v = k+2 x

k + 2 e0 = Vmax
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Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociacin del complejo ES (en condiciones de equilibrio rpido) 2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato (en condiciones de equilibrio rpido) 3. Mide la funcin de fijacin (en cond. de equilibrio rpido) 4. Concentracin de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad de la mxima (s0.5) Se define para una pareja enzima-sustrato Se mide en unidades de concentracin
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Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asinttica para s 2. Directamente proporcional a la concentracin de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2) 3. Mide la funcin de transformacin cataltica 4. Se expresa en unidades de velocidad
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Modelo Cintico de Michaelis Menten

E+S

k+1 k2

ES

k3

E+P

Modelo de la reaccin)
Segn la hiptesis del estado estacionario, la [ES] es pequea y constante a lo largo de la reaccin
Leonor Michaelis (1875-1949)

V1 = k1[E][S] V2 = k2 [ES] V3 = k3 [ES]

En el equilibrio la V de formacin de ES es igual a la velocidad de descomposicin V1 = V2 + V3 k1[S][E] = (k2 + k3) [ES] [E] = [ET] [ES] [ES] = [ET] [S] / (Km + [S])

sustrat o ES
Maud Menten (1879-1960)

produc to enzima

Km = (k2 + k3) / k1
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Modelo cintico de Michaelis-Menten

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Velocidad de la reaccin (v)

Cuando la [S] es pequea, la reaccin enzimtica es de orden 1

Cuando la [S] es grande, la reaccin enzimtica es de orden 0

Vmax

Relacin entre Km y Vmax Michaelis y Menten

Vmax/2

Estimacin grfica de los parmetros cinticos

Km

Concentracin de Sustrato [S]

La Km es la concentracin de sustrato donde se obtiene la mitad de la Vmax

Verificacin del modelo cintico de Michaelis-Menten
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Velocidad de la reaccin (v)

Vmax
R e p re se n ta c i n d ire c ta

Vmax/2

100

Vmax
v= Vmx s Km + s

80

60

Km

40

Concentracin de Sustrato [S]

20

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
33

0 0 20 40 60 80 100

Km
34

Representacin doble recproca (1/v vs. 1/[S])

La estimacin de los parmetros cinticos se hace a partir de una lnea recta y permite calcular KM y Vmax con mayor exactitud

Representacin de Lineweaver-Burk
v vs. [S] 1/v vs. 1/[S]

Representacin de Lineweaver-Burk (doble recproca)

Clculo de KM y Vmax (mtodo alternativo)

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Representacin Lineweaver-Burke
0.04

Representacin Hanes
1.2

1/v
0.03

s/v

1.0

0.8

1/Vmax -1/Km

0.02

0.6

0.01

1 Km 1 1 = + v Vmx s Vmx

0.4

-Km
0.2

s 1 K = s+ m v Vmx Vmx

0.00 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

0.0 -20 0 20 40 60 80 100 120

1/s
37

s
38

Representacin de Eadie-Hofstee Vmax Mtodos de linealizacin para determinacin parmetros cinticos

v + Vmx s
Mtodo LineweaverBurke Hanes
40

100

Eje Y 1/v s/v v

Eje X 1/s s v/s

80

v = Km

Intercepto Eje Y 1/V K/V V

Intercepto Eje x -1/K -K V/K

Pendiente K/V 1/V -K

60

20

v/s
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

EadieHofstee

39

40

Efecto del pH en la ENZIMA

Definicin Actividad Enzimtica

Es el nmero de moles de sustrato que reaccionan para formar producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima est plenamente saturada con sustrato y por tanto que la reaccin se efecta con su mxima rapidez El ndice de recambio muestra la eficiencia impresionante de la catlisis enzimtica

Cada enzima tiene un pH ptimo para su actividad El pH afecta las interacciones inicas
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Efecto del pH
En el efecto de la temperatura hay dos posibles mecanismos: 1. Sobre la fijacin del substrato al centro activo: - Grupos disociables de la enzima - Grupos disociables del substrato 2. Sobre la transformacin cataltica del substrato 3. Sobre la estructura de la protena enzimtica

1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT) 2. Desnaturalizacin trmica de la protena

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Efecto de la temperatura en la ENZIMA

Aumento de la velocidad Desnaturacin por calor

ORGANISMOS TERMFILOS
Son organismos que viven a altas t y realizan sus reacciones enzimticas a estas altas t Ejemplos son los que viven en las aguas termales Es tema de investigacin el aislamiento de las enzimas de estos organismos para desarrollar procesos industriales en condiciones ms extremas

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40

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Temperatura

Cada enzima tiene una temperatura ptima.

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El NAD es una coenzima aceptora de H

Coenzimas
Las coenzimas son pequeas molculas orgnicas, que se unen a la enzima. Las coenzimas colaboran en la reaccin enzimtica recibiendo transitoriamente algn grupo qumico: H+ , OH, CH3 . La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMA

Sustrato oxidado

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Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad

As esta actividad corresponde al mximo potencial cataltico que las enzimas poseen para un determinado conjunto de condiciones ambientales. Luego, estas deben ser consideradas en las expresiones matemticas representativas del proceso enzimtico. Existen situaciones (sustratos heterogneos) donde la velocidad inicial de reaccin no es representativa del real potencial cataltico de la enzima. Se asume que la velocidad inicial de reaccin es proporcional a la concentracin de protena enzimtica.

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Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de interacciones con el centro activo u otros centros especficos (alostricos). Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica.

Inhibicin enzimtica

De esta forma, habr dos tipos de inhibidores: I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad enzimtica.
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Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E+I ES + I EI ESI

Inhibicin enzimtica isostrica

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima: E+I E

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Inhibicin reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin cataltica: Inhibicin No Competitiva (c) El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la accin cataltica; este tipo se conoce como Inhibicin Anticompetitiva

Inhibicin Competitiva

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Inhibidores Competitivos
Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima Se une solo a la enzima libre V mx no se altera y K M cambia

Inhibicin competitiva

Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor competitivo es desplazado y se forma producto

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S E I EI
Se define una constante de equilibrio de disociacin del inhibidor:

ES

E+P
Ki = [E] [I] [EI]

Caractersticas: - Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibicin - Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del sustrato. - El inhibidor es tan especfico como el sustrato
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En condiciones de equilibrio rpido, llamando y a la concentracin del complejo EI, para la inhibicin competitiva obtenemos el sistema de ecuaciones

Por tanto, en la inhibicin competitiva,

Km =

(e0 x y ) s x (e0 x y )i Ki = y

De donde

1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia del inhibidor competitivo.

Que resuelto para x nos da

e0 s x= i Km 1 + + s Ki

Vmx s v= i Km 1 + + s Ki

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Sin inhibidor

Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble

Con inhibidor

1/v

0.07 0.06 0.05

El inhibidor competitivo aumenta la Km -1/Km

Km Km Sin con inhibidor inhibidor
-0.3 -0.2 -0.1

0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

1/Vmax

1/s
0.5 0.6

-1/(Km(1 + i/Ki))
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Ejemplo Inhibidor Competitivo

cido succnico + FAD == cido fumrico + FADH2 El inhibidor competitivo es el cido malnico Es un anlogo estructuralmente parecido al cido succnico

cido Flico y Sulfanilamida

La sulfanilamida es un anlogo estructural del cido p - aminobenzoico (PABA) PABA es el punto de partida para la sntesis de cido flico en las bacterias El cido flico es una vitamina esencial para la proliferacin (divisin) bacteriana Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones

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Metotrexato y Dihidrofolato
El cido flico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reaccin catalizada por la dihidrofolato reductasa Esta reaccin es parte del metabolismo de los nucletidos para la sntesis de DNA Metotrexato se usa en la terapia de algunos cnceres, inhibiendo la sntesis de DNA

Inhibidor competitivo su estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto
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Inhibidor No Competitivo
Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima Se une a la enzima libre y tambin al complejo enzima-sustrato Por accin del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibicin No Competitiva

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Inhibicin NO competitiva

Inhibidor NO competitivo
El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo

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S E I S EI ESI I ES E+P
Inhibicin No Competitiva

Caractersticas: El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos
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Inhibicin Acompetitiva o Incompetitiva

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Inhibidor Acompetitivo
En este tipo de inhibicin el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo despus de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato est saturando la enzima y toda la enzima est como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI. Como I solo se une a ES estimula la formacin de ES y, por tanto, incrementa la unin del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.

Inhibidor Acompetitivo
Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima Se une slo al complejo enzima-sustrato Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y tambin el de Vmx

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S E I ESI
Inhibicin Anticompetitiva

ES

E+P

Determinacin de parmetros cinticos de inhibicin

Modelo Inh comp Inh no comp total Kap Km(1+i/Ki) Km Km/(1+i/Ki) Vap Vm Vm/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)

El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inh acomp

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Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente - Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

Inhibidores Irreversibles
Producen inactivacin permanente de la actividad enzimtica Se interfiere con el normal desarrollo de una reaccin o va metablica Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

E+I

- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.
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Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

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Inhibicin enzimtica alosterica

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Enzimas Alostricas
Son enzimas cuya estructura proteica est formada de varias subunidades No se rigen por la cintica de M - M Adems del sitio o centro activo tienen sitios alostricos o de regulacin Sitio activo/sustratos; Sitio alostrico/moduladores o reguladores La relacin entre la velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato sigue cintica sigmodea

Enzimas alostricas
Las enzimas alostricas presentan estructura cuaternaria. Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molcula de sustrato La unin del sustrato es cooperativa la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

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Concepto de Cooperatividad
La unin de los sustratos al sitio activo de una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto fsico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones Modelos de unin: secuencial y concertado Ejemplos: unin Hb-O2, enzimas alostricas y sus sustratos

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Moduladores Alostricos
Tambin reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos Se unen al sitio alostrico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias Su unin produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo
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Aspartato Transcarbamilasa
c L-asp + Carbamil-P === Carbamilasp + Pi . Primera reaccin en la sntesis de pirimidinas Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP Tiene dos subunidades catalticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores
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RESUMEN
Las enzimas son protenas que catalizan las reacciones biolgicas Presentan especificidad por su sustrato Cada enzima presenta dos parmetros importantes Vmax (saturacin de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por el sustrato)

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RESUMEN
La actividad enzimtica puede ser inhibida, por inhibidores competitivos (similares al sustrato) o por inhibidores no competitivos competitivos. . La temperatura y el pH afectan a la enzima en su actividad cataltica. cataltica. Algunas enzimas requieren de coenzimas y/o cofactores para su actividad. actividad .
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