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Nicole Jachmann

Flssigchromatographische Bestimmung aliphatischer und aromatischer Amine mit 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

-2001-

Analytische Chemie

Flssigchromatographische Bestimmung aliphatischer und aromatischer Amine mit 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultt der Westflischen Wilhelms-Universitt Mnster

vorgelegt von

Nicole Jachmann
aus Senden

-2001-

__________________________________________________________
Dekan: Erster Gutachter: Zweiter Gutachter: Tag der mndlichen Prfung: Tag der Promotion: Prof. Dr. Wulfhard Lange Prof. Dr. Uwe Karst Prof. Dr. Karl Cammann ___________________________ ___________________________

Inhaltsverzeichnis
Abkrzungen

Einleitung

Ziel der Arbeit

Allgemeiner Teil

3.1

Amine

3 3 5 7

3.1.1 Definition, allgemeine Eigenschaften, Darstellungsmethoden 3.1.2 Vorkommen und Bedeutung von Aminen 3.1.3 Toxizitt von Aminen

3.2

Probenahmetechniken

8 8 9

3.2.1 Probenahme mit Impingern (Waschflaschen) 3.2.2 Probenahmerhrchen

3.3

Analytische Bestimmungsverfahren fr Amine

10 10 11 14

3.3.1 Grundstzliches zu Derivatisierungsverfahren 3.3.2 Derivatisierung von Aminen in Lsung 3.3.3 Derivatisierung von Aminen in der Gasphase

3.4

Detektion und Quantifizierung in der Flssigchromatographie

17 17 18 20

3.4.1 UV/vis-Detektion 3.4.2 Fluoreszenzdetektion 3.4.3 Massenspektrometrische Detektion

3.5

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)

23 23 24

3.5.1 Darstellung 3.5.2 Eigenschaften und Anwendung

Experimenteller Teil

26

4.1

Chemikalien

26

4.2

Gerte

26

4.3

Synthese und Charakterisierung der 4-Amino-7-nitrobenzo-2oxa-1,3-diazole (NBDAmine) 31

4.4

Flssigchromatographische Trennung und Detektion

60 60

4.4.1 UV/vis-spektroskopische Eigenschaften 4.4.2 Flssigchromatographische Trennung mit anschlieender UV/vis-Detektion 4.4.3 Fluoreszenzspektroskopische Eigenschaften der NBDAmine 4.4.4 Flssigchromatographische Trennung mit anschlieender UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion 4.4.5 Bestimmung der apparativen Nachweisgrenzen fr die UV/vis- und Fluoreszenzdetektion

63 65

68

70

4.5

Vergleich mit bestehenden Methoden

73

4.6

Flssigchromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Detektion 75 75 85

4.6.1 Allgemeines 4.6.2 Apparative Nachweisgrenzen der HPLC-MS-Methode

4.7

Bestimmung von Aminen in der Luft

88 88 89 97

4.7.1 Grundstzliches 4.7.2 Luftprobenahme mit Impingern 4.7.3 Luftprobenahme mit Probenahmerhrchen

4.8

Untersuchung von Realproben mit der NBDCl-Methode

101

Zusammenfassung

105

Literatur

107

Abkrzungsverzeichnis
A Abb. AcNi An APCI Ammoniak Abbildung Acetonitril Anilin Chemische Ionisation bei Atmosphrendruck (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) bA BA BFO BFZ BzA Cad CE d DBA DC DEA DMA DMF DMSO DP DPA DNFBz DNClBz EA 2-EAn 3-EAn 4-EAn EE EI-MS ESI eV biogene Amine Butylamin 5,7-Dinitrobenzofuroxan 4,6-Dinitrobenzofurazan Benzylamin Cadaverin Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis) Dublett Dibutylamin Dnnschichtchromatographie Diethylamin Dimethylamin Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Deprotonierungsmechanismus Dipropylamin 2,4-Dinitrofluorbenzol 3,5-Dinitrochlorbenzol Ethylamin 2-Ethylanilin 3-Ethylanilin 4-Ethylanilin Elektroneneinfangmechanismus Elektronenstoionisations-Massenspektrum Electrospray-Ionisation Elektronenvolt

Fa. FT-IR GC Him HMDA HPLC

Firma Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie Gaschromatographie Histamin Hexamethylendiamin Hochleistungsflssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography)

I IR
3

Intensitt Infrarot Kopplungskonstante einer vicinalen Kopplung (Kopplung ber drei Bindungen)

LC LIF m MAK 2-MBzA 3-MBzA 4-MBzA MeOH MHz MA MO m/z NBD NBDCl NMAn NMR NOCl NWG OSHA PA PE PeA PNZCl

Flssigchromatographie (Liquid Chromatography) Laserinduzierte Fluoreszenz (Laser Induced Fluorescence) mittel, middle; Multiplett Maximale Arbeitsplatzkonzentration 2-Methylbenzylamin 3-Methylbenzylamin 4-Methylbenzylamin Methanol Megahertz Methylamin Moleklorbital Masse-zu-Ladungs-Verhltnis 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol N-Methylanilin Kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance) 2-Naphthyloxycarbonylchlorid Nachweisgrenze Occupational Safety & Health Administration, U.S. Department of Labor Propylamin Polyethylen Pentylamin (Amylamin) p-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid

PP ppm Put q rel. R.F.I RP RT SIM Spd SPE Spm t TIC s UV/vis v/v VDI w WFR em ex max ZNS

Polypropylen parts per million Putrescin Quartett relativ relative Fluoreszenzintensitt Umkehrphase (Reversed Phase) Raumtemperatur Single Ion Monitoring Spermidin Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction) Spermin Triplett Totalionenstrom (Total Ion Current) stark (strong); Singulett Ultravioletter/sichtbarer Bereich des elektromagnetischen Spektrums Volumenanteil einer Substanz am Gesamtvolumen Verein Deutscher Ingenieure weak (schwach) Wiederfindungsrate chemische Verschiebung molarer Extinktionskoeffizient Wellenlnge Emissionswellenlnge Excitationswellenlnge Wellenlnge des Absorptionsmaximums Zentrales Nervensystem

1Einleitung

Einleitung

Die Bestimmung kurzkettiger aliphatischer Amine und flchtiger aromatischer Amine in der Luft am Arbeitsplatz ist eine wichtige Aufgabe der Arbeitsplatzberwachung, denn Amine treten in bedeutenden Mengen bei industriellen Groprozessen wie beispielsweise in der Farbstoff- und Polymerherstellung auf und besitzen sowohl akut als auch chronisch toxische Eigenschaften. Die Identifizierung und Quantifizierung mittels direkt-spektroskopischer Verfahren ist allerdings wegen der hohen Reaktivitt dieser Verbindungsklasse nur sehr bedingt mglich, da diese hufig schon whrend der Probenahme zu stabileren Verbindungen abreagieren und sich so der Bestimmung entziehen.

Die Identifizierung und Quantifizierung reaktiver Amine erfolgt deshalb mit Derivatisierungsreagenzien, chromatographische und die den Analyten stabilisieren und dessen Als

spektroskopische

Eigenschaften

verbessern.

Derivatisierungsreagenzien werden hufig halogenierte aromatische Verbindungen eingesetzt, die mit den Analyten in einer nucleophilen aromatischen

Substitutionsreaktion zu einem stabilen Produkt reagieren.

Die bestehenden Methoden erlauben ausschlielich die Identifizierung und Quantifizierung primrer und sekundrer aliphatischer Amine, whrend die Bestimmung von flchtigen aromatischen Verbindungen nicht mglich ist. Aufgrund der Probenahmetechniken und Kalibrationsmethoden werden bei diesen Methoden nur unzureichende Nachweisgrenzen erreicht.

Eine mgliche Lsung dieses analytischen Problems ist die in dieser Arbeit vorgestellte Methode auf der Basis des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols als Derivatisierungsreagenz zur flssigchromatographischen Bestimmung aliphatischer und aromatischer Amine mit anschlieender UV/visund fluoreszenz-

spektroskopischer Detektion sowie massenspektrometrischer Detektion.

2 Ziel der Arbeit

Ziel der Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Beantwortung der folgenden Fragestellungen:

1.

Ist es mglich, die Derivate kurzkettiger aliphatischer und flchtiger aromatischer Amine des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols zu

synthetisieren und in hoher Reinheit zu isolieren?

2.

Welche UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften zeigen die Aminderivate? Ist es mglich, anhand der UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften der Derivate auf verschiedene Gruppen von Aminen zu schlieen?

3.

Welche flssigchromatographischen Eigenschaften zeigen die verschiedenen Aminderivate bei der Trennung auf Umkehrphasensulen?

4.

Ist es mglich, die Identifizierung von Aminderivaten durch den Einsatz der massenspektrometrischen Detektion zu erleichtern? Welche

Ionisierungstechnik fhrt hierbei zu den besten Ergebnissen?

5.

Welche Probenahmetechniken knnen bei der Luftprobenahme von Aminen Anwendung finden?

6.

Worin liegen die Vor- und Nachteile der neuen Methode im Vergleich zu bereits bestehenden Methoden?

3 Allgemeiner Teil

3
3.1

Allgemeiner Teil
Amine

3.1.1 Definition, allgemeine Eigenschaften und Darstellungsmethoden

Amine sind stickstoffhaltige organische Verbindungen, die man vom Ammoniak derart ableiten kann, da mindestens ein Wasserstoffatom des Ammoniaks durch einen Alkyl- oder Arylrest substituiert ist. Da das Stickstoffatom sp3-hybridisiert ist, ist die Moleklgeometrie wie im Ammoniak tetraedrisch.

N H HH Ammoniak

N R HH ein primres Amin

N I R HR ein sekundres Amin

Abb. 3.1.1: Struktur und Moleklgeometrie des Ammoniak-Molekls und von Aminen (R, RI = Alkyl, Aryl).

Man unterscheidet je nach H-Substitutionsgrad zwischen primren (ein Rest, R-NH2), sekundren (zwei Reste, RRINH) und tertiren Aminen (drei Reste, RRIRIIN). Die Reste knnen gleich oder verschieden sein. Auerdem kann man je nach Rest R zwischen aliphatischen, aromatischen und gemischt aliphatisch-aromatischen Aminen unterscheiden.1

Ein Amin kann auch mehr als eine Aminfunktion besitzten. Bei zwei Aminfunktionen spricht man von einem Diamin, bei drei Aminfunktionen von einem Triamin, bei vier Aminfunktionen von einem Tetraamin und bei mehr als vier Aminfunktionen von einem Polyamin.2

Wie beim Ammoniak besitzt der Stickstoff auch in den Aminen ein freies Elektronenpaar. In Gegenwart von Suren bilden sich daher Alkylammoniumsalze, die durch Zugabe einer Base wieder das Amin generieren. Auerdem sind die Amine durch das freie Elektronenpaar zu nucleophilen Reaktionen befhigt.

3 Allgemeiner Teil

In wriger Lsung reagieren die Amine wie Ammoniak alkalisch. Die Basenstrke der Amine hngt von der Art und Anzahl der Alkyl- bzw. Arylreste ab. Verglichen mit Ammoniak ist die Basizitt der Amino-Gruppe durch den +I-Effekt der Alkylgruppe grer. Eine deutlich grere Basizitt zeigen die aromatischen Amine. Ursache dafr ist die Einbeziehung des freien Elektronenpaares des Stickstoffatoms in das Elektronensystem der Aromaten.3

Die Lslichkeit in Wasser nimmt mit der Lnge und der Anzahl der Alkylreste ab. Bis zum n-Butylamin sind die primren Amine mit Wasser unbeschrnkt mischbar. nHexylamin ist bereits nur noch wenig wasserlslich. Ebenso sind Trimethyl- und Triethylamin mit Wasser noch sehr gut mischbar, whrend Tripropylamin nur noch wenig hydrophil ist. Cyclische Amine sind dagegen aufgrund ihres gerichteten Dipolmomentes besser in Wasser lslich. Beispielsweise sind Pyrrolidin und Piperidin mit Wasser unbeschrnkt mischbar. In Suren sind dagegen alle Amine als Ammoniumsalze gut lslich.

Die Siedepunkte der Amine nehmen erwartungsgem mit steigender Kettenlnge des Alkylrestes zu. Ursache fr dieses Wechselwirkungskrfte Alkylresten. (van-der-Waalssche Verhalten ist die Zunahme zwischen der den

Bindungskrfte)

Die

gasfrmigen

(C1-C2)

und

flssigen

Amine

haben

meistens

einen

unangenehmen, charakteristischen Geruch. Methylamin und Ethylamin riechen noch ammoniakartig, whrend die folgenden aliphatischen Amine einen fischartigen oder seifigen Geruch haben. Die hheren Homologen sind feste, geruchlose Stoffe.

NH3

MeOH/Al2O3 T

MeNH2

MeOH/Al2O3 T

Me2NH

MeOH/Al2O3 T

NMe3

Abb. 3.1.2: Grotechnische Darstellung der Methylamine aus Ammoniak und Methanol.

Die wichtigsten grotechnischen Darstellungsmethoden fr aliphatische Amine sind die Alkylierung von Ammoniak mit Alkylhalogeniden oder Alkoholen in Gegenwart

3 Allgemeiner Teil

eines Katalysators, die Reduktion von Nitrilen durch katalytische Hydrierung, sowie die Reduktion von Carbonsureamiden mit Lithiumaluminiumhyrid. Die aromatischen Amine lassen sich leicht durch Reduktion der Nitroverbindungen in geschmolzenem Paraffin gewinnen.1

3.1.2 Vorkommen und Bedeutung von Aminen

Aliphatische und aromatische Amine sind wichtige Ausgangsmaterialien fr die chemische und pharmazeutische Industrie. Sie dienen zur Herstellung von Lsungsmitteln, Polymeren, Detergentien, Farbstoffen, Pflanzenschutzmitteln und Pharmazeutika. Beispielsweise sind Methylamin und Dimethylamin wichtige

Grundstoffe fr die Herstellung von N-Methylpyrrolidon und Dimethylformamid (DMF), die als organische Lsungsmittel Anwendung finden. Hexamethylendiamin (HMDA) ist ein wichtiges Ausgangsprodukt fr die Herstellung von Polyamid 6.6 (z.B. Nylon 6.6). Aus Anilin werden ebenso Isocyanate hergestellt, die der Gewinnung von Polyurethanen dienen.1 OH HOOC H3C N O N OH Morphin H H CH2CH2CH3 N H Coniin Lysergsure N CH3 H

Abb. 3.1.3: Strukturformeln ausgewhlter Alkaloide.

Amine kommen als Naturstoffe in Pflanzen vor. Stickstoffhaltige Naturstoffe, die alkalisch reagieren, bezeichnet man als Alkaloide. Dazu gehren u. a. Nicotin (aus Tabak, Nicotiana tabacum), Coniin (im gefleckten Schierling, Conium maculatum), Atropin (in der Tollkirsche, Atropa belladonna), Cocain (aus den Blttern des Kokastrauches, Erythroxylon coca), Morphin und Codein (aus Schlafmohn, Papaver

somniferum) und Lysergsure (im Mutterkorn, Secale cornutum).1,3,4

3 Allgemeiner Teil

Im menschlichen und tierischen Organismus gehen primre Mono- und Diamine meistens aus Decarboxylierungsreaktionen von Aminosuren hervor (biogene Amine, bA). Sie spielen als Hormone und Neurotransmitter eine groe Rolle. Amine, die wichtige Neurotransmitter darstellen, sind z.B. Serotonin und Noradrenalin. Als wichtige Hormone sind insbesondere Histamin und Adrenalin zu nennen.5 CH2CH2NH2 N N H Him

HO

CH2CH2NH2

Tym NH2 H2N Cad H NH2

H2N Put

H2N

N Spd H N
Spm

NH2

H2N

N H

NH2

Abb. 3.1.4: bersicht ber eine Auswahl der wichtigsten biogenen Amine Histamin (Him), Tyramin (Tym), Putrescin oder 1,4-Diaminobutan (Put),

Cadaverin oder 1,5-Diaminopentan (Cad), Spermidin (Spd), Spermin (Spm).

Nicht nur im lebenden Organismus treten Amine als Decarboxylierungsprodukte von Aminosuren auf, sie sind auch die Abbauprodukte von Proteinen im toten Organismus. In Gegenwart spezieller Decarboxylasen entstehen beispielsweise aus L-Lysin Cadaverin, aus L-Histidin Histamin und aus L-Ornithin Putrescin.6

3 Allgemeiner Teil

3.1.3 Toxizitt von Aminen

Die gasfrmigen aliphatischen Amine zeigen akute Toxizitt. Sie reizen die Schleimhute der Augen und Atemwege. Die Einwirkung hherer Konzentrationen auf die Augenschleimhute kann vorbergehende oder dauernde Erblindung bewirken. Die Inhalation grerer Mengen kann bis zum Lungendem und damit zum Tode fhren. Bei Benetzung der Haut mit flssigen Alkylaminen kommt es zu starken Vertzungserscheinungen. Tabelle 3.1.1 zeigt die Siedepunkte und MAKWerte ausgewhlter toxischer Amine.7,8

Tab. 3.1.1:

Siedepunkte und MAK-Werte ausgewhlter toxischer Amine.

Verbindung
Methylamin Dimethylamin Ethylamin Anilin 2-Naphthylamin Benzidin

Siedepunkt [C]
-7,5 6,9 16,6 184,4 306 400

MAK-Wert [mg/m3]
12 4 18 8 -

MAK-Liste
IIIB IIIA1 IIIA1

Aromatische Amine sind sowohl akut als auch chronisch toxisch. Der einfachste Vertreter der aromatischen Amine ist das Anilin. Es ist ein starkes Blut- und Nervengift, das in erster Linie durch Inhalation und infolge der Hautresorption von Dmpfen oder Flssigkeit zur Aufnahme gelangt. Als akute Wirkung steht zunchst die Methmoglobin-Bildung (Met-Hb) im Vordergrund. Das Met-Hb unterscheidet sich vom Hmoglobin durch die 3-Wertigkeit des Eisens (Oxy-Form) und die Unfhigkeit, den Sauerstoff zu binden, so da schwere Vergiftungen bis zum Tode durch inneres Ersticken auftreten knnen. Auerdem entwickelt sich bei hherer Dosis durch die lhmende Wirkung auf das zentrale Nervensystem (ZNS) ein tiefes Koma.9

3 Allgemeiner Teil

Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde erstmals auf den Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Blasenkrebs beim Menschen und der Anilin-Exposition in der Farbstoffindustrie hingewiesen (Anilinkrebs). Ein direkter Kausal-

zusammenhang zwischen der Anilinexposition und dem Auftreten maligner Tumore konnte aber bis heute nicht besttigt werden. Man geht davon aus, da die beobachteten Blasenkarzinome vermutlich durch 2-Naphthylamin oder Benzidin verursacht wurden, die als Verunreinigungen whrend der Anilinsynthese auftreten.10

3.2

Probenahmetechniken

3.2.1 Probenahme mit Impingern (Waschflaschen)

Fr die quantitative Bestimmung gasfrmiger Analyten bedient man sich hufig der Impinger-Technik.11,12 Als Impinger werden spezielle Gaswaschflaschen bezeichnet, die mit der Lsung des Derivatisierungsreagenzes gefllt sind und die man direkt nach der Probenahme als Mekolben verwenden kann. Nach dem Befllen der Impinger saugt man mit Hilfe einer Pumpe ein definiertes Luftvolumen durch die Lsung. Dabei sollte der Analyt vollstndig mit dem Reagenz reagieren. Zur Detektion von Analytdurchbrchen schaltet man hinter den Impinger mit der Sammellsung noch einen weiteren Impinger mit einer Kontrollsung.

Luftprobe

Pumpe

Sammellsung

Kontrollsung

Abb. 3.2.1: Schema fr den Aufbau der Probenahmeeinrichtung mit Impingern.

Nach der Probenahme wird der Impinger auf ein definiertes Volumen aufgefllt, und es wird sowohl eine Probe der Sammel- als auch der Kontrollsung direkt in das chromatographische System injiziert. Durchbrche in die Kontrollsung fhren zu

3 Allgemeiner Teil

einer falschen Bestimmung des Analyten in dieser Luftprobe (Minderbefunde). Grundstzlich knnen Durchbrche zwei Ursachen haben:

Die Analytkonzentration ist fr die Kapazitt des Sammellsung zu hoch.

Die Derivatisierungsreaktion verluft zu langsam, so da der Analyt nicht quantitativ mit dem Reagenz reagiert.

Mit der Impinger-Technik steht dem Analytiker eine schnelle Methode zur Gasphasenbestimmung zur Verfgung. Ein Nachteil ist allerdings der Umgang mit den z. T. toxischen Lsungsmitteln, die whrend der Probenahme verdampfen knnen.

3.2.2 Probenahmerhrchen

Eine weitere Mglichkeit zur quantitativen Bestimmung gasfrmiger Analyten ist die Verwendung von Probenahmerhrchen.13,14 Das Probenahmerhrchen wird hierbei mit einem Adsorptionsmaterial gefllt, das je nach Arbeitstechnik schon vor dem Befllen der Rhrchen mit einem Derivatisierungsreagenz belegt ist oder erst nach dem Fllen des Rhrchens belegt wird. Mit Hilfe einer Pumpe saugt man ein definiertes Luftvolumen durch das Rhrchen. Um Durchbrche zu detektieren, wird entweder hinter das Sammelrhrchen ein Kontrollrhrchen geschaltet, oder in einem einzigen Rhrchen wird hinter der Sammelphase noch eine Kontrollphase eingebracht.

Pumpe

Massenfluregler Kontrollrhrchen Sammelrhrchen

Luftprobe

Abb. 3.2.2: Schema fr den Aufbau der Probenahme mit Probenahmerhrchen.

Nach der Probenahme werden Sammel- und Kontrollrhrchen bzw. Sammel- und Kontrollphase getrennt voneinander eluiert und die Eluate in das

chromatographische Trennsystem injiziert.

3 Allgemeiner Teil

10

3.3

Analytische Bestimmungsverfahren fr Amine

3.3.1 Grundstzliches zu Derivatisierungsverfahren

Die Derivatisierung eines Analyten ist besonders hilfreich, wenn dieser eine sehr hohe Reaktivitt aufweist oder nur unzureichende Detektionseigenschaften besitzt, so da man ihn nicht direkt bestimmen kann.15,16,17,18

Ein leistungsfhiges Derivatisierungsreagenz sollte im Idealfall die folgenden Bedingungen erfllen:

Die Reaktionsgeschwindigkeit der Derivatisierungsreaktion sollte ausreichend hoch sein.

Die Reaktion sollte zur Bildung eines definierten und stabilen Produktes fhren.

Das

verwendete

Reagenz

sollte

hinreichend

selektiv

sein,

um

Nebenreaktionen mit Matrixkomponenten zu vermeiden.

Die Detektionseigenschaften der Analyten sollten sich durch den Einsatz des Reagenzes entscheidend verbessern.

Die

Umsetzung

saurer

und

basischer

Gruppen

des

Analyten

zu

unproblematischen Derivaten sollte zur Verbesserung der Trenneigenschaften fhren.

Mit der Derivatisierung sollte idealerweise eine Anreicherung der Analyten einhergehen knnen.

Kein Reagenz erfllt smtliche Anforderungen an ein ideales Derivatisierungsreagenz. Deshalb stehen fr viele Analyten eine Reihe von Reagenzien zur Verfgung, deren Verwendung von der jeweiligen analytischen Fragestellung abhngig gemacht werden mu.

3 Allgemeiner Teil

11

3.3.2 Derivatisierung von Aminen in Lsung

Die Lebensmittelchemie stellt einen groen Anwendungsbereich fr die Analytik von Aminen in Lsung dar. Von besonderem Interesse sind hier die sogenannten biogenen Amine (bA), die sich als Stoffwechselprodukte von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen6,20 in den unterschiedlichen Nahrungsmitteln befinden. Whrend der Fermentation21,22,23 von Lebensmitteln oder bei Verderbnisprozessen24,25 entstehen grere Mengen bA durch Decarboxylierung der entsprechenden freien Aminosuren, weshalb sie unter anderem wichtige Indikatoren fr den Verderb von Lebensmitteln und damit fr deren Qualitt sind.26,27,28

Lebensmittel stellen an die Analysenmethode sehr hohe Ansprche, da es sich in der Regel um Proben mit einer komplexen Matrix handelt.26 Aus diesem Grund mu das Reagenz mglichst selektiv mit den Analyten reagieren. Soll eine ganze Gruppe von Analyten, in diesem Fall verschiedene Amine, simultan mit einem

Derivatisierungsreagenz bestimmt werden, so ist eine anschlieende Trennung der Derivate sinnvoll. Die Trennung erfolgt in der Regel mittels Gaschromatographie (GC),29 Dnnschichtchromatographie (DC)30 oder Flssigchromatographie (LC). Wegen der hohen Selektivitt und Empfindlichkeit fr bA wird in der Vielzahl der Flle die Hochleistungsflssigkeitschromatographie (HPLC) mit anschlieender UV/vis31,32- oder fluoreszenspektroskopischer Detektion eingesetzt.33,34,35

a)

Derivatisierungsverfahren mit flssigchromatographischer Trennung und anschlieender UV/vis-spektroskopischer Detektion

3,5-Dinitrochlorbenzol (DNClBz)
Dieses Verfahren beruht auf einer Vorsulenderivatisierung der bA mit DNClBz als Derivatisierungsreagenz.36 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittels eines ternren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die entstandenen Derivate UV/vis-spektroskopisch bei 260 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgt ber die Reaktion mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard.

3 Allgemeiner Teil

12

O2N H Cl O2N DNClBz Amin + IN R RI

O2N R N - HCl O2N DNBzAmin RI

Abb. 3.3.1: Reaktion von 3,5-Dinitrochlorbenzol (DNClBz) mit Monoaminen als Beispiel (R = H, Alkyl; RI = Alkyl, Aryl).

Die DNClBz-Methode erlaubt die simultane Bestimmung der fnf wichtigsten in Fisch vorkommenden biogenen Amine: Histamin, Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin. Allerdings fhrt die Detektion bei 260 nm zu Strungen durch Matrixbestandteile, die bei diesen Wellenlngen absorbieren.

p-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (PNZCl)
Diese Methode beruht auf der Derivatisierung von biogenen Amine mit PNZCl als Derivatisierungsreagenz.37 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittels eines ternren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die entstandenen Derivate UV/vis-spektroskopisch bei 265 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgt ber die Reaktion mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard.

O O2N CH2

H O2N - HCl Carbamat CH2

O O C N

R RI

O C Cl + IN R I R Amin

PNZCl

Abb. 3.3.2: Reaktion von p-Nitrobenzyloxycarbonylchorid (PNZCl) mit Monoaminen als Beispiel (R = H, Alkyl; RI = Alkyl, Aryl).

Auch die PNZCl-Methode erlaubt eine simultane Bestimmung der fnf wichtigsten in Fisch vorkommenden biogenen Amine. Die Detektion bei 265 nm kann allerdings zu Strungen absorbieren. durch Matrixbestandteile fhren, die bei diesen Wellenlngen

3 Allgemeiner Teil

13

b)

Derivatisierungsverfahren mit flssigchromatographischer Trennung und anschlieender fluorimetrischer Detektion.

2-Naphthyloxycarbonylchlorid (NOCCl)
Bei dieser Methode wird NOCCl als fluorogenes Reagenz fr die Derivatisierung biogener Amine eingesetzt.38 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittels eines binren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die gebildeten Derivate fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlnge von 274 nm und einer Emissionswellenlnge von 335 nm detektiert und quantifiziert.

O 2

C O

Cl + H2N (CH2)4 NH2 - 2 HCl Put H H (CH2)4 N C O O

NOCCl

C O

Abb. 3.3.3: Reaktion von 2-Naphthyloxycarbonylchlorid (NOCCl) mit Putrescin (Put) als Beispiel fr ein biogenes Amin.

Analog zur DNBzCl-und PNZCl-Methode erlaubt die NOCCl-Methode eine simultane Bestimmung der fnf wichtigsten in Fisch vorkommenden biogenen Amine. Aufgrund der Fluoreszenzdetektion ist sie jedoch wesentlich strungsunanflliger als die beiden anderen Methoden.

3 Allgemeiner Teil

14

3.3.3 Derivatisierung von Aminen in der Gasphase

Flchtige Amine treten nicht nur bei industriellen Prozessen in der Farbstoff- und Polymerherstellung, sondern auch bei der Verarbeitung und Zersetzung von Stickstoffverbindungen vorwiegend tierischen Ursprungs auf. Aufgrund der Toxizitt vieler flchtiger Amine ist es sinnvoll, die Arbeitsplatzluft solcher Betriebe zu berwachen, in denen derartige Verbindungen emittiert werden. Hierunter fallen beispielsweise kunststoffverarbeitende, Pflanzenschutzmittel produzierende sowie Fisch und Fleisch verarbeitende Betriebe.

Aufgrund der komplexen Matrix, die in derartigen Luftproben zu erwarten ist, ist es sinnvoll, mglichst selektive Derivatisierungsreagenzien fr Amine einzusetzen und die verschiedenen Derivate nach erfolgter Probenahme voneinander zu trennen, um sie mglichst simultan bestimmen zu knnen. Die meisten bestehenden Methoden beruhen auf einer flssigchromatographischen Trennung mit anschlieender UV/visoder fluoreszenzspektroskopischer Detektion und Quantifizierung.

b)

Derivatisierungverfahren

mit

flssigchromatographischer

Trennung

und

anschlieender UV/vis-spektroskopischer Detektion.

2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFBz)
In Deutschland erfolgt die Bestimmung primrer und sekundrer aliphatischer Amine nach den Richtlinien des Vereins Deutscher Ingenieure (VDI).39 Diese

Bestimmungsmethode beruht auf der Derivatisierung aliphatischer Amine mit DNFBz als Derivatisierungsreagenz. Nach der Impingerprobenahme erfolgt die flssigchromatographische Trennung. Die gebildeten Derivate werden UV/vis-

spektroskopisch bei 370 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgt ber externe Standards.

3 Allgemeiner Teil

15

F NO2 + NO2 DNFBz Amin H IN R RI - HF

RI NO2

NO2 DNBzAmin

Abb. 3.3.4: Nucleophile aromatische Substitutionsreaktion von 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFBz) mit einem Amin (R, RI = H, Alkyl).

Bei der DNFBz-Methode handelt es sich aufgrund der externen Kalibration um eine sehr robuste Methode. Ein entscheidender Nachteil ist hier allerdings, da ausschlielich die Bestimmung aliphatischer Amine mglich ist.

5,7-Dinitrobenzofurazan (BFZ) und 4,6-Dinitrobenzofuroxan (BFO)


Bei diesen Methoden werden BFZ und BFO als Derivatisierungsreagenzien verwendet.40,41 Nach der Probenahme mittels Probenahmerhrchen erfolgt die flssigchromatographische Trennung. Die Quantifizierung erfolgt fr beide

Reagenzien UV/vis-spektroskopisch bei 510 nm.


Cl O2N N O N NO2 BFZ NO2 BFO N O2N

Cl

O N O

Abb. 3.3.5: Strukturformel des 5,7-Dinitrobenzofurazan (BFZ) und des 4,6Dinitrobenzofuroxan (BFO).

3 Allgemeiner Teil

16

b)

Derivatisierungverfahren

mit

flssigchromatographischer

Trennung

und

anschlieender fluorimetrischer Detektion.

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)
In den Vereinigten Staaten erfolgt die Bestimmung von primren und sekundren aliphatischen Aminen nach der Methode der Behrde fr Arbeitssicherheit und Gesundheit (OSHA, Occupational Safety & Health Administration, U.S. Department of Labor). Diese Methode beruht auf der Derivatisierung aliphatischer Amine mit NBDCl als Derivatisierungsreagenz.42 Nach der Probenahme mittels

Probenahmerhrchen (Adsorbens: XAD-7, Normalphasenkieselgel) erfolgt die flssigchromatographische Trennung mit einem binren Gradienten und einer Cyanopropyl-Sule. Die gebildeten Derivate werden UV/vis-spektroskopisch

und/oder fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlnge von 465 nm und einer Emissionswellenlnge von 525 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgt ber die Reaktion der entsprechenden Amine mit NBDCl, d.h. es wird nicht ber externe Standards kalibriert.

R Cl N H - HCl O + IN R I R N NO2 NBDCl Amin

N O N NO2 NBDAmin

Abb. 3.3.6: Derivatisierungsreaktion


I

von

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

(NBDCl) mit Aminen (R, R = H, Alkyl).

Ein Vorteil der OSHA-Methode ist die Verwendung von Probenahmerhrchen. Sie erlauben eine Probenahme ohne den Einsatz toxischer Lsungsmittel. Ein groer Nachteil dieser Methode ist, da ausschlielich die Quantifizierung aliphatischer Amine mglich ist. Desweiteren kann die Kalibration ber die Reaktion in Lsung zu

3 Allgemeiner Teil

17

schlechteren Nachweisgrenzen fhren, da die Reaktion mglicherweise nicht quantitativ verluft und Nebenprodukte gebildet werden.

3.4

Detektion und Quantifizierung in der Flssigchromatographie

3.4.1 UV/vis-Detektion

Die Absorption elektromagnetischer Strahlung im ultravioletten (200-400 nm) und sichtbaren Bereich (400-800 nm) fhrt zur Anregung von Valenzelektronen in einem Molekl. Das Molekl nimmt bei diesem Vorgang Energie in Form eines Photons auf und wird vom elektronischen Grundzustand in einen elektronisch angeregten Zustand berfhrt. Die verschiedenen elektronischen Zustnde haben im Gegensatz zu Atomen durch berlagerte Schwingungs- und Rotationsniveaus relativ breite Energiebereiche. Aus diesem Grund erhlt man bei Moleklen kein Linien- sondern ein Bandenspektrum.

Eine Klassifizierung der Elektronenbergnge (Absorptionsbanden) lt sich mit Hilfe der beteiligten Moleklorbitale (MO) treffen. Aus bindenden - oder -Orbitalen oder aus den nichtbindenden n-Orbitalen (einsame Elektronenpaare) kann ein Elektron in die leeren antibindenden *- oder *-Orbitale angehoben werden. Entsprechend kann man zwischen vier verschiedenen Arten von bergngen unterscheiden: *, n*, n* und *. 3,16,43,44 Fr die praktische Anwendung der UV/vis-Detektion in der HPLC sind nur diejenigen bergnge interessant, die charakteristisch fr das zu detektierende Molekl sind; dies sind fr gewhnlich n* und *-bergnge.45 Sie entsprechen der Anregung von freien Elektronenpaaren und -Elektronen und finden in einem Wellenlngenbereich von 200-800 nm statt

Quantitative Aussagen der UV/vis-Spektroskopie werden durch die Gltigkeit des Lambert-Beerschen-Gesetzes (Gl. 3.4.1) ermglicht:

E = log

I0 = log T = ( ) c x I

(Gl. 3.4.1)

3 Allgemeiner Teil

18

E: I0: I: T: (): c: x:

Extinktion, Intensitt des eingestrahlten Mestrahls, Intensitt des die Probelsung verlassenden Mestrahls, Transmission, Extinktionskoeffizient bei der Wellenlnge , Konzentration des Analyten, Schichtdicke.

Fr die UV/vis-Detektion werden in der HPLC heute drei verschiedene Detektortypen eingesetzt.17

Festwellenlngendetektoren mit einer Quecksilber-Niederdrucklampe, die nur die Detektion bei 254 nm erlauben.

Detektoren,

die

eine

Lichtquelle

mit

kontinuierlichem

Spektrum

im

ultravioletten (Deuteriumlampe, 190- 370 nm) und im sichtbaren (WolframHalogenlampe, 370-800 nm) Bereich des elektromagnetischen Spektrums besitzen. Durch einen Monochromator kann die Mewellenlnge dem Absorptionsmaximum der Analyten angepat werden.

Diodenarray-Detektoren, die die Aufnahme eines vollstndigen Spektrums zu jedem Zeitpunkt des chromatographischen Laufes erlauben. Dieser

Detektortyp kann neben der Quantifizierung wichtige Informationen bei der Identifizierung unbekannter Verbindungen liefern.

3.4.2 Fluoreszenzdetektion

In Analogie zur UV/vis-Spektroskopie bildet die Absorption eines Photons auch die Basis fr die Fluoreszenzspektroskopie. Das Molekl wird dabei in einen elektronisch angeregten Zustand berfhrt. Die Emission der Strahlung, bei der das Molekl in den Grundzustand zurckkehrt, hat entweder die gleiche Energie

(Resonanzfluoreszenz) oder eine geringere Energie als die einfallende Strahlung. Den Unterschied zwischen Anregungswellenlnge und Emissionswellenlnge bezeichnet man nach ihrem Entdecker als Stokes Shift. Ursache hierfr ist, da

3 Allgemeiner Teil

19

whrend der Absorption nicht nur eine elektronische Anregung, sondern auch eine Schwingungsanregung erfolgt (Franck-Condon-Prinzip). Die Schwingungsenergie wird durch Relaxation sehr viel schneller abgebaut als das Licht emittiert werden kann, so da die Rckkehr in den elektronischen Grundzustand immer aus dem Schwingungsgrundzustand des elektronisch angeregten Zustandes erfolgt.3,16,43,44,46

Fluoreszenzerscheinungen finden sich hufig bei aromatischen Verbindungen. Benzol selbst zeigt starke ultraviolette Fluoreszenz, d.h. es absorbiert kurzwellige ultraviolette Strahlung (230270 nm) und emittiert lngerwelliges, aber immer noch unsichtbares ultraviolettes Licht (260300 nm). Sind mehrere Benzolkerne kondensiert, so kann das emittierte Fluoreszenzlicht aufgrund des groen konjugierten -Systems in den sichtbaren Bereich des Spektrums rcken. Auf Substitutionen am Benzol reagiert das Fluoreszenz-Spektrum hinsichtlich Lage und Intensitt der Linien hnlich empfindlich wie das Absorptionsspektrum. Fhrt man eine Nitro-Gruppe (Nitrobenzol, Nitrotoluol) in den Benzol-Kern ein, so verschwindet die Fluoreszenz vllig; dagegen wird sie durch Einfhrung von Alkyl-Gruppen verstrkt; hier tritt eine sogenannte bathochrome Verschiebung (in den

lngerwelligen Bereich) ein. hnliche Effekte zeigen die CN- oder H2C=CH-Gruppe, whrend Halogene im Benzol-Molekl nur eine geringe Verschiebung der Fluoreszenz unter gleichzeitiger Schwchung der Intensitt bewirken.2

Fr die quantitative Fluoreszenzspektroskopie gilt die in Gl. 3.4.2 beschriebene Nherung: If = 2,303 I0 c x

(Gl. 3.4.2)

3 Allgemeiner Teil

20

If : : I0: : c: x:

Intensitt des Fluoreszenzlichts, Quantenausbeute, Intensitt des eingestrahlten Lichts, Extinktionskoeffizient, Konzentration des Analyten, optische Weglnge.

Im Gegensatz zur UV/vis-Absorptionsspektroskopie ist die Fluoreszenzdetektion durch signifikant niedrigere Nachweisgrenzen gekennzeichnet. Dies ist vor allem darauf zurckzufhren, da fr niedrige Analytkonzentrationen bei der

photometrischen Absorptionsmessung ein kaum geschwchtes Signal (I) vom Ausgangssignal (I0) subtrahiert werden mu. Im Gegensatz dazu findet die Fluoreszenzmessung nahezu ohne Hintergrundsignal statt. Klassische Fluoreszenzdetektoren fr die HPLC nutzen in der Regel lichtstarke Xenonlampen als Anregungsquelle. Das emittierte Licht wird hierbei senkrecht zur Einstrahlrichtung gemessen. Besonders hohe Anregungsenergien werden durch Laserquellen erreicht. Diese sogenannte laserinduzierte Fluoreszenz (LIF) ist besonders fr die MikroHPLC oder die Kapillarelektrophorese (CE) geeignet.

3.4.3 Massenspektrometrische Detektion

Eine hervorragende Ergnzung zur UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Detektion in der Flssigchromatographie bietet die massenspektrometrische Detektion. Im Gegensatz zu den optischen Detektionstechniken ist mit der massenspektrometrischen Verbindungen nicht nur Detektion aufgrund eine Identifizierung von unbekannten (UV/vis-

spektroskopischer

Eigenschaften

Eigenschaften, Fluoreszenzeigenschaften, Retentionszeiten), sondern auch mit Hilfe der Masse-zu-Ladungs-Verhltnisse der untersuchten Molekle mglich. Es besteht so die Mglichkeit, die Ergebnisse der spektroskopischen Methoden zu besttigen oder zu widerlegen.

Ein fundamentales Problem bei der Kopplung der Flssigchromatographie mit der Massenspektrometrie war lange Zeit die erhebliche Diskrepanz zwischen dem relativ groen Lsungsmittelvolumen, das die Trennsule verlt, und den bei der

3 Allgemeiner Teil

21

Massenspektrometrie erforderlichen Vakuumbedingungen. In modernen Interfaces wurde dieses Problem durch die Entwicklung der inzwischen weit verbreiteten Electrospray-Ionisation (ESI) und der chemischen Ionisation bei Atmosphrendruck (APCI) gelst.

Chemische Ionisation bei Atmosphrendruck (APCI)


Im APCI-Modus werden Ionen in der Gasphase bei Atmosphrendruck generiert. Hierzu wird der aus dem chromatographischen Trennsystem ankommende Eluensstrom durch ein Nebulizer-Gas fein zerstubt und in einer beheizbaren Kammer auf ungefhr 400 C erhitzt. Hierbei verdampfen das HPLC-Eluens und der Analyt schlagartig.
geheizte Kapillare Nebulizergas HPLCEluens Vorhanggas CoronarEntladung

Quadrupol

Vorvakuum

Hochvakuum

Abb. 3.4.1: Schematischer Aufbau eines APCI-Interfaces.

Die wegen der nur kurzen Verweilzeit in diesem Teil des Probenkopfes noch weitgehend unzersetzten Analytmolekle werden mit dem Trgergasstrom in den Hochvakuumbereich des Gertes transportiert. Auf ihrem Weg dorthin werden sie durch eine Metallnadel, an der wahlweise eine positive oder negative Spannung angelegt werden kann, ionisiert. Hierbei wird die Ionisation der Probenmolekle durch die aus den Trgergasmoleklen aufgrund von Coronarentladungen generierten Ionen induziert. Durch Zusammenste dieser ionisierten Gasmolekle mit den Analyten werden Ladungen bertragen. Anschlieend gelangen die geladenen Analytmolekle in den Massenanalysator.47,48

3 Allgemeiner Teil

22

Electrospray-Ionisation (ESI)
Ebenso wie die Ionisierung im APCI-Modus erzeugt der Electrospray-Proze Ionen in der Gasphase bei Atmosphrendruck. Hierzu wird das von der HPLC kommende Eluens durch eine Hohlnadel, an der ein hohes elektrisches Potential anliegt, in eine Kammer gesprht. Diesem Sprhnebelstrahl ist, hnlich wie bei der APCI-Technik, oftmals ein Gasstrom entgegengerichtet. Vielfach verluft dieser Gasstrom jedoch auch parallel zum Sprhnebelstrahl. Hierbei entstehen geladene Tropfen, die unter Verdampfung des Lsungsmittels und durch die daraus resultierenden CoulombExplosionen, die wegen des stetig steigenden Ladung/Masse-Verhltnisses auftreten, immer mehr an Gre verlieren.
Kapillare mit Hochspannung Nebulizergas HPLCEluens Vorhanggas

Quadrupol

Vorvakuum

Hochvakuum

Abb. 3.4.2: Schematischer Aufbau der ESI-Einheit.

Unter dem Einflu des elektrischen Feldes gelangen die geladenen Trpfchen durch eine Kapillare in den Vorraum des Massenanalysators, wo sie durch elektrostatische Linsensysteme fokussiert werden. Anschlieend gelangen die ionisierten Analyten in den Detektorbereich.48,49

Insbesondere fr komplexe Naturstoffe wie Proteine ermglicht die ElektrosprayTechnik die Erzeugung mehrfach geladener Spezies und erlaubt so den Zugang auch zu hohen Massenbereichen.48,50,51

3 Allgemeiner Teil

23

Der Quadrupol-Analysator
Ein Quadrupol-Massendetektor besteht aus vier parallel im Quadrat angeordneten Metallstben, von denen kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend verbunden sind. Die Trennung der Ionen erfolgt durch Ablenkung mit Hilfe elektrischer Felder. An jeweils zwei gegenberliegenden Stben liegt eine Wechselspannung an, die von einer positiven oder negativen Gleichspannnung berlagert wird. Die angelegte Wechselspannung baut alternierend positive und negative elektrische Felder auf, so da die Ionen einmal zur Mittelachse und einmal zu den Stben beschleunigt werden. Wie weit sie dabei aus ihrer geradlinigen Bahn seitlich abgelenkt werden, hngt von der angelegten Spannung, der Frequenz und der Masse der Ionen ab. Die negativ bzw. positiv berlagerte Gleichspannung sorgt dafr, da Ionen ab einer bestimmten Masse zu den Stben hin abgelenkt oder zur Mittelachse fokussiert werden. Durch geeignete Abstimmung der Gleich- und Wechselspannung lt sich erreichen, da jeweils nur Ionen eines bestimmten Masse-zu-Ladungs-Verhltnisses das Stabsystem passieren knnnen. Die Quadrupol-Einheit kann deshalb auch als Massenfilter bezeichnet werden.52

3.5

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)

3.5.1 Darstellung

Die Synthese des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols (NBDCl, 4-Chloro-7nitrobenzofurazan) ist erstmals 1967 von Ghosh und Whitehouse53,54 beschrieben worden. Ausgehend von 2,6-Dichloronitrosobenzol wird in einer nucleophilen aromatischen Substitutionsreaktion ein o-Nitrosophenylazid erhalten (a), welches nach Pyrolyse das 4-Chlorobenzo-2-oxa-1,3-diazol liefert (b). Die Nitrierung des 4Chlorobenzo-2-oxa-1,3-diazols nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (c). ergibt das gewnschte Produkt, 4-Chloro-7-

3 Allgemeiner Teil

24

Cl NO Cl NaN3 (a)

Cl NO N3 N N N N + Cl -N2 (b) N O N HNO3/ H2SO4 (c) NO2 Cl N O N O-

Abb. 3.5.1: Darstellung

des

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

(NBDCl)

ausgehend von 2,6-Dichloronitrosobenzol.

3.5.2 Eigenschaften und Anwendung

Benzo-2-oxa-1,3-diazole

haben

aufgrund

ihrer

attraktiven

spektroskopischen

Eigenschaften einen weiten Einsatz in der Analytische Chemie gefunden.55,56

RI
aH
5 4 3

N O2 N
1

bH

6 7

RII

Abb. 3.5.2: Strukturformel des Benzo-2-oxa-1,3-diazol-Grundgerstes (RI, RII = Substituenten).

In der Literatur sind die spektroskopischen Eigenschaften von sehr vielen Verbindungsklassen mit den Resten RI und RII diskutiert worden57. Whrend alle Benzo-2-oxa-1,3-diazole hervorragende UV/vis-spektroskopische Eigenschaften zeigen, sind jedoch nur einige Verbindungen auch gleichzeitig gute Fluorophore.57

3 Allgemeiner Teil

25

H3C

H N O N

H3C

H N O N

H3C

H N O N

SO2NH2 R.F.I. = 2,0

SO2N(CH3)2 R.F.I. = 5,9

NO2 R.F.I. = 62,7

Abb.3.5.3:

Strukturformel ausgewhlter Aminderivate der Benzo-2-oxa-1,3-diazole (R.F.I. = relative Fluoreszenzintensitt; bezogen auf SO2N(CH3)2/NH2 als Referenzverbindung mit R.F.I. = 1; die R.F.I. beziehen sich auf Messungen von Imai et al.57).

So zeigen beispielsweise die Aminderivate der Benzo-2-oxa-1,3-diazole mit Sulfonamid-Gruppe (RII = SO2NH2, SO2(CH3)2) nur sehr schwache Fluoreszenz verglichen mit den Aminderivaten der Benzo-2-oxa-1,3-diazole mit Nitrogruppe (RII = NO2). Abbildung 3.5.3 zeigt ausgewhlte Vertreter dieser Verbindungen. Fr die Bestimmung von Thiolen,58 Phenolen,59,60 Aminosuren,53,61,62,63,64,65,66 Aminen,42,53,67 Aldehyden und Ketonen,68,69,70 werden aufgrund ihrer guten Fluoreszenzeigenschaften hufig Derivatisierungsreagenzien auf der Basis des 7Nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-Grundgerstes (RII= NO2) eingesetzt. In dieser Arbeit sollen nicht nur die UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften der Aminderivate des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols,

sondern auch die massenspektrometrischen Eigenschaften untersucht werden.

4 Experimenteller Teil

26

4
4.1

Experimenteller Teil
Chemikalien

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen:

Aldrich (Steinheim), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Supelco (Deisenhofen).

Die Lsungsmittel fr die prparativen Arbeiten und spektroskopische Messungen wurden von Grssing (Filsum) bezogen. Als Laufmittel fr die HPLC dienten Acetonitril elution grade von Merck eurolab (Fontenau S, Bois/Frankreich) und Wasser fr die Chromatographie von Merck eurolab (Briare le Canal/Frankreich).

4.2

Gerte

4.2.1 Elementaranalyse

Die Elementaranalysen wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemie der Westflischen Wilhelms-Universitt Mnster mit einem vario EL III CHNOSAnalysator (Gerte-Version H) der Fa. Elementar Analysensysteme GmbH (Hanau) bestimmt.

4.2.2 FT-IR

Die Infrarotspektren wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemie der WWU Mnster mit dem Gert IFS 48 der Fa. Bruker (Bremen) aufgenommen. Die Infrarotspektren wurden im Bereich von 4000 cm -1 bis 400 cm-1 aufgenommen. Die

4 Experimenteller Teil

27

Lage der Banden wird in Wellenzahlen (cm-1) und ihre Intensitt mit s (strong, stark), m (middle, mittel), w (weak, schwach) angegeben. Die synthetisierten Verbindungen wurden als Kaliumbromid-Prelinge vermessen.

4.2.3 Massenspektren

Die Schubstangen-Massenspektrometrie mit Elektronensto-Ionisation bei 70 eV wurde an einem MAT 212 der Fa. Varian (Darmstadt) im Institut fr Anorganische und Analytische Chemie der WWU Mnster durchgefhrt.
1

4.2.4

H-NMR-Spektren

Die 1H-NMR-Spektren wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemie der WWU Mnster unter Verwendung des Gertes AC 200 der Fa. Bruker (Bremen) aufgenommen. Die Proben wurden in DMSO-d6 als Lsungsmittel vermessen Die chemischen Verschiebungen werden in parts per million (ppm) angegeben und beziehen sich auf Tetramethylsilan (TMS, Si(CH 3)4) als Referenzverbindung. Fr die Signalmultiplizitten wurden die Abkrzungen s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) verwendet.

4.2.5 Photometrie

Die photometrischen Messungen wurden mit einem Diodenarray-Photometer HP 8453 mit der Software UV/visible HP Chem-Station 845x der Fa. Hewlett-Packard (Waldbronn) durchgefhrt.

4.2.6 Fluoreszenzspektren

Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Fluoreszenzspektrometer Modell RF5301 und der Software Version 1.10 der Fa. Shimadzu (Duisburg) aufgenommen.

4 Experimenteller Teil

28

4.2.7 HPLC

Die flssigchromatographischen Trennungen wurden mit folgendem HPLC-System der Fa. Shimadzu (Duisburg) durchgefhrt:

Pumpen: zwei LC-10AS, Diodenarray-Detektor: SPD-10AVp, Fluoreszenz-Detektor: RF-10AXL, Software: Class LC 10 Version 1.6, Kontrolleinheit: CBM 10A, Entgaser: GT-154, Autosampler: SIL-10A.

Als stationre Phase wurde folgendes System verwendet:

Umkehrphasensule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen),


HPLC-Column, 15 cm x 3 mm, 5 m,

Vorsule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen), HPLC-Precolumn,


2 cm x 3 mm, 5 m.

Als mobile Phase kam folgender binrer Gradient aus Acetonitril und Wasser zum Einsatz:

Zeit [min] c(AcNi) [%] 30 30 50 50 100 100 30 30 0 1,5 8,5 10,5 13,5 14,5 16,0 19,5

Injektionsvolumen: 10 L, Flu: 0,62 mL/min.

4 Experimenteller Teil

29

4.2.8 LC-MS

Die flssigchromatographischen Trennungen wurden mit folgendem HPLC-System der Fa. Shimadzu (Duisburg) durchgefhrt:

Pumpen: zwei LC-10AD vp, UV/vis-Detektor: SPD-10A, Software: Class 8000 Version 1.11, Kontrolleinheit: SCL-10Avp, Entgaser: DGU-14A, Autosampler: SIL-10A, Massenspektrometer: LCMS QP8000.

Als stationre Phase wurde folgendes System verwendet:

Umkehrphasensule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen),


HPLC-Column, 15 cm x 3 mm, 5 m,

Vorsule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen), HPLC-Precolumn,


2 cm x 3 mm, 5 m.

Als mobile Phase kam folgender binrer Gradient aus Methanol und Wasser zum Einsatz:

Zeit [min] c(MeOH) [%]

0 35

0,5 35

7 50

11 100

13 100

14 35

18 35

Injektionsvolumen: 10 L, Flu: 0,6 mL/min.

4 Experimenteller Teil

30

4.2.9 Aktivprobenahme

Fr die Aktivprobenahme ist folgendes System zur Anwendung gekommen:

Pumpe: Als Pumpe kam ein Zweikanal-Air-Sampler Modell 1067 der Fa.
Supelco (Deisenhofen) zur Anwendung. Die Flurate der Zweikanal-Pumpe wurde mit Hilfe eines 1000mL-Bubble-Flowmeters der Fa. Supelco

(Deisenhofen) bestimmt.

Gepackte

Rhrchen:

Die

Herstellung

reagenzbeschichteter

Probenahmerhrchen erfolgte mit den SPE-Kartuschen Supelclean LC-8, Supelclean LC-8 TS, Supelclean LC-18 und Discovery DPA-6S-Material (Polypropylen-Filtrationskartuschen mit Polyethylenfritten, Fllmenge 500 mg, Partikelgre 45 m, Porendurchmesser 60 , Kartuschen-Volumen 6 mL) der Fa. Supelco (Deisenhofen)

Ungepackte

Rhrchen:

Die

Herstellung

selbst

gepackter

Probenahmerhrchen erfolgte unter Verwendung von 6mL-Glaskartuschen mit Teflon-Fritte der Fa. Supelco (Deisenhofen) und dem Packungsmaterial Discovery DPA-6S-Material (Partikelgrenverteilung 50-160 m,

unregelmige Partikelform, Lot: SP2388) der Fa. Supelco (Deisenhofen).

4 Experimenteller Teil

31

4.3

Synthese und Charakterisierung der 4-Amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazole (NBDamine)

4.3.1 4-(Amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDA)


H
aH
5

N
4

H
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Die Synthese des reinen NBDA-Standards ist sehr aufwendig, da das AmmoniakMolekl nur ein sehr schwaches Nucleophil darstellt. Die schwache Nucleophilie des Ammoniak-Molekls fhrt zu sehr langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten und damit zur Bevorzugung aller Konkurrenzreaktionen mit strkeren Nucleophilen.
I

R + HNRR Cl N O N NO2 NBDCl + OH


I

N O N NO2 NBDAmin OH N O N NO2 NBDOH

SN2Ar

SN2Ar

Abb. 4.3.1: Bildung des NBDAmins und des Hydrolyseproduktes NBDOH (R, RI = H, Alkyl, Aryl; SN2Ar = Nucleophile aromatische Substitution).

4 Experimenteller Teil

32

Beim Arbeiten mit ammoniakalischen Lsungen sind aufgrund der basischen Eigenschaften des Ammoniaks immer Hydroxyl-Anionen anwesend, die strkere Nucleophile als das Ammoniak-Molekls sind, so da als Konkurrenzreaktion bevorzugt die Hydrolyse auftritt. Bei der Aufarbeitung des Standards ist also das Hydrolyse-Produkt zu entfernen.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-(Amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols


In einem 100mL-Dreihalskolben werden 500 mg NBDCl (2,5 mmol) in 20 mL Acetonitril gelst. Zu dieser Lsung tropft man sehr langsam eine Mischung aus 8,5 mL einer 28%igen Ammoniumhydroxid-Lsung (125 mmol) gelst in 10 mL Acetonitril und lt 48 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Zur Reaktionsmischung gibt man 50 mL DMSO und extrahiert dieses Gemisch dreimal mit je 50 mL Diethylether (destilliert). Um das Hydrolyseprodukt aus der organischen Phase zu entfernen, extrahiert man dreimal mit je 20 mL einer 10%igen

Natriumhydrogencarbonat-Lsung, wscht einmal mit 20 mL Wasser und trocknet die organische Phase ber Natriumsulfat. Dann entfernt man das Lsungsmittel im Vakuum und erhlt ein schwarzbraunes Pulver.

Ausbeute: schwarzbraune Kristalle; 14% (63 mg, 0,35 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,24 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz)

EA berechnet fr: C6H4N4O3 gefunden:

C: 40,00%; H: 2,22%; C: 40,29%; H: 2,24%

Die Elementaranalyse lieferte fr den Stickstoff-Gehalt des NBDA keinen akzeptablen Wert, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen eingesetzten Methoden keine Hinweise auf eventuelle Verunreinigungen zeigten. IR [cm-1]:

3430 (m), 3340 (s), 3230 (m), 3085 (w), 2965 (w), 1645 (s), 1560(s), 1530 (w), 1495 (m), 1445 (m),1420 (m),1385 (w), 1310(s), 1285 (w)

4 Experimenteller Teil

33

EI-MS [m/z]: 180 (M+, 100%), 150 (M+-NO, 27%), 104 (31%), 77 (39%), 52 (15%), 30 (15%) APCI(-)-MS [m/z]: 179 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

448

(max) [L.mol-1.cm-1]: 11400 em [nm]: 524 ex [nm]: 470 4.3.2 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDMA)
H
aH
5

Fluoreszenz (CH3CN):

N
4

CH3
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Die Synthese des NBDMA-Standards erfolgt nicht direkt durch die Reaktion des NBDCl mit Methylamin als Nucleophil, da es sich beim Methylamin um ein bei Raumtemperatur flchtiges Amin (Kp. 6,3 C) handelt. Das Methylamin wird indirekt aus dem Hydrochlorid freigesetzt, indem man die Reaktion in einem schwach basischem Puffer durchfhrt. In Gegenwart des Puffers ist es zudem mglich, die Hydrolyse als unerwnschte Nebenreaktion vollstndig zu unterdrcken.

4 Experimenteller Teil

34

Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 250mL-Rundkolben werden ca. 0,85 g (12,5 mmol) Methylaminhydrochlorid in 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 48 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das rotbraune Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einem Bchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rotbraune Kristalle; 48% (233 mg, 1,2 mmol)

Ein alternativer Weg zur Darstellung des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols ist von Bldt et al. in der Literatur71 beschrieben.

H3C

NH2 N O N NO2-/H+

H3C

H N O N

NO2 MNBDH

NO2 NBDMA

Abb. 4.3.2: Reaktion des MNBDH mit Nitrit in saurer Lsung.

Hierbei wird das NBDMA nicht ber eine nucleophile aromatische Substitution hergestellt, sondern ber die Oxidation von 4-N-Methylhydrazino-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol (MNBDH) mit Natriumnitrit als Oxidationsmittel.

4 Experimenteller Teil

35

Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols aus MNBDH und Nitrit
0,2 g ( 0,9 mmol) MNBDH werden in 30 mL Ethanol und 5 mL konzentrierter Salzsure gelst und unter Eiskhlung mit einer Lsung von 70 mg (1 mmol) Natriumnitrit in 5 mL destilliertem Wasser versetzt. Nach halbstndigem Stehen der Lsung bei Raumtemperatur werden 50 mL Wasser hinzugegeben. Anschlieend lt man noch eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, wobei ein rotbrauner Niederschlag ausfllt. Dieser wird abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen.

Ausbeute: rotbraune Kristalle; 67% (122 mg, 0,63 mmol)

Die

Darstellung

des

NBDMA

ber

den

zweiten

Reaktionsweg

hat

zwei

entscheidende Vorteile gegenber dem ersten Reaktionsweg. Die Oxidation des MNBDH verluft viel schneller als die nucleophile aromatische Substitution des NBDCl und die Bildung des Hydrolyseproduktes tritt nicht als Nebenreaktion auf. Deshalb ist die Darstellung ber den zweiten Reaktionsweg wesentlich

unproblematischer als ber den ersten Reaktionsweg.

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,45 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,08 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,24 (d, 3H, N-CH3)

EA berechnet fr: C7H6N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 43,29%; H: 3,09%; N: 28,87%; C: 42,83%; H: 2,87%; N: 28,72%

3315 (s), 3085 (w), 2970 (w), 1620 (s), 1600(s), 1530 (w), 1480 (m), 1430 (w),1400 (w),1375 (w), 1350(w), 1320 (s), 1270 (s)

EI-MS [m/z]: 194 (M+, 100%), 164 (M+-NO, 5%), 148 (5%), 103 (9%), 91 (15%), 52 (15%) APCI(-)-MS [m/z]: 193 ([M-H]-)

4 Experimenteller Teil

36

UV (CH3CN):

max [nm]:

459

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23300 em [nm]: 529 ex [nm]: 344, 468 4.3.3 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDMA)
H3C
aH
5

Fluoreszenz (CH3CN):

N
4

CH3
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Analog zur Darstellung des NDBMA wird auch das NBDDMA aus NBDCl und Dimethylaminhydrochlorid in Gegenwart eines basischen Puffers dargestellt, da das Dimethylamin bei Raumtemperatur leicht flchtig ist (Kp. 7 C).

Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols


In einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1 g (12,5 mmol) Dimethylaminhydrochlorid in 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 30 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das orangefarbene Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einem Bchnertrichter abgesaugt; anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangfarbene Nadeln; 58% (302 mg, 1,45 mmol)

Ein alternativer Weg zur Darstellung des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols ist die Freisetzung des Dimethylamins als Nucleophil durch die Zugabe von verdnnter Natronlauge. Die sekundren Aminderivate haben im Gegensatz zu

4 Experimenteller Teil

37

den primren Aminderivaten die Eigenschaft, besser aus Reaktionslsungen auszukristallisieren, so da man sie mhelos vom in der Lsung befindlichen Hydrolyseprodukt abtrennen kann.

Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols


In einem 100mL-Rundkolben werden 1 g (12,5 mmol) Dimethylaminhydrochlorid in 20 mL Wasser gelst. Zu dieser Lsung gibt man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Unter stndigem Rhren bei Raumtemperatur tropft man sehr langsam mit einer Pasteurpipette 15 mL einer 1 M Natriumhydroxid-Lsung zu dieser Mischung und lt noch etwa eine Stunde weiterrhren, bevor man den entstandenen orangen Niederschlag ber einem Bchnertrichter absaugt, mit wenig Wasser und Acetonitril wscht und im Vakuumexsikkator trocknet.

Ausbeute: orange Nadeln; 60% (312 mg, 1, 5 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,53 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,23 (s, 6H, 2N-CH3,)

EA berechnet fr: C8H8N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 46,15%; H: 3,85%; N: 26,92%; C: 45,93%; H: 3,71%; N: 26,82%

3450 (m), 3100 (w), 2920 (w), 1610 (s), 1560(s), 1540 (m), 1500 (m), 1470 (m), 1430 (w), 1370 (w), 1320 (s), 1300 (s)

EI-MS [m/z]: 208 (M+, 100%), 162 (17%), 131 (48%), 117 (23%), 92 (12%), APCI(-)-MS [m/z]: 208 ([M]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

478

(max) [L.mol-1.cm-1]: 25300

4 Experimenteller Teil

38

Fluoreszenz (CH3CN):

em [nm]: 540 ex [nm]: 359, 439, 510

4.3.4 4-N-(Ethylamino)-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDEA)


H
aH
5

N
4

C2H5
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Auch das Ethylamin ist ein bei Raumtemperatur flchtiges Amin (Kp. 16,6 C), weshalb die Synthese auch hier indirekt aus dem Hydrochlorid in Gegenwart eines basischen Puffers durchgefhrt wird.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Ethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1 g (12,5 mmol) Ethylaminhydrochlorid in 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril. Die Reaktionsmischung lt man 36 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das braune Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einem Bchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: braune Kristalle; 53% (276 mg, 1,33 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,51 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,57 (q, 2H, N-CH2), 1,40 (t, 3H, CH3)

EA berechnet fr: C7H6N4O3 gefunden:

C: 46,15%; H: 3,85%; N: 26,92%; C: 45,94%; H: 3,43%; N: 26,35%

4 Experimenteller Teil

39

IR [cm-1]:

3270 (s), 3170 (w), 3080 (w), 2980 (w), 1610 (s), 1595(s), 1530 (m), 1480 (m), 1450 (w),1405 (w),1360 (w), 1250 (s)

EI-MS [m/z]: 208 (M+, 100%), 163 (3%), 131 (5%), 117 (15%), 76 (15%), 52 (2%) APCI(-)-MS [m/z]: 207 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

460

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23500 em [nm]: 525 ex [nm]: 340, 468 4.3.5 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDEA)
H5C2
aH
5

Fluoreszenz (CH3CN):

N
4

C2H5
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Auch das NBDDEA wurde indirekt durch die Freisetzung des Diethylamins in Gegenwart eines basischen Puffers dargestellt, obwohl das Diethylamin ein bei Raumtemperatur flssiges Amin ist (Kp. 56,3 C). Die direkte Synthese aus dem freien Amin mit NBDCl fhrte zu groen Mengen des Hydrolyseproduktes als Verunreinigung.

4 Experimenteller Teil

40

Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols


In einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1,4 g (12,5 mmol) Diethylaminhydrochlorid in 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 24 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das orange-rote Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einem Bchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orange-rote Kristalle; 67% (395 mg, 1,68 mmol)

Analog zur Arbeitsvorschrift (2) fr das NBDDMA lt sich auch das NBDDEA darstellen. Als sekundres Aminderivat fllt das NBDDEA spontan aus der Reaktionslsung aus.

Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols


In einem 100 mL-Rundkolben werden 1,4 g (12,5 mmol) Diethylaminhydrochlorid in 20 mL Wasser gelst. Zu dieser Lsung gibt man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Unter stndigem Rhren bei Raumtemperatur tropft man sehr langsam mit einer Pasteurpipette 15 mL einer 1 M Natriumhydroxid-Lsung zu dieser Mischung und lt noch etwa eine Stunde weiterrhren, bevor man den entstandenen orange-roten Niederschlag ber einem Bchnertrichter absaugt, mit wenig Wasser und Acetonitril wscht und im Vakuumexsikkator trocknet.

Ausbeute: orange-rote Kristalle; 49% (289 mg, 1,23 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,43 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,13 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,97 (q, 4H, 2N-CH2), 1,41 (t, 6H, 2CH3)

4 Experimenteller Teil

41

EA berechnet fr: C10H12N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 50,85%; H: 5,08%; N: 23,73%; C: 50,49%; H: 4,81%; N: 23,54%

3440 (m), 3120 (w), 2990 (w), 2940 (w), 1605 (s), 1560(s), 1530 (m), 1490 (m), 1450 (m), 1390 (w), 1360 (w), 1340 (s), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 236 (M+, 93%), 221 (100%), 159 (18%), 145 (74%), 103 (10%), 64 (5%) APCI(-)-MS [m/z]: 236 ([M]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

485

(max) [L.mol-1.cm-1]: 25600 em [nm]: 540 ex [nm]: 356, 452, 513 4.3.6 4-N-(n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDnPA)
H
aH
5

Fluoreszenz (CH3CN):

N
4

C3H7
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Obwohl das n-Propylamin ein bei Raumtemperatur flssiges Amin ist (Kp. 48 C), ist auch hier der indirekte Syntheseweg ber das Hydrochlorid gewhlt worden. Die primren Aminderivate zeigen sehr schlechte Kristallisationseigenschaften, fallen aber unter den gegebenen Reaktionsbedingungen aus und lassen sich ohne Verunreinigungen isolieren.

4 Experimenteller Teil

42

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1,2 g (12,5 mmol) Propylaminhydrochlorid in 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 20 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das braune Derivat fllt aus der Mischung aus und wird auf einem Bchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: braune Nadeln; 64% (355 mg, 1,6 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,50 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,19 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,47 (t, 2H, N-CH2), 1,82 (m, 2H, CH2), 1,02 (t, 3H, CH3)

Wiederholte

Elementaranalysen

lieferten

keine

akzeptablen

Kohlenstoff-,

Wasserstoff- und Stickstoffwerte, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen angebenen Methoden keinen Hinweis auf vorhandene Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3350 (s), 3310 (w), 3100 (w), 2960 (w), 1620 (s), 1590(s), 1525 (m), 1450 (w),1405 (w),1370 (w), 1270 (s)

EI-MS [m/z]: 222 (M+, 100%), 193 (55%), 163 (2%), 145 (2%), 117 (26%), 76 (4%) APCI(-)-MS [m/z]: 221 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

461

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23600

4 Experimenteller Teil

43

Fluoreszenz (CH3CN):

em [nm]: 524 ex [nm]: 334, 468

4.3.7 4-N,N-(Di-n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDnPA)


H7C3
aH
5

N
4

C3H7
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Die direkte Synthese aus NBDCl und Dipropylamin zum NBDDPA war nicht mglich, da das reine NBDDPA wegen der Verunreinigung mit dem Hydrolyseprodukt nicht aus der Reaktionslsung isoliert werden konnte. Im folgenden wurde zunchst das Hydrochlorid des Dipropylamins hergestellt und dann die schon bekannte Reaktion durchgefhrt.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N,N-(Di-n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol


In einem 250mL-Rundkolben werden 1,76 mL (1,3 g, 12,5 mmol) Dipropylamin gegeben. Unter Eiskhlung gibt man ganz langsam 1 mL konzentrierte Salzsure hinzu und lt die Mischung ca. eine halbe Stunde rhren. Zu dieser Lsung gibt man zunchst 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) und dann eine Lsung aus 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 20 mL Acetonitril. Die Mischung lt man ca. 6 Stunden bei Raumtemperatur rhren, saugt das ausgefallene orangefarbene Derivat auf einem Bchnertrichter ab, wscht es mit wenig Wasser und Acetonitril und trocknet es im Vakuumexsikkator.

Ausbeute: orangefarbene Nadeln; 82% (541 mg, 2,05 mmol)

4 Experimenteller Teil

44

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,42 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,10 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,74 (t, 4H, 2N-CH2), 1,83 (m, 4H, 2CH2), 1,10 (t, 6H, CH3)

EA berechnet fr: C10H12N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 54,55%; H: 6,06%; N: 21,21%; C: 54,35%; H: 5,82%; N: 21,18%

3440 (m), 3120 (w), 2990 (w), 2940 (w), 1610 (s), 1560(s), 1530 (m), 1490 (m), 1450 (m), 1390 (w), 1360 (w), 1340 (s), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 264 (M+, 31%), 235 (100%), 193 (21%), 159 (15%), 117 (18%), 41 (7%) APCI(-)-MS [m/z]: 264 ([M]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

488

(max) [L.mol-1.cm-1]: 25900 em [nm]: 540 ex [nm]: 355, 470, 513 4.3.8 4-N-(n-Butylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDnBA) und 4-N,N-(Di-n-Butylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDnBA)

Fluoreszenz (CH3CN):

H
aH
5

N
4

C4H9
3

H9C4
aH

N
4

C4H9
3

N O2 N
1

N O2 N
1

bH

6 7

bH

6 7

NO2

NO2

Fr die meisten bei Raumtemperatur nichtflchtigen Amine ist es mglich, eine Derivatisierung schnell und einfach in einem Probenglschen ohne Anwesenheit eines Puffers durchzufhren. Je nach Reaktivitt des Amins und

4 Experimenteller Teil

45

Kristallisationsneigung des Derivates findet eine heftige Reaktion mit sofortiger Kristallisation statt oder eine langsame Reaktion bei der das NBDamin erst nach lngerer Khlung ausfllt. Bei den NBD-Derivaten des n-Butylamins und des nDibutylamins finden sehr heftige Reaktionen ohne Kristallisation der Derivate statt. Selbst durch tagelange Khlung im Eisfach (-18 C) sind diese Derivate nicht zur Kristallisation zu bringen, so da eine Isolierung und damit Charakterisierung nicht mglich ist. Auch der indirekte Weg ber die Hydrochloride des n-Butylamins und des n-Dibutylamins fhrte nicht zum Ziel. Die Derivate lieen sich nicht isolieren. Ein mglicher Grund fr dieses Verhalten knnte sein, da es fr die NBDamine mit einer Alkylkettenlnge von vier C-Atomen nicht mglich ist, ein Kristallgitter aufzubauen. Die Kontrolle der Reaktionslsung durch HPLC mit UV/vis- und fluoreszenspektroskopischer Detektion zeigte anhand der Retentionszeiten und spektroskopischen Eigenschaften der detektierten Verbindungen, da es sich um die ensprechenden Derivate handelte. Die durch LC-MS gewonnenen Massenspektren konnten dies besttigen.

4.3.9 4-N-(n-Pentylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDPeA)


H
aH
5

N
4

C5H11
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(n-Pentylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 580 L (436 mg, 5 mmol) Amylamin zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischung wird etwa 4 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangebraune Kgelchen, 79% (494 mg, 1,98 mmol)

4 Experimenteller Teil

46

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,19 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,73 (t, 2H, N-CH2), 1,79 (m, 6H, 3CH2), 1,05 (t, 6H, CH3)

EA berechnet fr: C11H14N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 52,80%; H: 5,60%; N: 22,40%; C: 52,72%; H: 5,34%; N: 22,11%

3250 (s), 3170 (w), 3080 (w), 2975 (w), 1610 (s), 1595(s), 1530 (m), 1470 (m), 1450 (w),1410 (w),1360 (w), 1250 (s)

EI-MS [m/z]: 250 (M+, 100%), 163 (2%), 117 (21%),104 (31%), 76 (5%), APCI(-)-MS [m/z]: 249 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

459

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23600 em [nm]: 524 ex [nm]: 335, 468 4.3.10 4-N-(Benzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDBzA)

Fluoreszenz (CH3CN):

H
aH
5

N
4

CH2
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

4 Experimenteller Teil

47

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Benzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 546 L Benzylamin (536 mg, 5 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Man beobachtet eine heftige Reaktion mit Wrmeentwicklung. Die Mischung wird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt. Der Feststoff wird in etwa 1 mL 10%iger

Natriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rostbraune Kristalle, 74% (499 mg, 1,85 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,37-7,46 (m, 5H, Aryl-H), 6,20 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,69 (d, 2H, Aryl-CH2)

EA berechnet fr: C13H10N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 57,77%; H: 3,70%; N: 20,74%; C: 57,60%; H: 3,64%; N: 20,49%

3260 (m), 3070 (w), 1620 (m), 1580 (s), 1530 (w), 1480 (s), 1450 (m), 1420 (w),1400 (w), 1360(w), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 270 (M+, 27%), 236 (3%), 193 (3%), 167 (2%), 91 (100%) APCI(-)-MS [m/z]: 269 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

458

(max)/[L.mol-1.cm-1]: 23400 em [nm]: 523 ex [nm]: 334, 468

Fluoreszenz (CH3CN):

4 Experimenteller Teil

48

4.3.11 4-N-(o-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-2-MBzA)

CH3 H
aH
5

N
4

CH2
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(o-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2oxa-1,3-diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1292 L (1262 mg, 10 mmol) 2Methylbenzylamin zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Nach zweistndigem Rhren auf dem Magnetrhrer stellt man die Lsung fr 3 Tage ins Gefrierfach (-18 C). Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 31% (220 mg, 0,78 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,24-7.30 (m, 4H, Aryl-H), 6,20 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,64 (d, 2H, Aryl-CH2), 2,37 (s, 3H, CH3)

EA berechnet fr: C14H12N4O3 gefunden:

C: 59,15%; H: 4,23%; C: 59,96%; H: 5,10%

Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen eingesezten Methoden keinen Hinweis auf vorhandene Verunreinigungen ergaben.

4 Experimenteller Teil

49

IR [cm-1]:

3470 (m), 3280 (m), 3070 (m), 2980 (m), 2880 (m), 1620 (s), 1590 (s), 1520 (w), 1480 (m), 1445 (m),1400 (w), 1360 (w), 1290(s), 1230 (s)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 16%), 233 (2%), 207 (1%), 105 (100%), 77 (10%), 30 (2%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

473

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23800 em [nm]: 523 ex [nm]: 334, 468 4.3.12 4-N-(m-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-3-MBzA)

Fluoreszenz (CH3CN):

CH3

H
aH
5

N
4

CH2
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(m-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2oxa-1,3-diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 640 L (618 mg, 5 mmol) des Amins zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort, da eine heftige Reaktion stattfindet. Der Feststoff fllt sofort aus, wird auf einem Bchnertrichter abgesaugt, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 76% (539 mg, 1,9 mmol)

4 Experimenteller Teil

50

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,43 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,20-7,28 (m, 4H, Aryl-H), 6,23 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,65 (d, 2H, CH2), 2,41 (s, 3H, CH3)

EA berechnet fr: C14H12N4O3 gefunden:

C: 59,15%; H: 4,23%; C: 58,96%; H: 4,11%

Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie der anderen eingesezten Methoden keinen Hinweis auf vorhandene Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3470 (w), 2990 (s), 2915 (s), 2700 (w), 2610 (w), 2025 (w), 1610 (m), 1510 (w), 1490 (w), 1460 (m), 1400 (w),1390 (w), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 19%), 207 (2%), 105 (100%), 77 (5%), 30 (3%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

473

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23600 em [nm]: 524 ex [nm]: 334, 468

Fluoreszenz (CH3CN):

4 Experimenteller Teil

51

4.3.13 4-N-(p-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-4-MBzA)

CH3

H
aH
5

N
4

CH2
3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(p-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2oxa-1,3-diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 656 L 4-Methylbenzylamin (625 mg, 5 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Nachdem die Mischung 24 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt wurde, wird sie fr weitere 24 Stunden tiefgefroren (-18 C). Der ausgefallene Feststoff wird in etwa 1 mL 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig

Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 28% (198 mg, 0,7mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,22-7,28 (m, 4H, Aryl-H), 6,22 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,63 (d, 2H, CH2), 2,38 (s, 3H, CH3)

EA berechnet fr: C14H12N4O3 gefunden:

C: 59,15%; H: 4,23%; C: 59,13%; H: 4,18%

4 Experimenteller Teil

52

Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl die Kontrolle mittels HPLC und der anderen eingesetzten Methoden keinen Hinweis auf vorhandene Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3365 (s), 3270 (m), 3070 (w), 2950 (w), 1620 (s), 1580 (s), 1530 (m), 1490 (s), 1440 (w),1400 (m),1380 (w), 1360(s), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 25%), 250 (2%), 207 (2%), 105 (100%), 79 (4%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

473

(max) [L.mol-1.cm-1]: 23800 em [nm]: 524 ex [nm]: 337, 468 4.3.14 4-N-(Phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-oxa-1,3-diazol (NBDAn)

Fluoreszenz (CH3CN):

H
aH
5

N
4 3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

4 Experimenteller Teil

53

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazols


In einem 15mL Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 456 L Anilin (466 mg, 5 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen. Der rote Feststoff fllt sofort aus. Nachdem das Derivat auf einem Bchnertrichter abgesaugt worden ist, wird es mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rote Kristalle, 90% (576 mg, 2,25 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,48 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,36-7,55 (m, 5H, Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz)

EA berechnet fr: C12H8N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 56,25%; H: 3,12%; N: 21,88%; C: 56,03%; H: 2,87%; N: 21,57%

3285 (m), 1630 (w), 1595(m), 1565 (s), 1490 (s), 1445 (m),1405 (m),1370 (w), 1350(m), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 256 (M+, 100%), 193 (31%), 180 (63%), 140 (9%), 77 (38%), 51 (20%) APCI(-)-MS [m/z]: 255 ((M-H)-) max [nm]:

UV (CH3CN):

471

(max) [L.mol-1.cm-1]: 26000

4 Experimenteller Teil

54

4.3.15 4-N-(Methy-N-phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDNMAn)

H3C
aH
5

N
4 3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Methyl-N-phenylamino)-7-nitrobenzo-2oxa-1,3-diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1084 L N-Methylanilin (1072 mg, 10 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischung wird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt, bevor man sie fr 24 Stunden ins Tiefkhlfach stellt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelrote Kristalle, 33% (223 mg, 0,83mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,53 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,32-7,50 (m, 5H, Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,33 (s, 3H, N-CH3)

EA berechnet fr: C13H10N4O3 gefunden: IR [cm-1]:

C: 57,77%; H: 3,70%; N: 20,74%; C: 57,61%; H: 3,51%; N: 20,42%

3430 (w), 3100 (w), 2930 (w), 1610 (m), 1540(s), 1490 (m), 1450 (w),1420 (w),1360 (w), 1320 (s), 1300 (s), 1240 (m)

EI-MS [m/z]: 270 (M+, 27%), 236 (3%), 193 (3%), 167 (2%), 91 (100%)

4 Experimenteller Teil

55

APCI(-)-MS [m/z]: 270 ([M]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

476

(max) [L.mol-1.cm-1]: 26200 4.3.16 4-N-(o-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-2-EAn)


H5C2 H
aH
5

N
4 3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(o-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1243 L 2-Ethylanilin (1212 mg, 10 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischung wird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt, bevor man sie fr 24 Stunden ins Tiefkhlfach stellt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangerote Kristalle, 37% (263 mg, 0,93 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,48 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,32-7,40 (m, 4H, Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,66 (q, 2H, CH2), 2,37 (t, 3H, CH3)

4 Experimenteller Teil

56

Die

gefundenen

Elementaranalysen

weichen

stark

von

den

berechneten

Elementaranalysen ab, obwohl eine Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen zur Kontrolle eingesetzten Methoden keinen Anhaltspunkt fr eventuelle

Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3430 (w), 2970 (m), 2830 (s), 2590 (m), 1960 (w), 1620 (w), 1600(m), 1560 (m), 1520 (m), 1490 (s),1450 (m),1380 (w), 1310(m)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 100%), 255 (51%), 179 (32%), 103 (7%), 77 (19%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

473

(max) [L.mol-1.cm-1]: 25900 4.3.17 4-N-(m-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-3-EAn) C2H5

H
aH
5

N
4 3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

4 Experimenteller Teil

57

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(m-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazols


In einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 621 L 3-Ethylanilin (606 mg, 5 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Man beobachtet eine heftige Reaktion. Die Mischung wird noch etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt. Der ausgefallene Feststoff wird in etwa 1 mL 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rote Kristalle, 79% (561 mg, 1,98 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,34-7,40 (m, 4H, Aryl-H), 6,19 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,64 (q, 2H, CH2), 2,38 (t, 3H, CH3)

Die

gefundenen

Elementaranalysen

weichen

stark

von

den

berechneten

Elementaranalysen ab, obwohl eine Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen zur Kontrolle eingesetzten Methoden keinen Anhaltspunkt fr eventuelle

Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3440 (w), 3315 (w), 2970 (s), 2870 (s), 2590 (s), 1600 (s), 1540(s), 1510 (m), 1490 (m), 1460 (m),1400 (w),1370 (w), 1300(m), 1250 (w)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 15%), 255 (76%), 179 (100%), 167 (9%), 103 (12%), 77 (22%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

474

(max) [L.mol-1.cm-1]: 25800

4 Experimenteller Teil

58

4.3.18 4-N-(p-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-4-EAn)


C2H5 H
aH
5

N
4 3

N O2 N
1

bH

6 7

NO2

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(p-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol


In einem 15 mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mL Acetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 621 L 4-Ethylanilin (606 mg, 5mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischung wird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt. Der ausgefallene Feststoff wird in etwa 1 mL 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rote Kristalle, 70% (497 mg, 1.75 mmol)

Charakterisierung:
1

H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]:

8,48 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,33-7,40 (m, 4H, Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,64 (q, 2H, CH2), 2,38 (t, 3H, CH3)

Die

gefundenen

Elementaranalysen

weichen

stark

von

den

berechneten

Elementaranalysen ab, obwohl eine Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen eingesetzten Methoden keinen Anhaltspunkt fr eventuelle Verunreinigungen ergaben. IR [cm-1]:

3440 (w), 3290 (s), 2965 (s), 2850 (s), 2590 (s), 2060 (m), 1630 (m), 1590(s), 1560 (w), 1500 (s), 1445 (s),1410 (w),1350 (w), 1285 (m)

4 Experimenteller Teil

59

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 100%), 255 (43%), 179 (31%), 152 (7%), 103 (9%), 77 (14%) APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-) max [nm]:

UV (CH3CN):

473

(max) [L.mol-1.cm-1]: 27900

4 Experimenteller Teil

60

4.4 Flssigchromatographische Trennung und Detektion

4.4.1 UV/vis-spektroskopische Eigenschaften

Nachdem in Kapitel 4.3 die die Synthese und Charakterisierung der NBDAmine beschrieben wurde, erfolgt in diesem Kapitel die Untersuchung der UV/visspektroskopischen Eigenschaften der so synthetisierten Derivate. Fr die Aufnahme der UV/vis-Spektren wurden zunchst Stammlsungen von NBDCl und seinen Derivaten mit einem Gehalt von 1.10-3 mol/L in Acetonitril hergestellt. Die Stammlsungen wurden 1:10 mit Acetonitril verdnnt und UV/vis-spektroskopisch vermessen. Die bei der Charakterisierung und bei den der NBDAmine angegebenen bestimmten max

Absorptionsmaxima

Absorptionsmaxima

Extinktionskoeffizienten (max) wurden mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes aus diesen UV/vis-Messungen ermittelt.

Die UV/vis-Spektren des NBDCl und des Methylamin- und Dimethylaminderivates als exemplarische Vertreter fr primre und sekundre aliphatische Amine sind in Abbildung 4.4.1 dargestellt. Es sind deutliche Unterschiede zwischen dem Reagenz und seinen Derivaten zu erkennen. Die Absorptionsmaxima der Derivate zeigen eine Rotverschiebung von mehr als 120 nm gegenber dem Reagenz und die Extinktionskoeffizienten der Derivate sind mehr als doppelt so hoch wie der Extinktionskoeffizient des NBDCl.

4 Experimenteller Teil

61

30

[L*mol *cm ]*10

20

NBDCl NBDMA NBDDMA

-1

-1

10

0 200 400 600

[nm]

Abb. 4.4.1: UV/vis-Spektren des NBDCl, NBDMA und NBDDMA; c ~ 10-4 mol/L.

Vergleicht man primre und sekundre aliphatische Aminderivate miteinander, so sind deutliche Unterschiede zwischen diesen Derivatgruppen zu erkennen. Die Absorptionsmaxima der sekundren aliphatischen Aminderivate, hier NBDDMA, sind gegenber den primren aliphatischen Aminderivaten, hier NBDMA um etwa 20 nm rotverschoben. Die Extinktionskoeffizienten der sekundren Aminderivate sind verglichen mit den primren Aminderivaten ca. 2000 L*mol-1*cm-1 hher.

Vergleicht

man

die

UV/vis-Eigenschaften miteinander, so

der stellt

primren man

und

sekundren zu den

aromatischen

Aminderivate

Analogien

aliphatischen NBDAminen fest. Abbildung 4.4.2 zeigt exemplarisch fr die aromatischen Amine die UV/vis-Spektren des Anilin- und N-Methylanilinderivates.

4 Experimenteller Teil

62

30000

25000
3

NBDAn NBDNMAn

[L*mol *cm ]*10

20000

-1 -1

15000

10000

5000

0 400 600

[nm]

Abb. 4.4.2: UV/vis-Spektren des NBDAn und NBDNMAn; c ~ 10-5 mol/L.

Die Absorptionsmaxima der sekundren aromatischen Aminderivate sind gegenber den primren aromatischen Derivaten rotverschoben. Allerdings ist die

Rotverschiebung mit etwa 10 nm geringer als bei den aliphatischen Aminderivaten. Die Extinktionskoeffizienten der sekundren Aminderivate sind um etwa 2000 L*mol -1*cm-1 hher als die der primren Aminderivate, also hnlich wie bei den aliphatischen Aminderivaten.

Aufgrund ihrer spektroskopischen Eigenschaften lassen sich die NBDAmine in vier Gruppen einteilen: Primre aliphatische, sekundre aliphatische, primre

aromatische und sekundre aromatische Aminderivate. Das Ammoniak-Derivat nimmt eine Sonderstellung ein, da es sich UV/vis-spektroskopisch in keine der vier Gruppen einordnen lt.

4 Experimenteller Teil

63

Tab. 4.4.1: Vergleich der Absorptionsmaxima und Extinktionskoeffizienten der verschiedenen NBDAmin-Gruppen.

Derivat

Absorptionsmaximum

Extinktionskoeffizient

max [nm]
Ammoniak primre aliphatische Amine sekundre aliphatische Amine primre aromatische Amine sekundre aromatische Amine
~480 ~470 ~480-490 ~460 ~460

(max) [L*mol-1*cm-1]
11400 ~23300-23800

~25300-25800

~26000

~28000

Tabelle 4.4.1 zeigt die Charakteristika der Aminderivatgruppen. Primre aliphatische Aminderivate absorbieren bei ca. 460 nm. So lassen sie sich UV/vis-spektroskopisch leicht von den sekundren aliphatischen Aminderivaten unterscheiden, die bei 480490 nm absorbieren. Sekundre aliphatische Aminderivate zeigen zwar mit ca. 480 nm hnliche Absorptionsmaxima wie ihre aromatischen Verwandten, aber geringere Extinktionskoeffizienten. Das Ammoniak-Derivat zeigt mit 460 nm zwar das gleiche Absorptionsmaximum wie die primren aliphatischen Aminderivate, weist jedoch nur einen etwa halb so groen Extinktionskoeffizienten auf.

4.4.2 Flssigchromatographische Detektion

Trennung

mit

anschlieender

UV/vis-

Basis fr eine Identifizierung und Quantifizierung von Einzelsubstanzen in einem Substanzgemisch ist die Trennung der Einzelkomponenten vor der Detektion. Fr die Trennung der NBDAmine hat sich die flssigchromatographische Trennung mit

4 Experimenteller Teil

64

einem binren Gradienten aus Acetonitril und Wasser als geeignet erwiesen. Es wurde der in Abschnitt 4.2.7 erwhnte Gradient verwendet.

50000 NBDDMA NBDDPA NBDPA 10 NBDDEA 15

40000

460 nm 480 nm

Absorption [mAU]

NBDMA

30000 NBDA

20000

10000

0 0 5

NBDOH

NBDEA

Zeit [min]

Abb. 4.4.3: Chromatogramm

ausgewhlter

NBDAmine;

10-5

mol/L;

Detektionswellenlngen 460 und 480 nm.

Abbildung 4.4.3 zeigt die flssigchromatographische Trennung von insgesamt sieben aliphatischen Aminderivaten mit einer Zweiwellenlngendetektion bei 460 und 480 nm (Detektion bei den Absorptionsmaxima). Die Konzentration der einzelnen Aminderivate betrgt ~10-5 mol/L. Der Standard-Mix wurde aus den reinen Standards gelst in Acetonitril hergestellt.

Das Chromatogramm zeigt, da die aliphatischen Aminderivate mit steigender Alkylkettenlnge eluieren. Die beiden C2-Derivate, NBDDMA und NBDEA, zeigen eine leichte Coelution. Sie sind jedoch so weit getrennt, da eine Quantifizierung dieser Verbindungen mglich ist. Da das Reagenz nicht im sichtbaren Bereich, sondern ausschlielich im UV-A-Bereich des elektromagnetischen Spektrums absorbiert (siehe Abbildung 4.4.1), ist es bei diesen hohen Wellenlngen nicht zu sehen.

4 Experimenteller Teil

65

Tab. 4.4.2:

Absorptionsverhltnisse fr die verschiedenen NBDAmine.

primre

sekundre aliphatische Amine > 1,5

primre

sekundre

Derivat

Ammoniak

aliphatische Amine

aromatische aromatische Amine 1,1-1,2 Amine 1,3-1,4

Q480/460

<1

1,1-1,2

Neben den UV/vis-Eigenschaften bietet die Zweiwellenlngendetektion an den Absorptionsmaxima eine hervorragende Mglichkeit zur Identifizierung der einzelnen Substanzgruppen. Tabelle 4.4.2 zeigt die Verhltnisse der Peakflchen fr die Absorption bei 480 und 460 nm der verschiedenen Aminderivatgruppen, also Q480/460. Anhand des Q480/460 lt sich das Ammoniakderivat gut von den aliphatischen und aromatischen Aminen unterscheiden. Whrend das Ammoniakderivat ein Q480/460 von kleiner eins aufweist, haben alle anderen Amingruppen ein Q480/460 von grer eins. Sowohl primre aliphatische als auch primre aromatische Amine zeigen ein Q480/460 von 1,1 bis 1,2. Sie lassen sich allerdings anhand ihrer UV/vis-Spektren identifizieren, da die primren aliphatischen Amine Absorptionsmaxima bei 460 nm zeigen, whrend die primren aromatischen Amine Absorptionsmaxima bei 470 nm aufweisen.

4.4.3 Fluoreszenzspektroskopische Eigenschaften der NBDAmine

Fr die Aufnahme der UV/vis-Spektren wurden zunchst Stammlsungen von NBDCl und seinen Derivaten mit einem Gehalt von 10-3 mol/L in Acetonitril hergestellt. Die Stammlsungen wurden 1:10 mit Acetonitril verdnnt und fluoreszenz-

spektroskopisch vermessen.

Die Abbildungen 4.4.4 bis 4.4.6 zeigen exemplarisch die Anregungs- und Emissionsspektren fr die verschiedenen fluoreszierenden Aminderivatgruppen. Das Fluoreszenzspektrum des NBDA zeigt ein Anregungsmaximum bei 470 nm und ein Emissionsmaximum bei 524 nm, d.h. der beobachtete Stokes Shift liegt bei 54 nm.

4 Experimenteller Teil

66

80 70 60 Anregung Emission

Fluoreszenz [-]

50 40 30 20 10 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

[nm]

Abb. 4.4.4: Fluoreszenzspektrum des NBDA in Acetonitril, cNBDA = 810-5 mol/L; ex = 470 nm; em = 524 nm, Spaltbreite = 1,5 nm.

60 Anregung Emission

50

Fluoreszenz [-]

40

30

20

10

0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

[nm]

Abb. 4.4.5: Fluoreszenzspektrum des NBDMA in Acetonitril; cNBDMA= 1,410-5 mol/L; ex = 468 nm; em = 529 nm, Spaltbreite = 1,5 nm.

4 Experimenteller Teil

67

80 70 60 Anregung Emission

Fluoreszenz [-]

50 40 30 20 10 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

[nm]

Abb. 4.4.6: Fluoreszenzspektrum des NBDDMA in Acetonitril; cNBDDMA = 1,210-4 mol/L; ex = 439 nm; em = 540 nm, Spaltbreite = 1,5 nm.

Das Fluoreszenzspektrum des NBDMA, das hier als Vertreter fr die primren aliphatischen Aminderivate steht, zeigt ein Anregungsmaximum bei 468 nm und ein Emissionsmaximum bei 529 nm, so da die Rotverschiebung zwischen dem Anregungs- und Emissionsmaximum 61 nm betrgt. Als exemplarischer Vertreter fr die sekundren aliphatische Aminderivate ist das Fluoreszenzspektrum des NBDDMA gezeigt. Es zeigt ein Anregungsmaximum bei 439 nm und ein Emissionsmaximum bei 540 nm, so da der Stokes Shift ~ 100 nm betrgt.

Der Vergleich der Fluoreszenzintensitten zwischen den primren und sekundren aliphatischen Aminderivaten zeigt, da die primren eine etwa zehnmal grere Fluoreszenzaktivitt als die sekundren Derivate aufzeigen.

Die Fluoreszenzmessungen fr die aromatischen Aminderivate haben ergeben, da sowohl die primren als auch sekundren Vertreter dieser Substanzklasse keine Fluoreszenzaktivitt aufweisen. Das Reagenz, NBDCl, zeigt nur eine sehr geringe Fluoreszenz.

4 Experimenteller Teil

68

4.4.4 Flssigchromatographische Trennung mit anschlieender UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion

Eine noch grere Sicherheit bei der Identifizierung und Quantifizierung der einzelnen Aminderivat-Gruppen kann man erreichen, wenn man nach der flssigchromatographischen Trennung nicht nur eine UV/vis-Detektion durchfhrt, sondern UV/vis- und Fluoreszenzdetektion kombiniert.

35 NBDPeA 30 25 Absorption [mAU] NBDA 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 Zeit [min] 12 14 16 18 NBDBzA


= 460 nm Fluoreszenz
1000

NBDMA

800

NBDNMAn

Fluoreszenz [-]

NBDDMA NBDEA

NBDPA

NBDEA

600

NBD-4-EAn

400

200

Abb. 4.4.7: Chromatogramm ausgewhlter NBDAmine mit kombinierter UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion; c ~ 10-5 mol/L; UV/vis: 460 nm; Fluoreszenz: ex = 468 nm und em = 537 nm.

Abbildung 4.4.7 zeigt die flssigchromatographische Trennung von insgesamt zehn Derivaten mit anschlieender UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion. Die Trennung erfolgte mit einem binren Gradienten aus Acetonitril und Wasser, der ausfhrlich in Abschnitt 4.2.7 beschrieben wird. Die UV/vis-Detektion erfolgte bei 460 und 480 nm, also bei den Absorptionsmaxima der einzelnen Derivate, und die Fluoreszenzdetektion erfolgte bei 468 nm als Anregungswellenlnge und 537 nm als Emissionswellenlnge. Die Konzentration der einzelnen Aminderivate betrug

4 Experimenteller Teil

69

~10-5 mol/L. Der Standard-Mix wurde aus den reinen Standards gelst in Acetonitril hergestellt.

Aufgrund der unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften der verschiedenen Aminderivatgruppen ist es bei der simultanen UV/visund

fluoreszenzspektroskopischen Detektion mglich, analog dem Quotienten Q480/460 bei der Zweiwellenlngendetektion, die Quotienten QFl/460 und QFl/480 zu bestimmen. Tabelle 4.4.3 zeigt die berechneten Quotienten fr die einzelnen Substanzgruppen.

Tab. 4.4.3: Quotienten

fr

die

kombinierte

UV/vis-spektroskopische

und

fluoreszenzspektroskopische Detektion.

primre

sekundre aliphatische Amine 4,2-4,5 2,5-3,0

primre

sekundre

Derivat

Ammoniak

aliphatische Amine

aromatische aromatische Amine Amine -

QFl/460 QFl/480

~24 ~28

> 30 > 30

Anhand der Kombination der UV/vis- und Fluoreszenzeigenschaften ist eine schnelle und sichere Identifizierung der einzelnen Substanzklassen mglich. In Abbildung 4.4.7 erkennt man die Derivate der aromatischen Amine, NBDNMAn und NBD-4EAn, sofort, da sie keine Fluoreszenzaktivitt zeigen. Ob nun ein Derivat eines primren oder sekundren aromatischen Amins vorliegt, lt sich mit Q480/460 aus der Zweiwellenlngendetektion bestimmen. Sinngem verfhrt man mit den anderen Derivatgruppen. Die endgltige Identifizierung einer bestimmten Substanz erfolgt durch den Vergleich mit einem sauberen Standard, d.h. es mssen nicht nur Q480/460, QF/460 und QF/480 bereinstimmen, sondern auch die Retentionszeit. Die Quotienten QF/460 und QF/480 sind Werte, die sowohl vom Gert als auch von dessen Einstellung abhngig sind. Sie mssen also vor der Anwendung fr jedes Gert und die entsprechende Gerteeinstellung individuell ermittelt werden.

4 Experimenteller Teil

70

4.4.5 Bestimmung der apparativen Nachweisgrenzen fr die UV/Vis- und Fluoreszenzdetektion

Die apparativen Nachweisgrenzen der einzelnen NBDAmin-Standards sind ein wichtiger Parameter fr die analytische Anwendung der NBDCl-Methode. Zur Ermittlung der apparativen Nachweisgrenzen wurde eine Stammlsung ausgewhlter NBDAmine in Acetonitril hergestellt. Diese Lsung wurde anschlieend mehrfach verdnnt, so da man eine Kalibrationsreihe ber mehrere Dekaden erhielt. Im Anschlu wurden die einzelnen Lsungen in das HPLC-System, welches in Abschnitt 4.2.7 genau beschrieben wurde, injiziert und sowohl UV/visals auch

fluoreszenzspektroskopisch detektiert.

10

Peakflche [-]

10

10

10

10

-7

10

-6

10

-5

10

-4

Konzentration [mol/L]

Abb. 4.4.8: Linearittsbereich fr die UV/vis-Detektion bei 460 nm fr das Methylaminderivat des NBDCl; Fnfachinjektion; R2 = 0,999; n = 8.

4 Experimenteller Teil

71

10

10

Peakflche [-]

10

10

10

-8

10

-7

10

-6

10

-5

Konzentration [mol/L]

Abb. 4.4.9: Linearittsbereich

fr

die

Fluoreszenzdetektion

fr

das

Methylaminderivat des NBDCl; ex = 468 nm und em = 537 nm; Fnfachinjektion; R2 = 0,999; n = 7.

Sowohl fr die UV/vis- als auch fr die fluoreszenzspektroskopische Detektion des NBDMA erhlt man einen linearen Konzentrationsbereich von ber vier Dekaden (siehe Abbildungen 4.4.8 und 4.4.9).

Tabelle 4.4.4 zeigt die apparativen Nachweisgrenzen fr die UV/vis- und fluoreszenzspektroskopische Detektion fr ausgewhlte NBDAmine, wobei die apparative Nachweisgrenze als Signal/Rausch-Verhltnis S/R = 3 bestimmt wurde. Die Nachweisgrenzen bei der UV/vis-spektroskopischen Detektion wurden jeweils am Absorptionsmaximum der jeweiligen Verbindung ermittelt und die der Fluoreszenzdetektion bei einer Anregungswellenlnge von 468 nm und einer Emissionswellenlnge von 537 nm.

4 Experimenteller Teil

72

Tab. 4.4.4: Apparative

Nachweisgrenzen

fr

die

UV/vis-Detektion

und

Fluoreszenzdetektion.

NBDCl

UV/vis-Detektion

Fluoreszenzdetektion

max [nm]
NWG [10 mol/L] A MA DMA EA DEA PA DPA An NMAn
2,6 3,2 2,2 3,6 2,2 3,6 2,1 2,0 1,6
-8

ex = 468 nm; em = 537 nm


NWG NWG [10 mol/L]
0,4 0,7 2,8 0,5 2,7 0,4 2,3 -8

NWG [pg Analyt]


0,7 2,2 12,6 2,3 19,7 2,4 23,2 -

[pg Analyt]
4,4 9,9 9,9 16,2 16,1 21,2 21,2 18,6 17,1

Tabelle 4.4.4 zeigt, da die UV/vis-spektroskopische Detektion der Derivate der sekundren Amine etwa 1,5 mal bessere Nachweisgrenzen liefert als die Derivate der primren Amine. Hingegen zeigen sich bei der fluoreszenzspektroskopischen Detektion umgekehrte Verhltnisse. Die Detektion der primren Amine liefert etwa 4 bis 6 mal bessere Nachweisgrenzen als die der sekundren Amine. Beispielsweise zeigt das Dimethylaminderivat mit 2,2.10-8 mol/L gegenber dem Methylaminderivat mit 3,2.10-8 mol/L eine 1,5 mal niedrigere apparative Nachweisgrenze fr die UV/visDetektion, whrend das Methylaminderivat in der Fluoreszenz 4 mal bessere Nachweisgrenzen als das Dimethylaminderivat zeigt. Aus diesem Grunde sollte die Bestimmung in niedrigen Konzentrationsbereichen fr die primren Amine

4 Experimenteller Teil

73

fluoreszenzspektroskopisch und fr die sekundren Amine UV/vis-spektroskopisch erfolgen.

4.5 Vergleich mit bestehenden Methoden

Fr die Bestimmung von primren und sekundren Aminen in der Luft finden zwei Methoden Anwendung. In Deutschland findet die Bestimmung von Aminen am Arbeitsplatz in der Luft nach den Richtlinien des Vereins Deutscher Ingenieure (VDI) und in den Vereinigten Staaten nach der OSHA-Methode statt.

Beschreibung der Methoden:

VDI-Richtlinien: Diese Methode beruht auf der Derivatisierung von Aminen mit
2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFBz) als Derivatisierungsreagenz. Nach der Probenahme mittels Impingertechnik werden die Proben ber Nacht aufgearbeitet und anschlieend flssigchromatographisch mittels eines binren Gradienten aus Acetonitril und Wasser und einer Umkehrphasensule als stationre Phase getrennt. Die Detektion erfolgt UV/vis-spektroskopisch bei 370 nm. Die Kalibration erfolgt ber externe Standards.

OSHA-Methode: Diese Methode beruht auf der Derivatisierung von Aminen


mit 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl) als Derivatisierungsreagenz. Die Probenahme findet mittels Probenahmerhrchen statt, die als Adsorbens XAD-7, belegt mit 10% NBDCl, enthalten. Nach der Elution und Aufarbeitung der Proben werden sie flssigchromatographisch mittels eines binren Gradienten aus Isooctan und Isopropanol als mobiler Phase und einer Cyanopropyl-Sule als stationre Phase getrennt. Die Detektion erfolgt fluoreszenzspektroskopisch bei einer Anregungswellenlnge von 465 nm und einer Emissionswellenlnge von 525 nm (alternativ UV/vis-spektroskopisch bei 465 nm). Die Kalibration erfolgt ber die Reaktion, d.h. ohne Isolierung der Standards.

4 Experimenteller Teil

74

Vergleich und Bewertung der bestehenden Methoden mit der NBDCl-Methode:


Sowohl die NBDCl- als auch die VDI- und OSHA-Methoden nutzen eine nucleophile aromatische Substitutionsreaktion als Derivatisierungsreaktion, um die reaktiven Analyten zu stabilisieren und ihre Detektionseigenschaften zu verbessern. Die VDIMethode detektiert die Derivate ausschlielich UV/vis-spektroskopisch, whrend die OSHA-Methode die Derivate fluoreszenzspektroskopisch detektiert (alternativ ist eine UV/vis-spektroskopische Detektion mglich). Die NBDCl-Methode nutzt die

kombinierte UV/vis- und fluoreszenzspektroskopische Detektion. Tabelle 4.5.1 zeigt die apparativen Nachweisgrenzen der drei Methoden fr ausgewhlte Analyten.

Tab. 4.5.1: Apparative Nachweisgrenzen fr die VDI-, OSHA- und NBDCl-Methode fr ausgewhlte Analyten.

Methode

NWG [ng MA]

NWG [ng DMA]


0,8 2,8 0,010b

NWG [ng EA]


0,8 1,8 0,002a

NWG [ng DEA]


0,8 8,7 0,016b

VDI OSHA NBDCl


a b

0,8 1,9 0,002a

MA = Methylamin; DMA = Dimethylamin; EA = Ethylamin; DEA = Diethylamin. Fluoreszenzdetektion; UV/vis-Detektion.

Die VDI-Methode zeigt, verglichen mit der OSHA-Methode, um den Faktor 2 bis 8 bessere apparative Nachweisgrenzen. Grund hierfr ist die Kalibrationsmethode. Whrend die VDI-Methode ber externe Standards kalibriert, findet die Kalibration bei der OSHA-Methode ber die Reaktion statt. Bei der Kalibration in der Lsung kann es sein, da nicht alle Analytmolekle mit dem Derivatisierungreagenz reagieren oder sich Nebenprodukte bilden. Der Vergleich der VDI-Methode mit der NBDCl-Methode zeigt, da die NBDCl-Methode fr die primren Amine um einen Faktor 400 und fr die sekundren Amine um einen Faktor 80 sensitiver als die VDIMethode ist. Ursache hierfr sind die Detektionseigenschaften der Derivate. Whrend die DNBF-Derivate Extinktionskoeffizienten um 16000 L*mol-1*cm-1 besitzen, zeigen die NBDCl-Derivate Extinktionskoeffizienten von mindestens 23300

4 Experimenteller Teil

75

L*mol-1*cm-1. Auerdem zeigen die NBDCl-Derivate eine starke Fluoreszenz, was die Sensitivitt vor allem fr die primren Amine um ein Vielfaches steigert. Zudem zeigt sich, da die Detektion bei Wellenlngen von ber 450 nm mit weniger Strungen behaftet ist als bei niedrigeren Wellenlngen. Weder in der VDI-Methode noch der OSHA-Methode wird die Quantifizierung von aromatischen Aminen beschrieben.

Die NBDCl-Methode zeigt nicht nur bessere apparative Nachweisgrenzen aufgrund der Kalibration ber externe Standards als die VDI- und OSHA-Methode, mit ihr ist es auch aufgrund der UV/vis- und Fluoreszenzeigenschaften der Molekle mglich, zwischen den verschiedenen Amingruppen zu unterscheiden (s. Abschnitt 4.4.4). Sowohl die Identifizierung wird damit erleichtert als auch die Quantifizierung der Amine verbessert.

Ein Defizit aller drei Methoden ist allerdings, da eine Unterscheidung zwischen strukturell sehr hnlichen Analyten nicht mglich ist. Im nchsten Kapitel wird daher ausfhrlich beschrieben, welche Mglichkeiten die flssigchromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Detektion bietet, um dieses analytische Problem zu lsen.

4.6

Flssigchromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Detektion

4.6.1 Allgemeines

Die Mglichkeiten zur Identifizierung und Quantifizierung der NBDAmin-Derivate mittels flssigchromatographischer Trennung mit UV/visund fluoreszenz-

spektroskopischer Detektion sind in den vorhergehenden Kapiteln ausfhrlich beschrieben worden. Es bleibt festzuhalten, da die Identifizierung bei dieser Methode ausschlielich auf den UV/vis- und Fluoreszenzeigenschaften sowie den Retentionszeiten der Derivate beruht. Unterscheidet sich ein unbekanntes NBDAminDerivat qualitativ nur sehr geringfgig von einem bekannten Derivat, so kann diese Methode zu einer falschen Schlufolgerung fhren. Die Identifizierung von unbekannten NBDAmin-Derivaten, wie sie beispielsweise in komplexen Matrixes vorkommen, kann also nicht alleine auf dieser Methode beruhen.

4 Experimenteller Teil

76

Eine hervorragende Ergnzung zu den bestehenden Identifizierungsmglichkeiten bietet die Kopplung der Flssigchromatographie mit der Massenspektrometrie. Die Ionisierung der Analyten erfolgt bei der HPLC-MS meist mittels ElektrosprayIonisation (ESI) oder der chemischen Ionisation bei Atmosphrendruck (APCI). In der Literatur57 ist die massenspektrometrische Detektion einiger NBDAmin-Derivate mittels APCI als Ionisationsquelle bereits beschrieben worden. Die Derivate werden im positiven Modus ionisiert, d. h. sie werden protoniert.

M + H+

APCI(+)

[M + H]+

Abb. 4.6.1: Schema des Ionisationsmechanismus im positiven APCI-Modus.

Die Kopplung von Flssigchromatographie und Massenspektrometrie mit APCI(+) erwies sich im Fall der NBDAmin-Derivate als unzureichend. Die NBDAmine haben kaum protonierbare Gruppen, so da aufgrund der geringen Ionenausbeute die Derivate nur mit unzureichenden Nachweisgrenzen detektierbar waren.

Hingegen zeigte die APCI-Ionisierung im negativen Modus eine hervorragende Ionenausbeute, so da die NBDAmin-Derivate sehr gut massenspektrometrisch detektiert werden konnten.

Fr die LC/MS-Methode wurden folgende Gerteparameter verwendet: N2-Flu: 2,5 L/min, Ionisierungsspannung: -2,6 kV, APCI-Temperatur: 450 C, CDL-Spannung: 30 V, CDL-Temperatur: 300 C, Deflector-Spannung: -30 V, Detektor-Spannung: 1,7 kV.

Fr die flssigchromatographische Trennung wurde das in Abschnitt 4.2.8 beschriebene HPLC-System verwendet. Die Standards wurden nicht wie sonst blich in Acetonitril, sondern in einem Methanol/Wasser-Gemisch (v/v = 1/1) gelst. Durch die Verwendung von Methanol als organischer Eluenskomponente konnten die

4 Experimenteller Teil

77

Sprheigenschaften im Interface soweit verbessert werden, da hierdurch eine signifikant hhere Ionenausbeute resultierte.

Abbildung 4.6.2 zeigt das APCI(-)-Massenspektrum des Ammoniak-Derivates. Es wurde die relative Intensitt gegen das Masse-zu-Ladungs-Verhltnis aufgetragen. Der Basispeak des Massenspektrums hat das Masse-Ladungs-Verhltnis m/z 179.

179
100

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

0 150 200 250 300 350 400

m/z

Abb. 4.6.2: APCI(-)-Massenspektrum des NBDA, cNBDA ~ 10-5 mol/L. Dieser Peak entspricht dem [M-H]- -Ion, welches durch die Deprotonierung des Molekls im negativen APCI-Modus entsteht.

M - H+

APCI(-)

[M - H]-

Abb. 4.6.3: Schema des Deprotonierungsmechanismus im negativen APCI-Modus.

Die nchsten beiden Massenspektren (vgl. Abbildungen 4.6.4 und 4.6.5) zeigen exemplarisch die verschiedenen Ionisationsmechanismen der primren und

sekundren aliphatischen Amine. Ausgewhlt wurde zum einen das Derivat des Ethylamins, NBDEA, als Vertreter fr ein primres Amin und zum anderen das

4 Experimenteller Teil

78

Derivat des Dimethylamins, NBDDMA, als Vertreter fr ein sekundres Amin. Beide Derivate tragen insgesamt zwei C-Atome am Aminstickstoff und haben eine Molmasse von 208 g/mol.

100

207

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

0 150 200 250 300 350 400

m/z

Abb. 4.6.4: APCI(-)-Massenspektrum des NBDEA, cNBDEA ~ 10-5 mol/L. Das Massenspektrum des NBDEA zeigt einen Basispeak mit dem Masse-zuLadungs-Verhltnis m/z von 207. Dies ist mit dem [M-H] - -Ion in Einklang zu bringen, welches bei der Deprotonierung im negativen APCI-Modus entsteht. Es wird also das freie H-Atom am Aminstickstoff abstrahiert.

4 Experimenteller Teil

79

100

208

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

0 150 200 250 300 350 400

m/z

Abb. 4.6.5: APCI(-)-Massenspektrum des NBDDMA, cNBDDMA ~ 10-5 mol/L. Im Gegensatz zum Massenspektrum des NBDEA zeigt das Massenspektrum des NBDDMA einen Basispeak mit dem Masse-zu-Ladung-Verhltnis m/z = 208. Dieses entspricht der Bildung eines [M]- -Ions. Die Entstehung dieses Ions lt sich durch einen Elektroneneinfangmachanismus erklren, fr den die stark elektronegative Nitro-Funktion des NBDCl-Reagenzes verantwortlich ist.

M + e

APCI (-)

[M]-

Abb. 4.6.6: Schema des Elektroneneinfangmechanismus im negativen APCIModus.

Bisher wurde ein derartiger Elektroneneinfangmechanismus bei Nitroverbindungen nur in der Gaschromatographie beschrieben.72,73,74,75,76,77 Die Kopplung von Flssigchromatographie und Massenspektrometrie mit APCI(-) zeigte bisher immer nur einen Elektroneneinfangmechanismus mit anschlieender Dissoziation des Analyten (dissoziativer Elektroneneinfang).78 Der fr die sekundren aliphatischen NBDAmin-Derivate beobachtete Elektroneneinfangmechanismus ohne Dissoziation

4 Experimenteller Teil

80

des Molekls ist in der Massenspektrometrie bisher nicht beschrieben. Ein Verfahren zur Bestimmung nitroaromatischer Verbindungen mit der HPLC-ElektroneneinfangIonisations-Massenspektrometrie wurde bereits zum Patent angemeldet.79

Die nchsten beiden Massenspektren sollen zeigen, ob die primren und sekundren aromatischen Amine das gleiche Ionisierungsverhalten zeigen wie die aliphatischen Vertreter. Als Vertreter fr die primren aromatischen Amine ist das Derivat des Anilins ausgewhlt worden, NBDAn. Der Vertreter der sekundren aromatischen Amine ist das N-Methylanilin-Derivat, NBDNMAn.

100

255

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

0 150 200 250 300 350 400

m/z

Abb. 4.6.7: APCI(-)-Massenspektrum des NBDAn, cNBDAn ~ 10-5 mol/L. Erwartungsgem zeigt das Massenspektrum des Anilin-Derivates einen Basispeak mit dem Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z von 255. Dieser Peak zeigt das [M-H]- Ion des Molekls, d.h. das freie H-Atom am Aminstickstoff wurde gem dem typischen Deprotonierungsmechanismus des APCI(-) abstrahiert.

4 Experimenteller Teil

81

100

270

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

0 150 200 250 300 350 400

m/z

Abb. 4.6.8: APCI(-)-Massenspektrum des NBDNMAn, cNBDNMAn ~ 10-5 mol/L. Analog zu den aliphatischen Aminen zeigen auch die Derivate der sekundren aromatischen Amine im APCI(-)-Modus eine Ionisierung gem dem

Elektroneneinfangmechanismus. Das Massenspektrum des N-Methylanilin-Derivates zeigt als Basispeak das Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z 270. Dieser Peak entspricht dem [M]- -Ion.

Whrend die bereits beschriebenen Derivate relativ einfache Molekle sind, die keine Fragmentierung im APCI(-) aufweisen, zeigen grere Derivate ein

Fragmentierungsmuster. Die beiden folgenden Massenspektren (vgl. Abbildungen 4.6.9 und 4.6.10) zeigen die Fragmentierung der Derivate des 3-Methylbenzylamins (NBD-3-MBzA) und des 3-Ethylanilins (NBD3-EAn). Die ortho- und para-Derivate der Amine zeigen die gleichen Fragmentierungsmuster. Beide Derivate haben eine Molmasse von 284 g/mol.

4 Experimenteller Teil

82

110 100 90 80

283

179

rel. Intensitt [%]

70 60 50 40 30 20 10 0 150 200 250 300 350 400

212

223248

m/z

Abb. 4.6.9: APCI(-)-Massenspektrum des NBD-3-MBzA, cNBD-3-MBzA ~ 10-5 mol/L.

100

283

80

rel. Intensitt [%]

60

40

20

212
0 150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

Abb. 4.6.10: APCI(-)-Massenspektrum des NBD-3-EAn, cNBD-3-EAn ~ 10-5 mol/L.

4 Experimenteller Teil

83

Das Massenspektrum des 3-Methylbenzylamins hat einen Basispeak bei einem Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z von 283. Dieser ist sehr gut durch die Bildung des [M-H]- -Ion zu erklren, welches bei der Deprotonierung des primren aliphatischen Amins im negativen APCI-Modus entsteht. Ein weiterer, das Massenspektrum dominierender Peak ist bei einem Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z von 179 zu erkennen. Offensichtlich ist es durch die Ionisierung zu einem Bindungsbruch zwischen dem Aminstickstoff und dem Alkylrest gekommen, wie in Abbildung 4.6.11 dargestellt ist. Auerdem sind im Massenspektrum noch zwei weitere Peaks zu erkennen, die fr die Fragmentierung der Methylbenzylaminderivate charakteristisch sind: m/z = 223 und 248. Der Peak bei m/z = 212 ist ein Strpeak, der sich als Verunreinigung der mobilen Phase durch das ganze Chromatogramm zieht.

CH3

Ha

bCH 2 a N O N b

[M-H]m/z = 283 H

NI N O N NO2

NO2 M = 284 g/mol

m/z = 179

Abb. 4.6.11: Fragmentierungsschema fr das NBD-3-MBzA-Derivat.

Das Massenspektrum des 3-Ethylanilin-Derivates zeigt analog zum Massenspektrum des 3-Methylbenzylamin-Derivates einen Basispeak mit dem Masse-zu-LadungsVerhltnis m/z von 283. Dieser Peak zeigt das [M-H]- -Ion, welches durch die Deprotonierung des primren aromatischen Amins im negativen APCI-Modus gebildet wird. Der Strpeak bei m/z = 212, der im Massenspektrum des 3Methylbenzylamin-Derivates zu finden ist, findet sich auch im Massenspektrum des 3-Ethylanilin-Derivates.

4 Experimenteller Teil

84

Analog zu den Charakteristika bei der UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Detektion zeigen die verschiedenen Gruppen der NBDAmine auch bei der massenspektrometrischen Detektion charakteristische Eigenschaften. In Tabelle 4.6.1 sind diese Eigenschaften zusammengefat.

Tab. 4.6.1:

Ionisationsmechanismen im APCI(-) fr die verschiedenen NBDAmine.

Ionisationsmechanismus NBD-Derivat
Ammoniak primre aliphatische Amine sekundre aliphatische Amine primre aromatische Amine sekundre aromatische Amine EE DP EE DP

im APCI(-)
DP

Detektierter Peak
[M-H][M-H]-

[M]-

[M-H]-

[M]-

DP = Deprotonierungsmechanismus; EE = Elektroneneinfangmechanismus

Die Flssigchromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie und der chemischen Ionisation bei Atmosphrendruck im negativen Modus bietet sowohl als alleinige Methode als auch als ergnzende Methode zu der simultanen UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Detektion Mglichkeiten zur Identifizierung von unbekannten Aminen. Sie kann die aus der spektroskopischen Detektion gewonnenen Ergebnisse (Einordnung in eine bestimmte Aminderivat-Gruppe anhand von UV/vis-Spektrum, Q480/460, QF/460, QF/480, Retentionszeit) sttzen oder verwerfen. Um auf das zu Beginn des Abschnitts gebrachte Beispiel zurckzukommen, ist es schwierig allein mittels spektroskopischer Detektion ein qualitativ nur sehr geringfgig unterschiedliches unbekanntes NBDAmin-Derivat von einem bekannten NBDAmin-Derivat zu unterscheiden. Mit dem Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z

4 Experimenteller Teil

85

kommt eine weitere Information der zu untersuchenden Verbindung ins Spiel, die die Sicherheit bei der Identifizierung erhht. Fr Monoamine gilt folgendes: Liegen ungerade Masse-zu-Ladungs-Verhltnisse vor, so ist von einem

Deprotonierungsmechanismus (DP) auszugehen. Dieser ist bei den Derivaten der primren aliphatischen und aromatischen Amine zu beobachten. Liegen gerade Masse-zu-Ladungs-Verhltnisse vor so liegt ein Elektroneneinfangmechanismus (EE) vor. Diesen Mechanismus gehen die NBD-Derivate der sekundren aliphatischen und aromatischen Amine ein. Bei greren Aminderivaten mit gleichen Massen ist es mglich, diese am charakteristischen Fragmentierungsmuster zu unterscheiden, falls dieses bekannt ist. Die unterschiedlichen Isomere knnen allerdings mit dieser Methode nicht unterschieden werden, da sie das gleiche Fragmentierungsmuster zeigen.

4.6.2 Apparative Nachweisgrenzen der HPLC-MS-Methode

Nachdem die beiden zu unterscheidenden Ionisierungsmechanismen der NBDAmine im vorherigen Kapitel diskutiert wurden, werden in diesem Kapitel die apparativen Nachweisgrenzen der NBDAmine fr diese Ionisierungsmechanismen bestimmt. Zur Ermittlung der apparativen Nachweisgrenzen wurde eine Stammlsung ausgewhlter NBDAmine in Methanol/Wasser (v/v = 1/1) hergestellt. Diese Lsung wurde anschlieend mehrfach verdnnt, so da man eine Kalibrationsreihe ber mehrere Dekaden erhielt. Im Anschlu wurden die einzelnen Lsungen in das HPLC-MSSystem, welches in Abschnitt 4.2.8 beschrieben wurde, injiziert. Die Detektion erfolgte im SIM-Modus. In Abbildung 4.6.12 ist die flssigchromatographische Trennung mit MS-Detektion fr sieben NBDAmin-Derivate gezeigt. Die TIC-Angabe bezieht sich hierbei auf die Summe der eingestellten SIM-Spuren, wobei die Massezu-Ladungs-Verhltnisse auf der Basis der in Kapitel 4.6.1 erzielten Ergebnisse eingestellt wurden.

4 Experimenteller Teil

86

6,0x10

Intensitt [-]

NBDDMA

2,0x10

0,0

NBDPA

NBDA

4,0x10

NBDMA

NBDEA

10

NBDDEA 12

NBDDPA 14

8,0x10

16

18

Zeit [min]

Abb. 4.6.12: TIC-Chromatogramm der aufsummierten SIM-Spuren von NBDA, NBDMA, NBDDMA, NBDEA, NBDDEA, NBDPA und NBDDPA.

10

Peakflche [-]

10

10

10

-7

10

-6

10

-5

Konzentration [mol/L]

Abb. 4.6.13: Linearittsbereich der MS-Detektion fr das NBDMA; m/z 207; Dreifachinjektion; R2 = 0,998; n = 6.

4 Experimenteller Teil

87

Der lineare Konzentrationsbereich fr die MS-Detektion ist fr das NBDMA in Abbildung 4.6.13 gezeigt. Es wurde gem dem Ionisationsmechanismus der Derivate der primren Amine das Masse-zu-Ladungs-Verhltnis m/z von 193 detektiert, also das [M-H]- Ion. Man kann einen linearen Zusammenhang ber dreieinhalb Konzentrationsdekaden erkennen, also etwas niedriger als fr die UV/visund Fluoreszendetektion. Ebenso zeigt sich im Gegensatz zur UV/vis- und Fluoreszenzdetektion eine geringere Reproduzierbarkeit, die an der Gre der Standardabweichung zu erkennen ist.

Tabelle 4.6.2 zeigt die apparativen Nachweisgrenzen fr die MS-Detektion der NBDAmine im APCI(-)-Modus fr einige ausgewhlte Derivate:

Tab. 4.6.2: Apparative

Nachweisgrenzen

ausgewhlter

NBDAmine

fr

die

massenspektrometrische Detektion im negativen APCI-Modus.

Derivat NBDA NBDMA NBDDMA NBDEA NBDDEA NBDPA NBDDPA NBDAn NBDNMAn

m/z
179 193 208 207 236 221 264 255 270

NWG [10-8 mol/L]


5,3 9,3 8,0 6,0 5,3 4,7 4,7 4,0 5,5

NWG [pg Analyt]


9,0 28,8 36,0 27,0 38,7 27,7 47,5 37,2 58,9

Vergleicht man die apparativen Nachweisgrenzen der MS-Detektion mit den apparativen Nachweisgrenzen fr die UV/vis- und fluoreszenzspektroskopische Detektion, so stellt man folgendes fest: Sowohl die Derivate der primren als auch der sekundren Amine zeigen im Vergleich zur UV/vis-Detektion um einen Faktor zwei bis vier schlechtere Nachweisgrenzen. Die Derivate der primren aliphatischen

4 Experimenteller Teil

88

Amine zeigen im Vergleich zur fluoreszenzspektroskopischen Detektion um einen Faktor 10 bis 12 schlechtere Nachweisgrenzen und die Derivate der sekundren Amine um einen Faktor 2 bis 3 schlechtere Nachweisgrenzen. Ursache fr die schlechteren Nachweisgrenzen der MS-Detektion gegenber der UV/vis- bzw. fluoreszenzspektroskopischen Detektion knnte die unvollstndige Ionisierung sein. Um mit der MS-Methode niedrige Nachweisgrenzen zu erreichen, ist es notwendig, mglichst hohe Ionenausbeuten zu erreichen. Dies ist nur dann mglich, wenn mglichst viele Molekle in die Gasphase gelangen und dann auch noch ionisiert werden.

Die

MS-Detektion

stellt

eine

hervorragende

Ergnzung

zur

UV/vis-

und

fluoreszenzspektroskopischen Detektion der NBDAmine dar. Mit der MS-Detektion im negativen APCI-Modus ist es anhand der detektierten Masse-zu-LadungsVerhltnisse m/z mglich sowohl die verschiedenen Gruppen von Aminen zu bestimmen als auch strukturell sehr hnliche Amine zu identifizieren. Eine Quantifizierung der NBDAmine ist zwar mglich, sollte aber aufgrund der schlechteren Nachweisgrenzen bei der MS-Detektion besser mit UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion erfolgen.

4.7

Bestimmung von Aminen in der Luft

4.7.1 Grundstzliches

Nachdem

die

Grundlagen

fr

die

Identifizierung

und

Quantifizierung

von

aliphatischen und aromatischen Monoaminen in den vorherigen Kapiteln erlutert wurden, soll nun in diesem Kapitel die Probenahme von Aminen in der Gasphase beschrieben werden. Im ersten Teil dieses Kapitels wird die Entwicklung der Probenahmebedingungen mit Impingern beschrieben. Im zweiten Teil dieses Kapitels werden diese Bedingungen auf die Probenahme mit Probenahmerhrchen bertragen und modifiziert.

4 Experimenteller Teil

89

4.7.2 Luftprobenahme mit Impingern

Um Amine aus der Luft mit einer bestimmten Technik bestimmen zu knnen, ist es zunchst notwendig sowohl die Probenahmebedingungen (Konzentrationen, pHWert) zu optimieren als auch die Aminatmosphre zu simulieren, da beide Faktoren zu falschen Ergebnissen fhren knnen. Der in dieser Arbeit verwendete Versuchsaufbau bei der Bestimmung von Aminen in der Luft war der folgende: Die definierte Gasatmosphre wurde in einem 100 mL-Dreihalskolben, welcher auf einem Magnetrhrer stand, entwickelt. Die so generierte Amingasatmosphre wurde mit Hilfe einer Pumpe durch einen 50 mL-Impinger der die Sammellsung beinhaltete, dann ber einen 50 mL-Impinger, in dem sich die Kontrollsung befand und als letztes ber eine Waschflasche mit Aktivkohle geleitet. Die Waschflasche mit Aktivkohle vor der Pumpe diente dazu, das bei der Probenahme verdampfende Lsungsmittel zu adsorbieren. Die Glasgefe wurden zunchst durch PolypropylenSchluche verbunden. Die folgenden Experimente haben allerdings gezeigt, da Amine mglicherweise an PP-Schluchen adsorbieren.

Experimente mit PP-Schluchen


Es wurde der oben beschriebene Versuchsaufbau verwendet. Allerdings wurden die Impinger nicht mit Silikonschluchen, sondern mit PP-Schluchen verbunden. Die Wiederfindungsraten zeigten starke Minderbefunde auf, so da der Verdacht nahe lag, da das Amin entweder durch die Schluche hindurch diffundierte oder an diesen adsorbierte. In weiteren Versuchen wurden mit den zuvor verwendeten Schluchen mehrfach Blindproben genommen, d.h. es wurden Proben gezogen ohne Analyt vorzulegen. Dabei zeigte sich, da in den Blindproben eine nicht zu unterschtzende Menge Analyt gefunden wurde. Nach Ausstausch der Schluche durch sehr kurze Silikonschluche, so da praktisch ein Glas-an-Glas-Kontakt der Gefe zustande kam, trat dieses Problem nicht mehr auf.

4 Experimenteller Teil

90

Modellanalyt
Als Modellanalyt fr die Entwicklung einer definierten Aminatmosphre diente das Dipropylamin, DPA. Der Grund fr die Wahl des DPA war, da die krzerkettigen aliphatischen Amine, wie das Methyl-, Dimethyl-, Ethyl- und Diethylamin sehr niedrige Siedepunkte haben und deshalb bei Raumtemperatur gasfrmig sind. Kommerziell erhltlich sind aus diesem Grunde nur Ampullen, in denen das jeweilige gasfrmige Amin eingeschmolzen vorliegt oder die festen Hydrochloride. Praktisch ist es nicht mglich eine bestimmte Menge gasfrmiges Amin aus einer solchen Ampulle freizusetzen, um eine definierte Gasatmosphre zu erzeugen. Auch das Freisetzen der Amine aus den Hydrochloriden mit Base erwies sich als unpraktikabel, da die kurzkettigen Amine aufgrund ihrer hervorragenden

Wasserlslichkeit in der Lsung verbleiben. Aufgrund dieser Tatsache ist nur die indirekte Erzeugung einer definierten Gasphase durch die Verdampfung eines flssigen Analyten mglich.

DPA-Stammsung: In einem 10 mL Mekolben werden 10 L DPA (7380 g; 72,9


mol) in Acetonitril gelst.

Reagenz
Bei der Probenahme wurden verschiedene Lsungsmittel und Lsungsmittelgemische getestet. Es zeigte sich, da die besten Resultate erzielt wurden, wenn das NBDCl whrend der Probenahme ausschlielich in Acetonitril vorlag und erst bei der Probenaufbereitung ein basischer Puffer zugesetzt wurde.

NBDCl-Reagenzlsung: In einem 500mL-Mekolben werden 1,2 g NBDCl (6 mmol)


in Acetonitril gelst.

Untersuchungen zur Reaktionsgeschwindigkeit


Um die Bedingungen whrend der Probenahme im Impinger zu kennen, ist es wichtig die Reaktionsgeschwindigkeit unter verschiedenen Bedingungen zu

simulieren, da eine schnelle Reaktion des Analyten mit dem Derivatisierungsreagenz

4 Experimenteller Teil

91

die grundlegende Voraussetzung fr ein leistungsstarkes Analysenverfahren ist. Deshalb soll in diesem Abschnitt untersucht werden, wie schnell das Dipropylamin mit dem NBDCl in Lsung reagiert. Zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde die direkte photometrische Detektion ausgewhlt. In Abhngigkeit von der Zeit wurden die UV/vis-Spuren an den Absorptionsmaxima des Reagenzes und des Dipropylaminderivates detektiert, d.h. bei 338 und 480 nm. Um auszuschlieen, da die beobachtete Zunahme der Extinktion bei 480 nm auf das Hydrolyseprodukt zurckzufhren ist, wurden 10 L der Reaktionslsung in die HPLC injiziert und UV/vis-spektroskopisch bei 460 und 480 nm detektiert. Das Hydrolyseprodukt hat bei 460 nm sein Absorptionsmaximum, absorbiert aber bei 480 nm immer noch ausreichend stark, um es mit einem sekundren Aminderivat zu verwechseln. Die Auswertung des Chromatogramms zeigte, da das Hydrolyseprodukt entstand, aber der allergrte Teil der Extinktion auf das NBDDPA zurckfhren war. Da keine quantitative Bestimmung mittels der photometrischen Detektion stattfand, sondern nur eine qualitative Beobachtung, ist der Anteil des gebildeten Hydrolyseproduktes zu vernachlssigen.

Es wurden zwei Versuchsanstze durchgefhrt. Beide Anstze gehen von einem berschu des Reagenzes gegenber dem Analyten aus. Der berschu ist notwendig, um die Konzentrationsverhltnisse im Impinger bei der Probenahme mglichst authentisch simulieren zu knnen. Der erste Ansatz wird ohne Puffer durchgefhrt. Der zweite Ansatz soll den Einflu eines Puffers bei der Derivatisierungsreaktion zeigen.

Arbeitsvorschrift zum 1. Versuchsansatz: Zunchst stellt man eine 1 mM NBDClLsung in einem 10 mL-Mekolben her, indem man 20 mg NBDCl in Acetonitril lst. Dann wird eine DPA-Lsung hergestellt, indem man 10 L DPA (72,9 mol) in 10 mL Acetonitril lst. In eine Quarz-Kvette pipettiert man schnell zu 2 mL NBDCl-Lsung 10 L DPA-Lsung, schttelt die Kvette und detektiert die Extinktion fr 60000 Sekunden (ca. 17 Stunden).

4 Experimenteller Teil

92

1,0

0,8

338 nm 480 nm

Extinktion [AU]

0,6

0,4

0,2

0,0 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000

Zeit [sec]

Abb. 4.7.1: Extinktions/Zeit-Kurve (ohne Puffer).

fr

die

Reaktion

von

DPA

mit

NBDCl

Abbildung 4.7.1 zeigt die Extinktions/Zeit-Kurve fr die Reaktion von DPA mit NBDCl als Derivatisierungsreagenz. Die UV/vis-Spur bei 338 nm zeigt den Verbrauch des NBDCl, whrend die UV/vis-Spur bei 480 nm die Bildung des NBDDPA zeigt. Aus der Extinktions/Zeit-Kurve wird deutlich, da es sich um eine sehr langsame Reaktion handelt. Die Bildung des NBDDMA ist nach 60000 Sekunden immer noch nicht beendet. Eine Ursache hierfr knnte die Bildung des Dipropylhydrochlorides whrend der Reaktion sein. Mit jedem gebildeten NBDDPA-Molekl wird ein Molekl Hydrochlorid freigesetzt. Aufgrund des freien Elektronenpaares besitzt das Dipropylamin basische Eigenschaften, weshalb es zu Dipropylammoniumchlorid reagiert und so der Derivatisierungsreaktion nicht mehr als Nucleophil zur Verfgung steht.

Ein mglicher Lsungsansatz, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhhen, knnte der Einsatz eines basischen Puffers sein. Mit Hilfe eines Puffers werden die freigewordenen Protonen abgefangen. Ist die Pufferkapazitt hoch genug, sollte kein Dipropylammoniumchlorid gebildet werden knnen, so da das gesamte

Dipropylamin als Nucleophil fr die Reaktion zur Verfgung steht.

4 Experimenteller Teil

93

Arbeitsvorschrift zum 2. Versuchsansatz: Zunchst stellt man eine 1 mM NBDClLsung in einem 10 mL-Mekolben her, indem man 20 mg NBDCl in Acetonitril lst. Dann wird eine DPA-Lsung hergestellt, indem man 10 L DPA (72,9 mol) in 10 mL Acetonitril lst. In einer Quarz-Kvette pipettiert man schnell zu 2 mL NBDCl-Lsung 10 L DPA-Lsung und 100 L 1%igen NaHCO3-Puffer, schttelt die Kvette und detektiert die Extinktion fr 60000 Sekunden (ca. 17 Stunden).

0,8

480 nm 338 nm
0,6

Extinktion [AU]

0,4

0,2

0,0 0 10000 20000 30000 40000 50000

Zeit [sec]

Abb. 4.7.2: Extinktions/Zeit-Kurve fr die Reaktion von DPA mit NBDCl (mit Puffer).

In Abbildung 4.7.2 ist die Extinktions/Zeit-Kurve fr die Reaktion von NBDCl und DPA in Gegenwart eines basischen Puffers zu sehen. Verglichen mit der Reaktion ohne Puffer kann gezeigt werden, da die Reaktion wesentlich schneller verluft. Das DPA hat nach etwa 35000 Sekunden (ca. 10 Stunden) vollstndig zum NBDDPA abreagiert. Jedoch ist auch die Reaktion in Gegenwart des Puffers wesentlich zu langsam, wenn man lange Probenaufbearbeitungszeiten vermeiden mchte.

Sowohl die VDI- als auch die OSHA-Methode erhitzen die Proben bei der Aufbereitung. Offensichtlich ist die Reaktionsgeschwindigkeit derartiger nucleophiler Substitutionsreaktionen sehr langsam, so da auch bei der NBDCl-Methode bei der Aufarbeitung der Proben erhitzt werden mu.

4 Experimenteller Teil

94

1. Test
Anhand der Untersuchungen zur Reaktionsgeschwindigkeit konnte gezeigt werden, da ein leicht basischer Puffer fr die Derivatisierungsreaktion notwendig ist. Nach Voruntersuchungen Pufferkonzentrationen in hat Mekolben sich ein mit 1%iger verschiedenen NaHCO 3-Puffer Puffern als und

geeignet

herausgestellt. Nun mute herausgefunden werden, wieviel dieses Puffers fr die Reaktion zugesetzt werden mu, damit sie mglichst quantitativ abluft. Fr die Bestimmung der Wiederfindungsraten wurde folgendermaen vorgegangen: Man verdampft 1 mL der DPA-Stammlsung (7,29 mol) in dem dafr vorgesehenen 100 mL Dreihalskolben und saugt mittels der Pumpe fr 60 min die so entwickelte Gasatmosphre durch die Sammel- und Kontrollsung (je 40 mL NBDCl-Lsung). Nach der Probenahme gibt man in beide Impinger jeweils ein bestimmtes Volumen (1, 2, 3, 4 und 5 mL) des 1%igen NaHCO3-Puffers, lt 10 Minuten reagieren, fgt 3 Tropfen konzentrierte Salzsure hinzu und fllt bis zur Eichmarke mit Acetonitril auf. Jede Messung wurde dreimal durchgefhrt. Tabelle 4.7.1 zeigt die so gewonnenen Ergebnisse. Die Auswertung erfolgte mit dem in Abschnitt 4.2.7 beschriebenen HPLC-System. Die Detektionswellenlnge fr die UV/vis-spektroskopische Detektion lag bei 480 nm.

Tab. 4.7.1: Wiederfindungsraten der Impingerprobenahme mit simulierter DPAGasatmosphre; Sammeldauer = 60 min; T = RT.

Pufferzusatz Probe 1 2 3 4 5 [mL]


1 2 3 4 5

n [mol]
5,75 6,00 5,75 3,95 6,00

WFR [%]
7918 8211 797 5411 829

Probenzahl
3 3 3 3 3

4 Experimenteller Teil

95

Obwohl zur Reaktionslsung ein basischer Puffer zugesetzt wurde, um das bei der Reaktion entstehende Hydrochlorid abzufangen, verluft die Reaktion innerhalb der gegebenen Zeit nicht quantitativ. Die Wiederfindungsraten liegen zwischen 54 und 82%. Bei der Auswertung der Kontrollsung konnten keine Durchbrche festgestellt werden, so da davon ausgegangen werden mu, da die Derivatisierungsreaktion noch nicht abgeschlossen war.

2. Test
Wie aus den kinetischen Untersuchungen hervorgeht, verluft die

Derivatisierungsreaktion in Gegenwart eines Puffers zwar schneller als ohne Puffer, aber immer noch sehr langsam. In diesem 2. Test sollte nun gezeigt werden, welchen Einflu eine leichte Temperaturerhhung mit sich bringt. Die

Versuchsanordnung ist dieselbe, wie im 1. Test. Allerdings erwrmt man die Proben nach Zugabe des Puffers fr eine halbe Stunde bei 40 C im Wasserbad und lt sie wieder abkhlen, bevor man 3 Tropfen konzentrierte Salzsure hinzugibt und sie auffllt. Tabelle 4.7.2 zeigt die Ergebnisse, die aus diesen Untersuchungen hervorgehen.

Tab. 4.7.2: Wiederfindungsraten der Impingerprobenahme mit simulierter DPAGasatmosphre; Sammeldauer = 60 min; T = RT.

Pufferzusatz Probe 1 2 3 4 5 [mL]


1 2 3 4 5

ngefunden [mol]
6,65 7,90 6,75 6,75 6,90

WFR [%]
916 10812 937 938 953

Probenzahl
3 3 3 3 3

4 Experimenteller Teil

96

Die Wiederfindungsraten lagen fr diese Versuchsanordnung zwischen 91 und 108 %. Fr analytische Zwecke liegen alle Versuchsanordnungen in einem akzeptablen Rahmen. Da es aufgrund der Bildung des Hydrolyseproduktes von Vorteil ist, da mglichst wenig Wasser anwesend ist, wurde mit den Bedingungen aus Probe 1 weitergearbeitet.

3. Test
In diesem Test sollen die Wiederfindungsraten fr verschiedene verdampfte Dipropylaminkonzentrationen bestimmt werden. Hierfr verdnnt man die DPAStammlsung 1:10, 1:50 und 1:100 mit Acetonitril. Es werden jeweils 1 mL der DPAStammlsung und der verdnnten Lsungen verdampft. Die Proben werden wie im 2. Test 1. Probe aufgearbeitet. Tabelle 4.7.3 zeigt die Wiederfindungsraten fr die verschiedenen DPA-Konzentrationen.

Tab. 4.7.3: Wiederfindungsraten der Impingerprobenahme mit simulierter DPAGasatmosphre; Sammeldauer = 60 min; T = RT.

Probe

nSoll(DPA) [moL]

nHaben(DPA) [moL]
6,650 0,671 0,1387 0,0672

WFR [%]

Probenzahl

1 2 3 4

7,290 0,729 0,1458 0,0729

916 923 955 926

3 3 3 3

Die Wiederfindungsraten liegen fr die verschiedenen DPA-Konzentrationen im Bereich von 91 bis 95%, also fr analytische Zwecke in einem akzeptablen Rahmen. Um die Probenahme zu vereinfachen, sollen nun die so gewonnenen Ergebnisse auf die Probenahme mit Rhrchen bertragen und modifiziert werden.

4 Experimenteller Teil

97

4.7.3 Luftprobenahme mit Probenahmerhrchen

Nachdem im ersten Teil dieses Kapitels die Entwicklung der Luftprobenahme fr Amine in Impingern beschrieben wurde, sollen nun in diesem Teil diese Ergebnisse genutzt werden, um die Luftprobenahme von Aminen auf Probenahmerhrchen durchzufhren. Erste Versuche wurden mit vier kommerziell erhltlichen SPEKartuschen durchgefhrt: Supelclean LC-8, Supelclean LC-8 TS, Supelclean LC-18 und Discovery DPA-6S-Material (Polypropylen-Filtrationskartuschen mit

Polyethylenfritten, Fllmenge 500 mg, Partikelgre 45 m, Porendurchmesser 60 , Kartuschen-Volumen 6 mL). Die Probenahmerhrchen wurden folgendermaen belegt:

Arbeitsvorschrift fr die Belegung der SPE-Kartuschen mit NBDCl


Zunchst konditioniert man jede Kartusche mit 2 mL Acetonitril. Dann beschichtet man die Rhrchen mit 6 mL einer NBDCl-Lsung (2 g NBDCl in 50 mL Acetonitril) und saugt zum Trocknen 10 min einen trockenen Stickstoffstrom durch die Rhrchen.

Der apparative Aufbau bei der Probenahme entsprach dem Aufbau der Probenahme mit Impingern. Sammellsungs- und Kontrollsungsimpinger wurden gegen Sammelund Kontrollrhrchen ausgetauscht. Die Sammeldauer wurde auf 90 Minuten erhht, da nach 60 Minuten noch nicht die gesamte Probe verdampft war. Ursache hierfr sind die Rhrchen, die nicht einen so groen Gasflu wie die Impinger zulassen.

Arbeitsvorschrift fr die Probenaufbereitung


Nach der Probenahme wurden sowohl Sammel- als auch Kontrollrhrchen mit jeweils 9 mL Acetonitril in einen 10 mL-Mekolben eluiert. Zur eluierten Probenlsung gibt man 200 L eines 1%igen NaHCO3-Puffers und erhitzt das Gemisch im Wasserbad fr eine halbe Stunde auf 40 C. Lt die Lsung abkhlen, fgt 1 mL konzentrierte Salzsure hinzu und fllt mit Acetonitril auf.

Die so aufgearbeiteten Proben wurden direkt in das in Abschnitt 4.2.7 beschriebene HPLC-System injiziert. Die UV/vis-Detektion fand bei einer Wellenlnge von 480 nm statt. Tabelle 4.7.4 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

4 Experimenteller Teil

98

Tab. 4.7.4: Wiederfindungsraten bei der Probenahme mittels Kartuschen mit simulierter DPA-Gasatmosphre; nSoll = 7,29 mol; Sammeldauer = 90 min; T = RT.

Probe 1

Adsorbens
Supelclean LC8 Supelclean LC-

nHaben [mol]
5,32

WFR [%]
735

Probenzahl
3

8 TS1 Supelclean LC-

2,41

338

18 Discovery

5,47

753

DPA-6S

5,90

817

Die Wiederfindungsraten liegen fr die verschiedenen SPE-Kartuschen zwischen 33 und 81 %. Das Supelclean LC-8 TS erwies sich fr die NBD-Derivate als ungeeignet, da es sich nicht quantitativ eluieren lie. Die anderen Materialien sind im Rahmen der Meungenauigkeiten als identisch anzusehen. Somit sind alle drei Materialien fr die NBDCl-Methode als Adsorbens geeignet. Es kann davon ausgegangen werden, da ein systematischer Fehler entweder bei der Probenahme oder bei der Aufarbeitung vorliegt.

Bei ersten Versuchen mit der Impinger-Technik traten hnliche Probleme auf. Ursache hierfr war die Verwendung von Polypropylen-Schluchen als

Verbindungsstcke zwischen den Glasgefen. An diesen Schluchen wurde das Dipropylamin mglicherweise adsorbiert, so da sich die Wiederfindungsraten drastisch verschlechterten.

Ebenso wie die Verbindungsschluche bei der Impinger-Technik bestehen auch die SPE-Kartuschen aus Polypropylen, so da die Vermutung nahe liegt, da das Dipropylamin an den Kartuschen bzw. am Frittenmaterial, welches aus Polyethylen besteht, adsorbiert wird.

4 Experimenteller Teil

99

Aus diesem Grunde wurde mit Probenahmekartuschen weitergearbeitet, die einen Glasschaft und Fritten aus Teflon besitzen. Kommerziell erhltlich sind allerdings nur ungepackte Glaskartuschen, so da diese Probenahmekartuschen nicht nur selbst belegt, sondern auch gepackt werden muten. Zunchst erfolgte das Belegen des Adsorbens mit Reagenz. Als Trgermaterial wurde ein Discovery DPA-6SMaterial (Partikelgrenverteilung 50-160 m, unregelmige Partikelform, Lot: SP2388) der Fa. Supelco (Deisenhofen) ausgewhlt. Hierbei handelt es sich um ein Polyamidharz zur Adsorption von polaren Verbindungen.

Arbeitsvorschrift fr das Belegen des Adsorbens


Vorsichtig fllt man 5 g des Adsorbens in einen 100 mL Rundkolben. Dann gibt man eine Lsung aus 2 g NBDCl gelst in Acetonitril auf das Adsorbens und entfernt das Lsungsmittel am Rotationsverdampfer.

Die ersten Probenahmerhrchen wurden mit je 500 mg des belegten Adsorbens gepackt und dann mit Glaswolle festgepret. Der apparative Aufbau der Probenahmeeinrichtung entsprach dem bei den SPE-Kartuschen, d.h. hinter dem Sammelrhrchen befand sich ein Kontrollrhrchen. Es zeigte sich, da es mit dieser Anordnung nicht mglich war, die Aminatmosphre durch die Kartuschen zu ziehen. Mglicherweise weisen zwei Teflon-Fritte einen so hohen Widerstand auf, da die Pumpleistung der Pumpe nicht ausreicht, um die Aminatmosphre durch beide Rhrchen zu ziehen.

Anstatt ein Sammelrhrchen und ein Kontrollrhrchen zu verwenden, ist es auch mglich, in ein einziges Rhrchen eine Sammel- und eine Kontrollschicht einzubringen. Derartige Rhrchen werden im folgenden verwendet. Abbildung 4.7.3 zeigt ein solches Rhrchen.

Sammelschicht

Kontrollschicht

Abb. 4.7.3: Schema eines Sammelrhrchens mit integrierter Kontrollschicht.

4 Experimenteller Teil

100

Arbeitsvorschrift fr das Packen eines Glasrhrchens mit integrierter Kontrollschicht


In das 6 mL-Glasrhrchen werden 500 mg des belegten Adsorbens genau eingewogen. Die Sammelschicht wird mit Glaswolle bedeckt und mit einem Glasstab festgepret, so da kein Adsorptionsmaterial bei der Luftprobenahme

herausgesogen werden kann. Auf diese Schicht fllt man genau 200 mg des belegten Adsorbens als Kontrolle und pret sie gleichermaen mit Glaswolle fest.

Die Probenahme fand nun mit einem Rhrchen mit integrierter Sammelschicht statt. Mit Hilfe der Pumpe saugte man das gasfrmige Amin ber das Rhrchen. Die Probenahmedauer betrug 90 Minuten.

Arbeitsvorschrift fr die Probenaufbereitung


Nach der Probenahme wird die Glaswolle vor der Kontrollschicht sehr vorsichtig entfernt und das Adsorbens aus der Kontrollschicht vollstndig in einen 10 mLMekolben gefllt. Dieser wird mit 9 mL Acetonitril aufgefllt und fr 5 Minuten ins Ultraschallbad gestellt. Die Sammelschicht wird mit 9 mL Acetonitril in einen 10 mLMekolben eluiert. Sowohl zur Lsung der Kontrollschicht als auch zur Lsung der Sammelschicht gibt man 200 L eines 1%igen NaHCO3-Puffer und erhitzt das Gemisch im Wasserbad fr eine halbe Stunde auf 40 C, lt die Lsung abkhlen, fgt 1 mL konzentrierte Salzsure hinzu und fllt mit Acetonitril auf. Die Lsung der Kontrollschicht wird vor der Injektion in die HPLC noch filtriert, um feste Rckstnde des Adsorbens zu entfernen.

Die so aufgearbeiteten Proben wurden direkt in das in Abschnitt 4.2.7 beschriebene HPLC-System injiziert. Die UV/vis-Detektion fand bei einer Wellenlnge von 480 nm statt. Tabelle 4.7.5 zeigt die erhaltenen Ergebnisse fr verschiedene DPAKonzentrationen.

4 Experimenteller Teil

101

Tab. 4.7.5: Wiederfindungsraten der Probenahme mittels Glaskartuschen mit simulierter DPA-Gasatmosphre; Sammeldauer = 90 min; T = RT.

Probe

nSoll(DPA) [moL]

nHaben(DPA) [moL]
7,071 0,714 0,1385 0,0707

WFR [%]

Probenzahl

1 2 3 4

7,290 0,729 0,1458 0,0729

974 985 954 973

3 3 3 3

Die Wiederfindungsraten fr Glaskartuschen, die eine Sammel- und eine Kontrollschicht aus mit NBDCl belegten Discovery DPA-6S-Material enthielten, waren mit 95 bis 98 % fr das DPA nahezu quantitativ. Durch die Anwendung der Glaskartuschen konnte die Adsorption an der Kartusche und/oder der Fritte vermieden werden. Die Anwendung eines Probenahmerhrchens mit integrierter Kontrollschicht konnte die Probleme bei der Probenahme beheben. Die

Glaskartuschen/ DPA-6S-Methode stellt eine elegante Methode fr die Bestimmung von Aminen in der Luft am Arbeitsplatz dar.

4.8

Untersuchung von Realproben mit der NBDCl-Methode

Nachdem in den vorangegangenen Kapiteln die Entwicklung der NBDCl-Methode und der Probenahme dargestellt wurden, soll nun in diesem Kapitel die Anwendung im Alltag gezeigt werden. Als Realproben wurden drei verschiedene Fischproben ausgewhlt. Bei der Fischprobe 1 handelte es sich um ein frisches Matjesfilet, dessen Zersetzungsproze ber eine Woche beobachtet wurde. Hierzu wurde das Matjesfilet bei Raumtemperatur in einen 250 mL-Dreihalskolben gelegt. Tglich wurde eine Probe mit der in Kapitel 4.7.3 beschriebenen Glaskartuschen/DPA-6SMethode genommen. Bei der Fischprobe Hierbei 2 handelte es sich um eine unter

nordschwedische

Delikatesse.

werden

Heringsfilets

luftdicht

Anwesenheit von Bakterien in einer Metalldose verschlossen. Die Bakterien vergren den Fisch unter anaeroben Bedingungen. Vom Sud dieses Fisches wurde eine

4 Experimenteller Teil

102

Probe mit der Glaskartuschen/DPA-6S-Methode genommen. Fischprobe 3 ist hinter der Fischtheke eines Lebensmittelgeschftes mittels der Glaskartuschen/ DPA-6SMethode genommen worden. Die Eluate der Proben wurden flssig-

chromatographisch getrennt und sowohl UV/vis- und fluoreszenzspektroskopisch als auch massenspektrometrisch detektiert. Die UV/vis-Detektion erfolgte mittels der Zweiwellenlngendetektion bei 460 und 480 nm, die Fluoreszenzdetektion bei einer Anregungswellenlnge von 468 nm und einer Emissionswellenlnge von 537 nm. Die massenspektrometrische Detektion erfolgte im negativen APCI-Modus. Da die drei Chromatogramme der untersuchten Proben qualitativ nahezu identisch aussahen, wird exemplarisch die Abbildung 4.8.1 fr die Matjes-Probe gezeigt.

250

600 500 NBDOH 400

200 Absorption [mAU]

150 300 100 unbekanntes Amin 200 100 0


0 5 10 15

Fluoreszenz [-]

50

Zeit [min]

Abb. 4.8.1: Chromatogramm der Matjes-Probe (....... Fluoreszenz;_____ UV/visDetektion bei 480 nm).

Abbildung 4.8.1 zeigt das Chromatogramm der Matjes-Probe. Man erkennt zwei Peaks. Der erste Peak bei ca. 1,3 min ist das Hydrolyseprodukt NBDOH, welches durch die Aufarbeitung mit basischem Puffer und Erhitzen in grerer Menge gebildet wird. Der zweite Peak bei ca. 10 min ist das unbekannte Amin, welches aus der Fischprobe stammt. Fr die Identifizierung des unbekannten Amins sind folgende

4 Experimenteller Teil

103

Charakteristika aus der flssigchromatographischen Trennung mit UV/vis- und Fluoreszenzdetektion Absorptionsmaximum zu bei entnehmen: 480 nm; Das der UV/vis-Spektrum Quotient Q480/460 zeigt fr ein die

Zweiwellenlngendetektion liegt bei 1,6; der Quotient QF/480 bei 2,8 und der Quotient QF/460 bei 4,3. Vergleicht man die erhaltenen Ergebnisse mit den in Kapitel 4.4.2 und 4.4.4 angegebenen Werten, so kommt man zu der Schlufolgerung, da es sich um ein sekundres aliphatisches Amin handeln mu. Es zeigt ein Absorptionsmaximum bei 480 nm und Fluoreszenz, deshalb kann kein aromatisches Amin vorliegen. Desweiteren stimmen die Quotienten Q480/460, QF/480 und QF/460 mit denen von sekundren aliphatischen Aminen berein. Die Retentionszeit von ca. 10 min spricht fr das Diethylaminderivat.

Um die Vermutung zu besttigen oder zu widerlegen wurde die Probe mittels HPLCMS und APCI(-) untersucht. Handelte es sich um das Diethylaminderivat so mte man im TIC-Chromatogramm einen Peak bei ca. 10 min finden, der ein Massenspektrum mit einem Hauptpeak bei einem Masse-zu-Ladungsverhltnis von m/z = 236 hat. Im TIC-Chromatogramm ist jedoch kein Peak bei 10 min zu finden, so da es sich nicht um das Diethylamin-Derivat handeln kann.

Die aus der UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Detektion gewonnenen Charakteristika zeigen jedoch eindeutig, da es sich um ein sekundres aliphatisches Amin handeln mu. Mglicherweise wird ein NBDAmin-Derivat gebildet, welches einen Elektroneneinfang mit anschlieender Dissoziation eingeht, so da das entstehende Anion aufgrund seiner kleinen Masse nicht zu detektieren ist. Abbildung 4.8.2 zeigt einen solchen Elektroneneinfangmechanismus mit anschieender Dissoziation. Vor allem grere, polare Molekle, die nicht in der Lage sind, die negative Ladung zu stabilisieren zeigen einen derartigen Mechanismus.

4 Experimenteller Teil

104

N O + N NO2 N O N NO2 e

Abb. 4.8.2: Schema

des

Elektroneneinfangmechanismus

mit

anschlieender

Dissoziation.

Auch wenn die Identitt des unbekannten Amins nicht aufgeklrt werden konnte, zeigte dieses Beispiel, da die massenspektrometrische Detektion einen wichtigen Beitrag zur Identifizierung von unbekannten Verbindungen liefert und die Sicherheit bei der Identifizierung erhht. Die alleinige Identifizierung aufgrund der UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Detektion htte zu einer falschen Schlufolgerung gefhrt.

5 Zusammenfassung

105

Zusammenfassung

Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse lassen sich folgendermaen zusammenfassen:

1. In dieser Arbeit ist es gelungen, die Derivate kurzkettiger aliphatischer und flchtiger aromatischer Amine des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols zu synthetisieren und in hoher Reinheit zu isolieren. Dies ermglicht die Quantifizierung der Amine ber eine externe Kalibration und so die Verbesserung der Nachweisgrenzen fr diese Substanzklasse.

2. Alle Aminderivate zeigen gute UV/vis-spektroskopische Eigenschaften. Die Absorptionsmaxima liegen im Bereich von 460 nm bis 480 nm. Die Absorptionsmaxima sind charakteristisch fr die verschiedenen Gruppen von Aminen, so zeigen das Ammoniak-Derivat und die primren aliphatischen Amine Absorptionsmaxima bei 460 nm, sekundre aliphatische und aromatische Amine Absorptionsmaxima bei 480 nm und primre aromatische Amine Absorptionsmaxima bei 470 nm. Das Ammoniakderivat und die Derivate der aliphatischen Amine zeigen Fluoreszenz, whrend die Derivate der aromatischen Amine keine Fluoreszenz aufweisen. Anhand der UV/visund fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften der Amine ist es so mglich, auf die verschiedenen Amingruppen zu schlieen.

3. Die Aminderivate des NBDCl lassen sich mit Hilfe der Flssigchromatographie auf Umkehrphasenmaterialien gut trennen. Die Derivate der aliphatischen Amine eluieren mit steigender Alkylkettenlnge. Die flssig-

chromatographische Trennung des NBDCl von seinen Derivaten ist zwar mglich, aber nicht unbedingt notwendig, da sich das NBDCl spektroskopisch stark von seinen Derivaten unterscheidet. Bei Wellenlngen von ber 450 nm zeigt es keine Absorption.

4. Die Detektion der Aminderivate kann nicht nur UV/vis- und fluoreszenzspektroskopisch, sondern auch auch massenspektrometrisch erfolgen. Die hchsten Ionenausbeuten werden mittels der chemischen Ionisation bei

5 Zusammenfassung

106

Atmosphrendruck im negativen Modus (APCI(-)) erreicht. Die verschiedenen Derivatgruppen zeigen hierbei verschiedene Ionisationsmechanismen. Die Derivate der primren aliphatischen und aromatischen Amine ionisieren nach einem Deprotonierungsmechanismus, whrend die Derivate der sekundren aliphatischen und aromatischen nach einem bisher fr Nitroverbindungen in der APCI-MS nicht beschriebenen Elektroneneinfangmechanismus ohne Dissoziation der Molekle ionisieren.

5. Die aktive Probenahme mit der NBDCl-Methode kann sowohl mittels Impingern als auch Probenahmerhrchen erfolgen. Die Probenahme mittels Rhrchen hat gegenber der Impinger-Technik den Vorteil, da sie ohne toxische Lsungsmittel whrend der Probenahme auskommt.

6. Mit der in dieser Arbeit entwickelten NBDCl-Methode ist es nun mglich, nicht nur primre und sekundre aliphatische Amine, sondern auch aromatische Amine zu identifizieren und zu quanitfizieren. Im Vergleich zu der in Deutschland angewendeten VDI-Methode zeigt die in dieser Arbeit entwickelte NBDCl-Methode bessere photometrische Eigenschaften, d.h. grere

Extinktionskoeffizienten und hhere Absorptionsmaxima, wodurch niedrigere Nachweisgrenzen und eine strungsrmere Detektion erreicht werden. Im Gegensatz zur OSHA-Methode werden die Amine bei der NBDCl-Methode ber externe Standards und nicht ber die Reaktion kalibriert. Dadurch erreicht man je nach Analyt mindestens um einen Faktor 200 bessere Nachweisgrenzen.

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