Apostila de Microbiologia - 2012 - Parcial

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FACULDADE DE MEDICINA REA INTERDISCIPLINAR DE CINCIAS BIOMDICAS DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA
APOSTILA DAS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA VERSO 2012
Esta apostila servir como apoio nas aulas prticas das disciplinas 17021: Microbiologia Curso de Medicina 17026: Microbiologia e Imunologia Curso de Enfermagem 17029: Microbiologia Curso de Cincias Biolgicas
Ministradas pelos professores: Profa. Dra. Ana Maria Barral Martinez Profa. Dra. Andrea von Groll Prof. Dr. Pedro Eduardo Almeida da Silva
Tcnicos responsveis pelo preparo das aulas prticas: Ana Bbara Scholante Silva Rubens Caurio Lobato
Esta apostila foi elaborada pela professora Tesi Fonseca em 2009. A verso 2012 foi digitada pelas monitoras Jenifer Belcuore e Mahiara de Oliveira Lopes da Rosa e atualizada pela Profa. Andrea von Groll.
APOSTILA DAS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA _______________________________________________________________________________
INTRODUO AS MICROBIOLOGIA: 1. OBJETIVO
ATIVIDADES
PRTICAS
NO
LABORATRIO
DE
Conhecer os procedimentos bsicos de laboratrio - uso de Equipamentos de Proteo Individual - organizao e preparo da bancada de trabalho, - preparo do material a ser utilizado, - uso do bico de Bnsen, - ala bacteriolgica - descartes 2. 1. 2. 3. NORMAS PARA AS AULAS PRTICAS: obrigatrio o uso de avental, cala comprida e sapatos fechados; No entrar com alimentos e bebidas dentro do laboratrio; Levar para a bancada somente caneta e caderno para anotaes. As bolsas e pastas devem ser colocadas sobre as mesas laterais do laboratrio; 4. Sempre ao chegar bancada deve-se fazer a limpeza da superfcie com algodo e lcool-iodado; 5. As atividades prticas devem ser realizadas com concentrao e seriedade. 6. Ao abrir placas de Petri e tubos contendo microrganismos, estes devem ser manipulados atrs da chama do bico de Bnsen, na Zona de segurana"; 7. Sempre que o utilizar o Bico de Bnsen, afastar produtos inflamveis e o microscpio da chama; 8. Faa o correto descarte do material utilizado na aula prtica: a. Algodo e papel: lixeira para material seco que est sobre a bancada b. Swabs, pipetas Pasteur, lminas: descarte com hipoclorito de sdio sobre a bancada c. Placas e tubos com crescimento de microrganismoa: colocar na bancada lateral 9. No final da aula prtica deve-se limpar novamente a bancada com lcool-iodado. 10. Colocar os bancos debaixo da bancada 11. Realizar a anti-sepsia das mos 3. PRINCIPAIS FERRAMENTAS MICROBIOLOGIA: 1. Alas de inoculao: a. De platina circular b. De platina em agulha 2. Placas de Petri 3. Tubos de ensaio: a. Tampa rosca b. Tampa de algodo 4. Pipeta graduada 5. Pipeta Pasteur 6. Lmina de vidro NO LABORATRIO DE
7. Bico de Bnsen
8. Microscpio ptico: visualizao de bactrias coradas pela colorao de GRAM
ROTEIRO 01 UBIQUIDADE DOS MICRORGANISMOS 1. INTRODUO O meio aqutico foi o provvel ambiente de origem dos microrganismos que, posteriormente, se especializaram e colonizaram o ambiente terrestre. Hoje, eles so encontrados por toda a parte, em suspenso ou assentados com poeira em vrias superfcies. Como os microrganismos esto presentes nas partculas de p, so passveis de entrar no organismo humano cada vez que se respira. Felizmente, em sua maioria, so incuos ou benficos, impedindo assim a colonizao da pele e mucosas por bactrias patognicas. No obstante, uma pequena parcela de microrganismos responsvel por importantes enfermidades humanas e em animais. As bactrias so microrganismos visualizados apenas com o uso do microscpio. Quando semeadas em meio slido, entretanto, cada bactria multiplica-se sucessivamente, formando colnias, que so populaes de centenas a milhares de bactrias geneticamente idnticas visveis a olho nu. As caractersticas morfolgicas das colnias so importantes para identificao bacterina. 2. OBJETIVO Verificar a presena da microbiota no corpo humano e microrganismos no ambiente. 3. MATERIAIS Duas placas de Petri com agar base/grupo; Trs placas de Petri com agar base para demonstrao da semeadura Dois swabs esterilizados (para coleta da pele ou mucosas e de superfcies); Ala de inoculao (para coleta de gua); Bico de Bunsen 4. PROCEDIMENTO 1. Desinfectar a bancada com lcool iodado; 2. Identificar as trs placas de agar base com o nmero do grupo e com a condio de inoculao (pele/mucosas e alguma superfcie); 3. Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 4. Com auxlio de um swab, tocar a garganta/ouvido externo/lngua/dentes/embaixo das unhas, etc e, em seguida, remover a tampa da placa (que deve estar na zona de segurana e espalh-lo suavemente na superfcie do gar); 5. Fechar a placa e deixar, invertida, na bandeja para ser incubada a 35C por 24 horas; 6. Friccionar um swab na bancada/sola do sapato/cho/paredes/, etc e, em seguida, remover a tampa da segunda placa e espalh-lo na superfcie do gar; 7. Fechar a placa e deixar invertida na bandeja e, a seguir, o bico de Bunsen e a vlvula de segurana;
8. Como demonstrao pela professora, ser aberta uma placa de Petri por 30 minutos para verificar presena de microrganismos no ar. Esta placa ser fechada e colocada a 35C por 24 horas; 9. Desinfectar a bancada com lcool iodado.
5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Observar a presena e a diversidade morfolgica das colnias microbianas que cresceram sobre a superfcie dos agar base, inoculados nas distintas condies. Caracterstica das colnias a serem observadas: Tamanho- O tamanho das colnias varia desde dimenses muito pequenas (puntiformes) at colnias muito grandes. Bordos- regulares ou irregulares Elevao- As colnias podem ser muito finas (achatadas) ou espessas (elevadas). Pigmentao- As colnias podem ser coradas (pigmentadas) ou no (nopigmentadas). Detalhes pticos- As colnias bacterianas podem ser opacas, translcidas ou opalescentes.
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008. TORTORA G.J. et al. MICROBIOLOGIA. 6 ed. Porto Alegre: ArtMed, 2000. VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
ROTEIRO 02 TCNICAS DE COLORAO E MICROSCOPIA 1. INTRODUO Os microrganismos em seu estado natural, transparncia e dimenses reduzidas, no so facilmente visveis. Para a sua observao so necessrios microscpios. O microscpio ptico de campo claro o mais utilizado para a visualizao de amostras biolgicas. No entanto, exige a utilizao de tcnicas de colorao. Precedendo a colorao propriamente dita, necessria a confeco de lminas com os microrganismos a serem analisados. Os microrganismos so, na maioria das vezes, colocados sobre a lmina de maneira concentrada, formando um esfregao que fixado pelo calor, evitando assim que as clulas sejam perdidas durante as coloraes e sucessivas lavagens. Os corantes so compostos orgnicos de estrutura complexa que possuem a propriedade de se ligar a determinada estrutura e conferir cor a mesma. COLORAO SIMPLES utiliza um nico corante para constatar a presena de microrganismos em amostras ou substratos. Pode ser POSITIVA, em que o corante, carregado positivamente, se liga s cargas negativas da superfcie celular e do material nuclico (ex. mtodo de Giemsa para protozorios); ou NEGATIVA, onde o corante repelido pela carga negativa da superfcie celular (ex. tinta nanquim para Cryptococcus neoformans). A lmina de vidro, sobre a qual est o material, ficar corada enquanto o microrganismo aparecer mais claro, como em um negativo fotogrfico. COLORAO DIFERENCIAL utiliza dois corantes contrastantes, gerando coloraes diferentes em grupos distintos de bactrias (exs. mtodo de Gram e ZiehlNeelsen). Tambm possibilita a visualizao de estruturas particulares de alguns grupos bacterianos, em que os corantes se ligam somente a determinadas pores de uma clula, facilitando sua identificao (ex. tcnica de Schaeffer-Fulton para colorao de endosporos). Colorao de Gram Mtodo de dupla colorao muito usado na sistemtica bacteriana. Alm das caractersticas morfolgicas, a tcnica permite evidenciar determinadas propriedades das bactrias, as quais so classificadas em gram-positivas e gram-negativas, de acordo com diferenas na composio e estrutura da parede celular. As bactrias gram-positivas possuem espessa camada em sua parede celular, composta por peptdeoglicano. Nas bactrias gram-negativas, o peptdeoglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual se encontra outra camada, denominada membrana externa. A colorao de Gram consiste, basicamente, em tratar bactrias, sucessivamente, com cristal violeta, lugol, lcool e fucsina/safranina. Os dois primeiros corantes penetram tanto nas bactrias gram-positivas quanto nas gramnegativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com lcool a etapa diferencial: nas gram-positivas o lcool no consegue retirar o complexo cristal violeta + lugol, pois a sua ao desidratante faz com que a espessa camada de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante. Nas gram-negativas, devido pequena espessura da camada peptdeoglicana, o complexo
corado extrado pelo lcool, deixando as clulas descoradas. O tratamento com FUCSINA/safranina (contracorante) no altera a cor roxa das bactrias gram-positivas, ao passo que as gram-negativas, descoradas pelo lcool, tornam-se avermelhadas.
2. OBJETIVOS Executar a tcnica e entender o fundamento da colorao de Gram; Identificar tipos morfolgicos das bactrias; Distinguir os grupos de bactrias: gram-positivas e gram-negativas.
3. MATERIAIS Lmina para microscopia; Lpis para vidro; Ala de inoculao; Tubo contendo soluo salina estril em estante; Cultura de bactrias (inoculadas na aula anterior de ubiquidade microbiana); Bico de Bunsen Bateria para colorao de Gram: cristal violeta, lugol, lcool-acetona e FUCSINA; Papel absorvente; Microscpio e leo de imerso.
4. PROCEDIMENTO Esfregao de cultura bacteriana 1) Desinfectar a bancada com lcool iodado; 2) Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 3) Identificar o lado da lmina onde ser feito o esfregao; 4) Flambar a ala de inoculao ao rubro e deixar esfriar, mantendo-a prxima chama; 5) Tomar o tubo com soluo salina estril com a mo esquerda e, com os dedos mnimo e anular da mo direita, remover o tampo de algodo da boca do tubo; 6) Flambar a boca do tubo; 7) Introduzir a ala no interior do tubo e retirar uma gota de salina, depositando-a sobre a lmina; 8) Flambar novamente a boca do tubo; 9) Fechar o tubo com o tampo de algodo e depositar na estante; 10) Flambar novamente a ala e deixar esfriar; 11) Retirar uma colnia da cultura de bactrias; 12) Levar a amostra at a gota de soluo salina depositada na lmina e homogeneizar, com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino; 13) Deixar o esfregao secar naturalmente, por alguns segundos, nas proximidades da chama; 14) Fixar o esfregao, passando a lmina na chama do bico, como que cortando a chama, por trs vezes, para que o material fique bem aderido; 15) Flambar a ala de inoculao no bico de Bunsen; 16) Fechar a vlvula de segurana; 17) Desinfectar a bancada com lcool iodado Tcnica de colorao de Gram 1) Colocar a lmina contendo o esfregao sobre um suporte na pia; 2) Cobrir a lmina com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto; 3) Desprezar o cristal violeta; 4) Cobrir a lmina com lugol e deixar agir por 1 minuto; 5) Lavar a lmina com jatos de gua corrente; 6) Cobrir a lmina com a soluo de lcool-acetona e deixar por ~ 15 segundos ou at que se observe a descolorao; 7) Cobrir a lmina com fucsina 30 segundos e novamente lave a lmina; 8) Secar o lado oposto ao do esfregao com papel filtro e depois pressionar, delicadamente, sobre o esfregao ou, se preferir, deixar a lmina secar a temperatura ambiente; 9) Observar, aps colocar uma gota de leo de imerso sobre a lmina, ao microscpio em objetiva de imerso.
APOSTILA DAS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA _______________________________________________________________________________ ________________________________________________ _______________________________
5. INTERPRETAO AO DOS RESULTADOS Bactrias gram-positivas: positivas: colorao roxa escura; Bactrias gram-negativas: negativas: avermelhadas/rosadas.
Morfologia das bactrias:
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. Microbiologia Atividades Prticas. 2 edio. So Paulo: Editora Santos, 2008. VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
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ROTEIRO 03: MEIOS DE CULTURA E TCNICAS DE SEMEADURA
1.INTRODUO As bactrias, para que possam crescer e se multiplicar artificialmente (in vitro), exigem determinadas substncias, como fontes de carbono (acares e protenas), fontes de nitrognio (peptonas) e fontes de energia para fazer a sntese de sua prpria matria nutritiva. Exigem tambm suprimento de alguns sais inorgnicos, de vitaminas e outros fatores acessrios de crescimento. Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial de bactrias e fornecem os princpios nutritivos indispensveis, assim como outras condies necessrias ao crescimento bacteriano (pH, presso osmtica, grau de umidade, ... ). Os primeiros meios de cultura utilizados foram lquidos at que, em 1880, Robert Koch introduziu os meios slidos (meios para culturas puras) em bacteriologia, adicionando agar (polissacardeo com finalidade nica de endurecer o meio) aos mesmos. Os meios de cultura, quanto consistncia, so classificados em: MEIOS LQUIDOS utilizados para o crescimento de microrganismos a partir de culturas puras, onde s observado um nico tipo de colnia bacteriana, para realizao de futuros testes de identificao ou outras finalidades; MEIOS SLIDOS EM TUBOS quando na forma de agar-inclinado geralmente objetiva o crescimento macio e a conservao de microrganismos. Quando em coluna-alta geralmente utilizado para semeadura em picada para testes bioqumicos; MEIOS SLIDOS EM PLACAS DE PETRI geralmente utilizados para a obteno de culturas puras, possibilitando o isolamento dos possveis microrganismos existentes em microbiotas/culturas mistas; MEIOS SEMI-SLIDOS EM TUBOS geralmente utilizados para verificar a mobilidade e observar a fermentao de carboidratos por determinados microrganismos. Os meios de cultura, quanto ao tipo, so classificados em: MEIOS SIMPLES possuem os compostos essenciais para o crescimento de microrganismos de poucas exigncias nutricionais. Ex. caldo simples; MEIOS ENRIQUECIDOS possuem substncias de enriquecimento, como sangue de animais, soro, ovo, extrato de fgado, de crebro e de soja, acrescidas aos meios simples. Favorecem o crescimento de determinado tipo de microrganismos, sem chegar a inibir totalmente o crescimento dos demais. Exs. agar chocolate (Neisseria gonorrhoeae) e caldo tetrationato (Salmonella sp); MEIOS SELETIVOS favorecem o crescimento de determinado tipo de microrganismos, inibindo a proliferao dos demais com adio de substncias inibidoras (antibiticos), variao de nutrientes, de pH, temperatura, presso osmtica, ... Sais biliares em altas concentraes (8,5%) inibem bactrias gram-positivas e esporuladas, azida sdica inibe o crescimento fngico e novobiocina inibe o crescimento de Proteus sp. Exs. agar MacConkey (BGN) e agar sal-manitol (Staphylococccus sp); MEIOS SELETIVOS-DIFERENCIAIS utilizados para o isolamento e a identificao presuntiva de bactrias, possibilitando a diferenciao de colnias desenvolvidas em uma mesma placa, por meio de colorao, morfologia ou colorao do
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meio ao redor das colnias. Ex. agar MacConkey (E. coli e Enterobacter aerogenes produzem colnias de colorao rosa, enquanto Proteus sp e Salmonella sp apresentam colnias incolores ou brancas) . Determinado microrganismo inicia seu desenvolvimento ao ser inoculado em um meio de cultura adequado ao seu crescimento in vitro. A inoculao correta da amostra um dos passos mais importantes na identificao de patgenos. Para tanto, existem tcnicas de semeadura, que variam de acordo com o tipo de meio de cultura e finalidade do cultivo. Algumas regras que devem sempre ser seguidas nas inoculaes: Esterilizar por flambagem, antes e aps qualquer cultivo, a agulha e/ou ala de inoculao. Deixar esfriar o instrumento antes de obter a amostra; Abrir tubos e/ou placas de inoculao somente na zona de segurana, prximo chama do bico de Bunsen; Evitar ao mximo que tampas de tubos e/ou placas fiquem sobre a bancada durante a semeadura; Evitar ao mximo a perfurao do agar, para que no ocorra acmulo de bactrias neste setor do meio, to pouco alterao nas condies de crescimento bacteriano.
I.TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO LQUIDO EM TUBO 1. Mergulhar a ala de inoculao, devidamente esterilizada, na cultura bacteriana fornecida, previamente homogeneizada, e coletar uma gota de suspenso; 2. Introduzir a ala, carregada de microrganismo, no interior do tubo com meio de cultura lquido estril, agitando delicadamente.
II. TCNICA DE SEMEADURA POR ESGOTAMENTO EM MEIO SLIDO EM TUBO (AGAR INCLINADO) 1. Mergulhar a agulha/ala de inoculao esterilizada na cultura bacteriana devidamente homogeneizada e coletar uma gota de suspenso; 2. Introduzir a agulha/ala, carregada de microrganismo, no interior do tubo, com meio slido estril, at encostar, levemente, a agulha/ala na poro mais baixa do plano inclinado; 3. Subir, fazendo estrias simples (movimentos de vaivm) na superfcie do agarinclinado.
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III. TCNICA DE SEMEADURA POR ESGOTAMENTO EM MEIO SLIDO EM PLACA DE PETRI 1. Dividir externamente o fundo da placa de Petri em trs partes, fazendo linhas com a caneta de retroprogetor; 2. Mergulhar a ala de inoculao, devidamente esterilizada, na cultura bacteriana fornecida, previamente homogeneizada, e coletar uma gota de suspenso; 3. Executar a tcnica de esgotamento em placa, que consiste em encostar a ala, carregada de microrganismo, sobre um ponto da superfcie do meio, na borda do 1/3 delimitado na placa. A seguir, iniciar semeadura em estrias nos 2/3 restantes, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material, para que se formem colnias perfeitamente isoladas.
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IV. TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SEMI-SLIDO EM TUBO POR PICADA PROFUNDA 1. Mergulhar a agulha de inoculao esterilizada na cultura bacteriana devidamente homogeneizada e coletar uma gota de suspenso; 2. Introduzir a agulha, carregada de microrganismo, no interior do tubo com meio semi-slido estril. A inoculao dever ter a profundidade de 2/3 do meio semislido ao qual se aplicar apenas uma picada.
2. OBJETIVOS Fornecer noes bsicas sobre meios de cultura e tcnicas de semeadura; Realizar inoculao bacteriana em meios de cultura slidos em placas; Observar o crescimento bacteriano nos distintos meios de cultura e descrever caractersticas morfolgicas e cor das colnias
3. MATERIAIS Cultura em meio lquido da bactria Escherichia coli; Cultura em meio lquido da bactria Staphylococcus epidermidis; Ala de inoculao; Bico de Bunsen; Caneta de retroprojetor; Uma placa contendo agar-base para semeadura em superfcie; Uma placa contendo agar-sangue para semeadura em superfcie; Uma placa contendo agar MacConkey para semeadura em superfcie
4. PROCEDIMENTO TCNICA DE SEMEADURA POR ESGOTAMENTO EM MEIO SLIDO EM PLACA DE PETRI 1) Desinfectar a bancada com lcool iodado;
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2) Dividir cada um dos trs meios com a ala esterilizada ainda quente e identificar o fundo das placas com o nmero do grupo. Do lado esquerdo de cada placa colocar o nome da bactria que ser semeada (E. coli); j do lado direito identificar com o nome da outra bactria que ser semeada (S. epidermidis); 3) Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 4) Flambar a ala de inoculao ao rubro e deixar esfriar, mantendo-a prxima chama; 5) Tomar o tubo contendo a cultura lquida de Escherichia coli com a mo esquerda e, com os dedos mnimo e anular da mo direita, remover a tampa; 6) Flambar a boca do tubo; 7) Introduzir a ala no interior do tubo e retirar uma gota da suspenso; 8) Flambar novamente a boca do tubo, recolocar a tampa e depositar na estante; 9) Abrir uma das trs placas prximo chama, depositar a gota sobre um ponto da superfcie esquerda do agar e executar a tcnica de esgotamento em placa, de acordo com III.3; 10) Fechar a placa e deix-la com a tampa para baixo; 11) Repetir com as outras duas placas os passos 4 - 10; 12) Flambar a ala de inoculao ao rubro e deixar esfriar, mantendo-a prxima chama; 13) Tomar o tubo contendo a cultura lquida de Staphylococcus epidermidis com a mo esquerda e, com os dedos mnimo e anular da mo direita, remover a tampa; 14) Flambar a boca do tubo; 15) Introduzir a ala no interior do tubo e retirar uma gota da suspenso; 16) Flambar novamente a boca do tubo, recolocar a tampa e depositar na estante; 17) Abrir uma das trs placas prximo chama, depositar a gota sobre um ponto da superfcie direita do agar e executar a tcnica de esgotamento em placa, de acordo com III.3; 18) Fechar a placa e deix-la com a tampa para baixo; 19) Repetir com as outras duas placas os passos 12 18; 20) Flambar a ala de inoculao no bico de Bunsen; 21) Fechar a vlvula de segurana; 22) Desinfectar a bancada com lcool iodado
5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Identificar as principais diferenas entre os meios de cultura; Classific-los quanto ao tipo.
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Agar-Base
Agar-Sangue
Agar-MacConkey
Agar Sal-Manitol
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. Microbiologia Atividades Prticas. 2 edio. So Paulo: Editora Santos, 2008. OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008. VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
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ROTEIRO 04 MTODOS QUIMICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO 1. INTRODUO Os compostos qumicos so muito utilizados para o controle e a preveno de infeces hospitalares, em situaes que impedem o uso de mtodos fsicos, principalmente o calor, no controle do crescimento microbiano, como em equipamentos mdicos termolbeis, superfcies, pisos e paredes de ambientes hospitalares e laboratrios clnicos, alm de tecidos vivos de profissionais da rea da sade e dos pacientes. II. MTODOS QUMICOS Substncias qumicas, de origem natural ou sinttica, podem ser usadas para eliminar ou inibir o crescimento microbiano. Promovem a descontaminao, desinfeco, anti-sepsia ou esterilizao, com maior efeito sobre as clulas vegetativas, por seu metabolismo ativo. A escolha de um agente qumico requer a anlise de diversos fatores, uma vez que suas propriedades so muito variadas e precisam ser levadas em considerao para uma determinada aplicao. Duas caractersticas esto inter-relacionadas: a concentrao da substncia e o tempo de contato com os microrganismos, pois quanto maior a concentrao do composto qumico, menor o tempo de contato necessrio. A resposta das clulas varia em relao a fatores tais como pH, temperatura, presena de atria orgnica, fase de multiplicao e mesmo presena de outro agente qumico. A resistncia aos agentes pode ser uma propriedade intrnseca ou adquirida por determinado microrganismo. As bactrias gram-negativas, normalmente, so mais resistentes aos mtodos qumicos do que as bactrias gram-positivas, pela presena da membrana externa, que limita ou impede a entrada de vrios compostos qumicos, principalmente os de estrutura hidrofbica. Os agentes qumicos, em relao aos microrganismos, podem apresentar: EFEITO ESTTICO (bacteriostatico, fungistatico e/ou virustatico) Inibio do crescimento. Em condies normais, o microrganismo volta a crescer. EFEITO MICROBICIDA (bactericida, fungicida e/ou viruscida) Morte do microrganismo. Certas substncias so ativas contra um grande nmero de espcies de microrganismos, sendo ento caracterizadas pelo amplo espectro de atividade, enquanto outras afetam poucas espcies. De forma geral, nenhum composto qumico igualmente eficaz contra todos os microrganimos (fig. 01).
DESINFETANTES
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Compostos qumicos capazes de eliminar ou minimizar, indiscriminadamente, os microrganismos de superficies e/ou de objetos inanimados, sem eliminar as formas esporuladas. A escolha do desinfetante qumico deve ser feita cuidadosamente, j que produtos utilizados para uma determinada finalidade podem no ser igualmente efetivos para outra. ANTI-SEPTICOS So os desinfetantes utilizados em tecidos vivos. A distino entre ambos se relaciona ao grau de toxicidade exercido sobre os tecidos evidentemente, uma molcula s poder ser usada como anti-sptico se o usurio for preservado de sua ao txica. Em geral, os desinfetantes so to agressivos a ponto de no poderem ser aplicados em tecidos vivos. Algumas vezes, a distino depende da concentrao do composto qumico (baixas concentraes: ao anti-sptica; altas concentraes
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METODOS DE DESINFECCAO De acordo com o risco de infeco envolvido no uso dos materiais/artigos que sero submetidos ao do agente qumico, a desinfeco pode ser subdividida em trs categorias: Desinfeco de alto nvel Empregada nos artigos classificados como criticos, utilizados em procedimentos invasivos. Glutaraldeido: atua selando ou fixando a membrana citoplasmtica, o que bloqueia a sada dos componentes celulares, destruindo o microrganismo. Tem amplo espectro e ao esporicida, promovendo uma desinfeco de alto nvel. Uso indicado: soluo a 2%, pH entre 7,5 8,5 por 30 minutos para objetos sensveis ao calor, como os equipamentos de anestesia gasosa, e para rpida desinfeco de itens reutilizveis, como cateteres, endoscpios de fibra ptica e equipamentos de aspirao. No indicado para a descontaminao de superfcies. Uso limitado pelos vapores irritantes, odor desagradvel e potencial carcinognico. Quando manipulado, exige a utilizao de EPI (Equipamentos de Proteo Individual).
Formaldeido: assim como o glutaraldedo, atua selando a membrana plasmtica, tem amplo espectro de ao (bactrias gram-positivas e gram-negativas, fungos, vrus, micobactrias e endosporos bacterianos) e promove a desinfeco de alto nvel de, por exemplo, capilares dos sistemas de dialisadores. Pode ser usado na forma slida (pastilhas formalina), como soluo alcolica a 8% ou aquosa a 10%, por 30 minutos. Uso limitado pelos vapores irritantes s membranas mucosas dos olhos, nariz, trato respiratrio e potencial carcinognico. Exige a utilizao de EPI. Desinfeco de nivel intermediario Empregada nos artigos classificados como semicriticos, que entram em contato com pele no intacta e/ou mucosas ntegras. Compostos clorados (hipoclorito, cloro e iodo): atuam inibindo reaes enzimticas, desnaturando protenas e inativando cidos nuclicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, permanncia de atividade residual, baixo custo e rpida ao. Uso limitado pela presena de matria orgnica, que inativa os compostos; so corrosivos para metais, irritantes, descolorantes, fotossensveis e volteis. Em hospitais, so indicados para a desinfeco de nvel intermedirio de artigos e superfcies e tambm para a descontaminao de superfcies. Pode se apresentar na forma lquida, como o hipoclorito de sdio, e na forma slida, hipoclorito de clcio, com tempo de exposio dos artigos de 10 minutos. Alcoois etilico e isopropilico: desnaturam protenas e desorganizam os lipdeos de membrana. Indicados para desinfeco de nvel intermedirio de artigos e uperfcies por um tempo de 10 minutos. Os lcoois na concentrao de 60 90% so excelentes bactericidas, principalmente para as formas vegetativas. Atuam tambm sobre clulas de Mycobacterium tuberculosis, alguns fungos e vrus lipoflicos Incompatveis com
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acrlicos, borrachas e tubos plsticos, podendo danificar o cimento das lentes de equipamentos pticos. Inflamveis, devem ser guardados em reas ventiladas. O lcool etlico possui maior ao germicida, menores custo e toxicidade do que o isoproplico que, por sua vez, tem maior ao para vrus hidroflicos. Fenois e derivados fenolicos: desnaturam protenas. Os derivados fenlicos possuem alteraes na estrutura do fenol que aumentam a ao antimicrobiana e diminuem a toxicidade. O fenol mais usado para desinfeco de nvel intermedirio de superfcies, artigos metlicos, de vidro e culturas a serem descartadas. Para superfcies recomenda-se a exposio por 10 minutos e para artigos, 30 minutos. Dependendo da concentrao, pode ter diferentes nveis de ao: Fenol 0,5 1%: ao anti-sptica; Fenol 5% - desinfetante Iodoforos: por seu alto poder de penetrao na parede celular, atuam rompendo protenas. Tem ao contra clulas vegetativas, endosporos, vrios fungos e alguns vrus. Usados para a desinfeco em concentraes entre 30 e 50 ppm (partculas por milho) por, aproximadamente, 10 minutos. Em concentraes menores, atuam como antispticos. No mancham e so menos irritantes que o iodo. No recomendados para metais, como cromo, ferro e alumnio, que no resistem oxidao. Desinfeco de baixo nivel Empregada nos artigos nao-criticos, que entram em contato superficial com pele ntegra ou no entram em contato direto com o paciente. Alcoois Compostos clorados Compostos fenolicos: em concentraes menores que 5%. Iodoforos: em concentraes menores que 30 ppm. Compostos de amonio quaternario: inativam enzimas, desnaturam protenas essenciais e rompem a membrana celular. Desinfetantes de baixa toxicidade, classificados com atividade de baixo nvel. Mais efetivos contra bactrias grampositivas do que gram-negativas. Ativos contra alguns fungos e vrus no-lipdicos, no apresentando ao letal para micobactrias e endosporos. Indicados para a desinfeco de pisos, paredes e superfcies hospitalares por um tempo de, no mnimo, 10 minutos, a 0,4 0,6%. Esses compostos, em solues concentradas, podem causar efeitos txicos por todas as vias de exposio, levando a queimaduras na pele e mucosas. Exposies em concentraes diludas no provocam irritaes. Clorexidina: atua lesando a membrana citoplasmtica, sendo eficaz contra formas vegetativas, fungos e vrus com envelope lipdico, mesmo na presena de matria orgnica. No ativa contra esporos. Muito usada no controle da densidade microbiana na pele e mucosas (anti-sepsia). Combinada com detergente ou lcool, tambm usada
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para a escovao cirrgica das mos e na preparao pr-operatria de pacientes. Possui baixa toxicidade.
APLICAO DO PROCESSO QUMICO NA HIGIENIZAO DAS MOS EM SERVIOS DE SADE 1. INTRODUO A exemplo da Aliana Mundial para a Segurana do Paciente, iniciativa da Organizao Mundial da Sade (OMS) firmada com vrios pases desde 2004, atualmente programas que enfocam a segurana no cuidado do paciente nos servios de sade tratam como prioridade o tema higienizao das mos. Embora a higienizao das mos seja a medida mais importante e reconhecida h muitos anos na preveno e controle das infeces nos servios de sade, coloc-la em prtica consiste em uma tarefa complexa e difcil. Estudos sobre o tema avaliam que a adeso dos profissionais prtica da higienizao das mos de forma constante e na rotina ainda insuficiente. Dessa forma, necessria uma especial ateno de gestores pblicos, administradores dos servios de sade e educadores para o incentivo e a sensibilizao do profissional de sade questo. 2. CONCEITO A higienizao das mos a medida individual mais simples e menos dispendiosa para prevenir a propagao das infeces relacionadas assistncia sade. As mos constituem a principal via de transmisso de microrganismos durante a assistncia prestada aos pacientes, pois a pele um possvel reservatrio de diversos microrganismos, que podem se transferir de uma superfcie para outra, por meio de contato direto (pele com pele), ou indireto, atravs do contato com objetos e superfcies contaminadas. 3. OBJETIVOS Remoo de sujidade, suor, oleosidade, clulas descamativas e da microbiota da pele, interrompendo a transmisso de infeces veiculadas ao contato; Preveno e reduo das infeces causadas pelas transmisses cruzadas. 4. TCNICAS As tcnicas de higienizao das mos podem variar, dependendo do objetivo ao qual se destinam. Englobam: Higienizao simples; Higienizao anti-sptica; Frico de anti-sptico nas mos; Anti-sepsia cirrgica ou preparo pr-operatrio das mos.
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A eficcia da higienizao das mos depende da durao e da tcnica empregada. IMPORTANTE: antes de iniciar qualquer uma dessas tcnicas, necessrio retirar acessrios pessoais (anis, pulseiras, relgio), pois sob tais objetos podem se acumular microrganismos. 4.1. HIGIENIZAO SIMPLES Finalidade: remover os microrganismos que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como o suor, a oleosidade e as clulas mortas, retirando a sujidade (ao detergente) propcia a permanncia e a proliferao de microrganismos. Durao do procedimento: 40 a 60 segundos Procedimento:
IMPORTANTE
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No caso de torneiras com contato manual para fechamento, sempre utilize papel toalha; O uso coletivo de toalhas de tecido contra-indicado, pois estas permanecem midas, favorecendo a proliferao bacteriana; Deve-se evitar gua muito quente ou muito fria na higienizao das mos, a fim de prevenir o ressecamento da pele 4.2. HIGIENIZAO ANTI-SPTICA Finalidade: remover sujidade e microrganismos, reduzindo a carga microbiana das mos, com auxlio de um anti-sptico degermante (produto que associa a ao detergente e anti-sptica). Durao do procedimento: 40 a 60 segundos. Procedimento: igual ao procedimento de higienizao simples, substituindo-se o sabo por um anti-sptico degermante. Ex.: clorexidina degermante a 4%. 4.3. FRICO ANTI-SPTICA COM PREPARAES ALCOLICAS Finalidade: reduzir a carga microbiana (nmero de microrganismos viveis) nas mos, sem remoo de sujidades. Durao do procedimento: 20 a 30 segundos. Procedimento: assemelha-se ao procedimento de higienizao simples (passos figuras 2 9), substituindo o sabo por um desinfectante. A utilizao de lcool gel a 70%, por exemplo, pode substituir a higienizao com gua e sabo quando as mos no estiverem visivelmente sujas.
IMPORTANTE Para evitar ressecamento e dermatites, no higienize as mos com gua e sabo imediatamente antes ou depois de usar uma preparao alcolica; Depois de higienizar as mos com preparao alcolica, deixe que elas sequem completamente (sem utilizao de papel-toalha). 4.4. ANTI-SEPSIA CIRRGICA OU PREPARO PR-OPERATRIO Finalidade: eliminar a microbiota transitria da pele e reduzir a microbiota residente, alm de proporcionar efeito residual (efeito antimicrobiano prolongado que previne ou inibe a proliferao ou sobrevida de microrganismo) na pele do profissional. Durao do procedimento: trs a cinco minutos para a primeira cirurgia e dois a trs minutos para as cirurgias subseqentes. 5. OUTROS ASPECTOS DA HIGIENIZAO DAS MOS Manter as unhas naturais, limpas e curtas; No usar unhas postias quando em contato direto com o paciente; Evitar anis, pulseiras e outros adornos quando assistir ao paciente; Aplicar creme hidratante nas mos diariamente, para evitar o ressecamento da pele 6. PRTICA
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6.1. OBJETIVO Verificar a presena de microrganismos nas digitais, antes da higienizao das mos; Verificar a efetividade da tcnica de higienizao empregada (higienizao simples ou anti-sptica). 6.2. MATERIAIS Duas placas de agar base/grupo; Sabonete lquido Detergente; Anti-sptico degermante (clorexidina); lcool 70% lcool iodado Papel toalha estril Bico de Bunsen 6.3. PROCEDIMENTO 1) Identificar as duas placas de agar base com o nmero do grupo em ambas e com a letras A (ANTES HIGIENIZAO) em uma delas e letra B (DEPOIS HIGIENIZAO) na outra; Dividir a placa em cinco espaos e identificar cada dedo que ser pressionado 2) Na placa A (zona de segurana do bico de Bunsen), colocar a impresses digital dos componentes do grupo, antes da higienizao das mos; 3) Aplicar a tcnica de higienizao das mos a todos os componentes com sabonete lquido, anti-sptico ou preparao alcolica; 4) Na placa B (zona de segurana do bico de Bunsen), colocar as digitais dos componentes do grupo, aps a higienizao: Grupo 1: somente lavagem com gua e secar com papel estril Grupo 2: lavagem com gua e sabonete e secar com papel estril Grupo 3: lavagem com gua, sabonete e escovao e secar com papel estril Grupo 4: lavagem com gua e clorexidine degermante e secar com papel estril Grupo 5: lavagem com gua, secar com papel toalha estril e colocar lcool 70 nas mos Grupo 6: lavagem com gua, secar com papel toalha estril e colocar lcool iodado nas mos 5) Colocar as placas, devidamente identificadas e invertidas, na bandeja para serem incubadas a 35C por 24 horas; 6) Fechar o bico de Bunsen e a vlvula de segurana; 7) Desinfectar a bancada com lcool iodado
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6.4. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Quantificar o nmero de colnias antes e depois do processo de lavagem: Antes Depois G.1 gua G.2 sabonete G.3 sabonete e escovao G.4 clorexidine G.5 lcool 70 G.6 lcool iodado ESPECTRO DE AO DE AGENTES ANTI-SPTICOS Espectro antimicrobiano e caractersticas de agentes anti-spticos utilizados para higienizao das mos.
GRUPO BGP BGN MICOBAC TRIAS FUNGOS VRUS VELOCID ADE DE AO COMENTRIO
LCOOIS CLOREXIDI NA 2/4%
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+++
+++
+++
+++
Rpida. Interme diria.
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++
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COMPOSTOS DE IODO
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+++
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++
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Interme diria.
TRICLOSAN
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++
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Interme diria.
[tima] 70%. No apresenta efeito residual. Efeito residual. Raras reaes alrgicas. Efeito residual. Irritantes na higienizao anti-sptica das mos. Pode causar queimadura. Aceitabilidade varivel para as mos.
BGP: BACTRIAS GRAM POSITIVAS. BGN: BACTRIAS GRAM NEGATIVAS. +++ EXCELENTE ++ BOM ++ REGULAR - NENHUMA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA/INSUFICIENTE
FONTE: adaptada de CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Guideline for hand hygiene in healthcare settings: recommendations of Healthcare Infection
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Control Practices Advisory Committee and HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. MMWR
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS http:// www.anvisa.gov.br OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008. VERMELHO A.B. et al. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
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ROTEIRO 05 MTODOS FSICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO 1. INTRODUO Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes qumicos ou fsicos, os quais atuam eliminando totalmente os microrganismos ou impedindo o seu crescimento, criando condies nas quais eles no possam se reproduzir. O controle do crescimento microbiano muito importante, e necessrio, nas reas de Cincias da Sade, prevenindo as infeces hospitalares. Em laboratrios de pesquisa e de anlises clnicas os mtodos de controle do crescimento esto presentes no preparo de meios de cultura e esterilizao de vidrarias, como pipetas, placas de Petri, ponteiras e vrios outros materiais. I. MTODOS FSICOS Promovem descontaminao, desinfeco e esterilizao. Os mtodos freqentemente empregados para atingir esses objetivos usam os seguintes princpios: CALOR(MIDO E SECO); BAIXAS TEMPERATURAS; FILTRAO E RADIAO.
CALOR O mais antigo e conhecido agente de destruio de microorganismos o calor, mtodo de eleio por ser seguro, de baixo custo e no formar produtos txicos. O efeito do calor mido, produzindo morte trmica dos microorganismos, dado pela desnaturao das protenas celulares, principalmente as enzimas. J o calor seco causa oxidao dos constituintes orgnicos das clulas. O calor mido, na forma de vapor, tem maior poder de penetrao e elimina as formas vegetativas dos procariotos, vrus, fungos e seus esporos. Todos os microrganismos so sensveis ao calor, no entanto, os endosporos bacterianos so mais resistentes, devido as caractersticas peculiares na sua estrutura bastante desidratada, com 10-30% de gua no protoplasma, em contraste com as clulas vegetativas que possuem 70%. Esse baixo teor de gua reduz tambm a quantidade de gua associada a protenas do core, estabilizando-as e evitando a desnaturao trmica. Portanto, para os endosporos serem destrudos so necessrias temperaturas acima de 100C, com tempos variveis, dependendo da espcie procariota. As formas vegetativas das bactrias so mais facilmente eliminadas, com temperaturas entre 60-70C. Os esporos de fungos, formas de reproduo e de disperso das espcies, tambm podem ser eliminados em temperaturas que variam de 60-70C. J as formas vegetativas dos fungos so destrudas na faixa de 50-60C. Mtodos que empregam o CALOR MIDO
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Autoclave: equipamento que emprega o vapor de gua sob presso, produzindo a temperatura mnima de 121C. Quanto maior a presso da autoclave, geralmente de 1 atmosfera (atm) acima da presso do nvel do mar, maior ser a temperatura. O mtodo destri as formas vegetativas e esporuladas de procariotos e fungos, promovendo a esterilizao. Meios de cultura, soluo fisiolgica e demais solues, vidrarias e outros matrias termorresistentes podem ser esterilizados pelo mtodo. O monitoramento peridico de ciclos de esterilizao por calor mido, em autoclaves, utiliza um indicador biolgico de alta resistncia trmica, o Bacillus stearothermophylus ATTC* 7953 (121C-1 minuto e meio), organismo gram-positivo esporulado no patognico. gua em ebulio: o vapor de gua livre (100C-20 minutos). Destri formas vegetativas e alguns endosporos, dependendo da espcie bacteriana. No um mtodo de esterilizao, apenas permite o controle de crescimento microbiano. A fervura a 100C pode at destruir os endosporos bacterianos, mas o tempo necessrio para tanto, dependendo da espcie, pode chegar at 6 horas, inviabilizando uso do mtodo na maioria das vezes. Atualmente, usa-se gua em ebulio na limpeza de alguns instrumentos e no preparo de alimentos, como uma forma de garantir a eliminao de clulas vegetativas. Mtodos que empregam o CALOR SECO Estufas e fornos: tm menor poder de penetrao do que o calor mido e usam temperaturas e tempos maiores. A ausncia de umidade torna o processo menos eficiente e demorado. Na literatura so citados diferentes temperaturas e tempo necessrios para a esterilizao em estufas e fornos. O Ministrio da Sade recomenda o uso destes equipamentos para artigos e materiais que no podem ser autoclavados, como vidros e utenslios (170C-60 minutos), leos e ps (160C-120 minutos), caixas de instrumentos cirrgicos e metais (150C-150 minutos). O calor seco no corrosivo para objetos metlicos afilados e no desgasta a superfcie dos vidros. O monitoramento peridico de ciclos de esterilizao por calor mido, em autoclaves, utiliza um indicador biolgico de alta resistncia trmica, o Bacillus subtilis/atrophaeus ATTC 9372 (121C-60 minutos ou 170C-1 minuto), organismo gram-positivo esporulado no patognico. Flambagem: promove a combusto completa dos microrganismos em alas e agulhas microbiolgicas atravs do aquecimento, diretamente na chama do bico de Bunsen, at ficarem rubras ou incandescentes.
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BAIXAS TEMPERATURAS Mtodo de controle microbiano por diminuio na taxa de crescimento e na atividade enzimtica. Pode no causar a morte celular. Os microorganismos patognicos so, na maioria, mesfilos e no crescem a 5C, embora existam excees, como certas cepas de Clostridium botulinum. Mtodos que empregam BAIXAS TEMPERATURAS Refrigerao: tem efeito bacteriosttico. Nos refrigeradores comuns (0-7C) a taxa metablica da maioria dos microrganismos to reduzida a ponto no poderem se reproduzir. No entanto, microorganismos psicrfilos, como a bactria Pseudomonas sp, crescem lentamente em baixas temperaturas, alterando o sabor dos alimentos aps algum tempo. Usada para a preservao de alimentos durante perodo limitado de tempo. Congelamento: tem tambm efeito bacteriosttico. As temperaturas abaixo do congelamento obtidas rapidamente tendem a tornar os microrganismos dormentes, mas no necessariamente os matam. Usado na preservao de alimentos.
FILTRAO O princpio da filtrao no envolve a eliminao de microrganismos, e sim sua separao fsica dos componentes de determinada soluo ou do ar atravs da reteno em um filtro, com poros pequenos o suficiente para impedir a passagem de microrganismos e grandes para facilitar a passagem de lquido ou gases. Os filtros mais utilizados so os de celulose (membrana filtrante de 150m), seguidos pelos de amianto e teflon. O mtodo empregado em solues que contem componentes termolabeis e no podem ser autoclavados, solues de enzimas, vitaminas, insulina e antibiticos. A filtrao tambm recomendado na descontaminao do ar em fluxos laminares e sistemas de ventilao nos quais o controle biolgico de suma importncia, como salas de cirurgias, enfermarias de tuberculosos e unidades de queimados. Os fluxos laminares so cabines usadas em laboratrios, criando uma rea de trabalho estril que impede a contaminao por microrganismos do ambiente durante a manipulao de materiais, assim como o escape de microrganismos sob o cultivo para meio ambiente. Para tanto, o ar passado em filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) que removem todos os microrganismos maiores que 0,3m. RADIAO Mtodo utilizado para reduzir ou eliminar os microrganismos. Existem vrios tipos de radiaes eletromagnticas, como raios-X, ultravioleta (UV), feixe de eltrons e microondas. A radiao UV mutagnica, levando a formao de dmeros de timina, que impedem a ao da enzima DNA polimerase. Tem ao microbicida, mas baixo poder de penetrao, sendo seu uso recomendado apenas em superfcies. Eficaz na inativao dos vrus, muito embora, perca sua eficincia em presena de matria orgnica.
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2. OBJETIVOS Testar diferentes mtodos fsicos de controle do crescimento bacteriano: calor mido e radiao ultravioleta, verificar a diferena de ao dos agentes fsicos utilizados no experimento prtico e na demonstrao. Apresentar os seguintes procedimentos: filtro HEPA, auto-clave, filtro 0,22um 3. MATERIAIS/GRUPO Ao do calor mido Trs tubos de ensaio com caldo nutritivo estril com Escherichia coli e mais quatro com Bacillus subtilis; 1 placas de Petri com agar base por grupo 3 placas de Petri com agar base por turma Estante; Ala de platina Caneta de retroprojetor; Bico de Bunsen; Banho-Maria; Cronmetro
4. PROCEDIMENTOS Ao do calor mido nas bactrias 1) Desinfectar a bancada com lcool iodado; 2) Identificar os trs tubos com o nome da bactria recebida em caldo nutritivo (E.coli ou B.subtilis) e numer-los de 1 a 3; 3) Colocar os tubos 2 e 3 no banho-maria a 100 C 4) Dividir a placa de Petri em trs parties e identific-las com C, 5 e 20 e colocar o nome da bactria; 5) Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 6) Com a ala de platina semear uma gota do tubo 1 na partio C (controle) da placa; 7) Repetir o processo com o tubo 2 aps 5 minutos de fervura e com o tubo trs aps 20 minutos de fervura. 8) Incubar a placa na estufa a 37C, por 24-48 horas; 9) Desinfectar a bancada com lcool iodado.
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Ao da U.V. 1) Dividir a placa de Petri ao meio e identificar de um lado com U.V. e no outro sem U.V. 2) Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 3) Homogeneizar a cultura em caldo de E.coli ou B. subtilis; 4) Aps a retirada da tampa, flambar a boca do tubo com a cultura bacteriana; 5) Com a ala de platina semear uma gota do tubo em zigue-zague por toda placa; 6) Fechar a vlvula de segurana; 7) Levar a placa at a capela com lmpada U.V.; 8) Abrir totalmente a placa e colocar uma folha de papel que tape somente o lado sem U.V.; 9) Ligar a lmpada e deixar incidindo a luz sobre a placa por 30 min; 10) Fechar a placa e deixar na estufa a 37C, por 24 48 horas; 5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Verificar a eficcia dos diferentes mtodos de controle do crescimento empregados sobre os microrganismos propostos. Banho-maria: E.coli Controle 5 min 20 min Radiao U.V.: E.coli Com U.V. Sem U.V. B.subtilis B.subtilis
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. Microbiologia Atividades Prticas. 2 edio. So Paulo: Editora Santos, 2008 OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008 VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006
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ROTEIRO 06: IDENTIFICAO DE ESTAFILOCOCOS 1. INTRODUO Os estafilococos foram isolados e descritos pela primeira vez em 1878, por Robert Koch, em secrees purulentas provenientes de humanos. Em 1880, Louis Pasteur cultivou o organismo em meio lquido. Alexander Ogston, em 1881, demonstrou sua patogenicidade em camundongos, adotando o nome do gnero da palavra grega staphylo, que significa cacho de uvas. Em 1884, Rosenbach caracterizou o gnero com duas espcies: aureus e albus, relacionando-as a presena de pigmentos. Atualmente, segundo Euzeby (2009) httt://www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html, existe citao de 41 espcies e destas, 16 so encontradas em humanos, podendo provocar diferentes sndromes clnicas, como infeces cutneas, oportunistas, das vias urinrias e sistmicas. Dentre todas as espcies, aureus a mais virulenta. O S. epidermidis tambm um importante patgeno causador de infeces, principalmente correlacionadas com prteses cardacas valvulares. J o S. saprophyticus patgeno, quase que exclusivo, das vias urinrias. Gnero Staphylococcus Os estafilococos apresentam-se como clulas esfricas de 0,5 1,5 m de dimetro, isoladas em arranjos individuais, aos pares e em agrupamentos irregulares. So grampositivos, imveis, no-esporulados, aerbicos ou anaerbicos facultativos e, geralmente, produtores da enzima catalase. Suas colnias, em meio slido, so lisas, brilhantes, circulares e translcidas. O S. aureus, e algumas outras espcies, formam colnias amareladas, acinzentadas ou alaranjadas, devido presena de grande antidade de pigmentos carotenides, localizados na membrana celular. O S. epidermidis forma colnias brancas, devido pequena quantidade de carotenides em sua membrana. Em Agar sangue, o S. aureus geralmente produz hemlise. Outras espcies tm comportamento varivel. Crescem dentro de larga faixa de temperatura (10 - 45C), o que os torna, dentre as bactrias no esporuladas, as mais resistentes. A maioria das espcies relativamente termoestvel, suportando temperaturas de at 60C por meia hora. Portanto, so mais resistentes a desinfetantes comuns que a maioria das bactrias. Muito resistentes ao NaCl, apresentam crescimento em concentraes salinas de 0 20%. Atualmente, a maioria das cepas de estafilococos isoladas de pacientes hospitalizados resistente a penicilina e vrios outros antibiticos. Exame Bacterioscpico A partir da amostra/material clnico so feitos esfregaos, corados pelo mtodo de gram, onde geralmente aparecem cocos isolados e em pequenos grupos, de localizao intra e extra-celular. A maioria desses cocos gram positiva, mas os microrganismos mortos ou lisados aparecem como gram negativos. A presena em abundncia de neutrfilos indicativa de processo infeccioso. Exame Bacteriolgico
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A amostra clnica semeada, geralmente em agar sangue, e incubada a 37C (temperatura tima de crescimento) entre 18 e 24 horas. Aps o perodo, observa-se o crescimento de colnias tpicas: lisas, brilhantes, circulares e translcidas; amareladas/acinzentadas/alaranjadas; hemlise varivel. Recomenda-se o exame bacterioscpico das colnias suspeitas para confirmao morfolgica. O uso de meio de cultura seletivo, como o agar salgado (7,5% de NaCl), inibe o crescimento de bactrias sensveis a altas concentraes salinas. Teste da Enzima Catalase FUNDAMENTO: verificar a presena da enzima catalase. Usado para a diferenciao entre estafilococos e estreptococos. A catalase decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em oxignio e gua. O perxido de hidrognio forma-se como um dos produtos finais do metabolismo oxidativo ou aerbico dos carboidratos. Se acumulado na clula, pode ser letal para a bactria.
(formao de BOLHAS DE GS)
INTERPRETAO: catalase positiva _ estafilococos, micrococos e estomatococos; catalase negativa _ estreptococos
Teste da Enzima Coagulase FUNDAMENTO: verificar a capacidade de um microrganismo coagular o plasma, atravs da enzima coagulase. Usado para a identificao de estafilococos coagulasepositiva (fator de virulncia). A coagulase estafiloccica est presente em duas formas: ligada e livre. A coagulase ligada (fator de aglutinao) detectada em lmina para microscopia, convertendo o fribrinognio em fibrina (AGLUTINAO) diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao. J o teste da coagulase livre (prova em tubo padro ouro do teste) reage com os fatores de coagulao do plasma, formando uma substancia semelhante trombina, que age indiretamente, convertendo fibrinognio em fibrina (formao de COGULO). INTERPRETAO: coagulase positiva _ Staphylococcus aureus; coagulase negativa _ Staphylococcus saprophyticus e S. epidermidis
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2. OBJETIVOS Demonstrar os passos necessrios para isolamento e caracterizao de microrganismos; Reconhecer as caractersticas morfolgicas, tintoriais e bioqumicas do gnero Staphylococcus.
3. MATERIAIS/GRUPO Cultura em agar base inclinado da bactria Staphylococcus aureus; Cultura em meio lquido da bactria Escherichia coli (controle-negativo); Estante e caneta de retroprogetor; Placa de agar sangue; Ala de inoculao; Lminas; Pipetas Pasteur; Tubo com gua oxigenada 3%; Tubo com 0,5 ml de plasma humano; Bateria para colorao de Gram: cristal violeta, lugol, lcool-acetona e fucsina; Papel absorvente; Microscpio e leo de imerso
4. PROCEDIMENTOS PRIMEIRA AULA 1) Desinfectar a bancada com lcool iodado; 2) Identificar o fundo da placa com o nmero do grupo; 3) Abrir a vlvula de segurana e acender a chama do bico de Bunsen; 4) Flambar a ala de inoculao e a boca do tubo com agar inclinado; 5) Semear, por ESGOTAMENTO, a bactria Staphylococcus aureus em agar sangue. Realizar a tcnica de stab para melhor observao da hemlise; 6) Marcar o verso de uma das lminas com dois crculos; 7) Pingar em cada crculo uma gota de gua oxigenada; 8) Flambar a ala e a boca do tubo com agar inclinado; 9) Retirar uma alada de S. aureus do agar; 10) Depositar sobre um dos crculos e observar em poucos segundos a reao; 11) Repetir o procedimento com a cultura lquida da bactria E. coli (controle-negativo); 12) Depositar sobre outra lmina, com o auxlio da ala, duas gotas de gua; 13) Emulsionar sobre a gua, delicadamente, uma alada da bactria S. aureus; 14) Pingar uma gota de plasma na suspenso; 15) Agitar a lmina, com movimentos para frente e para trs, e observar em 15 segundos; 16) Repetir o procedimento com a cultura lquida da bactria E. coli (controle-negativo); 17) Flambar a ala, fechar a vlvula de segurana do bico e desinfectar a bancada com lcool iodado Incubar a placa por 24 horas a 37C em posio invertida (tampa para baixo).
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5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS CATALASE POSITIVA formao de BOLHAS DE GS S. aureus; NEGATIVA no formao de BOLHAS DE GS E. coli COAGULASE LIGADA POSITIVA formao de PRECIPITADO BRANCO (AGLUTINAO) NEGATIVA sem aglutinao E. coli 6. PROCEDIMENTOS SEGUNDA AULA 1) Observar a morfologia e a hemlise das colnias de S. aureus em agar sangue, semeado na aula anterior; 2) Desinfectar a bancada e abrir a vlvula do bico; 3) Fazer o esfregao em lmina de uma colnia bacteriana isolada com auxlio de gotas de gua destilada. Cuidar para que o esfregao no fique muito concentrado; 4) Deixar secar naturalmente por alguns segundos, prximo a chama do bico; 5) Fixar a lmina como que cortando a chama, por trs vezes, para que o material fique bem aderido; 6) Corar pela tcnica de gram Tcnica de colorao de gram Colocar a lmina contendo o esfregao sobre um suporte na pia; Cobrir a lmina com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto; Lavar a lmina em jato fraco de gua corrente; Cobrir a lmina com lugol e deixar agir por 1 minuto; Lavar novamente a lmina; Cobrir a lmina com a soluo de lcool-acetona e deixar por ~ 15 segundos ou at que se observe a descolorao; Cobrir a lmina com fucsina 20 segundos e novamente lave a lmina; Secar o lado oposto ao do esfregao com papel filtro e depois pressionar, delicadamente, sobre o esfregao ou, se preferir, deixar a lmina secar a temperatura ambiente; Observar, aps colocar uma gota de leo de imerso sobre a lmina, ao microscpio em objetiva de imerso
S. aureus;
7. INTERPRETAO RESULTADOS Observar as caractersticas morfolgicas das colnias semeadas em agar sangue na aula passada: tamanho, forma, cor, consistncia, densidade e odor (caractersticas comuns espcie aureus); Observar caractersticas morfotintoriais no exame bacterioscpico das colnias isoladas.
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8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. MICROBIOLOGIA Atividades Prticas. So Paulo: Santos, 2 edio, 2008; OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008; VERMELHO A.B. et al. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
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ROTEIRO 07 DIAGNSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE 1. INTRODUO O diagnstico laboratorial da tuberculose rotineiramente realizado atravs da microscopia, por seu baixo custo e facilidade de execuo. A metodologia apresenta um rendimento entre 50 e 80% para os casos de tuberculose pulmonar (II Consenso Brasileiro de Tuberculose, 2004). Amostras extra-pulmonares apresentam percentuais inferiores aos das amostras pulmonares, diminuindo a sensibilidade do exame microscpico para aproximadamente 30%. As bactrias do gnero Mycobacterium, dentre as quais est o bacilo da tuberculose Mycobacterium tuberculosis, possuem notvel caracterstica: dificilmente coram-se pelos corantes bsicos de anilina, mas, uma vez coradas, fixam-se de tal forma que no se descoram pela ao diferenciadora do lcool e dos cidos minerais fortes diludos. Essa propriedade, que se conhece por lcool-cido resistncia, permitiu aos pesquisadores Ziehl e Neelsen idealizarem um mtodo de colorao que , hoje em dia, de uso corrente na prtica. A colorao para bacilo lcool-cido resistente (colorao de BAAR) um dos mais importantes recursos empregados no diagnstico da tuberculose. Colorao de Resistncia ao lcool-cido Mtodo de Ziehl-Neelsen
As micobactrias dificilmente adquirem coloraes convencionais, como o mtodo de gram, necessitando de coloraes especiais. Isto, porque a parede celular dessas bactrias possui uma espessa camada lipdica (cido miclico), evitando a penetrao de diversos corantes. Em contrapartida, quando o corante penetra, a uma temperatura elevada, e alcana o citoplasma da clula, no pode ser removido, mesmo com o uso de agentes descorantes (mistura lcool-cido). A clula que permanece corada, aps a mistura ter sido aplicada, denominada lcool-cido resistente, enquanto aquelas que se descoram, por no possurem a mesma composio de parede, so denominadas lcool-cido sensveis. O mtodo de Ziehl-Neelsen compreende as seguintes fases: 1. colorao inicial com fucsina fenicada aquecida, at a emisso de vapores; 2. descolorao seletiva com soluo diluda de lcool-cido; 3. colorao de fundo com o corante contraste azul de metileno, facilitando a observao microscpica ao oferecer um fundo que contrasta com os microrganismos vermelhos, lcool-cido resistentes.
2. OBJETIVOS Apresentar a tcnica de colorao para bacilo lcool-cido resistente (mtodo de Ziehl-Neelsen); Visualizar Mycobacterium tuberculosis ao microscpio ptico, em objetiva de imerso.
3. MATERIAIS
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Esfregao preparado de ESCARRO de paciente com tuberculose, j fixado e corado por Ziehl-Neelsen; Microscpio ptico e leo de imerso 4. PROCEDIMENTO BACILOSCOPIA
Observar ao microscpio ptico, em objetiva de imerso, o esfregao previamente fixado e corado. Correr exaustivamente os campos at encontrar bacilos isolados, em grupos (globias) e/ou fragmentados, corados em vermelho.
5. CRITRIOS PARA A LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS DA BACILOSCOPIA, PADRONIZADOS PARA O MTODO ZIELH-NEELSEN PELA OMS Em amostras de ESCARRO, quando: no so encontrados BAAR em 100 campos microscpicos resultado NEGATIVO; so encontrados de 1 9 BAAR em 100 campos resultado encontrado (quantidade de BAAR encontrada); so encontrados de 10 99 BAAR em 100 campos POSITIVO +; so encontrados de 1 10 BAAR/campo em 50 campos observados POSITIVO ++; so encontrados, em mdia, mais de 10 BAAR/campo em 20 campos observados POSITIVO +++
6.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. MICROBIOLOGIA Atividades Prticas. So Paulo: Santos, 2 edio, 2008; VERMELHO A.B. et al. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
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ROTEIRO 08 Exame Microbiolgico de Urina: URUCULTURA
1.INTRODUO Amostras de urina so submetidas cultura quando existe suspeita de infeco do trato urinrio, para controle de tratamento ou em pacientes assintomticos com alto risco de infeco. A URUCULTURA o exame microbiolgico que pode fornecer informaes qualitativas e quantitativas das bactrias encontradas na urina. As bactrias mais frequentemente isoladas de processos infecciosos urinrios so as enterobactrias Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp. e Enterobacter spp. Entre is cocos gram-positivos, os mais freqentes so os estafilococos, destacando Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp.A maioria das infeces urinrias caracterizada pela presena de elevado nmero de leuccitos na amostra (piria), sendo importante verificar, juntamente com a cultura, a contagem de leuccitos e a presena de microorganismos (bacteriria) atravs do exame qualitativo de urina (EQU). H situaes em que infeces urinrias podem apresentar contagem normal de leuccitos ou somente um pouco elevada. MATERIAL CLNICO Preferencialmente a primeira urina da manh, AMOSTRA DE JATO MDIO, obtida aps procedimento de higienizao da regio genital e desprezo do primeiro jato urinrio* AMOSTRA DE QUALQUER JATO, obtida de crianas, aps higiene da regio genital, com auxlio de saco coletor. Alto ndice de contaminao; AMOSTRA obtida por PUNO SUPRAPBICA. Metodologia padro-ouro em crianas com idade inferior a dois anos. Utilizada para diagnstico confirmatrio; AMOSTRA DE PRIMEIRO JATO (primeiros 10 ml), obtida aps procedimento de higienizao da regio genital. Exame usado como substituto de secreo uretral, quando essa escassa, para a pesquisa de processos infecciosos na uretra.
MEIOS DE CULTURA O meio de escolha para a semeadura de amostras de urina o Agar-CLED (seletivo e diferencial), por reduzir, consideravelmente, a presena de contaminantes (difterides, lactobacilos e micrococos) e permitir o crescimento dos principais patgenos urinrios, propiciando boa diferenciao entre as colnias Utiliza-se tambm o Agar MacConkey, seletivo para bactrias gram-negativas, como as enterobactrias.
2. OBJETIVOS Realizar exame microbiolgico de urina (URUCULTURA) pelo mtodo das diluies seriadas; Avaliar, quantativamente, o(s) microorganismo(s) presente(s) na amostra de urina
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3. MATERIAIS Frasco contendo caldo nutritivo contaminado com determinada bactria (amostra); Trs tubos de ensaio contendo 9ml de gua destilada para as diluies seriadas; Pipeta Pasteur/ pipeta estril de 1ml; Trs placas contendo Agar MacConkey; Ala de Drigauski/ala de platina; Caneta marca-vidro; Fsforo; Bico de bunsen
4. PROCEDIMENTO MTODO DAS DILUIES SERIADAS 1. Higienizao da bancada. Acender a chama do bico; 2. Aps a agitao do frasco contendo a amostra numerada transferir, com pipeta Pasteur/pipeta seriada estril, 1ml da amostra para o primeiro tubo de ensaio (marcar TUBO 1 com caneta marca-vidro), com 9 ml de gua destilada, obtendo assim , diluio 1:10 (marcar a diluio no tubo). Homogeneizar com a prpria pipeta; 3. Transferir, a seguir, com pipeta Pasteur/pipeta estril, 1 ml do TUBO 1 para o segundo tubo (TUBO 2), tambm contendo 9ml de gua destilada, obtendo assim, diluio 1:100. Homogeneizar com a prpria pipeta; 4. Novamente, com pipeta Pasteur/pipeta estril, 1 ml do TUBO 2 para um terceiro tubo (TUBO 3) obtendo assim, diluio 1:1000. Homogeneizar com a prpria pipeta; 5. Transferir 1ml do TUBO 1 (inoculo 1), com pipeta Pasteur/estril, para a primeira placa de Agar MacConkey, marcada previamente com o nmero da amostra e a diluio 1:10. Espalhar o inculo, com auxlio da ala de Drigauski, em toda superfcie do Agar OU, com a ala de platina, executar a tcnica de semeadura quantitativa (FIGURA 1); 6. Transferir 1ml do TUBO 2 (inoculo 2), com pipeta Pasteur/estril, para a segunda placa de Agar MacConkey, marcada previamente com o nmero da amostra e a diluio 1:100. Espalhar o inculo, com auxlio da ala de Drigauski, em toda superfcie do Agar OU, com a ala de platina, executar a tcnica de semeadura quantitativa; 7. Executar o mesmo procedimento dos TUBOS 1 e 2 com o TUBO 3 (inoculo 3) diluio 1:1000;
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8. Incubar as trs placas de Agar MacConkey, identificadas com o nmero da amostra e a diluio correspondente, a 37C por 24/48 horas (FIGURA 2)
5. CONTAGEM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLNIA (UFC) Aps o perodo de incubao, observar as colnias bacterianas nas diluies seriadas. Evidentemente, na diluio 1:10 so observadas numerosas colnias, algumas vezes incontveis, enquanto na diluio 1:1000 a contagem normalmente torna-se possvel, pelo menor nmero de colnias. O ideal que a placa escolhida para a contagem de unidades formadoras de colnia (UFC) contenha um nmero considerado significativo no mtodo em questo, ou seja, no mnimo 20 a 30 colnias e no mximo 200 a 300 colnias. O clculo do nmero de bactrias presentes na amostra feito multiplicando-se o nmero de colnias contadas na placa pela diluio.
6. INTERPRETAO DE RESULTADOS Independente do tipo de coleta realizada, o resultado da cultura de urina (UROCULTURA) deve ser sempre quantitativo, em unidades formadoras de colnias por milmetro de urina (UFC/ml). Acima de 100.000 UFC/ml: indcio de infeco do trato urinrio De 10.000 a 90.000 UFC/ml: contaminao ou suspeita de infeco De 0 a 9.000 UFC/ml: sem significado clnico O ideal liberar o resultado da contagem de leuccitos e a presena, ou no, de microorganismos (bacteriria), juntamente com a URUCULTURA.
Figura 1. Tcnica de semeadura quantitativa
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Figura 2. Mtodo das diluies seriadas para exame microbiolgico quantitativo de urina 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. MICROBIOLOGIA Atividades Prticas. So Paulo: Santos, 2 edio, 2008; OPLUSTIL C.P. et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. So Paulo: Sarvier, 2000 VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006
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ROTEIRO 09: PROVAS BIOQUMICAS para a Identificao de Enterobacteriaceae 1. INTRODUO A famlia Enterobacteriaceae constitui um grupo heterogneo de bastonetes gramnegativos isolados com freqncia de amostras biolgicas. Muitas espcies fazem parte da microbiota do trato intestinal de animais e de humanos, sendo tambm encontradas no ambiente. A diferenciao das enterobactrias baseia-se, principalmente, na presena ou no de diferentes enzimas codificadas pelo material gentico das bactrias. Essas enzimas participam do metabolismo bacteriano em diversas vias, resultando em variadas propriedades bioqumicas utilizveis, na prtica, para a caracterizao bacteriana. Os substratos, com os quais as enzimas bacterianas podem reagir, so incorporados aos meios de cultura junto a um indicador, ou revelador, que pode detectar a utilizao do substrato ou a produo de produtos metablicos especficos. Por vezes, selecionando-se uma srie de provas bioqumicas que avaliem diferentes caractersticas metablicas, pode-se identificar o gnero e a espcie microbiana relevante na amostra biolgica analisada. O Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (1984) divide a famlia Enterobacteriaceae em oito tribos, baseado na homologia do DNA. A caracterizao das enterobactrias baseada em provas bioqumicas nem sempre est de acordo com a anlise de DNA. Embora a homologia do DNA seja um parmetro cada vez mais utilizado na taxonomia bacteriana, clinicamente as reaes metablicas das provas bioqumicas continuam sendo a maior ferramenta em diagnstico laboratorial.
PROVAS BIOQUMICAS GLICOSE PRINCPIO Determina a capacidade de um microrganismo de fermentar a glicose liberando cidos como produto final. Alm dos cidos, alguns apresentam a enzima formiase que degrada o cido frmico, formando gs. COMPOSIO Caldo de Peptona com 1% de Glicose; Indicador de Andrade Presena do tubo de Durham TCNICA Semeadura do microrganismo-teste com ala de inoculao em meio lquido; Incubao a 35 - 370C por 48 horas. RESULTADO Cor original do meio: rosa claro; Reao cida: cor rosa forte; Presena de gs: bolhas de ar dentro do tubo de Durham;
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LACTOSE PRINCPIO Determina a capacidade de um microrganismo de hidrolisar a lactose que um dissacardeo para formar GLICOSE + GALACTOSE e assim ferment-las obtendo cido como um produto final. COMPOSIO Caldo de Peptona com 1% de Lactose; Indicador de Andrade TCNICA Semeadura do microrganismo-teste com ala de inoculao em meio lquido; Incubao a 35 - 370C por 48 horas. RESULTADO Cor original do meio: rosa claro; Reao cida: cor rosa forte;
TSI (Triple Sugar Iron) OBJETIVO Diferenciar bacilos gram-negativos fermentadores (enterobactrias) de bacilos gram-negativos no fermentadores (BANFE) de carboidratos. PRINCPIO Teste baseado na fermentao de glicose, lactose e sacarose e na produo de cido sulfdrico (H2S). COMPOSIO 1% de lactose, 1% de sacarose e 0,1% de glicose e peptona; Vermelho fenol como indicador de alcalinizao; Sulfato ferroso como indicador de formao de H2S. TCNICA Semeadura do microrganismo-teste por esgotamento, com agulha de inoculao, em agar inclinado; Incubao a 35 37C por 18 24 horas. RESULTADO Cor original do meio: laranja; Reao alcalina: cor vermelha; Reao cida: cor amarela; Presena de gs: bolhas/meio fragmentado; H2S POSITIVO: presena de precipitado negro, devido formao de sulfato ferroso
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SIM (Sulfato, Indol, Mobilidade) OBJETIVO Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e de no enterobactrias (BANFE). PRINCPIO Certas bactrias, produtoras da enzima triptofanase, oxidam o aminocido triptofano, resultando na produo de indol, detectado aps a adio de algumas gotas do reativo de Kovacs. COMPOSIO Peptona trypticase; Sulfato ferroso como indicador de formao de H2S. TCNICA Inoculao do microrganismo-teste por picada profunda, com agulha de inoculao, em meio semi-slido, de acordo com roteiro 06; Incubao a 35 - 370C por 18 24 horas. RESULTADO Cor original do meio: amarelo-palha; MOBILIDADE-POSITIVA _ microrganismos mveis migram pela linha do inoculo e se difundem no meio, causando turbidez; MOBILIDADE-NEGATIVA _ microrganismos imveis crescem somente ao longo da linha do inoculo. O meio permanece lmpido.
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H2S-POSITIVO _ cor negra ao longo da linha de inoculao; H2S-NEGATIVO _ linha ao longo da inoculao inalterada. Realizar a leitura da mobilidade e H2S ANTES da adio do reativo de Kovacs (pdimetil amino benzaldedo) (2 - 4 gotas) para a leitura do indol INDOL-POSITIVO do reativo de Kovacs; INDOL-NEGATIVO do reativo de Kovacs. formao de anel vermelho na superfcie do meio, aps a adio formao de anel amarelo na superfcie do meio, aps a adio
LIA (Lysine Iron Agar) OBJETIVO Diferenciar organismos lisina-descarboxilase positivos de organismos lisinadescarboxilase negativos. PRINCPIO A lisina pode ser descarboxilada por algumas enterobactrias que a transformam em cadaverina, alcalinizando o meio de cultura. Uma vez que a descarboxilao ocorre apenas em meio cido (pH menor que 6), necessrio que se produza, previamente, a acidificao do meio por fermentao da glicose. COMPOSIO Agar lisina; Indicador de pH prpura de bromocresol. TCNICA
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Inoculao do microrganismo-teste por esgotamento/picada, com agulha de inoculao, em Agar inclinado/meio semi-slido, de acordo com roteiro 06; Incubao a 35 - 370C por 18 24 horas. RESULTADO Cor original do meio: prpura; LIA-POSITIVO com a formao da amina alcalina a partir da reao de descarboxilao, o pH novamente alterado (aumentado) e o meio reverte cor prpura original; LIA-NEGATIVO viragem levemente amarelada na base, pela acidificao do meio (fermentao da glicose).
FENILALANINA OBJETIVO Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias. PRINCPIO Algumas bactrias produzem a partir da fenilalanina, por ao enzimtica, cido fenilpirvico, detectado aps a adio da algumas gotas do reativo cloreto frrico 10%. COMPOSIO Agar fenilalanina. TCNICA Inoculao do microrganismo-teste por esgotamento, com agulha de inoculao, em agar inclinado, de acordo com roteiro 06; Incubao a 35 - 370C por 18 24 horas. RESULTADO Cor original do meio: amarelo-palha; Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado. FENILALANINA-POSITIVO formao de colorao esverdeada no pice/bisel do meio, aps a adio do cloreto frrico. A interpretao deve ser feita
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imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota em alguns minutos. As bactrias do gnero Proteus e Providencia so fenilalanina-positivas; FENILALANINA-NEGATIVO o meio permanece inalterado aps a adio do cloreto frrico.
CITRATO DE SIMMONS OBJETIVO Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e de no enterobactrias (BANFE). PRINCPIO Algumas bactrias tm a propriedade de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono. A oxidao do citrato leva liberao de ons sdio e formao posterior de carbonato, um sal que alcaliniza o meio, levando viragem do indicador. COMPOSIO Agar citrato de Simmons; Indicador de pH azul de bromotimol. TCNICA Semeadura do microrganismo-teste com agulha de inoculao, fazendo uma linha/esgotamento somente na superfcie do agar inclinado; Incubao a 35 - 370C por at 48 horas. RESULTADO Cor original do meio: verde; CITRATO-POSITIVO formao de colorao azul, ou crescimento, no local onde o microrganismo-teste foi inoculado; CITRATO-NEGATIVO colorao inalterada, sem crescimento bacteriano evidente.
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CALDO URIA OBJETIVO Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e de no enterobactrias (BANFE). PRINCPIO Alguns microrganismos possuem a habilidade de degradar a uria, pela ao da enzima urease, em duas molculas de amnia, resultando na alcalinizao do meio com viragem do indicador. COMPOSIO Caldo Uria; Indicador de pH vermelho de fenol. TCNICA Semeadura do microrganismo-teste com ala de inoculao em meio lquido, conforme roteiro 06; Incubao a 35 - 370C por 48 horas, ou at sete dias. RESULTADO Cor original do meio: rosa-plido; URIA-POSITIVO meio; URIA-NEGATIVO colorao inalterada. formao de colorao rosa pink pela alcalinizao do
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2. OBJETIVOS Executar algumas das principais provas bioqumicas utilizadas na identificao (gnero e espcie) de bastonetes gram-negativos; Avaliar e comparar os resultados obtidos com os dados disponveis na literatura (tabelas) para caracterizao fenotpica das bactrias.
3. MATERIAIS Placas de agar MacConkey com determinada cepa (microrganismo-teste), sujeita a identificao atravs das provas bioqumicas; Ala e agulha de platina; Estante com a bateria das provas bioqumicas na seguinte ordem: Medicina e enfermagem: TSI, SIM, LIS, CITRATO, URIA e FENILALANINA Biologia: GLICOSE, LACTOSE, SIM, LIS, CITRATO, URIA e FENILALANINA Reativo de Kovacs (indol); Cloreto frrico 10% (fenilalanina); Caneta marca-vidro; Fsforo; Bico de Bunsen 4. PROCEDIMENTO 1) Higienizao da bancada. Acender a chama do bico, flambar ala e agulha de inoculao; 2) Inocular colnias isoladas do microrganismo-teste, semeado na aula anterior em agar MacConkey, nos tubos das provas bioqumicas, de acordo com as tcnicas de semeaduras correspondentes a cada meio, apresentadas acima;
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3) Incubar a bateria de provas, identificadas com o nmero do grupo e da amostra a 37C por, no mnimo, 24 horas e, no mximo, sete dias.
5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Aps o perodo indicado de incubao, avaliar as provas bioqumicas, conforme roteiro acima, e anotar os resultados; Consultar tabela(s) para identificao fenotpica, em nvel de gnero e espcie, do microrganismo-teste.
Bactrias Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Shigella sp Salmonella paratyphi A Salmonella typhi Serratia marcescens Proteus mirabilis Proteus vulgaris Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis
Glicose cido Glicose Produo de gs Lactose H2S Motilidade Indol Lisina Citrato Urease Fenilal anina
+ + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + +/+ +/+/-
+ + + + - /+ - /+ - /+ + -/+ + -
- /+ + + + + + + + + + - /+ -
+ -/+ - /+ + + -/+ -
-/+ + + + + -
+ + + + + - /+ +/+ -
+ - /+ - /+ - /+ + + + +
+ + + + -
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ANTUNES G.S. Manual de Diagnstico Bacteriolgico. 2a edio, Porto Alegre: Editora da Universidade/UFRGS, 1995; ANVISA. Manual de Microbiologia Clnica para Controle de Infeco em Servios de Sade. 1a edio, 2004; JORGE O.C. MICROBIOLOGIA Atividades Prticas. So Paulo: Santos, 2 edio, 2008; OPLUSTIL C.P. et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. So Paulo: Sarvier, 2000. VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
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ROTEIRO 13 Sensibilidade aos Antibiticos In Vitro: ANTIBIOGRAMA 1. INTRODUO Antibiticos so compostos qumicos produzidos por microrganismos capazes de ocasionar a morte ou a inibio do crescimento de outros microrganismos. Actinomicetos, fungos e bactrias caracterizam-se como os principais produtores de agentes antimicrobianos. Alguns destes compostos, alm da sntese biolgica, podem ser produzidos por sntese orgnica. Para a utilizao de determinado antibitico com fins clnicos, necessrio considerar algumas importantes caractersticas, como seletividade, espectro de ao, induo de resistncia, solubilidade e efeitos na microbiota intestinal. A determinao in vitro da sensibilidade/resistncia de determinada bactria a um/vrios antibiticos recebe a denominao de ANTIBIOGRAMA. Para esta determinao utiliza-se, alm de tcnicas padronizadas, amostras de bactrias cujo grau de sensibilidade seja estvel e conhecido. O mtodo da difuso em agar (Kirby-Bauer) o mais empregado na rotina laboratorial. As concentraes previamente determinadas das drogas so incorporadas em discos de papel filtro e depositados sobre agar Mueller- Hinton. A zona, ou halo de inibio do crescimento bacteriano pode indicar as categorias sensvel, intermediria e resistente. Quando o agente infectante resistente a uma multiplicidade de antibiticos, torna-se importante o conhecimento da sensibilidade desse microrganismo para um melhor resultado teraputico. 2. OBJETIVOS Executar o antibiograma pelo mtodo de difuso em meio slido (Kirby-Bauer) para determinao da sensibilidade de bactrias a antibiticos; Avaliar a amplitude da atividade antimicrobiana dos antibiticos testados; 3. MATERIAIS Placas de agar MacConkey com determinada cepa (microrganismo-teste); Tubo de ensaio com soluo fisiolgica estril; Swabs; Placa de Petri com agar Mueller-Hinton; Pinas esterilizadas; Discos de antibiticos; Caneta marca-vidro; Fsforo; Bico de Bunsen 4. PROCEDIMENTO - MTODO DE DIFUSO EM MEIO SLIDO (KIRBYBAUER) 1) Higienizao da bancada. Acender a chama do bico; 2) Inocular, com swab estril, uma colnia isolada do microrganismo-teste, semeado na aula anterior em Agar MacConkey, no tubo de ensaio com soluo fisiolgica;
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3) Homogeneizar. Observar pequena turvao da soluo; 4) Retirar o excesso de cultura apertando o algodo do swab contra a parede interna do tubo de ensaio; 5) Assepticamente, transferir a cultura para placa de Petri com agar Mueller-Hinton, esfregando o swab em toda a superfcie do meio, visando a obteno de crescimento confluente; 6) Deixar a cultura secar por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente; 7) Com o auxlio de uma pina, previamente flambada ou esterilizada, transferir, de forma assptica, os discos de papel filtro com concentraes conhecidas de antibiticos para a superfcie do meio de cultura inoculado. Pressionar, levemente, os discos de papel contra a superfcie do agar; 8) Incubar a placa de agar Mueller-Hinton, identificada com o nmero do grupo e da amostra por 18 a 24 horas a 370C. 5. INTERPRETAO DOS RESULTADOS Aps o perodo indicado de incubao, observar a presena/ausncia de halos de inibio de crescimento, em torno dos discos de antibiticos; A zona clara de inibio ao redor de cada disco medida em milmetros, com o auxlio de rgua; A medida comparada com uma tabela-padro de interpretao.
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS JORGE O.C. MICROBIOLOGIA Atividades Prticas. So Paulo: Santos, 2 edio, 2008; OKURA M.H. et al. MICROBIOLOGIA: Roteiros de Aulas Prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008; VERMELHO A.B. et al. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FACULDADE DE MEDICINA REA INTERDISCIPLINAR DE CINCIAS BIOMDICAS DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

APOSTILA DAS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA VERSO 2012

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INTRODUO AS MICROBIOLOGIA: 1. OBJETIVO

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8. Microscpio ptico: visualizao de bactrias coradas pela colorao de GRAM

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Morfologia das bactrias:

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ROTEIRO 03: MEIOS DE CULTURA E TCNICAS DE SEMEADURA

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LCOOIS CLOREXIDI NA 2/4%

Rpida. Interme diria.

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(formao de BOLHAS DE GS)

INTERPRETAO: catalase positiva _ estafilococos, micrococos e estomatococos; catalase negativa _ estreptococos

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ROTEIRO 08 Exame Microbiolgico de Urina: URUCULTURA

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Figura 1. Tcnica de semeadura quantitativa

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