Identificacin de protenas mediante la reaccin el Biuret

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CONH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.

Espectrofotometra. Principios bsicos A diferencia de las pruebas realizadas anteriormente, la reaccin de Biuret es cuantificable, es decir, a mayor concentracin de protenas, mayor intensidad de color violeta. Esta reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas. Midiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado colormetro (si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores). La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda (l) (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiacin con una l especfica. El espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz monocromtica, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad de luz. Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar una

idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad ptica (DO)

LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS.

1.1. Definiciones y Unidades de actividad (3, 5, 6).

Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia, producidos por las clulas de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones biolgicas a travs de vas bien definidas y cuya actividad est sujeta a regulacin. Las sustancias sobre las que actan las enzimas, transformndolas, se denominan substratos.

La actividad de las enzimas se expresa generalmente por la, velocidad de la reaccin catalizada, a travs de las siguientes UNIDADES:

UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: Es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 micromol de substrato por minuto, bajo condiciones bien definidas (condiciones estndar). Esta es la expresin bsica de la velocidad de la reaccin. Se ha sugerido que la temperatura debe ser, en lo posible, de 30C y que las otras condiciones, tales como pH y concentraciones de substratos, debieran ser las ptimas para la actividad enzimtica.

KATAL (smbolo: kat): Es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de substrato por segundo. Esta unidad ha sido introducida recientemente por la Unin Internacional de Bioqumica 1 kat = 6 x unidades internacionales.

La Unidad Anson se ocupa cuando se usa hemoglobina como substrato: 1 Unidad Anson = aquella cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test, libera 1 mmol (1 milimol = mol) de aminocidos positivos al reactivo de Folin por minuto, calculados como tirosina. La miliunidad Anson corresponde a 1 mol (= mol) de tirosina.

(El R. de Folin - Ciocalteu para fenoles contiene tungstato y molibdato de sodio, sulfato de litio, HC1, y bromo y da color violeta con los aminocidos fenlicos) (36,76).

ACTIVIDAD ESPECFICA: Es el nmero de unidades de enzima por mg de protena. Es una medida muy utilizada para expresar la actividad de preparaciones enzimticas.

ACTIVIDAD MOLECULAR (nmero de recambio): Es el nmero de molculas de substrato, transformadas, por minuto, por una molcula de enzima. Se calcula dividiendo la velocidad mxima de la enzima por el peso molecular; es una caracterstica de las enzimas individuales y no refleja la pureza de la preparacin.

Si la enzima respectiva contiene un grupo prosttico, una coenzima o un centro cataltico (vanse stos ms adelante), cuya concentracin sea medible, la actividad enzimtica puede expresarse tambin por el nmero de molculas de substrato, transformadas por minuto, por cada centro cataltico (10).

1.2. Estructura de las enzimas.