INFORMES DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

JEFFERSON IVAN GIL MANCIPE COD: 1132306 JESICA ESPERANZA CIFUENTE CRUZ COD: 1133861 ERIKA BEATRIZ CASAS ROMERO COD: 20081248 YULIETH KARINA CEPEDA COD: 200810813

UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACIN LIC. EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIN AMBIENTAL TUNJA 2008

INFORMES DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

JEFFERSON IVAN GIL MANCIPE COD: 1132306 JESICA ESPERANZA CIFUENTE CRUZ COD: 1133861 ERIKA BEATRIZ CASAS ROMERO COD: 20081248 YULIETH KARINA CEPEDA COD: 200810813

Trabajo de Biologa de los Microorganismos presentado a la Profesora: SONIA ECHEVERRY HERNANDEZ

UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACIN LIC. EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIN AMBIENTAL TUNJA 2008

LABORATORIO 1 MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE

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INTRODUCCION En el medio ambiente encontramos un grupo denso de organismos microscpicos, que se desempean en diferentes papeles como en la Industria, la Agricultura, la Medicina y los Alimentos. A la vez encontramos dos clases de microorganismos, los ubicuos que se encuentran en todos los ambientes y superficies, y los inocuos que son los no patgenos. JUSTIFICACION La microbiologa es cada vez una disciplina bsica, fundamental para muchos bilogos. Siendo esta nuestra base del estudio realizamos un laboratorio donde se pretenda demostrar que en diferentes ambientes (aire, agua, tierra) encontramos organismos que con la ayuda del microscopio los podemos observar. MARCO TEORICO Desde las primeras horas de la vida, el hombre y todos los animales son colonizados por microorganismos, y algunos de ellos vivirn en simbiosis permanente con su husped en la piel, el tracto digestivo, las vas respiratorias altas, los odos y en otros muchos tejidos, constituyndose en la flora microbiana.
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El trmino flora se debe a que la mayora de los microorganismos de nuestro cuerpo son bacterias, y stas pertenecan al reino vegetal. (1)

Afortunadamente esta cohabitacin es por lo general armoniosa y equilibrada, e incluso algunos microorganismos son benficos para nosotros y participan en muchos procesos bioqumicos, por lo que sin ellos no sera posible que tuviramos una existencia saludable. Sin embargo, como en todo ecosistema, si el equilibrio se trastoca o si algn microorganismo extrao invade alguna regin del organismo de tal modo que rebase los sistemas normales de defensa, surgen entonces distintos tipos de enfermedades. Como sabemos, las enfermedades infecciosas son la primera causa de muerte en el mundo, y los factores ambientales y los cambios en el organismo husped pueden propiciar que aparezca este tipo de enfermedades. (1) Algunos microorganismos fabrican nutrientes para el cuerpo. Las bacterias de la flora normal del organismo ejercen un control en el crecimiento de otros microorganismos nocivos; si no fuese as, seramos invadidos por ellos y nos causaran un grave dao. Tambin se sabe que la flora normal estimula el desarrollo del sistema inmune y que puede ayudar a proteger nuestros organismos de otras infecciones y enfermedades. (1) Sin embargo, algunos de los microorganismos con los que convivimos diariamente pueden significar un riesgo para nuestra salud si crecen de forma desmesurada o si alcanzan sitios en nuestro cuerpo en los que normalmente no habitan o de los que deben estar totalmente ausentes. (1) As, el cuerpo es un delicado ecosistema en donde viven simbiticamente un gran nmero de microorganismos con su husped humano. La cantidad y el tipo de microorganismo en un sistema como ste depende de factores tales como la temperatura, el grado de acidez o alcalinidad, la disponibilidad de agua y la existencia de determinados nutrimentos o sustancias inhibitorias. Ejemplos de desequilibrio simbitico en la relacin con los microorganismos que nos habitan son algunas infecciones comunes, como las caries o el acn, entre otros muchos ms. (1) La microflora normal en el hombre: Como en la mayora de los animales, en el organismo humano hay lugares que normalmente se mantienen estriles y otros donde cohabitan, tambin normalmente, una gran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aun en las personas ms sanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la mdula sea y las vas areas inferiores (bronquios y alvolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los mecanismos de defensa de un organismo saludable. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas, y otros muchos espacios, residen diversos microorganismos que conforman la flora normal del ser humano. Algunos de ellos pueden provocar a veces diversas enfermedades infecciosas debido a un desequilibrio interno o externo, como ya se dijo. Algunos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del

cuerpo y que se consideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, S. aureus, Streptococcus mitis, S. salivaris, S. mutans, S. faecalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, Neisseriae, Veillonellae, bacterias coliformes como E. coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos, clostridios como Clostridium tetani, corinebacterias, micobacterias, actinomicetos y micoplasmas. (1) No siempre es claro el porqu un cierto microorganismo causa a veces una enfermedad y no lo hace en otras ocasiones. Por ejemplo, los gneros Fusobacterium y Bacteroides son inofensivos si estn en su hbitat normal, que es el intestino grueso, pero provocan graves abscesos si alcanzan heridas en otras partes del cuerpo. El Staphylococcus aureus tambin causa graves cuadros infecciosos como invasor secundario despus de una infeccin viral o cuando algn antibitico ha alterado el equilibrio de la flora normal. (1) Algunos microorganismos de la flora normal pueden provocar infecciones bajo circunstancias especiales, como pueden ser: el Staphylococcus aureus en vas nasales y piel, que provoca enfermedades nosocomiales e intoxicacin por alimentos; las especies de Peptostreptococcus en boca, heces y vagina provoca la formacin de abscesos y gangrena; las especies de Neisseriae en faringe, boca y vas nasales provoca meningitis; las especies de Moraxella en vas nasales y vas genitourinarias provoca conjuntivitis; las especies de Haemophilus en nasofaringe, conjuntiva y vagina provoca laringotraqueobronquitis, meningitis, piartrosis, conjuntivitis y problemas en las vas genitourinarias. (1) Descripcin de Colonias: Para realizar una descripcin macroscpica de bacterias, se debe tener en cuenta los siguientes parmetros: elevacin, borde o margen, aspecto, consistencia, pigmento y olor. Aspecto: Brillante o Translcida. Opaca o Mate. Consistencia: Blanda. Dura. Mucoide. Pigmento: Amarrillo, Blanco, Negro, Gris, Rojo, Violeta, Verde. Olor: Aromtico, Ptrido, Alcohlica.

RESULTADOS Tipo de muestra Piel (dedos mano en superficie-agar) Crecimiento Positivo X Sin crecimiento Caractersticas del crecimiento Moderado, pigmentacin crema, tamao puntiforme, forma regular circular, mismo tamao de las colonias. Escaso, pigmentacin crema, tamao puntiforme, forma regular circular, diferente tamao de las colonias. Escaso, pigmentacin amarillo-rosado, tamao puntiforme, forma regular circular, diferente tamao de las colonias, se observo un hongo. Escaso, pigmentacin crema-rosado, tamao puntiforme, forma regular circular, mismo tamao de las colonias, se observaron dos hongos.

Cavidad Oral (tos)

Ambiente (Bao de dama)

Piel (yema de los dedos pasados sobre el mesn)

DISCUSIN DE RESULTADOS Como se observa en los resultados en el tipo de muestra de piel colocados directamente sobre la superficie del agar, nos dio lugar a un crecimiento moderado posiblemente debido a que el individuo que realizo esta prueba antes de llegar al laboratorio tuvo contacto con otros objetos inanimados que contiene diferentes microorganismos. Este anterior enunciado se confirma segn (1) quien afirma que la flora normal de la piel puede ser modificada por diversos factores ambientales, tales como la humedad y la temperatura, la edad, el sexo y la raza, ya que las caractersticas cutneas varan de unas personas a otras, lo que favorece la colonizacin y proliferacin de determinados grupos de microorganismos. Adems, la colonizacin de la piel depende de las caractersticas particulares de cada zona topogrfica del cuerpo, y de acuerdo con sta vara tambin el predominio de ciertos grupos de microorganismos. El siguiente tipo de muestra fue la tomada de la cavidad oral (tos) la cual presento un crecimiento escaso debido a que dicho sujeto no posea ninguna infeccin en esta parte del cuerpo. Segn (1) las innumerables bacterias del ambiente son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a travs de la nasofaringe, la trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. As, los senos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles; aunque la nasofaringe es el hbitat natural de bacterias y virus patgenos comunes que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios y pulmones. El siguiente tipo de muestra que ocurri fue la dejada en el bao de damas (ambiente) el cual presento un crecimiento escaso, quizs porque anteriormente realizaron la limpieza a dicho lugar; y las pocas bacterias que crecieron en el medio de cultivo fueron las que se encontraban en el aire. Por ltimo se realizo la prueba de yema de los dedos pasados sobre el mesn, la cual en comparacin con la muestra uno presento un crecimiento escaso debido a que el mesn fue desinfectado con hipoclorito de sodio pues esto es un requisito indispensable antes de cualquier prueba de microbiologa. CONCLUSIONES En el ambiente existen diversidad de microorganismos los cuales desempean un papel fundamental en los ecosistemas. La simbiosis entre el hombre y los microorganismos permite preservar y proteger la convivencia entre estos, si la homeostasis se viera afectada el microcosmos causara una alteracin en la vida humana. La flora microbiana es diferente en cada individuo debido a las condiciones biolgicas donde se encuentra ubicado este sujeto.

BIBLIOGRAFA TRATADO DE MICROBIOLOGIA.1969. MOULDER, MURDOCH & RIPPON. Decimonovena Edicin, Editorial Interamericana. Mxico. INFOGRAFIA http://www.unap.cl/csmar/MicrobMed/Floramicro.pdf
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LABORATORIO 2 TECNICAS DE COLORACION PARA BACTERIAS

pared de Gram negativos pared de Gram positivos www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/.../image009.jpg

INTRODUCCIN Las bacterias se clasifican dependiendo de la composicin qumica de su pared celular y con ayuda de la tincin de Gram, las podemos observar Gram positivas que se ven con coloracin azul o morado y las Gram negativas de color rojo o rosado. En el grupo de las bacterias podemos encontrar diferentes formas como lo son esfricas (cocos), cilndricas (bacilos), espiraladas (espirilos o espiroquetas) y las de forma de coma (vibrios). Las bacterias a la vez las podemos encontrar solitarias, en parejas (diplococos o diplobacilos), en grupos de 4 clulas (ttradas), en grupos de 8 a 16 clulas (sarcinas), en racimos (estafilococos) o en cadenas (estreptococos o estreptobacilos). El azul de metileno es otra coloracin que permite observar las estructuras bacterianas como la cpsula, las endosporas o los flagelos. JUSTIFICACION Por medio de este laboratorio se pretenda observar la clasificacin de bacterias Gram positivas o Gram negativas, con la ayuda de la tincin de Gram y las muestras o colonias obtenidas de la prctica anterior. Tambin analizamos el azul de metileno para la muestra de frotis de carrillo.

MARCO TEORICO Tincin de Gram: La coloracin de Gram se encuentra entra las ms importantes para las bacterias. Fue elaborada por el dans Hans Christian Gram en 1884, y permite distinguir entre diferentes bacterias que pueden mostrar una morfologa similar. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de Gram. (1) Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano. (1) Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, se describe a continuacin la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul. (1) Posteriormente el portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodoyoduro potsico o lugol. El ingrediente activo es aqu el I 2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situacin. (1) Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I 2 -cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal

violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava azules, pero las Gram negativas son incoloras. (1) Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. (1) Morfologa Bacteriana: La tincin de Gram aporta dos ideas bsicas para la definicin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, los microorganismos Gram positivos aparecen teidos de color azul-violeta y Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. (1) Las formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin Gram son: Cocos: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao. (1) Bacilos: Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos. (1) Espirales: Treponemas, Borrelias. (1) Azul de Metileno: El azul de metileno es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia. Es un compuesto qumico heterocclico aromtico con frmula molecular: C16H18ClN3S. (2) En medicina se usa como tintura para teir ciertas partes del cuerpo antes o durante la ciruga. Su uso es principalmente como antisptico y cicatrizador interno. Tambin se utiliza como colorante en las tinciones para la observacin en el microscopio. En acuacultura por los hobbistas de peces tropicales para tratar las infecciones fngicas. Tambin puede ser efectivo para tratar peces infectados con el parsito protozoa ich: Ichthyophthirius multifiliis. (2)

Endosporas: Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. (1) Levaduras: Levadura es el nombre genrico dado a un grupo de hongos Ascomicetes pertenecientes al orden Endomicetales. Las levaduras son microhongos que se encuentran generalmente en forma de clulas nicas y que se reproducen mediante gemacin. Algunas levaduras estn formadas nicamente por clulas individuales y a veces cadenas cortas, mientras que otras se encuentran con un cierto rango de formas celulares, incluyendo diversos tipos de filamentos. Una caracterstica de la poblacin en crecimiento de las clulas de levaduras es la presencia de yemas, producidas cuando la clula se divide. La clula hija comienza siendo una pequea yema, que va creciendo hasta que alcanza un tamao similar al de la madre y entonces se separa. Para la reproduccin sexual forman ascas. (3) La membrana celular consta de polisacridos y muy poca quitina. Tienen glucgeno como sustancia de reserva y contienen tambin numerosas vitaminas. Provocan la fermentacin alcohlica de las masas de harina y de los lquidos azucarados, y muchas de ellas se utilizan para obtener bebidas y elaborar pan y otros productos. La levadura es una anaerobio facultativo: transformando azcar a la misma velocidad, la levadura aerbica produce dixido de carbono, agua y una produccin relativamente alta de nueva levadura, mientras que la levadura crecida anaerobicamente tiene una velocidad relativamente lenta de crecimiento, que ahora se acopla a una alta conversin de azcar en alcohol y dixido de carbono.
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RESULTADOS Muestra Piel (dedos mano en superficie-agar) Piel (yema de los dedos pasados sobre el mesn) Frotis de carrillo Color de la Bacteria Morado-Gram positivas. Morado-Gram positivas. Rosado-Gram negativas. Forma de la Bacteria Cocos (esfricos) Esfricos (ms grandes que los cocos) Cocos (esfricos) Agrupacin de la Bacteria Diplococos, Estafilococos. Levaduras. Diplococos.

DISCUSIN DE RESULTADOS Como se observa en la tabla y los esquemas de los resultados, la muestra de piel colocada directamente sobre el agar mostr un dato esperado como lo son las bacterias Gram positivas, en forma de cocos y con agrupaciones de diplococos y estafilococos lo cual lo confirma (4) quien demuestra que estos microorganismos estn presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamferos y aves. Tambin los estafilococos crecen fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en condiciones aerbicas se da el mejor crecimiento, su mayor velocidad de crecimiento es de 5-25 C; pero tambin se puede ver en activa fisin binaria entre 30 y 27 C. Adems producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos y tienen importancia medica mayoritariamente el S. aureus, y en humanos adems de ste, el S. saprofiticus y el S. epidermides. El siguiente resultado fue de la colonia de bacterias que crecieron de la muestra de yema de los dedos pasados sobre el mesn, la cual nos dio levaduras de color morado. Segn (5) los hongos suelen establecerse en reas hmedas del cuerpo donde rozan dos superficies cutneas: entre los dedos de los pies, en las ingles y bajo las mamas. Por extrao que parezca, las infecciones micticas en una parte del cuerpo pueden causar erupciones en otras partes no infectadas. Por ejemplo, una infeccin mictica en el pie puede causar una erupcin abultada y pruriginosa en los dedos. Estas erupciones representan reacciones alrgicas al hongo. Por ltima muestra fue la analizada bajo el azul de metileno, el cual era el frotis de carrillo como resultado nos dio bacterias Gram negativas en forma de cocos y agrupacin en diplococos. Esto microorganismos de la cavidad bucal se adhieren a diferentes ambientes fisicoqumicos y nutricionales, como la mucosa del carrillo, la lengua, las hendiduras gingivales y la superficie de los dientes, favorecen la adherencia y el crecimiento de tipos selectos de microbios. Segn (6) las fuentes intrnsecas de nutrientes para los microorganismos de la cavidad bucal son los materiales que se encuentran en torno de los dientes, los exudados, las clulas epiteliales degradadas y los componentes de la saliva, ciertas protenas salivales proporcionan aminocidos que influyen en el crecimiento de Streptococcus mutans y de Streptococcus sanguis; la saliva de los sujetos con caries influye mejor en el crecimiento de los Streptococcus mutans. Adems la comida que ingerimos permanece en la cavidad bucal, y sirve como fuente extrnseca de nutrientes para la microflora bucal. Respecto a la tincin de Gram conteste las siguientes preguntas: a. Por qu el cristal violeta se considera un colorante primario? El cristal violeta se considera como colorante primario ya que contiene seis grupos metilo y es un colorante catinico que penetra en todas las clulas bacterianas. (7)

b. Por qu el lugol se considera un mordiente? El lugol o solucin de Lugol es una solucin de I2 (1%) en equilibrio con KI (2%) en agua destilada. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico, para cubrir deficiencias de yodo, y para la desinfeccin de agua en emergencias. En microbiologa, es empleado en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta; por lo que se denomina como mordiente al lugol debido a que forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. (7) (8) c. Por qu la fucsina de Gram se considera un colorante contraste? La fucsina de Gram es un colorante de contraste para poner en manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza esta coloracin. (7) d. De las tinciones o coloraciones empleadas en la prctica, Cul se considera simple y cual diferencial? Justifique su respuesta. Las coloraciones en microbiologa se utilizan para observar la morfologa bacteriana. Los tipos de coloraciones se dividen de acuerdo a la complejidad y a la afinidad estructural. Las coloraciones de acuerdo a la complejidad se dividen en 2 tipos que son la tincin simple y la tincin diferencial. (7) (9) La tincin simple se llama as porque nada mas usan un solo colorante, que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbol fucsina. Con este tipo de tincin se puede crear un contraste con el medio donde se est haciendo el frotis o tincin y se puede observar la morfologa y la disposicin bacteriana. La importancia esta en que es muy fcil de aplicar. Un ejemplo de uso de tincin simple esta cuando se ven levaduras y diferenciar las vivas de las muertas. (7) (9) En comparacin la tincin de Gram que es una tincin diferencial es aquella donde se usa ms de un colorante. Con esta tincin se puede observar morfologa, tamao, organizacin de las bacterias y adems categorizar los microorganismos.
(7) (9)

e. Cul es la utilidad de la tinta china y el verde de malaquita en las practicas de Microbiologa? La tinta china se utiliza en microbiologa para teir las cpsulas dependiendo qumicamente la pared de estas, las que no se colorean con facilidad se debe a que la cpsula contiene mucopolisacridos en su composicin. Para esto se emplean tinciones especiales como la coloracin de rojo congo que usa el principio de la coloracin negativa, en el cual se ve la cpsula como un halo claro contra un fondo oscuro. (10) (11) Las esporas son relativamente resistentes a los agentes fsicos y qumicos y no se colorean con facilidad por lo que se utiliza l verde de malaquita capaz de teir las esporas en caliente. (10) (11)

CONCLUSIONES Para la observacin de bacterias se deben tratar con colorantes o sustancias que se adhieran a su pared celular para la diferenciacin morfolgica. La clasificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas, se debe principalmente al color que tien. Aunque estas tambin poseen estructuras internas que las diferencian unas de otras. La tincin de Gram es una coloracin que permite una mayor diferenciacin para bacterias, en comparacin con el azul de metileno que solo usa un colorante para teir las estructuras. INFOGRAFIA http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioTinciones.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_metileno
(2) (1)

http://biocity.iespana.es/biocity/micro/leva.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus
(4)

(3)

http://www.msd.es/publicaciones/mmerck_hogar/seccion_18/seccion_18_202.htm 5 http://html.rincondelvago.com/flora-bucal.html
(6)

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://es.wikipedia.org/wiki/Lugol (8) http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_metileno http://es.wikipedia.org/wiki/Verde_Malaquita http://es.wikipedia.org/wiki/Tinta_china

(11) (9)

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LABORATORIO 3 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

http://www.mcd.com.mx/img/foto_catalogo.jpg

INTRODUCCION Los medios de cultivo son un sistema artificial que permite las condiciones ptimas y necesarias para el desarrollo de determinados microorganismos. De acuerdo con esto encontramos diferentes requerimientos nutricionales, distintos tipos de medios en cuanto a consistencia: lquidos, slidos, alrededor de 1.6% de Agar, semislidos 0.8% de Agar, que como se observa, la consistencia depende de la cantidad del Agar o de su ausencia, el Agar es componente esencial que proviene de las algas rojas, adems que es resistente a la accin de degradacin que realizan las bacterias. JUSTIFICACION Los medios de cultivo proporcionan nutrientes para el crecimiento y reproduccin de los microorganismos. El conocimiento de la nutricin microbiana es muy importante ya que se nos facilita saber en qu medio de cultivo podemos inocularlos para ayudarles en su desarrollo continuo. En este laboratorio desarrollaremos clculos matemticos para saber qu cantidad se necesita para preparar los diferentes medios de cultivo (slidos agares y lquidos caldos).

MARCO TEORICO Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. (1) En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el Agar, la gelatina o la slicagel. (1) Evolucin de los medios de cultivo: La microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. (2) La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. (2) Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. (2) En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. (2) Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de

enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos. (2) RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS 1. Revise la composicin qumica de los medios de cultivo empleados en la prctica. Para la preparacin de medios de cultivos se necesita componer una base mineral que proporcione todos los nutrientes que pueden suministrarse a cualquier organismo en forma inorgnica. Este medio base puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una fuente de energa, una fuente de nitrgeno y algn factor de crecimiento requerido. Estos suplementos variarn, naturalmente, de acuerdo con las peculiaridades de la nutricin del organismo en particular que desea cultivar. Un medio compuesto por completo de nutrientes qumicamente definido se denomina Medio Sinttico y uno que contiene ingredientes de composicin qumica desconocida se denomina Medio Complejo.
(3)

As que el medio de cultivo que empleamos tena por lo menos carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas y en muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministran originalmente. (3) 2. Consulte que es un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo diferencial. Ilustre con un ejemplo. Est claro que no hay un medio ni un conjunto de condiciones que puedan favorecer el crecimiento de todos los tipos diferentes de organismos que existen en la naturaleza. Por el contrario, cualquier medio que es adecuado para el crecimiento de un organismo especfico es, en cierto modo selectivo para el mismo. Adems, los microorganismos pueden obtenerse selectivamente de habitas naturales bien sea por aislamiento directo o por enriquecimiento as que un medio cultivo selectivo favorece el crecimiento especifico de un microorganismo particular, ha este medio de cultivo selectivo se le pueden agregar sustancias que ayuden al crecimiento de ciertos grupos de bacterias permitiendo as el crecimiento de otras dependiendo de la sustancia que desea ser aadida. Un ejemplo son los medios que llevan violeta cristal e inhiben el crecimiento de bacterias Gram- positivas. (3) En cambio un medio de cultivo diferencial contienes distintos compuestos qumicos o indicadores sobre los que se determina un microorganismo para esto

se adquieren coloraciones especficas que reaccionan de una manera determinada a la vez est destinado a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios que pueden ser Agar sangre que diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey el cual diferencia la lactosa+ de la lactosa. Un ejemplo seria en el medio EMB (eosina azul de metileno) ciertos tipos metablicos de bacterias producen cambios de color y precipitacin de sales cuando producen cidos por fermentacin de ciertas fuentes de carbono. Otro el medio agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad de hemlisis de ciertas bacterias. (3) 3. Establezca la diferencia entre un medio de cultivo natural y un medio de cultivo artificial o sinttico. Los medios de cultivo natural son sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. En comparacin con los medios de cultivo artificial o sinttico los cuales tienen una composicin qumica definida cualitativamente y cuantitativamente. (1) 4. Qu es una prueba de esterilidad? A travs de un ejemplo explique su utilidad en las prcticas de Microbiologa. La esterilizacin es un tratamiento que deja el objeto tratado libre de todo organismo vivo esto puede lograrse mediante exposicin a agentes letales fsicos o qumicos o, en el caso especial de las disoluciones, por filtracin as que para establecer los procedimientos de esterilizacin hay que tener en cuenta dos factores. La tasa de mortalidad y el tamao de la poblacin inicial as que en la prctica de esterilizacin, la poblacin microbiana que ha de ser destruida es casi siempre mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao de la poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la poblacin mixta. Estos son casi siempre las endosporas, altamente resistentes, de ciertas bacterias. Por consiguiente, para asegurarse de la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin, los objetos que se utilizan son suspensiones de esporas de resistencia conocida. (3) As pues teniendo en cuenta la cintica de la muerte microbiana, podemos formular el fin prctico de la esterilizacin mediante un agente letal de una manera ligeramente ms refinada: La probabilidad de que el objeto tratado contenga siquiera un superviviente debe ser infinitamente pequea. Por ejemplo, si queremos esterilizar un litro de un medio de cultivo, esta meta puede logarse para todos los fines prcticos si el tratamiento no deja ms de un sobreviviente por cada 10 a la seis litros. Bajo tales circunstancias, la probabilidad de fallo es ciertamente muy pequea de modo que los procedimientos de esterilizacin se plantean de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad. (3)

A la vez encontramos otro tipo de esterilizacin que es por calor ya que le calor es el agente letal ms ampliamente utilizado para la esterilizacin y los objetos pueden ser esterilizados por calor seco, aplicado en un horno en atmsfera de aire o por calor hmedo, que proporciona el vapor caliente. Por consiguiente la esterilizacin por calor seco requiere una duracin e intensidad mucho mayor por que la conduccin de calor es menos rpida en aire seco que en aire hmedo. Las bacterias pueden sobrevivir en estado de desecacin completa y, en este estado, la resistencia intrnseca al calor de las clulas vegetativas bacterianas est enormemente aumentada, casi hasta el nivel caracterstico de las esporas. (3) Por consiguiente, la tasa de muerte es mucho ms baja para las clulas desecadas que para las hidratadas. Por eso el calor seco se usa principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales slidos estables al calor luego los objetos se envuelven en papel o se les protege de otra forma de la contaminacin posterior y son expuestos a una temperatura de 170 o durante 90 minutos en un horno. (3) CONCLUSIONES De la composicin qumica depende mucho si se desea preparar un cultivo solido (Agar) o un medio liquido (caldos). La esterilidad al preparar un medio de cultivo es muy importante, debido a que no debe a ver contacto con los microorganismos del ambiente para tener un cultivo libre de organismos microscpicos. INFOGRAFIA http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/medicult.pdf http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioMedios.htm http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cap3.htm
(3) (2) (1)

RECONOCIMIENTO DE LA AUTOCLAVE

http://ccacolombia.com/tienda/images/Autoclave%20no%20electrico%2025%20lt.jpg

JUSTIFICACION En el reconocimiento de la autoclave se pretenda tener una idea global de la funcin que desempea cada parte para la esterilizacin de los recipientes contaminados con microorganismos. MARCO TEORICO Una autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material mdico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y temperatura para ello. El fundamento de la autoclave es que coagula las protenas de los microorganismos debido a la presin y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, as como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave. (1) Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centgrados. Un tiempo tpico de esterilizacin a esta temperatura y presin es de 15 minutos. El hecho de contener fluido a alta presin implica que las autoclaves deben ser de manufactura slida, usualmente en metal, y que se procure construirlas totalmente hermticas. (1) Las autoclaves son ampliamente utilizadas en laboratorios e instituciones mdicas, como una medida elemental de esterilizacin de material. Aunque cabe notar que debido a que el proceso involucra vapor de agua a alta temperatura, ciertos

materiales no pueden ser esterilizados en autoclave, como el papel y muchos plsticos (a excepcin del polipropileno). (1)

RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS Partes del Autoclave: Manmetro: Sirve para medir la presin de fluidos contenidos en recipientes cerrados. Un manmetro es un tubo; casi siempre doblado en forma de U, que contienen un lquido de peso especfico conocido, cuya superficie se desplaza proporcionalmente a los cambios de presin. (2) Reguladores de Presin: Un regulador es bsicamente una vlvula de recorrido ajustable conectada mecnicamente a un diafragma. El diafragma se equilibra con la presin de salida o presin de entrega y por una fuerza aplicada al lado contrario, a la cara que tiene contacto con la presin de salida. La fuerza aplicada al lado opuesto al diafragma puede ser suministrada por un resorte, un peso o presin aportada por otro instrumento denominado piloto. (2) El piloto es por lo general, otro regulador ms pequeo o un equipo de control de presin. (2) Tornillo de seguridad: Permite mantener el material fuera de la presencia del medio. (2) Palanquilla de la vlvula: Se puede definir como un aparato mecnico con el cual se puede iniciar o detener o regular el paso de gases mediante una pieza movible que abre y cierra, aislando una serie de lquidos gases, desde los mas simples hasta los ms corrosivos o txicos; sus tamaos van desde una fraccin de pulgada hasta 30ft o mas de dimetro. (2) Cierre hermtico: Mediante mariposas, exhalador de vapores y vlvula de control. La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manmetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (tambin llamado espita) y el tercero, para una vlvula de seguridad que funciona por contrapeso o resorte. (2) Recipiente exterior: Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metlica, que en la parte inferior recibe calor por combustin de gas o por una resistencia elctrica. (2) Explique la finalidad de las siguientes etapas de la esterilizacin empleando la autoclave:

1. Etapa de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilizacin. (2) 2. Etapa de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilizacin. (2) 3. Etapa de enfriado: Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y temperatura del caldern empiezan a bajar poco a poco. (2) Consulte otros mtodos de esterilizacin (fsicos y qumicos) La esterilizacin, tanto del material y medios frescos, como de los medios ya usados que haya sufrido contaminacin, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro. Esta esterilizacin suele efectuarse con calor hmedo en unos aparatos denominados autoclaves. En situaciones especiales, como en el caso de que algn componente del medio sea termolbil, puede usarse un sistema de esterilizacin por filtracin. (3) Mtodos Fsicos: Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas y fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. (3) Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. Cuando ste es de metal se deja permanecer en el rea de reduccin de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc.). Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio asptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la esterilizacin nunca es perfecta. (3) Calor Seco: El calor seco produce desecacin de la clula, esto es txico por niveles elevados de electrolitos y fusin de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. (3) Mtodos Qumicos:

Agentes Qumicos: La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antispticos tiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina). (3) Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas. (3) Glutaraldehdo: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc. (3) CONCLUSIONES Es necesario tener un conocimiento bsico sobre la utilizacin y manejo de la autoclave. La esterilizacin por medio de diversos mtodos es fundamental debido a que algunos microorganismos no se destruyen utilizando solamente la autoclave. INFOGRAFIA http://es.wikipedia.org/wiki/Autoclave
(1)

www.etsea2.udl.es/invitro/autoclau.htm

(2)

http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml

(3)