I.

INTRODUCCION

Las bacterias se presentan en tres formas caractersticas, como son: bacilos, espirilos, algunas presentan variaciones morfolgicas, debido a la edad del medio del cultivo (formas pleomorficas o involucin) cada genero tiene sus propias caractersticas tanto en forma , tamao y disposicin de la clula. Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes bsicos se manifiesta si tomamos en cuenta su principal contenido en cidosnucleicos. Esta propiedad a sido aprovechada para estudiar mejor los diferentes tipos morfolgicos y estructuras que ayudan a la identificacin de una especie o grupo en particular.

II.

OBJETIVOS

Familiarizar al estudiante con las caractersticas morfolgicas (tamao, forma, disposicin), y movimiento, de algunos microrganismos, mediante el uso del microscopio, en muestra fresca y fijarlas.

Proporcionar conocimientos sobre coloracin, como simple y compuesta.

los mtodos mas comunes de

III.

REVISIN BIBLIOGRFICA

3.1.

Examen en fresco Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos

vivos y observar: la movilidad, el tamao y la forma de agrupacin de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; as como grnulos refrctiles, esporas si teir y cloroplastos dentro de las clulas vivas. Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin por la escasa diferencia entre los ndices de refraccin del medio y de los microorganismos; por otra parte, el movimiento continuo de los microorganismos, as como el causado por las corrientes de fluido, frecuentemente hacen difcil la observacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. Las preparaciones deben de obtenerse de material clnico fresco o de cultivos recientes durante 24 horas y realizndoles en medios adecuados. Es una tcnica que apenas se utiliza en el diagnostico microbiolgico, porque ofrece muy poca informacin en cuanto a la estructura y composicin de las bacterias. 3.2. Mtodo de gota pendiente Esta preparacin se realiza colocando una gota de la suspensin bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un crculo con vaselina o parafina. (acta como sellador) o parafina; sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavacin central que queda adherido gracias a la vaselina. Se invierte la preparacin y se observa colocndola en la platina del microscopio. La ventaja de esta tcnica, es que la preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo.

Fig.1: Mtodo de gota pendiente.

3.3.

PREPARACIONES FIJAS La preparacin consiste en una capa de la muestra extendida sobre un

portaobjetos libre de grasa. Esta preparacin debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a travs de ella. El extendido o frote se puede hacer de varias maneras: Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequea gota de agua mediante el asa y distribuyndolo en el portaobjetos. Por impronta, presionando el porta sobre la muestra. Colocando una gota de la muestra fluida en el portaobjetos.

Los extendidos o frotes se dejan secar al are; para asegurar que las clulas queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tincin; la preparacin se fija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercrico, procediendo a hacer la tincin. Esta puede ser: Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio; utilizan colorantes. Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparacin y se observa la silueta incolora de los microorganismos.

3.3.1. COLORANTES

Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste; son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren color. Estn formados por un grupo cromforo, que en la parte de la molcula responsable del color y un grupo auxcromo que, al formar sales, les permite disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa la preparacin de forma rpida sobre la llama de un mechero; el calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas coaguladas unen las clulas al porta. Cuando se desea fijar especmenes delicados se utiliza la fijacin qumica, que es menos agresiva que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los

microorganismos.

3.3.1.1.

Tipos de colorantes

Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Colorantes bsicos: son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente (el cromforo) y se combinan con los componentes cidos de la clula como ADN y ARN. Colorantes cidos: es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes bsicos de la clula, como el citoplasma; es decir se combinan con los componentes celulares en funcin de sus respectivas cargas; por lo tanto, los factores como fuerza inica, composicin del medio, temperatura y pH afectan las tinciones.

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas tcnicas de tincin. Los mordientes intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula por el colorante. Se usa cuando la afinidad qumica entre el componente celular y el colorante es baja; tambin se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podran ser visualizados de otra forma. Los colorantes ms utilizados son los de tipo bsico, ya que la mayor parte de las clulas microbianas poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes celulares tales como el negro de Sudn, que es liposoluble y permite distinguir los glbulos de grasa.

3.3.2. Tipos de tinciones Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

1. Tinciones simples En las tinciones simples se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple

mejora la observacin de la clula completa. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante.

2. Tinciones diferenciales

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial consta de dos etapas: una tincin primaria (siguiendo el mismo mtodo que en una tincin simple) seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa. Por ejemplo, la tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias.

3. Tincin de Gram

Mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica. Desarrollado por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste:

En un primer momento las bacterias se tien con violeta de genciana (derivado metilado anilnico) y despus se tratan con la solucin de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potsico y 300 partes de agua); por ltimo se lavan con alcohol etlico, o acetona y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante). A veces se aade una contra tincin con fucsina o eosina para teir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas ms visibles que tie de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta ms intenso. El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las clulas Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa.

IV.

MATERIALES Y METODOS

4.1. -

MATERIALES Muestras Tubos conteniendo cultivos bacteriano (caldo o agar):cultivo de 24 horas de Escherichia coli, y Staphylococcus aureus, Bacillus sp; y cultivos de 48 horas de Saccharomyces cerevisiae. Leche coagulada /yogurt / frutas fermentadas, etc.

Laminas portaobjetos/laminilla cubreobjetos

Asa de siembra Torundas estriles Solucin salina Bacteria Gram: Cristal violeta Lugol Decolorante alcohol: acetona Colorante de contraste : safranina

Azul de metileno en solucin acuosa. Plumn indeleble o lpiz de cera. Laminas fijadas Microscopio ptico.

4.2.

PROCEDIMIENTO

1. Examen en fresco (observar la morfologa y motilidad de las bacteria) - Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado. Con el as de siembra colocar una gota de la muestra a observar. - Colocar una laminilla cubreobjetos, sobre la gota, y observar al microscopio utilizando primero el objetivo de 10x y luego el de 40x.

2. Preparaciones fijadas: Coloraciones a) Coloracin simple Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado. Con el asa de siembra tomar un inoculo del cultivo bacteriano (si en caso es liquido), o colocar una gota de solucin salina estril (en caso de ser solido) en el portaobjeto, luego tomar un poco de la muestra y mezclar con la solucin salina estril. Hacer una extensin en la lmina (frotis), que no sea ni muy gruesa ni muy fina.

Dejar sacar a temperatura ambiente, o pasando por la llama del mechero al fin de obtener la fijacin del frotis.

Cubrir la preparacin con 2 0 3 gotas de colorante de azul de metileno, dejar que actu por 1minuto.

Lavar la preparacin con agua corriente, y evita que el chorro de agua le caiga directamente sobre el frotis.

Secar y observar en el microscopio ptico, usando el lente de inversin (100x), con aceite de inversin o cedro.

b) Coloracin compuesta : Mtodo Gram Tomar un inoculo con el asa de siembra y extenderlo sobre la laminilla portaobjeto limpio y desengrasada. Haciendo el frotis. Fijar la preparacin del medio ambiente y a la llama del mechero, controlar sobre el dorso de la mano si el calentamiento es moderado, ya que si no habr calcinacin Cubrir con la solucin cristal violeta por un minuto. Lavar ligeramente con agua corriente. Cubrir la preparacin con lugol, dejando actuar el mordiente, por uno o dos minutos Lavar con agua corriente. Agregar alcohol-acetona, hasta que este no arrastre colorante (regular mediante movimientos de balanceo de la preparacin). Lavar con agua corriente. Contrastar con el colorante safranina, por 30 segundos a 1min. Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados. Secar al aire o con ayuda al mechero. Observar al microscopio ptico, con el objetivo de inversin (100x).

V.

RESULTADOS

Cuadro 1: Observaciones microorganismos. Nombre del microorganismo Muestra 1 (Agar nutritivo) 1-10 um. De Muestra 2 (Levadura) Cocos ancho y 2-3 um. De longuitud Muestra 3 (Yogurt) Bacilos 0,2-5 um. Independiente bacilos Gram (-) Independiente estafilococos Gram (+) Forma de la clula Tamao de la clula Disposicin celular Gram (+) y (-) Clasificacin

VI.

DISCUSION

La tincin compuesta y la tincin gram que hemos realizado en la prctica no se obtuvieron resultados, ya que no se observaron el microscopio. La tincin gram fue para el yogur, pero se realiz una tincin simple para el yogur lo cual se observo Lactobacillus delbrueckiisubsp. Bulgaricus de coloracin azul , esto indica que la coloracin simple fue til para el reconocimento de estos microorganismo.

VII.

CONCLUSIONES

Se conoci las tcnicas de coloracin como la simple y compuesta. Se observ las distintas formas y tamaos de las bacterias analizadas en el laboratorio.

La forma de bacteria presente en el yogurt es de forma esfrica conocida tambin como cocos.

Se pudo notar en la coloracin de tincin simple los estafilococos coloreado de azul.

En la tercera muestra no se distingui muchos detalles pues esto se debe a que no se obtuvo una buena extensin

VIII.

CUESTIONARIO

1. Por qu es necesario que se fije la preparacin a la llama el mechero? La fijacin tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloracin as como tambin preservar la forma original de los microorganismos. El procedimiento ms comn es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta tcnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos ms suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetrxido de osmio, cido pcrico, etc.

2. Debido a que las bacterias Gram (+) se colorean de color violeta y las Gram (-) de rojo? Explique. La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+) y G(-), se deben en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana. La pared de las bacterias Gram (+) est constituida

fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglucano (20-30 nm), que es un polmero de N- acetil glucosamina y cido N-acetil murmico. Las cadenas de peptidoglucano, se unen a travs de puentes formados por aminocidos, en arreglos que varan de una especie bacteriana a otra. En esta capa podemos tambin encontrar cidos teicoicos, formados por steres fosfato de glicerol o ribitol, y cidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los cidos teicoicos pero se hallan anclados a la membrana citoplasmtica. En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglucano es mucho ms delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura

compleja en cuya composicin intervienen fosfolpidos, protenas y lipopolisacridos.

3. Ud. Cree que mediante la coloracin Gram se puede observar al Mycobacterium tuberculosis? Explique de acuerdo a su respuesta. En caso negativo describir el mtodo para observarlo y como se llama? No, porque Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composicin de su pared celular (tiene cidos miclicos). Es observado mediante el mtodo de: Tincin de cidoalcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Esta tincin tiene inters desde el punto de vista del diagnstico clnico puesto que algunos

microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra). Procedimiento y descripcin: 1. Extensin (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). 2. Fijacin. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel conFucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisin devapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. 5. Aadir cido-alcohol y esperar 30 segundos. 6. Lavar con agua 7. Aadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. 8. Lavar con agua, secar y observar (100).

4. Describir el mtodo para colorear esporas bacterianas. Describiremos las tcnicas de Dorner y de Moeller : Para la coloracin de esporos segn Dorner, se sensibiliza y colorea a la espora con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraer el colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se vern las esporas rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La tcnica de Moeller utiliza cido crmico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear a la espora. La decoloracin se realiza con cido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul. 5. Cree Ud. que el tamao de la clula coloreada es natural o no? Explique porque? 6. De acuerdo a sus observaciones en las lminas fijadas (anteriormente) Qu semejanzas encuentra en las muestras estudiadas?

Tincin de esporas

IX.

REFERNCIA BIBLIOGRAFICA

Manual de microbiologa general de la UNAM: Velsquez, M. O.; Vierna, G. L. y Luna, M. B.: Manejo y cuidado de los microorganismos. Pp.25-32

http://aulavirtual.usal.es/ http://www.ucbcba.edu.bo/ MOSSEL D. QUEVEDO F. Control microbiolgica de los alimentos. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Lima-Per. 1967.

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VAILENAS

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Microbiologia General. Universidad Agraria La Molina. Lima Per. 1980. Pag. 01-20p.