Las balsas de lpidos: poner orden en el caos.

Pike LJ . Fuente
Universidad de Washington Escuela de Medicina, Departamento de Bioqumica y Biofsica Molecular, 660 menos. Euclid, Caja 8231, St. Louis, MO 63110, EE.UU..pike@biochem.wustl.edu

Abstracto
Las balsas de lpidos son los subdominios de la membrana plasmtica que contienen altas concentraciones de colesterol y glicoesfingolpidos. Ellos existen como distintas regiones lquido-ordenada de la membrana que son resistentes a la extraccin con detergentes no inicos. Balsas parecen ser pequeo en tamao, pero pueden constituir una fraccin relativamente grande de la membrana plasmtica. Mientras balsas tienen una protena distintiva y composicin de los lpidos, todas las balsas no parecen ser idnticas en trminos de cualquiera de las protenas o los lpidos que contienen. Una variedad de protenas, especialmente aquellos involucrados en la sealizacin celular, se ha demostrado que particin en las balsas de lpidos. Como resultado, se cree que las balsas lipdicas de estar involucrados en la regulacin de la transduccin de seales. La evidencia experimental sugiere que hay probablemente varios mecanismos a travs del cual las balsas controlan la sealizacin celular. Por ejemplo, balsas pueden contener vas de sealizacin incompletas que se activan cuando un receptor u otra molcula requerida se reclutaron en la balsa. Las balsas tambin pueden ser importantes en la sealizacin limitantes, ya sea por el secuestro fsica de los componentes de sealizacin para bloquear las interacciones no especficas, o mediante la supresin de la actividad intrnseca de las protenas de sealizacin presentes en las balsas. Esta revisin ofrece una visin general de las caractersticas fsicas de las balsas de lpidos y resume los estudios que han ayudado a aclarar el papel de las balsas lipdicas en la sealizacin a travs de receptores tirosina quinasas y los receptores acoplados a protenas G.
Complementarias palabras clave: colesterol, transduccin de seales, liquidordered. Dominios Durante 30 aos, el modelo de mosaico fluido de Singer y Nicolson (1) ha sentado las bases para nuestra comprensin de la estructura de las membranas celulares. En este modelo, las protenas de membrana son vistos como icebergs flotando en un mar de lpidos. Sin embargo, el trabajo en la ltima dcada ha aportado pruebas de que la membrana plasmtica no es un ocano al azar de los lpidos. Ms bien, hay una estructura dentro de este mar de los lpidos que a su vez impone organizacin en la distribucin de las protenas en la bicapa. Las "estructuras" de lpidos en la membrana del ocano se llaman balsas lipdicas. Las balsas de lpidos son regiones localizadas de niveles elevados de colesterol y contenido de glicoesfingolpidos dentro de las membranas celulares (vase la fig. 1). Las cadenas laterales de cidos grasos de los fosfolpidos presentes en las balsas de lpidos tienden a ser ms altamente saturada que los de la membrana que rodea. Esto permite que el embalaje final con las cadenas de acilo saturadas de esfingolpidos, y probablemente conduce a la separacin de fases. Debido a la presencia de colesterol, se forma un dominio de lquido-ordenada que exhibe menos fluidez de la membrana plasmtica que rodea. Este acondicionamiento hermtico de los lpidos y separacin de fases es probablemente

responsable de la propiedad de la firma de las balsas lipdicas: su insolubilidad en detergentes no inicos (2). Caveolae son pequeas invaginaciones de la membrana plasmtica que se pueden ver como un subconjunto de las balsas lipdicas. Al igual que las balsas de lpidos, caveolae tiene un alto contenido de colesterol y glicoesfingolpidos, sin embargo, caveolae se distinguen de las balsas de lpidos por la presencia de la protena de unin a caveolina colesterol-1 (3) que parece ser responsable de la estabilizacin de la estructura de invaginado de caveolas ( 4, 5). La presencia dentro de las balsas de lpidos (y caveolae) de una variedad de protenas de membrana que participan en la sealizacin celular (6, 7) ha llevado a la consenso de que estos dominios lipdicos juegan un papel importante en el proceso de transduccin de seales. Esta revisin se centrar en las balsas de lpidos que se encuentran en las membranas plasmticas y su papel en la transduccin de seales. Salvo en casos especficos, no se hace una distincin entre las balsas planas y caveolae invaginada, ya la mayora de estudios no distinguen inequvocamente entre estos subtipos de balsas. Opiniones centrados en la estructura y funcin de caveolas invaginado se han publicado recientemente (7-9). Aislamiento de las balsas lipdicas Histricamente, las balsas de lpidos se han definido funcionalmente por su baja densidad y la insolubilidad en fro 1% de Triton X-100 (10). Esto ha dado lugar a las siglas DRM (membrana de detergente-resistente), TIM (membranas Triton insolubles), y TIFF (fraccin insoluble en Triton flotante).

figura 1. Estructura de las balsas lipdicas. Las balsas de lpidos bicapa (azul) son dominios de la membrana especializados que contienen altas concentraciones de colesterol, esfingomielina, y ganglisidos. Tambin se enriquecen en fosfolpidos que contienen cadenas de acilo grasos saturados (lneas rectas en las colas de lpidos). Esta composicin da lugar a la separacin de fases lateral y la generacin de un dominio lquido-ordenada. Granel membrana plasmtica (gris) contiene menos colesterol, esfingomielina y ganglisidos, y ms fosfolpidos con cadenas acilo insaturados. Como resultado, es ms fluido que las balsas de lpidos. Una variedad de particin de

protenas en balsas lipdicas: protenas glycosylphosphatidylinositolanchored, protenas transmembrana (TM), protenas doblemente aciladas (Acil). Como se muestra en el diagrama, no todas las balsas de lpidos tienen la protena idntica o composicin de lpidos (Balsa 1 vs Balsa 2). No se muestran invaginada caveolae, una subclase de las balsas de lpidos que contiene caveolina. PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PS, fosfatidilserina, PI, fosfatidilinositol, SPM, esfingomielina, Chol, colesterol, Gang, ganglisidos. El mtodo tradicional de preparacin de las balsas de lpidos resistentes al detergente incluye raspar las clulas en tampn fro que contiene 1% de Triton X-100, y homogeneizar el lisado (10). Las balsas se aislaron por flotacin en un gradiente de densidad lineal de sacarosa de 5% a 30% donde distribuyen en la parte superior unos fracciones del gradiente (10). Este procedimiento produce un producto bastante consistente que est enriquecida en colesterol y balsa protenas marcadoras como flotillin y glicosilfosfatidilinositol protenas (GPI)-vinculados. Las diferencias pueden surgir, sin embargo, si la medida de la manipulacin fsica de los lisados con detergente es variada. Por ejemplo, los receptores de factor de crecimiento epidrmico (EGF) se retienen en las balsas de lpidos Triton X-100-resistentes si el lisado se coloca en un tubo y simplemente invierte varias veces antes de la centrifugacin y flotacin de las balsas. Por el contrario, los receptores de EGF se pierden de DRM si el lisado de detergente original se homogeneiz antes de la centrifugacin (observaciones no publicadas). Por lo tanto, se debe tener cuidado de ser coherente en todos los aspectos del procedimiento de aislamiento para obtener preparaciones que son comparables a travs de experimentos. Recientemente, una amplia variedad de detergentes distintos de Triton X-100 se han utilizado para aislar fracciones de membrana detergentinsoluble de baja densidad. Estos incluyen NP-40, octil-glucsido, CHAPS, Lubrol, y Brij 98, as como las concentraciones de menos de 1% de Triton X100 (11-13). Mientras que hay un solapamiento sustancial en el contenido de protenas y lpidos de las balsas lipdicas preparadas por estos diversos mtodos, tambin existen diferencias significativas entre ellos (11-13). Esto sugiere que los diversos mtodos para la preparacin de lpidos balsa no producen fracciones de membrana idnticos. Por lo tanto, en gran medida, las balsas de lpidos insolubles en detergente son realmente el producto nico del mtodo por el cual se han hecho. Tambin se han reportado varias preparaciones libres de detergente de las balsas de lpidos. Una preparacin implica la lisis de clulas enteras en un tampn de carbonato de sodio (pH 11). Este tampn se utiliza debido a que el pH elevado ayuda en la eliminacin de protenas de membrana perifricas. Despus de sonicacin del lisado, balsas se centrifugan en un gradiente discontinuo de sacarosa y la banda en el 5% y la interfaz de sacarosa 35% (14). Esta es una preparacin relativamente sencilla, pero de flotacin a travs de 35% de sacarosa no es una prueba particularmente estrictos para las membranas de baja densidad. Adems, pueden surgir problemas debido a que el material que en ltima instancia se someti a ultrasonidos y se separ por centrifugacin en gradiente de densidad contiene todas las membranas intracelulares.

Debido a que las balsas estn presentes en las membranas intracelulares, as como la membrana de plasma, no hay garanta de que una protena que se encuentra en la fraccin de luz al final de este procedimiento estaba realmente presente en la membrana plasmtica al inicio de la preparacin. Un procedimiento ms selectiva para la purificacin de las balsas de lpidos no detergentes se inform por Smart et al. (15). En este mtodo, las clulas se lisaron en tampn de sacarosa isotnica, y un sobrenadante postnuclear se asla. Una fraccin de membrana de plasma purificado se prepara por sedimentacin del sobrenadante postnuclear en un gradiente de Percoll auto-formada. Las membranas plasmticas se separan fcilmente del aparato de Golgi, retculo endoplsmico, mitocondrias y por este mtodo. El patrn de bandas de estas diversas fracciones de membrana se puede modificar mediante la alteracin del pH y la composicin inica de la gradiente de Percoll para obtener una separacin ptima (16). Las membranas plasmticas purificadas se sometieron a ultrasonidos para liberar las balsas de lpidos (y caveolae), que estn aisladas por flotacin en un gradiente continuo de Opti-Prep en solucin isotnica. Este mtodo produce una balsa lipdica preparacin altamente purificada, que probablemente refleja estrechamente la composicin de estos dominios en clulas intactas. Todas las preparaciones anteriores aislar todas las formas de las balsas de lpidos presentes en la clula, es decir, balsas planas y caveolae invaginado. Las balsas de lpidos caveolina que contienen se pueden separar de balsas noninvaginated por anticaveolin purificacin de inmunoafinidad (17). Si caveolae son para ser aislado de las clulas endoteliales vasculares, est disponible un procedimiento que separa fsicamente caveolae de las balsas de lpidos (18). Rata vasculatura pulmonar se perfunde con partculas de slice coloidales catinicos para recubrir el lado extracelular de la membrana plasmtica. Las balsas de lpidos, siendo plana, son con recubrimiento de superficie en este procedimiento. Sin embargo, debido a los cuellos de caveolae son tan estrechas, el interior de estas invaginaciones no est revestido. Las clulas endoteliales se aislaron a partir de estos vasos perfundidos y, posteriormente, se preparan las membranas plasmticas. Las membranas plasmticas se homogeneizan para liberar el caveolae, que flotan en una menor densidad en gradientes de densidad de sacarosa de hacer las membranas plasmticas de slice recubiertas que contienen las balsas lipdicas planas. Las membranas plasmticas, despojados de caveolae, se pueden lavar con una solucin rica en sal para eliminar la slice. La extraccin de estas membranas con Triton X-100 y flotacin en un gradiente de densidad resultados en el aislamiento de una fraccin de membrana de baja densidad que est desprovisto de la caveolina pero enriquecido en otros marcadores de balsas de lpidos, y probablemente corresponde a balsas lipdicas planas purificada. Esta preparacin, aunque engorroso y no en general aplicable a todos los tipos de clulas, genera lo que probablemente son las preparaciones ms altamente purificadas de caveolas y balsas de lpidos.

Tamao de las balsas lipdicas

Debido a caveolas representan un dominio morfolgicamente identificable, el tamao de esta subclase de las balsas de lpidos se puede determinar fcilmente a travs de microscopa electrnica. Caveolae, en general, result ser invaginaciones en forma de matraz de 100 nm de

dimetro (19). Sin embargo, caveolae se encuentra a menudo en racimos de uvas que tienen un tamao total mucho mayor. Adems, la caveolina-3, la forma especfica de msculo de la protena estructural caveolar, caveolina-1, est involucrado en el desarrollo de tbulos T que puede ser micras de longitud (20). El tamao de las balsas lipdicas aplanados no se puede medir directamente, debido a que los dominios no se pueden distinguir de la membrana que rodea. Por lo tanto, los mtodos relativamente indirectos se han empleado para determinar el tamao de estos dominios. Estos estudios han generado estimaciones muy variables de tamao de la balsa. Las protenas unidas a GPI se conocen a particin en las balsas de lpidos y se utilizan a menudo como marcadores para estos dominios (10, 18). Anlisis de la velocidad de difusin lateral de las protenas unidas a GPI, as como ganglisidos, un marcador de lpidos balsa, sugieren que los dominios son de 200 nm a 300 nm de dimetro (21-23). Estudios de despolarizacin de la fluorescencia del receptor de folato unido a GPI obtienen resultados consistentes con un tamao de 70 nm para las balsas de lpidos (24). Sola partcula de seguimiento de pista de las protenas ancladas a GPI produjo un tamao de 26 nm (25). Se obtuvieron valores algo ms altos (0,2-2 m) en un estudio que utiliza un solo colorante rastreo para examinar la fluorescencia de una sonda de lpidos fluorescente (26). Por el contrario, varios estudios que utilizan la transferencia de energa de resonancia fluorescente no han encontrado evidencia de dominios lipdicos estables de este tamao, y sugieren que estos dominios pueden existir slo transitoriamente en algunas membranas (27, 28). Cada tcnica aplicada al estudio de lpidos balsa tamao tiene sus propias fortalezas y debilidades. Basado en la suma de los datos disponibles en la actualidad, una interpretacin conservadora es que las balsas de lpidos son probablemente las estructuras con un dimetro medio en el intervalo de 100 nm a 200 nm, muy por debajo de la resolucin del microscopio de luz. Otra consideracin importante con respecto al tamao de balsa es la fraccin de la membrana plasmtica que est realmente cubierta por las balsas de lpidos. Si se supone que las balsas lipdicas representan todo lo que queda despus de una clula ha sido sometido a extraccin con 1% de Triton X-100, a continuacin, las balsas de lpidos parecen representar el 50% del rea de superficie de la membrana de plasma (29, 30). Sin embargo, las estimaciones significativamente ms bajos para la fraccin de membrana plasmtica se presentan como balsas (13%) se han derivado de los estudios de microscopa de una sola molcula (26, 30). La superficie abarcada por las balsas de lpidos es casi seguro que vara entre los tipos de clulas, y esto podra explicar la variabilidad en las estimaciones publicadas de la cobertura de balsa. Los valores ms firmes para el tamao y la fraccin de membrana de las balsas lipdicas esperan el desarrollo de mejores mtodos fsicos. Sin embargo, la informacin disponible en la actualidad proporciona una explicacin para la observacin de que muchas protenas que se pueden localizar en balsas bioqumicamente a menudo parecen estar distribuidos difusamente en la membrana de la clula en lugar de presentar en un patrn puntiforme. Un dimetro balsa por debajo del lmite de resolucin del microscopio de luz acoplada con la ms amplia cobertura de la superficie de la membrana plasmtica por estos dominios se traducira en un aparentemente una distribucin

uniforme de las protenas balsa-localizados, como se visualiza mediante mtodos de inmunofluorescencia. Composicin de las balsas lipdicas Varios diferentes preparaciones de lpidos balsa han sido analizados mediante diversas metodologas para determinar su composicin de lpidos. En general, estos estudios han demostrado que las DRM son enriquecidos en colesterol y glicoesfingolpidos, pero a menudo son pobres en glicerofosfolpidos. En un estudio de 1% de Triton X-100 insolubles en membranas, de baja densidad a partir de clulas MDCK, Brown y Rose (10) informaron de que las vesculas contenan 32% en moles de colesterol y 14% en moles de esfingomielina en comparacin con 12% en moles de colesterol y 1 mol % esfingomielina en clulas enteras. Los sistemas DRM tambin se enriquecieron aproximadamente 5 veces en glicolpidos, tales como sulftidos y ganglisidos, en comparacin con las clulas intactas. Resultados similares fueron reportados por Prinetti et al. utilizando un enfoque de marcaje metablico (31). Un anlisis de espectrometra de masas en tndem de alta resolucin de 0,1% de Triton X-balsas lipdicas 100-resistentes aislados a partir de clulas cebadas RBL-2H3 proporcionan un extenso anlisis de la composicin de cidos grasos de los diferentes fosfolpidos presentes en estos sistemas DRM (32). Estos estudios demostraron que el 50% de las cadenas laterales de cidos grasos en los lpidos de las membranas plasmticas contena enlace doble cero o uno, pero esto aument a 60% en lpidos de los DRM. Por lo tanto, los sistemas DRM mostr un aumento moderado en cidos grasos saturados en comparacin con las membranas plasmticas. Anlisis de las balsas lipdicas preparadas a partir de clulas KB por un protocolo libre de detergente demostr muchas similitudes pero tambin algunas diferencias con respecto a los anlisis anteriores de gestin de derechos digitales (33). Se encontraron las balsas de lpidos no detergente a ser 2 veces enriquecido en colesterol y 30% de aumento en el contenido de esfingomielina en comparacin con la membrana plasmtica mayor. Curiosamente, las balsas no detergentes fueron enriquecidos en plasmalgenos etanolamina, en particular los de cido araquidnico que contiene. Dado que se espera que los DRM a ser baja en PUFAs, la preferencia por araquidnico lpidos que contienen cido fue inesperada. Este hallazgo sugiere que estos que contiene cido araquidnico plasmalgenos puede ser importante para la funcin de las balsas lipdicas. En este sentido, un informe reciente que se requieren plasmalgenos etanolamina para el transporte de colesterol desde la membrana plasmtica hacia el retculo endoplsmico es particularmente intrigante (34). La mayora de los lpidos balsa tpica (por ejemplo, colesterol, esfingomielina y glucoesfingolpidos) tienden a encontrarse principalmente en el folleto exofacial de la membrana. Por el contrario, glicero-fosfolpidos que contienen etanolamina son preferentemente localizados en el folleto cytofacial de la membrana plasmtica. El hallazgo de que las balsas contienen un subconjunto

distinto de estos lpidos cytofacial (33) sugiere que la composicin de ambos los folletos exofacial y cytofacial de balsas son especficos para estos dominios, e implica que las balsas son probablemente estructuras bicapa. Anlisis de DRM preparadas a partir de estas mismas clulas KB (33) indica que los DRM son bajos en glicerofosfolpidos, en comparacin con balsas no detergentes (Fig. 2A). Los sistemas DRM son particularmente baja en lpidos prospecto interior tales como fosfolpidos aninicos y fosfatidiletanolamina, y no se enriquecen en plasmalgenos etanolamina como son las balsas no detergentes. Estas diferencias entre la composicin de los lpidos de DRM y balsas no detergentes sugieren que el tratamiento con detergente de las membranas puede extraer selectivamente el folleto exofacial de balsas y dejar detrs de los lpidos de la hoja interna. Tambin se evalu el grado de saturacin-insaturacin de cadenas laterales de cidos grasos en balsas en comparacin con las membranas plasmticas en los estudios en clulas KB (33). El por ciento de las especies de fosfolpidos que contienen cadenas laterales de cidos grasos saturados o monoinsaturados slo era 40% en las membranas plasmticas, as como en las balsas de lpidos no detergentes. Sin embargo, en las membranas preparada a partir de las mismas clulas por extraccin con 1% de Triton X-100, 60% de las especies de fosfolpidos contena slo cadenas laterales de cidos grasos saturados o monoinsaturados. Por lo tanto, slo las balsas preparados por extraccin con detergente mostraron un nivel elevado de las cadenas laterales acilo grasos saturados.

figura 2. Comparacin de la composicin de los lpidos y la insaturacin de la cadena lateral en las balsas de lpidos no detergentes y Triton X-100 balsas de lpidos insolubles. Membranas plasmticas purificadas (PM), balsas lipdicas no detergentes (balsas) y membranas resistentes a detergentes (DRM) se preparan a partir de clulas KB (33). Electrospray espectrometra de ionizacin de masas se utiliz para determinar la estructura de los fosfolpidos presentes en cada preparacin de membrana. A: Composicin lipdica de DRM y balsas no detergentes. Los resultados se muestran como nmol de lpido / mg de protena. B: Distribucin de dobles enlaces en las cadenas laterales de acilo por clase de lpidos. El por ciento de dos o ms enlaces dobles se

calcula mediante la determinacin de la fraccin de las especies de fosfolpidos individuales que contena un total de dos o ms dobles enlaces entre los dos grupos acilo presentes en el lpido. Anlisis de la distribucin por clase de las insaturaciones en las cadenas laterales de cidos grasos indica que el mayor nivel de lpidos saturados presentes en las DRM puede explicarse en gran medida por la exclusin de estas preparaciones de lpidos prospecto interior que contienen dobles enlaces en su lateral de cido graso cadenas (Fig. 2B). La fraccin de las especies de fosfatidilcolina y esfingomielina que contienen menos de dos dobles enlaces en total es ms o menos equivalente en las membranas plasmticas, balsas no detergentes, y DRM. Sin embargo, las membranas plasmticas y las balsas no detergentes exhiben muchas especies ms fosfatidiletanolamina y aninicos fosfolpidos que contienen dos o ms dobles enlaces que hacen DRM. Como fosfatidiletanolamina y los fosfolpidos aninicos estn normalmente asociados con la hoja interna de la membrana, esta observacin es consistente con la hiptesis de que el tratamiento con detergente extrae selectivamente el prospecto exterior de las balsas. Protena de composicin de balsas lipdicas Una variedad de protenas se han encontrado para ser enriquecido en las balsas de lpidos y / o caveolae. Esto incluye caveolinas, flotillins, las protenas unidas a GPI, de bajo peso molecular y las protenas G heterotrimricas, quinasas de la familia src, receptores de EGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), los receptores, los receptores de endotelina, la fosfotirosina fosfatasa syp, Grb2, Shc, MAP quinasa (MAPK), protena quinasa C, y la subunidad p85 de la PI-3quinasa (7, 10, 14, 35-41). Los mecanismos mediante los cuales se produce la asociacin de balsa parecen ser variable. Caveolina, una protena de la membrana intrnseca, es una protena de unin colesterol y probablemente se concentra en caveolae debido a su capacidad para unirse a este esterol (3). Por el contrario, las protenas ancladas a GPI, quinasas de la familia src, y la sintasa de xido ntrico endotelial parecen localizar a las balsas de lpidos como consecuencia de modificaciones de lpidos (42, 43). Para algunas protenas transmembrana, que abarca el dominio membrana parece mediar la distribucin de la protena en los dominios de membrana enriquecida en colesterol (44). Los estudios del comportamiento de otras protenas de transmembrana (TM) han sugerido que la asociacin de las protenas con dominios enriquecida en colesterol se ve influenciada por la longitud de sus dominios transmembrana (45). Extracelulares motivos que contienen carbohidratos tambin se han implicado en la direccin de la asociacin de TMs con dominios cholesterolenriched (46, 47). Ms recientemente, Yamabhai y Anderson (48) demostraron que las secuencias en la porcin ms proximal a la membrana del dominio extracelular del receptor de EGF se dirigen a las balsas de lpidos, independientes de cualquier modificacin de hidratos de carbono de la secuencia. Por lo tanto, aparece una variedad de mecanismos para ser empleados para la localizacin de protenas de las balsas de lpidos. Segregacin de componentes en balsas de composicin distinta

Cada vez hay ms pruebas de que no todas las balsas de lpidos son equivalentes. Una variedad de estudios han demostrado que las balsas de lpidos con claramente diferente de protena y / o componentes lipdicos coexisten dentro de las clulas (vase la fig. 1). Madore et al. (49) examinaron la distribucin de Thy-1 y la protena prin (PrP), dos protenas ancladas a GPI, en fracciones de baja densidad de Brij membranas de cerebro de rata de 96 solubilizadas. Purificacin por inmunoafinidad de la preparacin con anti-Thy-1 anticuerpos condujo al aislamiento de una fraccin que contena Thy-1 adems de gran parte de la PrP. Sin embargo, la purificacin por inmunoafinidad utilizando anticuerpos anti-PrP result en el aislamiento de las membranas que contenan esencialmente la totalidad de la PrP, pero slo el 10% de la Thy-1. Del mismo modo, Drevot et al. (12) demostraron que el agotamiento de DRM de clulas T con anti-Thy-1 anticuerpos cuantitativamente extrados receptores de clulas T (TCR) de las balsas. Sin embargo, predepletion de las balsas con anticuerpo anti-TCR retira poco Thy-1. Estos datos son consistentes con la interpretacin de que Thy-1 est presente en la mayor parte de las balsas lipdicas de clulas T, mientras que slo un subconjunto de las balsas contienen expresa PrP (49) o de TCR (12). En trminos ms generales, esto implica que no todas las balsas contienen el mismo subconjunto de protenas. Microscopa de inmunofluorescencia tambin se ha utilizado para identificar clases distintas de las balsas de lpidos. La protena anclada a GPI, fosfatasa alcalina placentaria, y prominin (una protena de membrana pentaspan), se mostr a estar presente en una fraccin de baja densidaddetergente resistente,. Sin embargo, por inmunofluorescencia, estas protenas exhiben distribuciones de la superficie celular, puntiformes distintos (11). Metodologa similar fue usado por Gmez-Mouton et al. (50) para demostrar que en la migracin de las clulas T, que conducen balsas borde contenan receptores de quimioquinas y un receptor activador del plasmingeno uroquinasa, as como GM pero carecan de GM. Por el contrario, las balsas urpodo contenidos CD44 y GM, pero carecan de GM. En la levadura, existe una agrupacin de ergosterol (el equivalente de levadura de colesterol) y protenas balsa de apareamiento-especficas en la punta de la proyeccin de acoplamiento. Raft protenas que no estn involucrados en el apareamiento no se localizan de manera similar (51). Estos experimentos indican claramente que existen distintas poblaciones de balsas en clulas y que pueden movilizarse a diferentes regiones de la clula despus de un estmulo. Balsas lipdicas Y Sealizacin Celular La existencia de diferentes clases de las balsas de lpidos (adems de caveolae invaginado) tiene implicaciones significativas para la funcin de estos dominios de la membrana en la sealizacin celular. Un nmero de posibilidades se resumen a continuacin para proporcionar un marco para la interpretacin de la mirada de observaciones experimentales a veces en conflicto en relacin con balsas y de sealizacin celular. Esto es seguido por una discusin de los estudios sobre el papel de las balsas lipdicas en dos sistemas de sealizacin diferentes: los receptores de tirosina quinasas y los sistemas de receptor acoplados a protena G. En el caso ms simple, balsas pueden ser vistos como una seal de plataformas que sirven para colocalize los componentes necesarios, facilitando su interaccin y el apoyo de sealizacin. En este escenario, receptores, factores de

acoplamiento, enzimas efectoras, y los sustratos se colocalized en una sola balsa. La va se activa por la unin de hormonas. La transduccin de seales se producira rpidamente y de manera eficiente debido a la proximidad espacial de los componentes que interactan. Especificidad de la sealizacin se podra mejorar mediante la restriccin de la localizacin del receptor a una clase particular de balsas que contiene un subconjunto especfico de los componentes de sealizacin. Esta restriccin sera limitar el acceso del receptor a los componentes de otras vas de sealizacin y prevenir de sealizacin no especficos. Adems, el potencial para la localizacin espacial de los propios balsas lipdicas podra admitir la activacin focal de la va, la introduccin de especificidad adicional en la respuesta. En un modelo ms complicado, componentes complementarios de una va de sealizacin seran segregados en diferentes balsas lipdicas en condiciones basales. La estimulacin de la clula con un factor o la hormona de crecimiento dara lugar a la fusin transitoria de las balsas lipdicas. Alternativamente, balsas podran contener una va de sealizacin casi completa que se activa cuando un receptor u otra molcula requerida que se localiza normalmente en la parte nonraft de la membrana se reclutaron en la balsa. Esto colocalize los diversos componentes, la promocin de interacciones y que conduce a la activacin de una va de sealizacin. En estos escenarios, balsas pueden ofrecer regulacin a travs de compartimentacin, el flujo a travs de una va de sealizacin propuesta est restringido debido a la localizacin de los componentes que interactan en diferentes compartimientos fsicos. En esta situacin, la localizacin de las protenas a las balsas no se requiere especficamente para el funcionamiento de la va. Ms bien, las balsas proporcionan una separacin fsica de las protenas que de otra manera interactuar, lo que lleva a la activacin no regulada de una va. Esto implica que la interrupcin de las balsas lipdicas podra conducir a la desregulacin de algunas vas de sealizacin, una prediccin que se ha confirmado experimentalmente. Las balsas de lpidos tambin podran controlar la sealizacin celular mediante la modulacin de las actividades intrnsecas de protenas localizadas dentro de ellos. Esto podra ser debido al lpido especfico medio ambiente presente en balsas o podra ser el resultado de la estrecha aproximacin en balsas de una protena de sealizacin con una molcula reguladora. La observacin de que algunas tirosina quinasas receptoras comportan de manera diferente cuando estn en las balsas de lpidos que cuando estn en las membranas nonraft apoya un papel de balsas en la modulacin de la actividad de las protenas balsa (ver ms abajo). En algunos sistemas, balsas pueden desempear un papel ms sutil en la sealizacin. Muchas protenas balsa no estn completamente localizados en balsas lipdicas, pero en lugar de particin a varios grados entre la balsa y nonraft porciones de la membrana. Este es el caso de las tirosina quinasas receptoras. Si estas tirosina quinasas funcionar de manera diferente en balsa y membranas nonraft y tener acceso a diferentes subconjuntos de sealizacin asociados en los diferentes compartimentos, es posible que el mismo receptor podra activar diferentes vas de sealizacin, dependiendo de donde estaba localizado. Por lo tanto, los cambios en la particin de las molculas entre balsa y compartimentos nonraft (debido a cambios en los niveles de

colesterol?) Podra alterar la relacin de sealizacin a travs de diferentes vas. Las balsas tambin pueden desempear un papel en la terminacin de la seal. Las balsas se sabe que estn implicados en los acontecimientos endoctica (5, 8), y podra limitar la sealizacin celular mediante la internalizacin de los componentes especficos, que les impide seguir participando en un camino particular. Las balsas de lpidos en los receptores de tirosina quinasa SEALIZACIN Muchos receptores de tirosina quinasas, incluyendo el receptor de EGF, el receptor de PDGF, y el receptor de la insulina, se ha demostrado que estar localizado en las balsas de lpidos (35, 36, 5254). A diferencia de algunas otras protenas de lpidos balsa, estas tirosina quinasas receptoras de transmembrana son, en general, no se ha recuperado en 1% fracciones X-100-resistentes Triton sino ms bien estn aislados con otros marcadores de balsas lipdicas slo cuando se utilizan mtodos no detergentes de preparacin (55-57 ), sin embargo, los mtodos que utilizan menores concentraciones de Triton X-100 o ms suaves detergentes a veces producir material en el que estos receptores balsa-localizados se conservan en la fraccin de detergente-resistente (57, 58). Por lo tanto, es evidente que la naturaleza de la asociacin de los receptores de tirosina quinasas con balsas difiere de la de otros marcadores de balsas, tales como protenas GPIanchored, que son altamente resistentes a detergente. Esto ha dado lugar a la hiptesis de que los depsitos de lpidos pueden ayudar a centrar las memorias de balsas (59). Aunque muchos receptores tirosina quinasas se localizan en balsas de lpidos, el efecto del ligando sobre esta asociacin es muy variable (que se resumen en la Tabla 1). Receptores de EGF se mueven rpidamente fuera de las balsas de lpidos tras la activacin por ligando (60), un comportamiento que es nico entre los receptores de tirosina quinasas. En las clulas que contienen caveolae, receptores de insulina estn constitutivamente secuestradas en caveolas (58). Sin embargo, en las clulas que carecen de caveolae, receptores de insulina son reclutados en las balsas mediante la adicin de insulina. La localizacin de receptores de factor de crecimiento nervioso (NGF) y PDGF a las balsas parece ser relativamente poco afectada por ligando (35, 61). Las implicaciones funcionales de tales cambios en la compartimentacin del receptor no est claro, sin embargo, una correlacin aproximada entre el efecto del ligando sobre la localizacin del receptor y el efecto de agotamiento de colesterol en la sealizacin mediada por el receptor (Tabla 2) sugiere que los receptores que permanecen en, o son contratado para, despus de la unin del ligando balsas son mucho ms dependientes de la integridad de balsa para la funcin de receptores que son balsas de salida tras la unin del ligando. Varios mtodos han sido utilizados para investigar el papel de las balsas lipdicas en la sealizacin celular. Un enfoque ha sido estimular las clulas con un factor de crecimiento y luego aislar la balsa y las membranas nonraft y determinar en qu compartimento se ha producido un evento de sealizacin especfica. El uso de este enfoque, se ha demostrado que la autofosforilacin del

receptor de PDGF, as como la fosforilacin de tirosina de otros sustratos celulares se produce principalmente en las balsas de lpidos y es muy dbil en las membranas nonraft (35, 62). TABLA 1. Resumen de los efectos de la unin del agonista en el receptor de localizacin

EGF, factor de crecimiento epidrmico; NGF, factor de crecimiento nervioso; PDGF, factor de crecimiento derivado de las plaquetas. a) ErbB2 no se une directamente a un ligando agonista, pero se activa mediante la formacin de heterodmeros con receptores de EGF activados por ligando. b) Los receptores de insulina residen constitutivamente en caveolas en las clulas que expresan caveolina pero para moverse en las balsas de lpidos tras la unin a la insulina en las clulas que no expresan caveolina. TABLA 2. Resumen de los efectos del agotamiento de colesterol en la sealizacin a travs de receptores tirosina quinasas

MAPK, MAP quinasa -. Indica un efecto positivo. - Indica un efecto negativo. 0 indica que no hay cambio. Del mismo modo, la fosforilacin del receptor de NGF a TrkA se produce en gran medida dentro de las balsas de lpidos, y slo en este compartimento es TrkA se ha encontrado asociada con las molculas de sealizacin corriente abajo, Shc y la fosfolipasa C-(61). En consonancia con su movimiento de salida de balsas despus de la unin del ligando, receptor de EGF autofosforilada aparece tanto en balsa y compartimentos nonraft (observaciones no publicadas), sin embargo, el receptor de EGF parece activar la va de sealizacin MAPK en una manera que implica las balsas de lpidos. Se encontr estimulacin de Rat-1 clulas con EGF para dirigir a la contratacin de Raf-1 a las balsas de lpidos en 30 segundos (36). Dado que el reclutamiento de Raf-1 a las membranas

es un paso inicial en la activacin de MEK y MAPK posteriormente, esta localizacin inducida por EGF de Raf-1 a las balsas de lpidos sugiere que la sealizacin de MAPK puede ser iniciada dentro de este compartimiento. De acuerdo con esta interpretacin es la constatacin de que la activacin de MAPK por PDGF puede ser recapitulado in vitro utilizando nicamente aislados membranas de lpidos balsa (63). Adems de la activacin de MAPK, tirosina quinasas parecen activar otras vas de transduccin de seal en gran medida desde el interior de las balsas. Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PTD-Ins (4,5) P2) es el principal sustrato para el factor de crecimiento estimulado rotacin fosfatidilinositol, la generacin de los dos segundos mensajeros intracelulares inositol trifosfato y diacilglicerol. Los estudios con clulas MDCK, clulas Neuro 2a, y las clulas A431 indican que tanto como la mitad de los celulares PtdIns (4,5) P2 est presente en las balsas de lpidos (56, 64, 65). La estimulacin de las clulas A431, ya sea con EGF o la bradiquinina dado lugar a la prdida dependiente del tiempo de PtdIns (4,5) P2 de la fraccin de baja densidad con ningn cambio en el nivel de nonraft Ptd-Ins (4,5) P2, lo que indica que rotacin de fosfatidilinositol se produce en las balsas de lpidos en lugar de en la membrana plasmtica a granel (65). Del mismo modo, la estimulacin de las clulas PC12 con NGF induce la hidrlisis de esfingomielina que slo que est presente en las balsas de lpidos (54). Por lo tanto, una variedad de vas de sealizacin que utilizan protenas y componentes de lpidos parece ser iniciado en las balsas de lpidos.

Un segundo enfoque para estudiar la funcin de las balsas de lpidos implica clulas ozono de colesterol. Las balsas de lpidos se mantienen unidas en gran medida a travs de las interacciones entre el colesterol y esfingolpidos. Por lo tanto, la integridad de estos dominios puede ser alterada por el tratamiento de las clulas con agentes tales como filipin o metil-ciclodextrina que secuestran o eliminar el colesterol (66-68). En contraste con los estudios descritos anteriormente en el que el fraccionamiento de membrana se utiliza en ltima instancia para identificar la funcin de balsa, el agotamiento de colesterol permite un anlisis de la funcin de las balsas lipdicas en la sealizacin celular en clulas intactas. Consistente con un papel positivo para las balsas de lpidos en la transduccin de la seal, el agotamiento de colesterol generalmente conduce a un deterioro significativo de la capacidad de los receptores de tirosina quinasas de la seal (que se resumen en la Tabla 2). El tratamiento con metil-ciclodextrina disminucin de la fosforilacin estimulada por insulina de su receptor, el IRS-1, y la ATP citrato lysase, as como la insulina estimula la captacin de glucosa y la oxidacin (52, 58, 69, 70). La insulina estimulada por la activacin de PI-3-quinasa, tal como se mide a travs de la activacin de PKB / Akt, as como la activacin de MAPK, tambin se redujo tras el agotamiento de colesterol (69). El agotamiento de colesterol celular, ya sea con filipin o lovastatina inhibe la activacin estimulada por PDGF-PI-3 quinasa (71) y la actividad de la tirosina quinasa (62). Del mismo modo, el agotamiento de colesterol alterada NGF estimulada por la activacin de MAPK y la autofosforilacin del receptor (72), e inhibi la estimulada por EGF metabolismo de PI (68).

La excepcin obvia a la regla de que el agotamiento de colesterol inhibe la sealizacin del receptor de tirosina quinasa es el receptor de EGF (Tabla 2). Para este receptor, la unin del ligando, la dimerizacin del receptor, y la autofosforilacin, as como la activacin de MAPK, son todos mejorada siguiente interrupcin de las balsas de lpidos (73-76). Teniendo en cuenta que el receptor de EGF es tambin el nico receptor que se mueve fuera de las balsas tras la unin agonista, es tentador especular que estos dos comportamientos nicos estn relacionados. La observacin de que el receptor de EGF puede activar MAPK en la aparente ausencia de balsas lipdicas sugiere que las balsas no pueden ser absolutamente necesarios para la activacin de esta va. En efecto, la evidencia experimental sugiere que la activacin de los componentes de la cascada de sealizacin de MAPK no se produce exclusivamente en las balsas de lpidos. Por ejemplo, la unin de GTP a H-Ras conduce a la liberacin de esta protena de sealizacin de balsas (77). Por otra parte, la adicin de seales de orientacin a Raf-1, la protena inmediatamente aguas abajo de Ras, ya sea para dirigir en balsas o evitar que entre en balsas, no altera la capacidad de la protena Raf-1 modificado para participar en la activacin de MAPK ( 78). Por lo tanto, los pasos posteriores de la va MAPK no pueden tener lugar en balsas en absoluto, y solamente los primeros pasos de la activacin de MAPK pueden ocurrir tanto en balsa y fracciones nonraft, dependiendo del tipo de receptor. La observacin de que algunos eventos de sealizacin de hormonas estimuladas se han mejorado tras el agotamiento de colesterol revela un papel regulador negativo de balsas en la transduccin de seal. Como se seal anteriormente, el agotamiento de colesterol aumenta la actividad MAPK basal y estimulada por EGF aumenta la activacin de MAPK (73, 74, 78). El aumento de la actividad MAPK basal parece ser dependiente de actividad de la PI (78) 3-quinasa y para implicar la activacin independiente de ligando del receptor de EGF (79). Al parecer, este PI 3-quinasa va dependiente de la activacin se suprime normalmente en la presencia de balsas intactas. La base para mejorar la activacin de MAPK estimulada por EGF en las clulas empobrecido en colesterol (73, 74, 78) no se conoce, pero puede ser debido a la activacin de una va no tradicional similar que se suprime normalmente cuando los componentes de sealizacin estn restringidos a las balsas de lpidos . Alternativamente, esto puede ser el resultado de la capacidad del medio ambiente especializado de las balsas de lpidos para modular la actividad intrnseca del receptor de EGF. El agotamiento de colesterol por el tratamiento de las clulas con metil-ciclodextrina conduce a un aumento tanto de la actividad de quinasa intrnseca y la unin de EGF tirosina protena (74-76). Estos hallazgos sugieren que la funcin del receptor de EGF puede ser suprimida por el colesterol o la localizacin de dominios cholesterolenriched. Por lo tanto, adems de servir como plataformas para la iniciacin de la seal, las balsas de lpidos puede proporcionar un nivel tnico de la regulacin negativa de molculas de sealizacin, lo que ayuda a suprimir la sealizacin espurias. Si bien es evidente que los dominios de membrana enriquecida en colesterol son importantes en la transduccin de seal de receptor de tirosina quinasa, un modelo general an no se ha desarrollado por su papel en este proceso. Algunas vas, tales como metabolismo de PI, pueden

requerir universalmente balsas para colocalize el receptor de activacin con sus molculas efectoras y una fuente de sustrato para la produccin de segundos mensajeros. Esta va puede representar el modelo en el que una balsa contiene algunos o todos los componentes de sealizacin necesarios, que requiere slo hormonas para reclutar los elementos finales y de activacin del activador de la va. Para otras vas tales como la activacin de MAPK, el papel de las balsas de lpidos parece ser ms compleja y receptor especfico. Los receptores que son reclutados o restringidos a las balsas de lpidos pueden preferentemente iniciar MAPK sealizacin de ese compartimento, pero ms tarde los acontecimientos pueden ocurrir fuera de ese dominio. En esta situacin, balsas pueden facilitar la sealizacin mediante la localizacin de los componentes en un espacio restringido, lo que permite ms rpida y eficiente de interaccin para los receptores como el receptor de EGF que se puede mover fuera de las balsas, la funcin de las balsas lipdicas es menos claro. Algunos componentes de la cascada MAPK son reclutados para balsas tras la unin de hormonas, pero la activacin de la va no parece estar restringida a ese dominio, ya que los receptores que se encuentran fuera de las balsas son capaces de participar de la va. A este respecto, el receptor de EGF se diferencia de otras tirosina quinasas receptoras que no parecen ser capaces de iniciar la sealizacin MAPK en la ausencia de balsas lipdicas. Qu propiedad del receptor de EGF confiere esta capacidad nica que queda por determinar, pero puede estar relacionado con los otros dos propiedades nicas del receptor de EGF: i) su capacidad para salir de balsas tras la unin del ligando, y ii) la inhibicin del receptor de EGF de unin intrnseca y actividades quinasa de colesterol o lpidos balsas. Estas ltimas observaciones apuntan a la posibilidad de que en algunos sistemas, balsas son ms importantes para la supresin de la sealizacin que para el apoyo a la sealizacin. Las balsas de lpidos en g SISTEMAS receptor acoplado a protena Se han mostrado un gran nmero de receptores acoplados a la protena G para ser enriquecido en balsas de lpidos o caveolae. Esto incluye y los receptores adrenrgicos, receptores de adenosina, receptores de angiotensina II de tipo 1, los receptores EDG-1, receptores de endotelina, m receptores colinrgicos muscarnicos (80), rodopsina (81), y la bradiquinina y los receptores B B (39, 82-88) . Al igual que los receptores de tirosina quinasas, la localizacin de los receptores acoplados a la protena G a las balsas de lpidos es modulada por ligando (Tabla 1). Para el receptor adrenrgico (89, 90) y el receptor de adenosina A (85), el tratamiento con agonista de causas translocacin del receptor afn de las balsas de lpidos o caveolae. Por el contrario, la angiotensina II tipo 1 receptor (90), el receptor muscarnico (80), el receptor de EDG-1 (86), y la bradiquinina y los receptores B B (87, 88, 91) estn dirigidas a las balsas tras la activacin por agonista. La localizacin del receptor de endotelina es aparentemente afectada por agonista (39). La importancia funcional de estos cambios inducidos por el agonista en la localizacin del receptor no se ha demostrado de manera inequvoca. Sin embargo, es posible que el movimiento ligandinduced de los receptores en las balsas de lpidos puede promover la asociacin con el receptor de las protenas G y enzimas efectoras que se enriquecen en este compartimiento. Adems, muchos receptores acoplados a protenas G son insensibilizados a travs de un mecanismo que implica el secuestro de los receptores de la superficie celular (92). Las balsas de

lpidos y caveolae se sabe que estn implicados en la endocitosis (5, 8). Por lo tanto, para los receptores que son reclutados en las balsas de lpidos-caveolae despus de la adicin de agonista, es posible que el reclutamiento a las balsas no slo inicia la sealizacin, pero tambin representa la primera etapa de la desensibilizacin de esa seal. Los experimentos en el receptor de acetilcolina muscarnico y el apoyo del receptor de angiotensina II tipo 1 esta hiptesis (89, 90). Igual de importante que la localizacin de los receptores acoplados a la protena G a las balsas de lpidos es la distribucin de las protenas G en s. Una variedad de protenas G se han notificado a ser enriquecido en balsas de lpidos y / o caveolae como Gs, Gi, Go, Gq y transducina (15, 37, 38, 68, 81, 93-95). La localizacin de las protenas G a las balsas de lpidos parece ser el resultado de la acilacin de la subunidad de estas protenas (96). Ah, y Schnitzer (97) informaron que Gq interacta con la caveolina, por lo que se concentra en caveolae, mientras que Gi y Gs no se unen caveolina y por lo tanto estn dirigidos a las balsas lipdicas de forma predeterminada. Por lo tanto, diferentes protenas G pueden separar en diferentes subtipos de balsas de lpidos dependiendo de la presencia de otros componentes en la clula. Una posibilidad interesante es que el diferencial de focalizacin de protenas G para caveolae o balsas de lpidos podra conducir a una segregacin inducida por el agonista en paralelo de los receptores que interactan con las protenas G en el mismo compartimiento. Este mecanismo podra mejorar la selectividad del receptor para la activacin de vas de sealizacin especfica localizada a un subconjunto de las balsas lipdicas o caveolae. Adems del enriquecimiento de los receptores y protenas G en las balsas de lpidos o caveolae, varias protenas enzimas efectoras G se han notificado a estar presente en o reclutado a las balsas de lpidos despus de la activacin del receptor. El monofosfato de guanosina cclico (GMPc) fosfodiesterasa involucrada en el sistema de transduccin de la seal visual ha demostrado ser reclutados por DRM despus de la estimulacin de la membrana externa del segmento barra con la luz y la guanosina trifosfato gamma tio (GTP-S) (81). Se han encontrado varias diferentes formas de la adenilato ciclasa, incluyendo los tipos III, IV, V, y VI, estar localizado en las balsas de lpidos (82, 84, 95, 98-100). Adenilato ciclasa endgena parece concentrarse constantemente en las balsas de lpidos, mientras que la adenilato ciclasa sobreexpresa distribuye a un grado variable entre las balsas y las membranas plasmticas a granel, dependiendo del tipo examinado celular (82, 84, 100). Enfoques similares a los utilizados para estudiar los sistemas de la tirosina quinasa del receptor se han empleado para investigar protena G-receptor acoplado a la sealizacin en las balsas de lpidos. Uso de fraccionamiento de membrana, la rodopsina se muestra a estar presentes en las balsas de lpidos, y la activacin por la luz induce la translocacin de la transducina y GMPc fosfodiesterasa en balsas (81). Esto sugiere que los primeros pasos de la transduccin de seal visual es probable que ocurran en este compartimento rodeado de membrana. Ms extenso trabajo ha demostrado la importancia de la localizacin balsa en el sistema de sealizacin del receptor 2-adrenrgico. En miocitos cardiacos neonatales, 2 - adrenrgicos son altamente enriquecido en lpidos balsas caveolae. Por el contrario, 2 - adrenrgicos y adenilato

ciclasa distribuir entre balsas y la membrana plasmtica mayor (82, 84). Receptores prostanoides EP2 estn excluidos de las balsas. La sobreexpresin de la adenilato ciclasa, que se enriquece en las balsas de lpidos, conducido a una mayor mejora de la 2 - adrenrgico actividad estimulada de 2 - adrenrgico actividad estimulada, y no para aumentar la respuesta a la prostaglandina E2 (84). Ostrom et al. (84) sugirieron que la capacidad de la adenilato ciclasa sobreexpresado para mejorar la sealizacin del receptor correlacionadas con el grado en que el 1 - y 2 - receptores colocalized con 2 - adenilato ciclasa en las balsas de lpidos. Se pensaba que los agonistas derivarse del hecho de que el receptor 1-adrenrgico se mantuvo en balsas despus de la estimulacin hormonal, mientras que los agonistas inducen la migracin del receptor 2-adrenrgico de las balsas de lpidos - El aumento selectivo de la respuesta a 1 - 2 con ascompared. Este sera separar el receptor 2-adrenrgico de su protena G y adenilato ciclasa efector, y el lmite de sealizacin. Este agonista-promovi la salida del receptor 2-adrenrgico de balsas fue inhibida por la expresin del pptido C-terminal de la cinasa del receptor adrenrgico-(-ARK), que bloquea la activacin endgena de-ARK por subunidades G secuestrantes (101). Concomitante con este receptor de inhibicin del movimiento hacia fuera de las balsas lipdicas, hubo una mejora de la produccin de cAMP estimulada por _2-adrenrgico. Juntos, estos datos son consistentes con la hiptesis de que la localizacin de los receptores _adrenrgicos en raftscaveolae lpidos promueve su interaccin con las protenas G y adenilato ciclasa, y mejora su respuesta al agonista. Otras vas de sealizacin de la protena G-mediadas tambin parecen estar activada principalmente en balsas lipdicas. En las clulas A431, una gran parte de los PtdIns (4,5) P2 se concentra en las balsas de lpidos, y la hidrlisis de la bradiquinina-estimulada de Ptd-Ins (4,5) P2 utiliza slo esta balsa-piscina localizada de Ptd Ins-(4 , 5) P2 (65). Del mismo modo, en las plaquetas de la produccin de trombina-estimulada de cido fosfatdico y de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato se concentra en gran medida en balsas (102). La produccin de cido fosfatdico podra ser un resultado de la generacin de diacilglicerol debido al metabolismo de PI, y es por lo tanto compatible con la compartimentacin de la facturacin fosfatidilinositol en las balsas de lpidos. La produccin focal de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato sugiere que, adems de metabolismo de PI, fosfatidilinositol 3-quinasa de activacin de las plaquetas tambin se pueden localizar en balsas de lpidos. La endotelina estimula la activacin de MAPK a travs de un mecanismo que implica Gq y la fosfolipasa C-_ activacin. La capacidad de la endotelina para estimular MAPK es dependiente de palmitoilacin del receptor de la endotelina, una modificacin que se orienten a las balsas de lpidos (103). Esto implica que la localizacin del receptor de la endotelina a las balsas de lpidos es necesario para la estimulacin de esta va de sealizacin Gqmediated, y es consistente con la conclusin de que la rotacin de PI se inicia en las balsas de lpidos.

En general, las conclusiones sugeridas por los estudios de fraccionamiento de membrana se confirman en gran medida en experimentos en los que G sealizacin del receptor acoplado a la protena se sondea a travs de agotamiento de colesterol (Tabla 3). Como fue el caso de los receptores de tirosina quinasa de sealizacin, el agotamiento de colesterol generalmente afecta protena G de sealizacin mediada. La bradiquinina estimulada por metabolismo de PI se encontr que estaba inhibida por el agotamiento de colesterol, que deslocaliza los PtdIns (4,5) P2 y otros componentes balsa (68). Del mismo modo, la trombina-estimulado la generacin de cido fosfatdico y la produccin de 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol es inhibida por el agotamiento de colesterol (102). Al igual que los estudios de fraccionamiento, estos datos sugieren que estos eventos de sealizacin mediada por la protena G requieren balsas lipdicas intactas y proceden dentro de este compartimento. Otros acoplados a la protena G-receptor de rutas de sealizacin activadas tambin son sensibles a la deplecin de colesterol. Estimulada por endotelina fosforilacin de la tirosina quinasa de adhesin focal de MAPK y fue inhibida por el tratamiento de los astrocitos primarios con filipin (104). Del mismo modo, el tratamiento de la arteria de la cola de rata de endotelio denudado con ciclodextrina condujo a la inhibicin de la endotelina-, 5-hidroxitriptamina-, y la vasopresina estimulada por contraccin de la clula muscular lisa (105). Transactivacin del receptor de EGF por la angiotensina, una va que implica Ca2_ y c-src, tambin estaba alterada siguiente agotamiento de colesterol (106). Estos datos indican que las balsas intactos son necesarios para la activacin de una variedad de protena G-receptor acoplado a vas de sealizacin. Como fue el caso de los receptores de tirosina quinasas, existe una excepcin a la conclusin general de que el agotamiento de colesterol inhibe T sealizacin del receptor acoplado a la protena. Tanto la activacin de adenilato ciclasa y la contraccin de miocitos mediada a travs del receptor _2adrenrgicos se han mejorado por el agotamiento de colesterol (82, 83). Curiosamente, como el receptor de EGF, que es la excepcin tirosina quinasa a lo general "inhibido-por-colesterolagotamiento" regla, el receptor _2-adrenrgico migra fuera de las balsas lipdicas despus de la unin agonista. Es posible que, al igual que el receptor de EGF, la actividad del receptor de _2adrenrgico es inhibida por el colesterol o el medio ambiente balsa lipdica. Esta inhibicin puede ser aliviado despus de la liberacin del receptor a partir de balsas, ya sea por el agotamiento de colesterol unin o ligando. La liberacin de todos los componentes balsa en la membrana plasmtica mayor mediante el tratamiento con ciclodextrina a continuacin, puede permitir receptor de G-interacciones protena-ciclasa ms productivos, lo que resulta en la produccin de AMPc elevada. Se necesitan ms estudios sobre el efecto del colesterol en la funcin del receptor _2-adrenrgico para aclarar estas observaciones. El hallazgo de que el agotamiento de colesterol mejora la fraccin de la rodopsina que se convierte en la conformacin activado por fotlisis (107) es consistente con la posibilidad de colesterol y las balsas de lpidos puede regular negativamente la funcin de algunos receptores. TABLA 3. Resumen de los efectos del agotamiento de colesterol en la sealizacin a travs de receptores acoplados a protenas G

_ Indica un efecto positivo. _ Indica un efecto negativo. 0 indica que no hay cambio. RESUMEN Las balsas de lpidos son subdominios organizados de la membrana plasmtica y otras membranas intracelulares, tales como el aparato de Golgi. Parecen ser pequeo en tamao, pero pueden constituir una fraccin relativamente grande de la membrana plasmtica. Mientras balsas tienen una protena distintiva y composicin de los lpidos, los estudios sugieren que no todas las balsas son idnticos en trminos de cualquiera de las protenas o los lpidos que contienen. Adems, las balsas de diferentes protenas o composicin de lpidos pueden espacialmente segregados en las clulas para llevar a cabo tareas especficas, como en la levadura de apareamiento o linfocitos que migran. Estas diferencias en la composicin y espacial es probable que sean importantes para la funcin balsa en la sealizacin celular. El cuadro general que emerge de estudios sobre el papel de las balsas lipdicas en la transduccin de seal es uno en el que las balsas parecen ejercer un control tanto positivo como negativo en la transduccin de seales. En su papel positivo, balsas que contienen diferentes protenas de sealizacin pueden clster o fusible a la estimulacin agonista, que conduce a la mezcla de los componentes y que resulta en la activacin de vas de sealizacin. En su papel negativo, balsas pueden segregar espacialmente componentes que interactan para bloquear la activacin de la va no especfica, o pueden suprimir directamente la actividad de las protenas de sealizacin presentes en las balsas. A pesar de una extensa investigacin se ha hecho sobre el papel de las balsas en la transduccin de seales, muchos de los estudios utilizan mtodos muy indirectos, tales como el agotamiento de colesterol, de implicar a las balsas en la sealizacin. Experimentos verdad inequvocos son raros. Por lo tanto, mientras que los datos son consistentes con un papel para balsas, hay un modelo unificador de exactamente cmo funcionan las balsas en la transduccin de la seal ha evolucionado todava. Seguir avanzando en la definicin del papel de las balsas en la sealizacin celular requerir el desarrollo de nuevas herramientas para visualizar con mayor eficacia las balsas de lpidos y para aislar y estudiar distintas poblaciones de estos dominios.