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1. Tema: Mtodos de extraccin, aislamiento, purificacin e inmovilizacin enzimticos 2. Objetivo Conocer tcnicas para la extraccin, aislamiento, purificacin e inmovilizacin enzimticos. Aprender de los fundamentos de cada tcnica de extraccin, aislamiento, purificacin e inmovilizacin enzimticos. 3. Justificacin El uso de enzimas en la biotecnologa tiene posibilidades ilimitadas, por tal razn la extraccin y uso correcto de las enzimas ayuda a aumentar la velocidad de las reacciones y la eficiencia energtica de las mismas. 4. Marco Terico 4.1 Extraccin Enzimtica La extraccin enzimtica se basa en medios fsicos y medios qumicos. 4.1.1 Los Medios Fsicos De Extraccin Enzimtica 4.1.1.1 Sonicacin En esta tcnica se utiliza la energa del sonido generalmente se realiza con ultrasonido que son frecuencias mayores a 20 kHz. La aplicacin de ultrasonido en lquidos produce el fenmenos llamado cavitacin produciendo zonas de compresin y rerefaccin. Las burbujas producidas en las cavidades comprimidas poseen presiones de miles de atmsferas formando ondas de choque que producen la ruptura de las clulas. En la sonicacin se utiliza osciladores ultrasnicos son los cuales se obtuvieron resultados exitosos siendo utilizado en paredes celulares bacterianas y en los protozoos Infusoria y Elodea. Provocando una disrupcin selectiva (Wiseman, 1991).

Fig1: Mtodo de sonicacin

Fig2: Aparato de sonicacin

4.1.1.2 Congelacin y descongelacin La congelacin y descongelacin provoca un valor menor al 10% de liberacin de protenas solubles. Esta tcnica se utiliza generalmente con otros mtodos ya que las pastas bacterianas son guardadas a 20C antes de la extraccin y purificacin de las enzimas. La congelacin y descongelacin puede dar lugar a una prdida de la actividad enzimtica. Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y descongelamiento. El lquido al congelarse a -56 C forma cristales muy finos que rompen la clula cuando esta se descongela rpidamente a 37C (Wiseman, 1991).

Fig3: Bombona de almacenaje de nitrgeno lquido

4.1.1.3 Trituracin y agitacin con abrasivos Para la trituracin se puede utilizar un molino para conseguir la disrupcin de las bacterias per requiere dos horas de funcionamiento. Para esta tcnica tambin se puede utilizar agitacin con perlas de vidrio las cuales son de 0,13 a 0,26 mm, a una velocidad de 300 a 500 sacudidas por minuto. Se emplea la prensa francesa, consiste en el paso de las clulas

a gran presin por un pequeo orificio a una cmara con presin baja, lo cual ocasiona la ruptura de las clulas por descompresin. La filtracin al pasar las clulas a travs de orificios a presin de dimetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares (Wiseman, 1991).

Fig4: Prensa francesa

Fig5: Mtodo de presin

4.1.2 Los Medios Qumicos De Extraccin Enzimtica Los medios qumicos son: lcalis, lizosima y EDTA, detergentes, y shock osmtico. 4.1.2.1 Alcalis El tratamiento para lcalis se utiliza por ejemplo en paredes de plantas, hongos y bacterias, mientras mayor sea el grado de hidrlisis ms enzima ser liberada de la membrana. El xito del tratamiento depende de la estabilidad de la enzima a pH elevado. Tambin se ha indicado que este mtodo sirve para inactivar proteasas lo que reduce el nivel de contaminacin ( Wiseman,1991). 4.1.2.2 Lizosima y EDTA La lisozima es una enzima que se obtiene a partir de la clara de huevo de la gallina. Las bacterias Gram positivas mucopptido alrededor de la membrana son ms suceptibles a la lisozima que la Gram negativa. La ruptura final de la envoltura celular depende de la presin osmtica del medio en suspensin una vez rota la pared celular. En las bacterias Gram negativas a parte de la lisozima se debe aadir EDTA para producir la liberacin de lipopolisacridos de la envoltura de la pared. Se ha indicado que el EDTA actua como agente quelante unindose a cationes divalentes esenciales en la pared lo que hace que la lisozima pueda acceder (Wiseman, 1991). 4.1.2.3 Detergentes Los detergentes pueden ser compuestos inicos como el lauril sulfato o no inicos como el Tween. En condiciones de fuerza inica baja y pH apropiado los detergentes se combinan con lipoprotenas formando micelas. Por tal razn los compuestos lipoprotecos de las membranas biolgicas se pueden solubilizar o hacer permeables. Los detergentes inicos son ms reactivos que los no inicos, ocasionando en muchos casos desnaturalizacin, precipitacin e hidrlisis de protenas, por tal razn estos detergentes no son los indicados para la extraccin de enzimas (Wiseman, 1991).

4.1.2.4 Shock Osmtico El shock osmtico es utilizado para la extraccin de enzimas hidrolticas y protenas ligadoras a partir de bacterias Gram negativas. Las clulas se hacen estallar al someterlas a un medio hipotnico, lo cual hace que la membrana no resista la presin osmtica. El mtodo incluye el lavado de las bacterias con una solucin tamponada para liberarlas del medio de cultivo y posteriormente se introduce en sacarosa el 20% en donde se deja que las clulas alcancen el equilibrio y pierdan su agua interna que se elimina de la suspensin por centrifugacin. La pasta de clulas obtenida se coloca en agua a 4 C. El repentino aumento de la presin osmtica del interior de las clulas hace que exploten liberando constituyentes celulares entre estos algunas enzimas ( Wiseman,1991).. 4.1.3 Protocolo de Extraccin de Enzimas Se tom ocho muestras al azar que luego se mezclaron para tener una muestra representativa. Posteriormente, se guardaron en bolsas plsticas en cava a 8C hasta el momento de su uso. Se sec la muestra parcialmente en una estufa de conveccin forzada a 48C por 48 h. La muestra se redujo a un tamao de partcula de 1 mm. La protena soluble presente en los extractos y en los sobrenadantes de la precipitacin se determin por el mtodo de Lowry modificado, en un espectrofotmetro UV-Visible Cary 50 (Mulgrave, Victoria, Australia) a la longitud de onda de 742 nm y utilizando albmina de suero de bovino como protena estndar(Urribarri,2004 ) .

Se utiliz como agente extractante hidrxido de calcio. Las extracciones se realizaron por triplicado en Erlenmeyers de 250 mL con 5 g de materia seca en un bao de mara con agitacin constante (100 rpm). Posteriormente, se filtr al vaco empleando una tela sinttica y los slidos se lavaron con 10 mL de agua destilada. Al extracto y lavado se les midi el pH. Los extractos se guardaron a 4C por 24 h. Luego se sometieron a centrifugacin (10000 rpm) por 30 min en una centrfuga Centra NTMP4R, separando as la fibra y la protena verde presente en el extracto proteico. En ste se recuper la protena blanca o citoplsmica. Se determin protena soluble a los extractos por el mtodo de Lowry modificado. Posteriormente se calcul el rendimiento de extraccin como el cociente entre los gramos de protena soluble en el extracto y la protena cruda inicial

expresado como porcentaje. Se realizaron extracciones a pH 10 de la solucin de hidrxido de calcio, 60C, relacin slido lquido 1:10 en tiempos de 5, 10, 20 y 30 min. Se realizaron las extracciones a valores de pH de la solucin extractante de hidrxido de calcio de 10, 11, 12 y 12,60 (solucin saturada), a 60C, relacin slido lquido 1:10 y tiempo de extraccin ptimo determinado en la experiencia anterior. Se efectuaron extracciones a temperaturas de 30, 45, 60, 75 y 90C y relaciones slido lquido 1:10 y 1:15 (factorial 5 x 2), utilizando el pH ptimo de la solucin de hidrxido de calcio y el tiempo ptimo de extraccin. Se evalu el rendimiento de extraccin de protenas en cada una de las condiciones planteadas y se seleccionaron como ptimas aquellas condiciones donde se obtuvo mayor rendimiento (Uriibarri, 2004).

4.2 Aislamiento y Purificacin Enzimtica 4.2.1 Mtodos Basados En Diferencias De Solubilidad Las enzimas que se encuentran disueltas muestran cambios significativos de solubilidad en funcin del pH, fuerza inica, propiedades dielctricas del disolvente, la temperatura, concentracin de solutos como por ejemplo sales. Las enzimas precipitan en

concentraciones altas de las sales. Para realizar esto se basan en la precipitacin fraccionada con concentraciones crecientes. Las sales ms usadas son el sulfato amnico y el sulfato magnsico (Primo, 1995). 4.2.2 Precipitacin Con Solventes Orgnicos Los solventes orgnicos polares como el etanol o la acetona permiten la precipitacin de enzimas. El principal efecto es la disminucin de la asociacin del agua con las enzimas. El efecto es la disminucin de la solubilidad de las enzimas logrando que estas precipiten (Calvo, 2003).

4.2.3 Cromatografa De Intercambio Inico Generalmente hay tres tipos de intercambiadores de iones las resinas, las celulosas y los geles de agarosa y dextrano intercambiadores de iones. Las resinas cambiadores de iones son polmeros insolubles en agua que contienen grupos catinicos o aninicos. Las resinas tienen ventaja de ser estables a los esfuerzos mecnicos, adems tienen una gran capacidad de adsorber protenas que sedimentan rpidamente. Las celulosa cambiadoras de iones tienen la propiedad que dentro de ellas puede introducirse gran variedad de grupos cargados que pueden ser catinicos o aninicos. El nivel de sustitucin de ests es muy bajo y la capacidad de las celulosas es la decima parte de la capacidad de las resinas. En esta tcnica se utiliza una columna rellana de un polmero sinttico que contiene grupos catinicos y grupos aninicos. Al colocar la solucin en la columna los diferentes tipos de enzimas sern detenidos en la columna por tener una carga opuesta a la de la matriz. En la cromatografa sobre columnas de intercambio inico las enzimas se fijan en la parte de arriba y son eluidas con tampones de pH y aumento de las concentraciones. Aqu se utiliza normalmente dietilaminoetilcelulosa y carboximetilcelulosa (Primo, 1995; Medina, 2005).

Fig6: Esquema de mtodo de cromatografa de intercambio inico

4.2.4 Cromatografa De Filtracin En Gel La cromatografa de filtracin en gel emplea matrices formadas por esferas porosas. Cuando ingresa en la columna la solucin que contienen las enzimas las molculas de menor o igual tamao que el de los poros son retenidas a lo largo de la columna, mientras que las molculas de mayor tamao no penetran en los poros y por lo tanto se desplazan con el flujo que atraviesa la columna. El proceso de cromatografa en gel consiste en el reparto de las molculas de soluto entre la fase mvil de solvente y la fase estacionaria constituido por espacios existentes entre las partculas porosas del gel. La fase mvil es el lquido que circula por el exterior de las partculas de gel y se conoce como volumen vaco mientras que la fase estacionaria es el lquido que ocupa el interior de las partculas de gel. El soluto se distribuye por difusin entre la fase estacionaria y la mvil. (Caballero, et al 2008)

Fig7: Esquema de mtodo de cromatografa de filtracin en gel

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4.2.5 Cromatografa de Afinidad La cromatografa de afinidad se basa en la interaccin ms o menos especfica entre una protena y un ligando. El ligando puede ser: especfico o inespecfico. El ligando especfico puede ser un anticuerpo, un sustrato, un sustrato anlogo o un inhibidor. El ligando inespecfico es el que reacciona con varias protenas y puede ser especifico para diferentes clases de enzimas como 5AMP ADP o NAD o puede interaccionar con un amplio rango de protenas. La reaccin dede ser reversible y se puede emplear varios eluyentes para retirar una protena de un ligando de afinidad. La matriz a la que el ligando se debe unir debe poseer las siguientes caractersticas: baja reactividad, buenas velocidades de flujo, grupos qumicos modificables y abundantes, deben ser estables mecnicamente y qumicamente, deben ser porosos y formar rede hidroflicas (Wiseman, 1991).

Fig8: Esquema de mtodo de cromatografa de afinidad 4.2.6 Cromatografa De Interaccin Hidrofbica La cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC) es una de las principales tcnicas utilizadas para la separacin y purificacin de enzimas en procesos biotecnolgicos. Esta tcnica fue desarrollada a partir de la observacin de que algunas protenas eran retenidas inesperadamente en geles de afinidad que tenan molculas hidrofobias. En HIC, las

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protenas se unen reversiblemente a ligandos hidrofbicos que se encuentran inmovilizados en el soporte cromatogrfico, debido a la presencia de una elevada concentracin de sal. La elucin se logra disminuyendo la fuerza inica en la fase mvil, formando un gradiente decreciente (Mahn, 2009). 4.2.7 Electroforesis La electroforesis es una tcnica que ayuda a separar biomolculas con una carga neta a travs de un campo elctrico. La migracin depende de la forma, tamao, carga y composicin qumica. Existen diversos tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los diversos tipos de soporte y estos pueden ser: geles de celulosa usados para aminocidos y carbohidratos, los geles de acrilamida y agarosa son utilizados para DNA, RNA y protenas. La concentracin de la poliacrilamida puede variar de acuerdo el tamao de las de la molcula a separar por ejemplo 7,5% de poliacrilamida para separar protenas de mediano en cambio si se utiliza un concentracin del 2,5% sirve para separar molculas de peso molecular alto. Para protenas se utiliza geles en condiciones nativas para que las protenas mantengan su conformacin y geles desnaturalizantes a los que se agrega un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol ocasionando que la protena pierda su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria produciendo un polipptido lineal (Segal, 2005).

Fig9: Esquema de un aparato de electroforesis

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4.2.8 Protocolo de Precipitacin de las Protenas.

Se realizaron tratamientos termoqumicos por triplicado. Se tomaron alcuotas de 20 mL del extracto resultante de la mejor condicin de extraccin (mayor rendimiento de extraccin obtenido) en vasos de precipitado y se ajust el pH a 4 o 4,5 (puntos isoelctricos de la protena foliar) con cido clorhdrico 1N estandarizado. Posteriormente se introdujeron en un bao de mara a temperaturas de 50, 65 y 80C por 30 minutos (factorial 2 x 3) y se centrifugaron, obtenindose un precipitado proteico que se llev a una estufa a 60C por 24 h hasta secarse, y luego se le determin protena cruda; al sobrenadante se le determin protena soluble. La protena precipitada se determin por diferencia entre la protena del extracto respectivo y la del sobrenadante. El rendimiento de precipitacin se obtuvo del cociente entre la cantidad en gramos de protena en el precipitado y la cantidad en gramos de protena soluble en el extracto proteico, expresado como porcentaje. Se pesaron 50 mg de concentrado proteico por triplicado y se llevaron a tubos de cierre hermtico para la hidrlisis de las protenas con 20 mL de HCl 6 N. Se desplaz el aire con nitrgeno gaseoso. Los tubos se colocaron en una estufa a 110C por 22 h. Cumplido el tiempo de hidrlisis, se elimin el exceso de HCl por neutralizacin con 20 mL de NaOH 6 N. El pH de las muestras se ajust a 2,2 con una solucin de HCl 0,05 N. Se filtr el contenido de los tubos con papel Whatman 1 y el sobrenadante se coloc en balones volumtricos de 100 mL y se aforaron con solucin de buffer citrato a pH 2,2. Luego se filtraron con filtros Millipore de 0,2 mm de dimetro de poro. El filtrado se conserv en congelacin a 10C hasta su uso. Las muestras y los estndares se derivatizaron precolumna en forma automatizada, utilizando un inyector Shimadzu modelo SIL6B. A 75 mL de la muestra (mezcla estndar de aminocidos o hidrolizado) se le agregaron 300 mL de solucin fluorescente de Ortoftaldehido- tiol (OPT). El tiempo programado para la inyeccin fue de 2 minutos, despus de la derivatizacin. Anlisis de aminocidos (Uriibarri, 2004).

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Los aminocidos se determinaron por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) mediante la utilizacin de un cromatgrafo marca Shimadzu, equipado con un detector de fluorescencia modelo FLD 6A a una longitud de onda de 350 nm, dos bombas de alta presin modelo LC 6A provistas de una cmara mezcladora de solventes, necesarias para crear gradientes, y un horno modelo CTO 6A. Se inyectaron 20 mL de muestra utilizando un inyector automtico modelo SIL 6B. La columna utilizada fue tipo Altex Ultrasphere ODS con partculas esfricas de 5 micras dedimetro y un sistema controlador SCL 6B que gobierna las funciones del equipo. El tiempo de retencin y rea bajo la curva se obtuvo mediante un integrador Chromatopac CR-4A. Se utilizaron dos sistemas de solventes, un sistema A compuesto por buffer acetato a pH 6,6, metanol y tetrahidrofurano en proporciones 80:19:1; un solvente B, compuesto por metanol y buffer acetato a pH 6,6, en proporciones 80:20. Se utiliz un gradiente binario en combinaciones tanto isocrticas como de incremento lineal del solvente B. El flujo fue constante e igual a 1,2 mL/min y la temperatura de la columna fue de 33C. Se us una estndar SIGMA LAB de concentracin 50 pmol/mL como referencia para la cuantificacin de los aminocidos. Anlisis Estadstico. Los resultados de las extracciones se analizaron usando procedimientos GLM del SAS (26). Se aplic un anlisis de varianza a cada uno de los estudios. Se evalu el efecto de las principales variables, y en el caso de los diseos factoriales temperatura vs relacin slido - lquido, se evaluaron las interacciones (Uriibarri, 2004).

4.2.9 Protocolo de Purificacin de Enzimas Las semillas fueron molidas y la harina resultante deslipidada con ter de petrleo, tamizada a travs de una malla nmero 60 y secada a temperatura ambiente. Se almacen a 4C hasta antes de su uso. Para la extraccin de la fraccin albmina, se utiliz el mtodo de Osborne (16), con algunas modificaciones. La harina deslipidada, en una proporcin 1:3 con agua desionizada y 0,1 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), fue agitada por tres horas, a 4C, para as extraer la fraccin albmina. La mezcla fue centrifugada a 3 000 g, por 10 minutos, y el sobrenadante liofilizado y conservado a 4C. Unos 60 mg del extracto de albmina liofilizado disueltos en el buffer de corrida (Tris HCl 0,1 M pH 8,5) fueron

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aplicados a una columna de Sephadex G-75, con un flujo de 11 mL/h y a temperatura de 4C. Los eluatos con mayor absorbancia, a 280 nm del pico 1, fueron reunidos y liofilizados. El siguiente paso consisti en una electroelucin, segn lo descrito por Harrington (17), para lo cual se tom 250 mg del liofilizado del pico 1 y se los someti a electroforesis preparativa en gel de acrilamida (Villanueva, sf).

4.3 Inmovilizacin Enzimtica Una vez obtenidas las enzimas para abaratar costos se puede inmovilizar las enzimas en soportes slidos que permita la reutilizacin de estas en procesos industriales. La inmovilizacin consiste en fijar o atrapar la enzima en material insoluble que puede ser gel membrana, perlas de vidrio etc. La inmovilizacin puede realizarse por mtodos fsicos como la adsorcin de la enzima sobre un soporte insoluble la retencin o atrapado de la enzima en un gel poroso que permita el paso del sustrato y evite la prdida de la enzima (Castillo, et al, 2005).

4.3.1 Tcnica de Inmovilizacin de Enzimas 4.3.1.1 Unin a un soporte Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, amplie el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. La inmovilizacin artificial de enzimas se puede subclasificar en funcin del modo de unin fsico del enzima en inmovilizacin por adsorcin fsica inica, quelacin o unin metlica

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covalente. En cualquiera de estos mtodos la seleccin de soporte insoluble as como el mtodo de unin tienen una importancia mxima (Arroyo, sf).

a) Adsorcin Fsica Este mtodo se basa en la adsorcin fsica de las molculas de enzima en la superficie de una matriz slida poniendo en contacto la solucin acuosa del enzima con el soporte mediante una de las siguientes tcnicas: procedimiento esttico, electrodeposicin, proceso en reactor, bao con agitacin. El mtodo bao de agitacin en el ms usado en laboratorios y es en la que el soporte se coloca en la solucin de la enzima y se mezcla mediante agitacin continua en un bao vibratorio de agua con el que se obtiene una deposicin uniforme de enzima. El mtodo ms utilizado en los procesos comerciales es el reactor en el que el soporte se carga en el reactor empleado, y el enzima se aade al reactor y se recircula o agita dentro de l (Arroyo, sf).

b) Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. Las ventajas de este mtodo son: manipulacin sencilla, carga constante, una mayor resistencia a la desactivacin por efecto de la temperatura, disolventes orgnicos, pH (Arroyo, sf).

4.3.1.2 Atrapado Este mtodo de inmovilizacin dentro de la red espacial de una matriz se basa en la localizacin de la enzima dentro de la red espacial de una matriz poilmrica o de una

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membrana de forma que se evite la liberacin de la protena. Es mtodo puede aplicarse para el atrapado de cualquier tipo de enzimas, clulas microbianas y orgnulos de diferentes tamaos (Wiseman, 1991). a)Atrapado en geles Este mtodo de atrapado en geles se basa en la localizacin de las enzimas dentro de los espacio intersiciales de geles polimricos. El mtodo para la formacin del gel consiste en polimerizar acrilamida en una solucin acuosa del enzima insoluble con un agente de entrecruzamiento (Wiseman, 1991). b)Microencapsulado El microencapsulado de enzimas consiste en atrapar al enzima en membranas polimricas semipermeables esfricas. Las enzimas inmovilizadas de esta fprma estn contenidos fsicamente dentro de la membrana y las molculas de producto y substrato deben difundir a travs de ella libremente siempre que sus tamaos sean los suficientemente pequeas (Wiseman, 1991). c) Entrecruzamiento Este mtodo se basa en la formacin de enlaces covalentes entre las molculas de enzima mediante reactivos bi o multifuncionales que dan lugar a la formacin de agregados tridimensionales entrecruzados totalmente insolubles en agua pero que no necesitan el uso de soportes adicionales. Este mtodo necesita la adicin de un cantidad apropiada de agente entrecruzante a la solucin del enzima en condiciones tales que se obtengan mltiples enlaces covalentes (Wiseman, 1991).

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Fig11: Esquema de los mtodos de inmovilizacin enzimtica

4.3.2 Protocolo de Inmovilizacin Enzimtica a) Seleccin del soporte para la inmovilizacin

Debido a que no existe un soporte universal para la inmovilizacin de una enzima, ste tiene que ser seleccionado con base en algunas de sus caractersticas, como tipo de enzima a inmovilizar y proceso en que se desea usar. Aqu se describe la utilizacin de Bakerbond Glutaraldehdo-P como ejemplo de soporte inorgnico y del poliestireno-divinilbenceno (PS/DVB) (al 2.0 % de divinilbenceno, con una malla de 200 a 400, Polisciences, Inc.) como ejemplo de matriz orgnica insoluble en agua. ste ltimo fue modificado por incorporacin del pptido glicilglicilglicina o triglicina (PS/DVB- 3G) funcionalizando as

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la matriz original con grupos carboxilo. El soporte funcionalizado se activ con 1,1carbonildiimidazol (CDI, SIGMA). Para esto se agregaron 4 meq (0.646 g) del activador CDI disueltos en 5 mL de acetona por cada gramo de resina funcionalizada a activar. La reaccin se llev a cabo durante 2:30 h a 40 C en un rotavapor (marca Heidolph WB 2000), concluido el tiempo de reaccin, el soporte activado se lav con acetona.

b) Seleccin de una protena reportera

Para estimar algunos parmetros que permitieran establecer las condiciones iniciales para la inmovilizacin de la peroxidasa de chayote (POCh), se utiliz como protena reportera a la meta-mioglobina (m-Mb), con propiedades espectroscpicas y catalticas conocidas y de bajo costo, capaz de iniciar con sta la factibilidad de la inmovilizacin de enzimas peroxidasas en ambos soportes. Para la obtencin de la m-Mb, se parti de mioglobina, extrada a partir de carne de res y posteriormente, mediante la adicin de ferricianuro de potasio fue llevada a su forma meta (Bylkas y Andersson 1997).

c) Estimacin de los parmetros para la inmovilizacin de m-Mb

Para estimar algunos parmetros iniciales como velocidad de agitacin (V, rpm), tiempo de reaccin de inmovilizacin (t, h), temperatura (T, oC), cantidad de soporte (mg), volumen del reactor (Vr) y volumen de la solucin de la protena reportera, para la inmovilizacin de la POCh, se llevaron a cabo diferentes experimentos por triplicado utilizando m-Mb, inicialmente en el soporte comercial Bakerbond Glutaraldehdo-P (BBG-P) en reactores de tefln colocados en un matraz de bola de 100 ml y en un rotavapor. Para determinar la concentracin adecuada de m-Mb se registraron los espectros de absorcin ultravioletavisible (UV-VIS) (espectrofotmetro UV-VIS-NIR, Shimadzu UV-31000S) a diferentes diluciones de sta con amortiguador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.0. Tambin, fueron probados diferentes reactores en forma y volumen considerando que iban a ser sometidos a agitacin y calentamiento a distintas temperaturas, adems, que las cantidades de soporte y de protena reportera no fueran muy grandes. La cantidad del soporte BBG-P fue variada desde 50 a 100 mg. Para estimar los valores de los parmetros de V, T y t, se fijaron dos de

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ellos y se vari el tercero. Concluido cada experimento (3 reactores), el sobrenadante se separ cuidadosamente del soporte y cada uno se trat de manera independiente. Al sobrenadante se le realiz su espectro UV-VIS, mientras que el soporte se lav con una solucin de NaCl 2M para eliminar la m-Mb que no fue inmovilizada. Al sobrenadante y al soporte con la m-Mb inmovilizada se les realiz el ensayo de actividad tipo peroxidasas diseado para hemoglobinas (Everse et al. 1994). Posteriormente, se grafic el parmetro determinado contra la concentracin de la m-Mb en el sobrenadante despus de la reaccin de inmovilizacin. El valor elegido para el parmetro en estudio fue aquel donde la concentracin de m-Mb en el sobrenadante fue menor El experimento de inmovilizacin de la m-Mb en BBGP fue realizado con los mejores parmetros seleccionados en su conjunto. Se estim el porcentaje de inmovilizacin a partir de la absorbancia a 409 nm de m-Mb antes y despus del proceso de inmovilizacin. A la m-Mb inmovilizada se le aplic la prueba de actividad tipo peroxidasa como se mencion anteriormente.

d) Inmovilizacin de una peroxidasa patrn y la peroxidasa de chayote

Bajo las condiciones utilizadas para la inmovilizacin de m-Mb en el soporte BBG-P, se procedi a inmovilizar a la peroxidasa de rbano blanco o rbano picante (Horseradish, HRP) (ya que esta peroxidasa se usa a nivel industrial y se ha estudiado con ms detalle, tomndose como referencia o patrn para el estudio de peroxidasas obtenidas de nuevas fuentes) y la peroxidasa de chayote (POCh). Sin embargo, debido a los bajos rendimientos y a la liberacin de sustancias coloridas en el proceso de inmovilizacin se decidi descartar este soporte y concentrar el estudio en el soporte PS/DVB-3G activado. La metodologa implementada se transfiri al nuevo soporte y se obtuvieron mejores resultados bajo las condiciones ya determinadas. Se realizaron pruebas de actividad enzimtica para peroxidasas al soporte PS/DVB-3G sin activar y activado. A continuacin se procedi a inmovilizar en ste a la peroxidasa patrn y la POCh, las cuales presentaron un ndice de pureza o R.Z. (A403nm/A280nm) de 1.0 (SIGMA) y 0.77 (Villegas-Rosas 1993), respectivamente. Se utiliz una masa de 100 mg del soporte al cual se les aadieron 800 L de solucin de enzima (A403nm:~0.8). La HRP y POCh inmovilizadas (HRP-PS/

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DVB-3G y POCh-PS/DVB-3G, respectivamente), se lavaron con NaCl 2M hasta que la solucin de lavado no present actividad de peroxidasa y a las enzimas inmovilizadas se les realiz el ensayo de actividad para peroxidasas (Villegas, 2003).

5. Conclusiones Los mtodos de extraccin fsicos de enzimas son tiles en el laboratorio pero pierden dicha utilidad al ser utilizados a gran escala ya sea por el tamao de los equipos, aumento del tiempo, por esta razn la extraccin por medios qumicos es ms eficaz. Los mtodos de purificacin y aislamiento ms utilizados a gran escala son por ejemplo la precipitacin con solventes orgnicos mientras que la tcnica de cromatografa aunque es muy til y exacta en laboratorio a gran escala se necesitara equipos muchos ms grandes y mucho ms tiempo e inversin

6. Bibliografa Arroyo, M. Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Universidad Complutense de Madrid. Departemento de Bioqumica y Biologa Molecular Wiseman, A., et al.1991. Manual de Biotecnologa de los Enzimas. Acribia. Inglaterra. Castillo, F., et al. 2005. Biotecnologa Ambiental. Tbar. Espaa Primo, E. 1995. Qumica Orgnica Bsica y Aplicada. Reverte. Espaa. Caballero., et al. 2008. Cromtatografa de filtracin en gel, Universidad de Crdoba, Espaa, http://www.uco.es/organiza/departamentos/ bioqumica-biol-mol/pdfs(

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