INFORME PRCTICO DE BIOQUMICA

Estudio de la actividad de una enzima -fructofuranosidasa (invertasa o sacarasa) de la levadura Objetivos: a. Evaluar el efecto del sustrato sobre la velocidad inicial de una reaccin catalizada. b. Determinar los parmetros cinticos (Km y Vmax) de la invertasa de la levadura. Resultados experimentales: Tabla para curva de calibracin para el DNS

Curva de calibracin del DNS con glucosa

0,45 0,4
Absorbancia a 570nm

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 2

f(x) = 0,04x - 0,03

6
[Glucosa] (mM)

10

12

Tubo B 1 2 3 4 5

Glucosa 10 mM (L) 20 40 60 80 100

H2O (L) 100 80 60 40 20 -

DNS (mL) 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9

Absorbancia (570nm) 0 0.035 0.152 0.208 0.355 0.423

[Glucosa] (mM) 0 2 4 6 8 10

570nm=0.0447 mMcm

Tubo

[Glucosa] (mM)

Absorbancia'

Absorbancia''

Promedio Absorbancia 0,000 0,057 0,083 0,160 0,177 0,226

B 1 2 3 4 5

0 2 4 6 8 10

0,000 0,066 0,075 0,155 0,180 0,246

0,000 0,050 0,090 0,165 0,173 0,206

Curva de calibracin del DNS con glucosa

0,25 0,2
Absorbancia a 570nm

0,15 f(x) = 0,02x + 0,01 0,1 0,05 0 0 2 4 6

[Glucosa] (mM)

10

12

570nm=0.0224 mMcm

Clculo de concentracin de Glucosa a partir de la absorbancia en cada tubo: Utilizamos la Ley de Lambert y Beer

(l: espesor de de la masa de solucin interpuesta expresada en cm = 1) Tubo [Sacarosa] (mM) 0 10 20 50 100 300 400 Volumen sacarosa 400mM (l) 0 25 50 125 250 750 900 Volumen Buffer (l) 900 875 850 775 650 150 0 Volumen invertasa (l) 100 100 100 100 100 100 100 Absorbancia (570nm) 0 0.018 0.034 0.072 0.118 0.130 0,103

Blanco 1 2 3 4 5 6

A partir de las absorbancias obtenidas, calculamos junto con el psilon hallado, las concentraciones obtenidas de Glucosa (producto). Luego, calculamos la velocidad inicial, para cada concentracin de Glucosa (el tiempo utilizado para este clculo es de 5 minutos):

[Sacarosa] (mM)

Absorbancia (570nm)

[Glucosa] (mM)

Velocidad inicial (mM/min) 0,000 0,320 0,610 1,280 2,110 2,330 1,840

1/[Glucosa] (mM)

1/Vo (mM/min)

0 10 20 50 100 300 400

0,000 18,000 34,000 72,000 118,000 130,000 0,103

0,000 1,610 3,040 6,440 10,550 11,630 9,220

0,000 0,620 0,330 0,160 0,090 0,085 0,100

0,000 0,072 0,059 0,051 0,049 0,048 0,049

Vo = f ([Sacarosa])
2,5
Velocidad inicial (mM/min)

2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
[Sacarosa] (mM)

Vo = f([Sacarosa])
2,5
Velocidad inicial (mM/min)

2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 150 200 250 300 350

[Sacarosa] (mM)

La grfica de arriba corresponde a todos los valores obtenidos en la prctica, incluso el ltimo valor (tubo 6) donde la absorbancia no nos dio como debera. Realizamos una segunda grfica eliminando dicho valor para luego poder observar una curva ms acorde a lo que se espera.

1/Vo = f(1/[S])
0,08 0,07 0,06
1/Vo (mM/min)

f(x) = 0,08x + 0,03

0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
1/[Glucosa] (mM)

La siguiente tabla de datos y sus respectivas graficas corresponden al mismo prctico. Fueron obtenidas por otros compaeros del grupo. Debemos utilizar sus valores ya que nosotros en lugar de utilizar dos blancos de los tubos control, procedimos a utilizar uno por cada uno de ellos; generando un problema a la hora de promediar los valores (por falta de datos). El promedio de los valores nos beneficia para llegar un correcto resultado de la concentracin de glucosa. [Sacarosa] (mM) Absorbancia (570nm) [Glucosa] (mM) Velocidad inicial (mM/min) 0,000 0,534 2,411 4,366 7,232 6,107 7,795 1/[Glucosa] (mM) 1/Vo (mM/min)

0,000 10,000 20,000 50,000 100,000 300,000 400,000

0,000 0,020 0,090 0,163 0,270 0,228 0,291

0,000 2,679 12,054 21,830 36,161 30,536 38,973

0,000 0,373 0,083 0,046 0,028 0,033 0,026

0,000 0,031 0,024 0,023 0,023 0,023 0,023

Vo = ([Sacarosa])
9 8
Velocidad inicial (mM/min)

7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

[Sacarosa] (mM)

1/Vo = (1/[S])
0,04 0,03 0,03
1/Vo mM/min

f(x) = 0,04x + 0,02

0,02 0,02 0,01 0,01 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
1/[Glucosa] mM

Km= 1 Vmax= 44,64

Conclusin Observando los datos referentes a la concentracin de la enzima en funcin de tiempo podemos ver como esta aumenta, demostrando que la enzima est actuando, catalizando la reaccin y formando producto (glucosa). Si estudiamos la velocidad de una reaccin en presencia de enzima, tendremos que hay que medir la velocidad de la reaccin en el momento inicial de lo contrario no se puede establecer asociacin entre la velocidad de la reaccin y la concentracin de sustrato ya que si dejamos pasar el tiempo la concentracin de sustrato va disminuyendo. Analizando la relacin entre Vo y [S] tendremos que no hay relacin lineal entre Vo y [S]. La relacin entre Vo y sustrato es la de una hiprbole rectangular a la que al aumentar la cantidad de sustrato la enzima se va saturando hasta llegar a un punto que se alcanza la velocidad mxima. Para poder calcular los valores cinticos debemos realizar una grfica de dobles recprocos, lo que producir una grfica lineal, analizando esta grfica se pueden obtener los datos tanto de la velocidad mxima como del Km, el Km es una constante cintica que expresa la concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad mxima. Los valores obtenidos son: Km = 1 mM Vmax = 22,37 mM/min

Maria Noel Hackembruch 4.996.182-9 Evangelina Martnez 4.701.012-1 Csar Vidal 4.558.978-4

B8-G18 B8-GA18 B8-G18