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7.7.2011

BACHELOR MODELLSYSTEME IN DER MOLEKULARBIOLOGIE 2010/11
BACHELOR
MODELLSYSTEME IN DER MOLEKULARBIOLOGIE
2010/11

Kleine Zusammenfassung / Ergänzung und Mitschrift aus der Vorlesung natürlich keine Garantie um durch die Prüfung zu kommen aber hoffentlich bringts euch a bissal was ; ) | Liza

Modellsysteme in der Molekularbiologie Ringvorlesung WS 2011

Modellorganismus = von vielen verschiedenen Wissenschaftlern sehr extensiv untersucht, um eine definierte biologische Fragestellung/Phänomene zu verstehen. Man erwartet, dass die Ergebnisse und Entdeckungen von allgemeiner Bedeutung/Gültigkeit sind. Man wählt also bestimmte Organismen, die gesuchte Eigenschaften besonders deutlich aufweisen.

bestimmte Aspekte sollen besonders gut entwickelt sein (Bsp. man untersucht Entstehung von Organen günstig wenn Organismus durchsichtig man wählt bestimmte durchsichtige Fische)

weiters sollten „Stock – Organismen“ vorhanden sein, damit diese nicht zu teuer weitergegeben werden

Experimente sind durch MO kontrollierbar, Falsches kann aufgedeckt werden, genauso wie Betrug überprüfbar ist Bsp) ATP Synthese bei Pro und Eukaryonten sehr ähnlich!

Mit MO werden auch Unterschiede (nicht nur Gemeinsamkeiten) untersucht.

ESCHERICHIA COLI

- begeißeltes (daher bewegliches) Bakterium

- 20 30 min Vermehrungszeit (37°C)

- Kommt mit verschiedenen Umweltbedingungen gut klar

- ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül mit etwa 4300 Proteinen

- an ihm wurden DNA Replikation, Proteinsynthese, Operons etc. erforscht

- in Flüssigkeit gezüchtet, unter Schütteln (braucht O 2 , wenn nicht bildet sich Nährstoffgradient wird an gewissen Stellen mehr verbraucht an gewissen Stellen in Probelösung werden Nährstoffe weniger)

- kann Richtung problemlos ändern, Bewegung auch im Kreis möglich System in Bakterien, das Nährstoffgradienten erkennt Bewegung in diese Richtung Chemotaxis

- Coli war 1. Organismus, der DNA sehr leicht aus Umwelt aufnehmen kann (von Plasmiden, Phagen) die DNA kann dadurch vermehr werden, sie muss aber zuerst auf die Plasmide und von dort in E. Coli übertragen werden

- für Industrie wichtig: Proteinsynthese, allerdings bei E. Coli etwas andere Synthese als bei Eukaryonten; wird zur Herstellung von Medikamenten verwendet (z.B. Insulin)

- bestimmte Substanzen können gezielt produziert werden (Bsp. Aminosäuren)

- auch gut studiert werden kann Verhalten der Individuen in einer Population (obwohl genetisch gleich Unterschiede in Verhalten, unterschiedliche Ausprägung von Proteinen, obwohl idente Gene)

- Topo Isomerase in E. Coli sehr gut untersucht worden

- Transport, Stoffwechselvorgänge ebenfalls

BACILLUS SUBTILIS

kann resistente Dauerform bilden (Sporen) im Gegensatz zu E. Coli; bei schlechten Umweltbedingungen werden diese dann besser „Keimung“ Untersuchungen: vom Keim zum fertigen Organismus

wird als nicht pathogener MO gezüchtet

BÄCKERHEFE (Saccharomyces cerevisiae)

eukaryot. Organismus

Auffälligkeiten: „Narben“ bud scars, Narben von Sprossen; Bildung eines „bud“ eines Spross

Fragestellungen die damit beantwortet werden können: „Wie kommt Teil eines Kerns in andere Zelle?“

Regenerationszeit: 90 120 min bei etwa 30°C

leicht kultivierbar, auch selektiv kultivierbar (in synthetischem Medium es können bestimmte Nährstoffe weggelassen werden und so beispielsweise das Wachstum der Hefe hemmen durch Weglassen von Leucin; so kann auch Hefe gezüchtet werden, durch Einschleusen von Plasmiden, die bei dieser konkreten Bedingung wächst)

2 Mating Types ( a und α, MATa und MATα):

unterscheiden sich nach außen nicht; wird a mit α gepaart diploider Organismus

1 Chromosomensatz: 16 Chromosomen haploid (sowohl a als auch α) auch tetraploid

kann eingefroren werden

30% der Gene der Hefe haben menschliche Homologe

12 Millionen Basenpaare

6300 verschiedene. Proteine in verschiedenen Mengen

nicht pathogen, sehr geeignet für genetische Screens

es können sehr viele Organismen gleichzeitig gemessen werden

alle Anfänge mit Hefe gemacht erstes richtiges Modellsystem

Lebenszyklus haploide Zelle Spross Teilung (vegetativ) in a und a bei Mischung von a und α:

a Faktor und α - Faktor werden gebildet wird jeweils anderer Faktor entdeckt Stop des Wachstums Bildung von kleiner Ausbuchtung hier kommt es zur Fusion Zygote Kernverschmelzung diploid bei meiotischer Teilung 4 haploide Ascosporen aus diploiden Individuen

a a α α
a
a
α
α

bei schlechten Bedingungen

Wenn Lebensbedingungen besser werden Germination Bildung von vegetativen Formen

Kultivierung in Kolben (unter Schütteln) oder Agar Platten Koloniebildung

Bsp. für Anwendung: Zelle a mit Marker X Zelle α mit Marker Y

bei Verschmelzung Bildung von Spross a/ Zelle X/Y Marker von Wildtype bei

gleich dominanten Markern ruhen lassen schlechte Umweltbedingungen hervorrufen

Glucose + Stickstoff entziehen Bildung von Tetrade (4 Sporen) können seziert

werden 1 Ascus kann separiert + zerlegt werden 4 einzelne Zellen mit Abstand wieder Agarplatte zum Auskeimen Ergebnis: sofort sichtbarer Marker (durch Wachstumsschwierigkeiten kleinere Kolonien) einer der Marker dafür verantwortlich mit - statt + benannt weil hemmend

Randon Spore Analyse: Zufallsanalyse eine Spore wird aus Tetrade entfernt + kultiviert

Sehr einfach MUTAGENESE vollziehbar, weil sehr viele Stoffe und Umstände für Hefe mutagen wirken.

Arbeit mit Temperatur Bestrahlung mit hoher Temperatur welche Kolonie ist nun temperatursensitiv Kolonie mit nicht bestrahlter Kolonie auf Agar Platte erwärmen resistente Kultur? „temperatursensitive Mutanten“ kann bei hoher Temperatur wachsen oder nicht

welche Genveränderung hängt damit zusammen? Suche von Komplementation durch gesunde Gene, die in Zelle eingefügt werden kann Temperaturresistenz wieder hergestellt werden DNA Fragment kann analysiert werden und so das Gen für Temperatursensitive gefunden werden (wird heute allerdings nicht mehr so oft angewendet)

DELETION/AUSTAUSCH YFG = your favourite gene; bestimmtes Stück (Gen oder Teil davon) Primer docken rechts und links vom Gen an (hier Kan MX Kanomezinresistenz) Primer verlängert (45 60 Nucleotide) Primer verlängert diese sind mit Regionen um YFG homolog PCR kann nun als lineares Fragment eingebaut werden Eigenschaft von Hefe: auch kurze Abschnitte sind sehr schnell integriert YFG kann schnell ersetzt werden

„FAGGING“, PROTEINFUSION „Kassette“ wird integriert wesentlich gleicher Vorgang YFP fusioniert mit GFP aber auch hier wird selektiver Marker gebraucht GFP muss wieder gefunden werden wenn am Endterminus Problem: Promotor wird unterbrochen, also muss zusätzlicher Promotor angebunden werden, daher normalerweise am C Terminus angesetzt

Mitochondrial Import Machinery Mitochondrial preproteins with amino - terminal presequences must cross two membranes to reach the matrix of the organelle. Both outer and inner membranes contain hydrophilic high-conductance channels that are responsible for selective translocation of preproteins. The channels are embedded in dynamic protein complexes, the TOM complex of the outer membrane and the TIM23 complex of the inner membrane. Both channel-forming proteins, Tom40 and Tim23, carry specific binding sites for presequences, but differ in their pore size and response to a membrane potential. Studies with the TOM machinery show that other subunits of the translocase complex also provide specific binding sites for preproteins, modulate the channel activity and are critical for assembly of the channel.

Yeast Two Hybrid System (Y2H) = Technik der Molekularbiologie zur Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen. Im Screening - Verfahren können in einem eher empirischen Ansatz mit einer cDNA - Bank als „Prey“ mögliche Interaktionspartner identifiziert werden, oder aber es können bei dem so genannten „Single mating“ mit diesem System gezielt die Interaktion für bestimmte Proteine überprüft werden.

in-vivo-Methode

Grundlage = ein zur Genregulation benötigtes Protein, ein so genannter Transkriptionsfaktor. In Saccharomyces cerevisiae bedient man sich normalerweise des Transkriptionsfaktors GAL4. Dieser besitzt zwei verschiedene Domänen, eine zum Binden an der DNA (Bindedomäne, GAL4-BD) und eine, welche die Transkription aktiviert (Aktivierungsdomäne, GAL4-AD). Obwohl die beiden Domänen sich normalerweise auf derselben Polypeptidkette befinden, sind diese auch dann wirksam, wenn sie von zwei unterschiedlichen Proteinen über nonkovalente Protein-Protein-Interaktionen zusammengebracht werden. Dazu bedient man sich zweier in Hefe kompatibler Expressionsvektoren.

Jedes der beiden Plasmide trägt jeweils ein für das entsprechende Experiment konstruiertes Fusionsgen. Dieses kodiert im ersten Fall für ein Hybridprotein, das aus der GAL4-BD besteht und an der sich die Aminosäuresequenz anschließt, für die ein potentieller Bindungspartner gefunden werden soll („Bait-Protein“, Köderprotein). Das zweite Plasmid kodiert ein Hybridprotein, das sich aus der GAL4-AD und im Anschluss aus einem möglichen Bindepartner für das Bait-Protein zusammensetzt („Prey-Protein“, Beuteprotein). Beide Hefe-Zwei-Hybrid-Plasmide replizieren sich sowohl in Hefe wie auch in E. coli autonom (Shuttle-Vektoren).

Ein Hefestamm wird mit beiden Plasmiden transformiert, der kein funktionierendes gal4- Gen hat und ein oder mehrere Reportergene trägt, denen eine Bindestelle für den GAL4- Transkriptionsfaktor vorgeschaltet ist. Als Reporter dieser Interaktion fungieren Gene, die entweder bestimmte Aminosäuren bzw. Basen herstellen können (z. B. Histidin, Uracil oder Adenin) oder eine optische Erkennung ermöglichen (z. B. ein Farbumschlag katalysiert durch das lacZ-Gen). Wenn es zwischen „Bait“ und „Preyzu einer Interaktion kommt, resultiert daraus in der Regel eine funktionelle Rekonstitution des GAL4-

Transkriptionsfaktors, was eine Expression der Reportergene zur Folge hat. Letzteres kann durch Wachstum auf entsprechenden Selektionsmedien nachgewiesen werden, z. B. auf einem Mangelmedium für Histidin wachsen in der Folge nur Hefen, bei welchen „Bait“ und „Prey“ interagieren und so das Enzym zur Histidin-Synthese exprimieren.

DNA MICROARRAY EXPERIMENT A DNA microarray consists of an orderly arrangement of DNA fragments representing the genes of an organism. Each DNA fragment representing a gene is assigned a specific location on the array, usually a glass slide, and then microscopically spotted (less than 1 mm) to that location. Through the use of highly accurate robotic spotters, over 30,000 spots can be placed on one slide, allowing molecular biologists to analyze virtually every gene present in a genome. The main advantage of microarrays is that the spots are single stranded DNA fragments that are strongly attached to the slide, allowing cellular DNA or RNA to be fluorescently labeled and laid overtop of the array. DNA or RNA in the overlaid sample will stick (through a process called hybridization) to a complementary spot on the array, that is, Gene-A will stick to a spot composed of a Gene-A fragment. By exposing the microarray to a fluorescently labeled sample the DNA that hybridizes will be identifiable as glowing spots on the array, while the spots that have nothing hybridized to them will not be visible. Two main types of commercial microarrays, oligonucleotide arrays (Affymetrix) and cDNA arrays (BD Biosciences and others), provide good examples of how this technology works.

SYNTHETIC GENETIC ARRAY ANALYSE Synthetic lethality occurs when the combination of two mutations leads to an inviable identify genes whose products buffer one another or impinge on the same essential pathway. For the yeast Saccharomyces cerevisiae, we developed a method termed Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, which offers an efficient approach for the systematic construction of double mutants and enables a global analysis of synthetic lethal genetic interactions. In a typical SGA screen, a query mutation is crossed to an ordered array of approx 5000 viable gene deletion mutants (representing approximately 80% of all yeast genes) such that meiotic progeny harboring both mutations can be scored for fitness defects. This array-based approach automates yeast genetic analysis in general and can be easily adapted for a number of different screens, including genetic suppression, plasmid shuffling, dosage lethality, or suppression.

CAENORHABDITIS ELEGANS

Name von schlängelnder Bewegung Sydney Brenner „Vater“ von C. elegans, beschäftigt sich mit Grundprobleme der Biologie und suchte einen einfachen Organismus für diese Studien.

Wieso gerade C. elegans?

I. Relativ einfacher Organismus um Entwicklung zu studieren, vom befruchteten Embryo zu Erwachsenen, bis zum Tod

- differenzierte Gewebe (Muskel, Darm, Haut, Nerven), wie im Menschen

- im Gegensatz zu uns, Größe handhabbar, Haltung in riesigen Quantitäten

- eine kleine und invariante Anzahl an Zellen im Adulten (cell signaling, cell lineage)

- mittelgroßes, sequenziertes Genom, mit hoher Gendichte

- kurzer Lebenszyklus erleichtert die Isolation von Mutanten und phenotypische Studien

- weit verbreitet verwendeter multizellulärer Organismus, der sich einfrieren lässt

- Stocks als Dauerlarven

II. Wir können über Gesundheit und Krankheit lernen

- viele wesentliche Gene für Entwicklung sind im Menschen auch vorhanden

- Zelltodgene sind im Menschen konserviert (z.B Krebszellen gehen in den programmierten Zelltod

- Gene die Krankheiten hervorrufen können im Wurm analysiert werden

- Homologe Gene von Wurmparasiten können in C. elegans studiert werden

III. Viele Wekzeuge wurden bereits entwickelt!

- Einbringen exogener Gene

- Gene können ausgeschaltet werden; Expressionsanalysen (microarrays, ChIP-Seq, -omics,

etc…)

Lebenszyklus kurzer Lebenszyklus (2,5 Tage bei 25°C), Lebensdauer ~ 18 Tage auf Petrischalen mit Agarflächen + E. Coli als Nahrung für Würmer gezüchtet 4 Larvenstadien bei ungünstigen Bedingungen Dauerstadium zwischen L1 und L2 Larvenstadium; bei Übergang von Dauer auf Larvenstadium „Schlüpfen“

holocentrische Chromosomen: Zentromerangriffspunkte für Spindel über ganzes Chromosom verteilt

C. Elegans besitzt sehr kleines Genom, was ihn für die Forschung optimal macht!

Anatomie:

Schlund, Gonade, einfacher Verdauungstrakt, Nervensystem, Epidermis, Uterus Männchen: markantes Merkmal Befruchtungsfächer (Spiculae), mit diesen wird jedes Tier abgetastet bis Weibchen gefunden wird

Männchen sind sehr selten, müssen daher durch meiotic Non – Disjunction „hergestellt“ werden Hitzeschock verlieren zweites X Chromosom, Hermaphroditen werden erzeugt (können sich selbst befruchten, da zunächst von den Gonaden Keimzellen gebildet werden, die sich zu Spermien differenzieren und danach auf Oozytenproduktion umgestellt wird)

Entwicklung in Gonade: in L1: Vorläuferzelle C1 + C2 teilen sich in weiteren Stadien, gehen dann in Spermatogenese Spermien gebildet und gelagert in Gonade an Eizellen vorbei obere Zellen differenzieren sich zu Eizellen (gelb in Abb.) werden nach unten zu den Spermien befördert.

(gelb in Abb.) werden nach unten zu den Spermien befördert. Zellinie ist völlig reproduzierbar, Anzahl der

Zellinie ist völlig reproduzierbar, Anzahl der somatischen Zellen ist festgelegt führte zur Entdeckung von Apoptose John Sulston erstellte Lineage durch gezielte Färbungen im Wurm

Embryogenese 1. Abschnitt

- Teilungen erfolgen in einer Membran, bis er schließlich schlüpft

- 1. Zellteilung immer asymmetrisch: AB und P1 (Keimbahn)

- dann Teilung zu Abp und Aba: dorsoventrale Achse festgelegt

- P1 teilt sich zu EMS und P2

- Spindelrotation um 90°C

- alle folgenden P Teilungen sind asymmetrisch!

- keine strenge Korrelation zwischen Gründerzelle u. Gewebe; Gewebe aus verschiedenen Gründerzellen; Ausnahme Keimbahn (P4), Gedärm

(E)

2.Abschnitt

- 100 min nach erster Teilung beginnt Gastrulation

Gründerzellen; Ausnahme Keimbahn (P4), Gedärm (E) 2.Abschnitt - 100 min nach erster Teilung beginnt Gastrulation

- verschiede Zellen “wandern” z.B.: E Nachkommen sinken ins Innere des Embryos (12 Zellen wandern im Embryo)

- weitere Zellteilungen folgen

3. Abschnitt

- 350 min nach erster Teilung proliferative Phase beendet

- Morphogenese

- Muskelzucken

- zylindrische Form

- Kollagenkutikula

- 760 min Pharynx beginnt zu pumpen

- 800 min Wurm schlüpft mit 558 Zellen (113 programmierter Zelltod)

Induktion:

Weiterleitung von Signalen zwischen den Zellen Beispiel für Induktion Delta Notch Signaling: abgeschnittener Notch Teil wandert in Zelle, P1 Zelle hat Delta Liganden, AB Zelle hat Notch Rezeptor

P granules werden dazu gebraucht, dass die befruchtete Zelle gebildet werden kann, sind stark in P1 Zelle (posterior) vertreten später symmetrisch in beiden Tochterzellen vorhanden GFP Gene Florescence Protein aus C. elegans + einer Quallenart isoliert

Transgenesis:

in 5 10% d. Fälle fremdeingebaute DNA wird in längere Stücke zusammengefasst

unc. Mutanten = uncoordinated, nicht bewegliche Würmer, die nicht ins Dauerstadium übergehen könnenn

DROSOPHILA

- kein Schädling

- Kosmopolit Verbreitungsgebiete wie Mensch

- in Amerika erst relativ junge Arten, schnelle Besiedelung, sehr anpassungsfähig

- holometaboles Insekt = Metamorphose von Larve bis ausgewachsenes Tier (drittes Larvenstadion ~ 3 Tage Puppenphase 3 Tage ist nach Schlüpfen in 3 4 Stunden geschlechtsreif)

- deutlicher Geschlechtsdimorphismus an Färbung, Größe, Vorhandensein von Geschlechtskämmen am 1. Beinpaar zu erkennen

- kein Patentschutz bei Drosophila

Mutationen heterozygote Mutationen durch Inzucht homozygot (rezessiv) „White Mutation“ Drosophila mit heller Pigmentierung weisen große Resistenz gegen X Rays auf (tolerieren bis zu 400 Rad) somatische Zellen sind großteils nicht mehr teilungsfähig bei ausgewachsenen Tieren mutieren nicht mehr

chemische Mutagenese funktioniert ebenfalls sehr gut; in 50er: „genetische Parasiten“ jumping genes (parasitische DNAs) können Positioon im Genstrang verändern Schmarotzer, die versuchen ihre Genzahl zu erhöhen; können z.B. Punktmutationen initiieren (bspw. Chromosomenbrüche)

Tansposable Elements TE content bei Mensch 50% des Genoms stammt von Transposon natürliche Mutationen 0.2 0.4% Transposons springen gerne in regulierende Sequenzen hypomorphe milde, nicht lethale Effekte Hitchhock (Temperaturbestrahlung) Puff Bildung im Gen

Applying Transposon for Mutagenesis and Functional Genetics

1. Gene Disruption

- hopomorphic mutation = A type of mutation in which the altered gene product possesses a reduced level of activity, or in which the wild-type gene product is expressed at a reduced level.

- often inserted in regulatory seuqences

- loss of function mutation

2. Mutation Rescue Screen

- prepare a transgene with a P element

- injecting this transgene in the Drosophila embryo

- the growing fly has gametes with transformed DNA in its genome

3. Ectopic over expression gain of function

embryo - the growing fly has gametes with transformed DNA in its genome 3. Ectopic over

4.

P LacZ enhancer trap Gene expression in situ

An enhancer trap is a transgenic construction for the identification of enhancers, produced by the fusing of two proteins, genes for which are inserted into the genome. The enhancer trap structure contains a mobile element (necessary for random insertion in the genome) usually some sort of P element (a promoter that must be sensitive to the enhancer) and a reporter gene. The reporter gene is necessary for identification of the spatial regulation by enhancers. The most common and basic enhancer traps are: P[ lacZ ] from the bacterium E. coli and P[ GAL4 ] from yeast. The enhancer trap also uses some sort of visible marker that allows the new insertions to be recognized such as the white gene, resulting in a red eye color in Drosophila or ampicillin resistance for E. coli. There exists a large number of fly stocks containing GAL4 insertions and an equally large number of fly stocks containing an UAS DNA sequence followed by a gene of interest. The beauty of this arrangement is that the expression of a large number of genes with different GAL4 "drivers" is possible. Rather than generating transgenic flies with the enhancer linked directly to the gene of interest (this takes about a year, if you are starting without the appropriate DNA construct), you simply mate (cross) one transgenic fly with another transgenic fly.

5. RNAi - mediated gene knock - down

RNA-based, mRNA-targeted therapeuticals specifically target and degrade mRNA using a naturally occurring cellular mechanism, called RNA interference, that regulates the expression of genes. RNA interference (RNAi) is a highly promising therapeutic approach for those diseases where aberrant protein production is a problem. RNAi can also be applied to inhibit the expression or replication of pathogenic viruses, such as HIV and hepatitis C virus.

RNA interference is an apparently ancient defense mechanism against foreign double - stranded RNA (dsRNA). In RNAi response, RNAs of 21 - 23 nucleotides in length, called small interfering RNAs (siRNAs), are snipped from longer dsRNA chains by an enzyme called Dicer. The antisense strand of the siRNA is used by an RNA-induced silencing complex (RISC) to guide messenger RNA (mRNA) cleavage, so promoting mRNA degradation.

used by an RNA-induced silencing complex (RISC) to guide messenger RNA (mRNA) cleavage, so promoting mRNA

Polytene chromosomes are giant chromosomes common to many dipteran (two-winged) flies. They begin as normal chromosomes, but through repeated rounds of DNA replication without any cell division (called endoreplication), they become large, banded chromosomes. For unknown reasons, the centromeric regions of the chromosomes do not endoreplicate very well. As a result, the centromeres of all the chromosomes bundle together in a mass called the chromocenter.

Polytene chromosomes are usually found in the larvae, where it is believed these many- replicated chromosomes allow for much faster larval growth than if the cells remained diploid. Simply because each cell now has many copies of each gene, it can transcribe at a much higher rate than with only two copies in diploid cells.

used for:

gene localization

studying Drosophila gene expression, in situ!

Drosophila Melanogaster Genome

- sequence completed in 2000

- 180 million bp

- ~ 14000 genes

- diploid, 3 autosomes, X and Y (2n =8)

- ~ 50% of genes have human homologues

- ~ 60% of known disease causing genes in humans have Drosophila homologues

Advantages of Drosophila

+ 2 week generation time

+ easy and cheap culture conditions

+ small (4mm long)

+ easy genetics

+ robust genome = tolerates high dosages, large deletions, etc.

+ complete genetic/molecular toolbox, knock-in, knock-out

+ inducible TE system (P element)

+ polytene chromosomes, in vivo protein/DNA interaction

+ well studies ecology, phylogeny and evolution

+ species rich (> 1.500 species)

+ already 12 complete genomes available (>40 MY)

+ stock and species center

+ non-pathogenic and non-commercial

+ open scientific community

Disadvantage of Drosophila

- cannot freeze

- homologous recombination difficult

Fruitless master control gene of male specific sexual behavior in Drosophila Male courtship behaviour in Drosophila:

- male orients toward and follows female

- male taps female with his forelegs

- male sings a species specific courtship song by extending and vibrating one wing

- male licks female genitalia

- male curts his abdomen for copulation fixed pattern of events

PFLANZLICHE MODELLORGANISMEN

Polymorphismus:

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) sind Unterschiede der DNA-Sequenz homologer Chromosomen. Einige von ihnen führen zu Veränderungen des Restriktionsschnittstellen-Musters. Dieses kann als Bandenmuster sichtbar gemacht werden. Die RFLP-Analyse hat viele Anwendungen, zum Beispiel bei der Genomkartierung in der Grundlagenforschung oder bei der Diagnose von Erbkrankheiten.

Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht. RFLPs dienen u.a. als genetische Marker bei der Genkartierung, da sie umso wahrscheinlicher zusammen vererbt werden, je näher sie zusammen liegen. Sie werden darüber hinaus auch zur Suche nach Quantitative Trait Loci, also Chromosomenabschnitten mit Einfluss auf die Ausprägung eines quantitativen Merkmals, sowie in Southern Blots genutzt.

Genetic Control of Flowering Time in Arabidopsis:

The genetic variation present among a large number of mutants with an earlyor late - flowering phenotype, affecting the control of both environmental and endogenous factors that influence the transition to flowering, is described. The genetic, molecular, and physiological analyses have led to identification of different components involved, such as elements of photoperception and the circadian rhythm. Furthermore, elements involved in the signal transduction pathways to flowering have been identified by the cloning of some floral induction genes and their target genes.

FISCHE ALS MODELLSYSTEME Entwicklungsbiologie:

- externe Entwicklung

- schnelle Entwicklung

- Transparenz

Zebrafisch (Danio rerio) wichtige Stadien + Prozesse:

- Blastula

- Epibolie: Umschließung des Dotters

- Gastrulation: Differenzierung der Keimblätter

- Tailbud Stadium: Neuralplatte

- Somitogenese: Segmentierung des Rumpfes

- Pharyngula: vollendete Organogenese, geschlossenes Neuralrohr, „Phylotypiaches“ Stadium der Wirbeltiere

- Adult: keine genetische Geschlechtsbestimmung Bestimmung erfolgt innerhalb des ersten Lebensmonats

wichtige Daten:

Generationszeit: 3 4 Monate Nachkommen pro Weibchen: ~ 200 / Woche Organogenese: 1dpf Embryonalentwicklung: extern Gene (1n): ca. 30000 Genom (1n): 1,4 Gbp Chromosomen (1n): 25

RNA-IN SITU HYBRIDISIERUNG:

Detektion eines speziellen Transkripts durch eine Antisense-RNA (Die Antisense-RNA (aRNA) ist eine einzelsträngige RNA, die komplementär zur Messenger-RNA (mRNA) ist. Die mRNA wird vom nicht-kodierenden Strang (Matrizenstrang) der DNA transkribiert. Wird auch der komplementäre Strang transkribiert, entsteht eine zur mRNA komplementäre aRNA. Die aRNA inhibiert durch Basenpaarung mit der komplementären mRNA deren Translation in der Zelle. Damit wird die Genexpression einzelner Gene reguliert. Antisense-RNA stellt eine natürliche Möglichkeit der Genregulation der Proteinbiosynthese dar.)

Im Gewebe: Detektion von Zellen, die ein bestimmtes Transkript herstellen.

Genregulation der Proteinbiosynthese dar.) Im Gewebe: Detektion von Zellen, die ein bestimmtes Transkript herstellen.

No tail (ntl): spezifische Expression in der sich entwickelnden Chorda dorsalis (Notochord) retinal homeobox 3 (rx3): spezifische Expression in der Anlage der Retina und des Hypothalamus Paired homeobox 2 (Pax2): Expression in verschiedenen Anlagen, u.a. Ohrvesikel, Auge, Mittelhirn, Schilddrüse fli1: spezifische Expression in den Endothelien der Blutgefäße (intersegmental blood vessels)

Genexpressionsmusterwerden systematisch erfasst und durchsuchbar gemacht auffindbar z.B. in online - Gendatenbanken

Ernst Haeckel “Biogenetische Grundregel” (Ontogenese rekapituliert Phylogenese) Stundenglas-Modell (Hourglass model): Bestimmte Embryonalstadien ähneln sich stärker als (a) Adulte und (b) früheste Entwicklungsstadien

als (a) Adulte und (b) früheste Entwicklungsstadien In welchem Stadium der Fischentwicklung werden tendenziell
als (a) Adulte und (b) früheste Entwicklungsstadien In welchem Stadium der Fischentwicklung werden tendenziell

In welchem Stadium der Fischentwicklung werden tendenziell eher alte Gene exprimiert?

George Streisinger etablierte die Fische (Zebrafisch und Medaka) als Modellsysteme.

1.

Diploider Screen

1. Diploider Screen 2. Parthenogenetischer Haploid - Screen PARTHENOGENESE (von griechisch παρθένοσ parthenos,

2. Parthenogenetischer Haploid - Screen

PARTHENOGENESE (von griechisch παρθένοσ parthenos, "Jungfrau" & γένεςισ genesis, "Entstehung, Zeugung"): eine asexuelle Form der Fortpflanzung ohne Beisteuerung des

männlichen Chromosomensatzes (auch GYNOGENESE (von griechisch γυνή gyne, "Frau")).

(von griechisch γυνή gyne , "Frau")). lebensfähig bis ca. 3 Tage einige typische Defekte (Augen,

lebensfähig bis ca. 3 Tage einige typische Defekte (Augen, Ohrvesikel) Limitationen

3. Parthogenetischer Diploid Screen

Zum Zeitpunkt der Befruchtung befindet sich die Zebrafisch-Oocyte noch vor der Meiose II:

Jede Oocyte enthält noch einen diploiden Chromosomensatz. Wird die Cytokinese verhindert, entsteht eine diploide Zygote.

die Cytokinese verhindert, entsteht eine diploide Zygote. Cytokinese = letzter Schritt nach Telophase um die
die Cytokinese verhindert, entsteht eine diploide Zygote. Cytokinese = letzter Schritt nach Telophase um die

Cytokinese = letzter Schritt nach Telophase um die Mutterzelle in 2 voneinander unabhängige Kompartimente zu unterteilen. Zellteilung

Genetische Screens im Zebrafisch haben vor allem zur Entdeckung einer Reihe von Genen beigetragen, die
Genetische Screens im Zebrafisch haben vor allem zur Entdeckung einer Reihe von Genen beigetragen, die

Genetische Screens im Zebrafisch haben vor allem zur Entdeckung einer Reihe von Genen beigetragen, die in der Embryonalentwicklung des Zebrafischs und anderer Wirbeltiere eine kritische Rolle spielen. no tail (ntl): Verlust der Chorda dorsalis und der Identität des ventralen Neuralrohrs Identifikation in einem haploid Screen one-eyed pinhead (oep): Zyklopaugen retinal homeobox 3 (rx3): Verlust der Retina und spezieller Zellen im Hypothalamus pax2a (no isthmus/noi): verschiedene Effekte, u.a. Verlust der Mittel-Hinterhirn-Grenze und der Schilddrüse

Forward Genetics: (dazu gehören die eben besprochenen Methoden)

Genetics: (dazu gehören die eben besprochenen Methoden) Reverse Genetics: 1. Zink Finger Nucleasen Design

Reverse Genetics:

1. Zink Finger Nucleasen

Design spezifischer Restriktionsenzyme (Zinc Finger Nucleasen) für einen

Sequenzabschnitt in einem speziellen Genlokus.

für einen Sequenzabschnitt in einem speziellen Genlokus. Beispiel: gezielte Mutation des no tail (ntl)-Gens 2.

Beispiel: gezielte Mutation des no tail (ntl)-Gens

2. Morpholino Antisense Oligonukleotide

MORPHOLINOS (abgeleitet vom chemischen Terminus Morpholino-Ring): Oligonukleotide mit Morpholino-Rückgrat > Nuklease-resistente Wirkung: Interferenz mit

(a)

Splicing von primären Transkripten

(b)

Translation von mRNA

Nuklease-resistente Wirkung: Interferenz mit (a) Splicing von primären Transkripten (b) Translation von mRNA

Morpholino Oligos oder kurz Morpholinos sind Nukleinsäure-Analoga, die als Werkzeuge in der Molekularbiologie verwendet werden, um einen Knockdown (= nur teilweises Abschalten der Funktion eines Genes bezeichnet) von Genen zu erzielen. Die synthetischen Moleküle, die durch strukturell veränderte Nukleinsäure-Bausteine synthetisiert werden, werden auch als PMOs (phosphorodiamidate morpholino oligo) bezeichnet. Sie werden in antisense-RNA-Experimenten eingesetzt und hemmen durch die Bindung an die komplementäre mRNA entweder die Translation oder das Splicing der prä-mRNA und damit die Bildung eines Proteins. Ihre Wirkungsweise ist also vergleichbar den siRNAs, jedoch besitzen Morpholinos eine höhere Stabilität und damit längere Halbwertszeit, da sie keine RNase-Substrate darstellen und daher weniger schnell abgebaut werden als antisense-RNA. Nachteil ist jedoch, dass eine Transfektion (= Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen, mit Plasmiden) der Morpholinos schwierig ist, daher wird meist auf Injektion zurückgegriffen. Vor allem im Zebrafisch-Modellsystem werden Morpholinos häufig eingesetzt, um die Funktion von Genen in der frühen Embryonalentwicklung zu analysieren.

3.

SHRNA

Der RNAi - Pathway ist alt und konserviert. Initiiert durch verschiedene Ausgangsmoleküle dsRNA, siRNA, shRNA.

durch verschiedene Ausgangsmoleküle dsRNA, siRNA, shRNA. Design: micro-RNA-ähnlicher RNA-Stemloop gegen ein

Design: micro-RNA-ähnlicher RNA-Stemloop gegen ein Target-Gen. Injektion des Expressionskonstrukts, Knock Down des entsprechenden Target Gens.

gegen ein Target-Gen. Injektion des Expressionskonstrukts, Knock – Down des entsprechenden Target – Gens.

A small hairpin RNA or short hairpin RNA (shRNA) is a sequence of RNA that makes a tight hairpin turn that can be used to silence gene expression via RNA interference. shRNA uses a vector introduced into cells and utilizes the U6 or H1 promoter to ensure that the shRNA is always expressed. This vector is usually passed on to daughter cells, allowing the gene silencing to be inherited. The shRNA hairpin structure is cleaved by the cellular machinery into siRNA, which is then bound to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNAs which match the siRNA that is bound to it.

shRNA is transcribed by RNA polymerase III. shRNA production in a mammalian cell can sometimes cause the cell to mount an interferon response as the cell seeks to defend itself from what it perceives as viral attack. This problem is not observed in miRNA, which is transcribed by RNA polymerase II (the same polymerase used to transcribe mRNA).

shRNAs can also be made for use in plants and other systems, and are not necessarily driven by a U6 promoter. In plants the traditional promoter for strong constitutive expression (in most plant species) is the cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), in which case RNA Polymerase II is used to express the transcript destined to initiate RNAi.

virus 35S promoter (CaMV35S), in which case RNA Polymerase II is used to express the transcript

Keimbahn Transgenese:

Stabile Integration von DNAKonstrukten in das Zebrafisch-Genom, via Transposons, via Retroviren, via Endonucleasen (SceI). Integration von kleineren DNAKonstrukten bis hin zu BACs (bacterial artificial chromosomes,

150kB).

Zellautonomie und die Entdeckung induktiver Signale:

Bei autonomer Entwicklung entwickeln sich die Zellen unabhängig von anderen (entspricht Mosaikentwicklung). Ursache dieser Zellautonomie ist ein Mosaik von Determinanten (= Bestandteile einer Eizelle) welche den Zellen, in die sie während der Embryonalentwicklung gelangen, ihren Entwicklungsweg bestimmen (ist also schon "vorprogrammiert"). Oft handelt es sich dabei um mütterliche (= maternale) mRNA, die in bestimmten Regionen der Eizelle verteilt ist. Sichtbar wird das, wenn der Phänotyp der Nachkommen von der Mutter bestimmt wird, d.h. die 1. Mendelregel (= "Reziprozitätsregel") trifft nicht zu.

Zell Mosaike als Mittel der Untersuchung:

Hat die Zell-spezifische Inaktivierung von Faktor X einen Einfluss auf Nachbarzellen, oder nur auf die Zelle selbst? Hat die ektopische Expression von Faktor X einen Einfluß auf Nachbarzellen, oder nur auf die Zelle selbst? Bsp. für Fragestellungen

Mittel zur Herstellung von Zellmosaiken:

Genetische Methoden (wie in anderen Modellsystemen) z.B. über Zell-spezifische Promotoren ektopische Expression von Genen Zell-spezifischer Knock-Down (shRNA). Klassische Embryologie (Besondere Stärke des Fischsystems) z.B. Zell- oder Organ- Transplantation

Zelltransplantation:

Universelle Methode schnelle Experimente (Blastula- Transplantation: 3h) beliebig kombinierbar. Donor >> Host mutant >> Wildtyp Wildtyp >> mutant Überexpression >> Wildtyp Morpholino-Knockdown >> Wildtyp shRNA-Knockdown >> Wildtyp

Beispiel no tail (ntl): Ist die Mutation zell-autonom? oder nicht-zellautonom? Haben mutante Zellen das Potential, zu (a) Chorda (b) Neuralrohr zu werden?

Mutation zell-autonom? oder nicht-zellautonom? Haben mutante Zellen das Potential, zu (a) Chorda (b) Neuralrohr zu werden?

Mutante Zellen können auch im Wildtyp - Kontext keine Chorda bilden >> zell-autonome Funktion. Sie können aber zur Bodenplatte des Neuralrohrs beitragen >> dieser Phänotyp ist also nichtzellautonom (Hinweis auf ein induktives Signal von Chorda auf Neuralrohr).

Beispiel: Einfluss einer bestimmten Signalmolekül-Klasse (Fgf-Signale) auf die Projektion der retinalen Ganglien-Zellen ins Gehirn:

auf die Projektion der retinalen Ganglien-Zellen ins Gehirn: Neurobiologie Bsp. Fluchtantwort als einfacher neuronaler

Neurobiologie Bsp. Fluchtantwort als einfacher neuronaler Schaltkreis Charakteristika:

schnell (ms-Bereich)

gerichtet (von der mechanischen Reizquelle fort)

stereotypisch (Erstbeschreibung im Karpfen und Lungenfisch)

stereotypisch (Erstbeschreibung im Karpfen und Lungenfisch) Mauthner Zellen sind extrem große Neurone mit langen
stereotypisch (Erstbeschreibung im Karpfen und Lungenfisch) Mauthner Zellen sind extrem große Neurone mit langen

Mauthner Zellen sind extrem große Neurone mit langen kontralateralen Projektionen.

Kritische Rolle dieser Zellen bei der Fluchtantwort:

Kritische Rolle dieser Zellen bei der Fluchtantwort: Jeder Fisch hat zwei Mauthner-Zellen, im unteren Teil des

Jeder Fisch hat zwei Mauthner-Zellen, im unteren Teil des Hirnstamms liegt auf der linken Seite und auf der rechten Seite. Jede Mauthner-Zelle hat ein Axon, das über gekreuzte innervierende Neurone gleichzeitig Gehirn-Ebene und Rückenmark mit zahlreichen Verbindungen ausstattet. Die Synapsen, welche durch eine Mauthner-Zelle generiert werden, werden so mächtig, dass ein einzelnes Aktionspotential Anlass zu einem großen Verhaltensreaktion gibt: innerhalb von Millisekunden wenden die Fische ihren Körper in eine C-Form, was einen Rückstoß erzeugt, der sie so schnell vorwärts treibt. Funktionell ist dies eine schnelle Flucht Reaktion. Am einfachsten ist sie durch eine starke Schallwelle oder Druckwelle auszulösen, die auf das Seitenlinienorgan des Fisches auftritt. Mauthner Zellen sind nicht die einzigen identifizierten Neurone im Fisch es gib etwa 20 weitere Arten, darunter einige "Mauthner-Zellen Analoga" in jedem spinalen segmentalen Kern. Obwohl eine Mauthner-Zelle in der Lage ist eine Fluchtantwort von ganz alleine herbeizuführen, ist das gewöhnliche Verhalten anderer Arten von Zellen in der Regel auschlaggebend, um die Gestaltung der Amplitude und Richtung der Reaktion zu bestimmen. Mauthner-Zellen wurden als Befehl Neurone beschrieben. Ein Befehl Neuron ist eine besondere Art der identifizierten Neurone, wie eine Nervenzelle, die in der Lage ist, ein spezifisches Verhalten von selbst definiert auszusenden. Solche Neuronen erscheinen am häufigsten in den schnellen Flucht Systemen verschiedener Spezies der Tintenfische. Riesenaxone und Tintenfisch Riesen Synapsen, werden für bahnbrechende Experimente in der Neurophysiologie wegen ihrer enormen Größe verwendet, auch wegen der schnellen Flucht Schaltung des Tintenfisches. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Konzept eines Befehl Neurons umstritten ist, weil Studien zeigen, dass einige Neurone, die zunächst in die Beschreibung passen zu schienen, nur in einer begrenzten Anzahl von Fällen eine Reaktion auslösen können.

Optogenetik Modifikation von Neuronenaktivität durch Licht Channelrhodopsin: ein photo konvertierbares Werkzeug der Optogenetik natürliches Vorkommen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Depolarisierung der Zellmembran neuronale Aktivierung

Depolarisierung der Zellmembran – neuronale Aktivierung Wenn man dieses Protein in einen transparenten Fisch einbringt
Depolarisierung der Zellmembran – neuronale Aktivierung Wenn man dieses Protein in einen transparenten Fisch einbringt

Wenn man dieses Protein in einen transparenten Fisch einbringt und gezielt in speziellen Neuronen aktiviert, kann man die Funktion dieser Neuronen für ein gegebenes Verhalten testen. z.B. auch für die Fluchtantwort des Zebrafisches

Stabile Markierung von Sensorischen Neuronen mit

(a)

Channelrhodopsin

(b)

EGFP

Erzeugt die Aktivierung dieser spezifischen Neuronen eine Fluchtantwort?

MARINE MODELLSYSTEME Welche Probleme bringt ein Fokus auf wenige Modellsysteme mit sich?

- Jede Art hat Besonderheiten (zB. Bestimmte Entwicklung, Lebensweise, Zellbiologie, Sinnesorgane)

- Viele spannende und grundsätzliche biologischen Phänomene sind mit den ”typischen” modernen molekularen Modellsystemen nicht abgedeckt. Das bedeutet also, dass sich Modellsysteme in der Biologie ständig wandeln.

Marine Modellsysteme:

weniger molekulare Methoden etabliert, als z.B. Maus, Hefe, C.elegans oder D. melanogaster, aber wichtig für Verständnis der Evolution, Chronobiologie marine Ökologie (Plankton!)

Platynereis dumerilii:

– “einfaches” Nervensystem typisches Strickleiternervensystem der Wirbellosen

einfach und preiswert kultivierbar

Inzuchtstämme

typischer Lebenszyklus eines marinen Wirbellosen

große, synchron entwicklende Gelege

Genomgrösse: 1 Giga Basenpaare

transparente Embryonen

Mikroinjection möglich

Platynereis Lebenszyklus:

– Mikroinjection möglich Platynereis Lebenszyklus: Metamophose zu weiblichen und männlichen Tieren.

Metamophose zu weiblichen und männlichen Tieren.

Platynereis kann funktionell manipuliert werden was wiederum wichtig ist für:

Verfolgung von Zellentwicklungsschicksalen

Transgenese

funktionale Tests (z.B. Morpholinos, RNA Interferenz, Zink - finger vermittelte Mutationen)

Pdu-tuba4.4k:GFP spiegelt die Expression des endogenen Gens wieder (Fluoreszierendes Gen

Warum gerade dieser Modellorganismus? Menschen und Platynereis verändern sich besonders langsam.

Menschen und Platynereis verändern sich besonders langsam. Was bedeutet das für evolutionäre Studien? Bsp. Augen

Was bedeutet das für evolutionäre Studien? Bsp. Augen gibt es in allen großen Tiergruppen. Augentypen sind morphologisch sehr unterschiedlich (Zelltypen, Zellzahl, Zusammensetzung, Aufbau). Es existieren 2 Typen von Photorezeptorzellen, der ziliäre Typ und der rhabdomere Typ. Trotz aller Unterschiede erstaunliche Ähnlichkeiten bei der Augenentwicklung von Taufliege und Wirbeltieren! Das pax6 Gen von Maus und Taufliege kann ektopische (= nicht am physiologischen Ort befindliche) Augen induzieren. Langsam evolvierende Spezies können dazu beitragen, das Rätsel um die Entwicklung der verschiedenen Augentypen zu lösen.

Opsine:

Spezies können dazu beitragen, das Rätsel um die Entwicklung der verschiedenen Augentypen zu lösen. Opsine:

Zwei getrennte Opsinfamilien sind so alt wie alle Bilateria. (blau = Ecdysozoa, rot = Lophotrochozoa, grün = Deuterostomia)

Zwei Zelltypen (rhabdomer vs. ziliär) und zwei Opsinfamilien:

Kann man das korrelieren? Zwei Photorezeptorgruppen standen am Anfang der Evolution von Bilateria:

standen am Anfang der Evolution von Bilateria: Gene, Zelltypen, Organe und viele andere Strukturen können

Gene, Zelltypen, Organe und viele andere Strukturen können im Verlauf der Evolution verloren gehen durch Mechanismen der Organevolution Duplikation, Modifikation, Zellwanderungen und Zelltypverlust. Es kommt also auf den richtigen Vergleich zwischen den Spezies an um Erkenntnisse zu gewinnen.

In welchen anderen Bereichen bieten marine Modellsysteme Erkenntnisse? Die Biologie der inneren Uhr: Chronobiologie Biologischer Rhythmus = periodische Wiederkehr spezieller Zustände, z.B. Schlaf- / Wachzyklus Biologische Uhr = innerer Mechanismus in Organismen, der den Rhythmus kontrolliert!

Klassische genetische Modellsysteme zeigen diese Rhytmen nicht! Zircadiane Rhythmen: Molekulare Mechanismen bekannt bei: Prokaryonten, Tieren, Pflanzen, Pilzen Saisonale Rhythmen: Molekulare Mechanismen bekannt bei: Tieren, Pflanzen andere Rhythmen:

halb-tiden

tiden

halb-monatlich

monatlich

jährlich

1.) Kein Molekül einer lunaren Uhr ist bisher bekannt. 2.) Ungeklärt, wie verschiedene Rhythmen in einem Organismus koordiniert werden können!

Lunarperiodizität: ein gut dokumentiertes Phänomen in Platynereis dumerilii Das Leben im Rhythmus der Gezeiten:

Clunio marinus (Chironomidae, Diptera), Gezeitenzone der Europäische Atlantikküste Schlupfrhythmen der erwachsenenMücken:

1) Seasonal 2) Circalunar 3) Circadian Circalunare und circadiane Rhythmen werden durch innere Uhren kontrolliert. Wie weist man die innere Uhr nach? 1.) Rhythmus durch äußere Stimuli bedingt 2.) Rhythmus läuft auch ohne äußere Stimuli (Dunkel-Dunkel Experimente), durch äußere Stimuli mit Umwelt synchronisiert

Der circalunare Rhythmus von Platynereis wird durch eine innere Uhr kontrolliert:

von Platynereis wird durch eine innere Uhr kontrolliert: Diesbezüglich stehen für die Wissenschaft noch viele

Diesbezüglich stehen für die Wissenschaft noch viele offene Fragen zur Verfügung:

Wie wird das Mondlicht wahrgenommen? Wie interagieren zirkadiane und zirkalunare Uhren? Wie funktioniert die zirkalunare Uhr aufmolekularer Ebene? Wie funktioniert die lokale Adaptationder circadianen Uhr bei Clunio?

Diatomeen = Kieselalgen (>10 5 Arten)

- Zellenhülle (Frustel): Siliziumdioxid (Anhydrid der Kieselsäure: SiO2 · n H2O)+

- entstanden durch sekundäre Endosymbiose (ca. vor 1 Mrd. Jahre) (Grünalge verschmilzt mit Rotalge 2 Plastiden vorhanden chimärer Plastid entsteht Diatomeen, Braunalgen und weitere Algen)

- Kieselalgen sind Teil des marinen Phytoplankton

- photosynthetisch aktive Meeresorganismen: <1% der gesamten photosynthetischen Biomasse der Erde

- eukaryotische Phytoplanktonarten: Diatomeen, Coccolithophoriden, Dinoflagellaten

- aber: photosynthetische Meeresorganismen: ca. 50% der jährlichen Primärproduktion von Biomasse

3 Diatomeenspezies dienen als Molekulare Modellsysteme:

Thalassiosira pseudonana (32.4 Mb) Koordiniert durch Ginger Armbrust Phaeodactylum tricornutum (27.4 Mb) Koordiniert durch Chris Bowler Fragilariopsis cylindrus (98 Mb) Koordiniert durch Thomas Mock

P. tricornutum lässt sich einfach kultivieren (vergleichbar mit E.coli oder S. cerevisiae) Existente molekulare Resourcen für Phaeodactylum:

- Phaeodactylum Digitale Gene Expressionsdatabank

- Genetische Transformationen: Überexpression, “Knockout” (RNAi), Subzelluläre Lokalisation (z.B. über GFP)

- Mikroarrays

- Vergleichende genomische Sequenzanalyse

„Gene Gun“: DNA beschichtete Gold- oder Wolframpartikel werden mit Helium-vermitteltes Partiklebombardement auf die Diatomeenzellen auf einer Agarplatte geschossen.

Ein GFP: Talin Fusionsprotein zur Beobachtung zellulärer Prozesse

Diatomeen als Modell für lichtregulierende Prozesse.

Studium d. Photosynthese:

Kieselalgen besitzen Photosysteme von Grün- und Rotalgen. Wie genau betreiben diese Organismen also Photosynthese? Die Qualität und Quantität des Lichts im Meer gibt Auskunft über:

• Tageszeit

• Saison

• Bewölkung

• Tiefe

• Küstenentfernung

• Turbulenzen

Die Photorezeptoren in Diatomeen bestehen aus Apo Proteinen + Chromophoren.

Diatomeen bestehen aus Apo – Proteinen + Chromophoren . Es kam zur Entdeckung einer enormen Vielfalt

Es kam zur Entdeckung einer enormen Vielfalt an Lichtrezeptormolekülen in den Diatomeen.