ANLISIS GENOTXICO DE MUESTRAS DE AGUA DEL RO RAMIS (Departamento de Puno, Per) UTILIZANDO ERITROCITOS DE LA SANGRE PERIFRICA DEL PEZ

CEBRA ( Danio rerio) Carlos Scotto1, Javier Alvarez1, Carlos Llanos1, Omar Leyva1, Sul Sotomayor2, Karol Chvez2, Eber Justo2, Oliver Casso2, Csar Larico2, Wilmar Mayta2 & Wilson Sanga3
1. Laboratorio de Mejora Gentica y Reproduccin Animal, Facultad de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Nacional Federico Villarreal, Calle Ro Chepn s/n. El Agustino. Lima -Per. Email: carlosscottoespinoza@gmail.com 2. Facultad de Ingenieras y Ciencias Puras, Universidad Andina Nstor Cceres Velsquez, Pasaje la Cultura, Edificio el Campin No. 305, Tercer piso. Juliaca Per. Email: inka_man@hotmail.com 3. Direccin General de Asuntos Ambientales Mineros del Ministerio de Energa y Minas. Av. Las Artes Sur 260. San Borja. Lima. Email: wsanga@hotmail.com

RESUMEN Los relaves mineros liberan al ambiente diversos compuestos genotxicos. Las cuencas de los ros aledaos son los ms afectados, por ello es importante determinar la calidad de sus aguas. El test de Microncleos (MN) cuantifica el dao genotxico producido en los eritrocitos del pez Cebra ( Danio rerio) por accin de los compuestos genotxicos presentes en las aguas de los ros contaminados. Por lo tanto, la presente investigacin analiz cinco puntos de la Cuenca del ro Ramis (Departamento de Puno, Per) utilizando el test de MN y al pez Cebra como bioindicador, que fueron evaluados a las 24, 48 y 72 horas de exposicin a tres diferentes volmenes (1X, 1/2X y 1/4X) para cada punto muestreado. Entre los resultados ms resaltantes, a las 24 h de exposicin, tenemos la muestra tomada de la Laguna Lunar de Oro (M5) que fue mortal (100%) a 1X; mientras que la muestra tomada de la Pampilla (M4) present hasta un 23% de MN a 1/2X; y la muestra del ro Taraco (M1) present un 12% de MN. El anlisis a las 48 y 72 horas de exposicin mostr la presencia de un mximo de 5% de MN para todas las muestras. Con esto podemos concluir que el test de MN sirve como ensayo de genotoxicidad rpido y eficaz para determinar la calidad de agua de los ros contaminados por un relave minero. Palabras claves: Danio rerio, eritrocitos, test de microncleos, genotoxicidad, ciclosfosfamida, relave minero.

GENOTOXIC ANALYSIS OF FRESH WATER SAMPLES FROM THE RAMIS BASIN (Department of Puno, Per) USING ERYTHROCYTES (peripheral-blood) OF ZEBRA FISH (Danio rerio) ABSTRACT
Mine tailings release several genotoxic compounds into the environment, from which neighboring river basins are the most affected, so it is important to determine the quality of its waters. Micronucleus test (MN) quantifies the genotoxic damage produced in erythrocytes of zebrafish (Danio rerio) due to genotoxic compounds present in contaminated rivers. Therefore, this study analyzed five points in the Ramis River Basin (Department of Puno, Peru) using zebrafish as a biomarker and the MN test; the fish were exposed during 24, 48 and 72 hours at 3 different volumes (1x, 1/2x and 1/4x) for each point sampled. Among the most striking results, at 24 h of exposure, the sample taken from the Laguna Lunar de Oro (M5) revealed fatal results for the fish (100%) at 1X, while the sample taken from the Pampilla (M4) presented a 23% of MN at 1/2X, and sample taken at the Taraco river (M1) showed a 12% of MN. The analysis at 48 and 72 h of exposure showed the presence of a maximum of 5% of MN for all samples. We can, therefore, conclude that the MN test serves as efficient genotoxicity indicator to determining the quality of river water contaminated by mine tailings. Key words: Danio rerio, erythrocyte micronucleus test, genotoxicity, cyclophosphamide, mine tailings.

INTRODUCCIN

Los estudios de genotoxicidad y/o teratogenia que evaluen y determinen la calidad del agua de los ros, lagos, humedales, bofedales u otras fuentes de agua en el Per; y que potencialmente puedan afectar a la salud humana o animal, y contaminar al medioambiente son muy escasos o inexistentes. Actualmente, existe la presencia de contaminantes mineros como los metales pesados (metil mercurio, sulfuro de plomo, arsnico, cadmio y otros) en los ambientes acuticos. Se sospecha que sean los factores causantes en cascada de dao a nivel gentico molecular, cromosmico, celular, embrionario y/o fetal. Muchas veces imperceptible o de deteccin tarda cuando el dao al organismo ya se produjo irremediablemente causando incluso la muerte del individuo o de la poblacin. El presente proyecto utiliz al pez cebra (Danio rerio), el cual es un animal modelo de laboratorio universal y un vertebrado filogenticamente muy cercano al humano, por lo que cualquier dao producido por diversos contaminantes acucolas, permiten su extrapolacin probada al humano para obtener resultados confiables e inmediatos. Adems, son peces fciles de manipular y soportan grandes nmeros en poco espacio; y poseen una alta capacidad reproductiva (entre 300-400 huevos por puesta), lo cual facilita el realizar diferentes experimentos con varias repeticiones por contaminante analizado. Un rasgo anatmico muy importantes para la presente propuesta es que los peces poseen glbulos rojos con ncleo, el cual contiene el material gentico o ADN visible por simple tincin lo que hace posible el observar fcilmente cualquier efecto genotxico adverso en forma directa por microscopia y evaluar rpidamente los efectos nocivos de un contaminante acucola de inters (Anitha et al., 2000, Llanos et al., 2013; Scarpato et al., 1990; De Flora, 1993). A diferencia de otras tcnicas que utilizan tcnicas moleculares de ltima generacin para la deteccin de los mismos efectos genotxicos, pero que son muy costosos en reactivos y equipamiento.

Los genotxicos mineros en general, penetran hasta el ncleo de las clulas humanas y de los animales y daan su ADN (mutaciones en los genes), lo que a su vez daa a los cromosomas y esto conlleva a producir alteraciones en el embrin (teratogenia), que finalmente se traduce en dao en el individuo adulto.

Heddle (1973) y Schmid (1975) fueron los primeros investigadores que propusieron un ensayo alternativo y simple para determinar el dao nuclear y cromosmico in vivo mediante el conteo de microncleos (MN) en diferentes poblaciones celulares. Los peces por representar varios niveles de la cadena alimenticia acutica, son excelentes indicadores de la contaminacin del agua, puesto

que pueden bioacumular y biomagnificar a travs de ella altas concentraciones de estos elementos. Ejemplo claro de esto es el mercurio, el cual es bioamplificado casi en su totalidad por los peces en forma de metilmercurio sustancia altamente txica y de fcil fijacin en los tejidos musculares y adiposos, convirtindola en elemento clave en el transporte de este metal en las cadenas alimentaras acuticas que culminan en el consumo humano (CEPIS, 1978; WHO, 2003; lvarezLen, 2009; Reish & Oshida, 1987).

El pez cebra (Danio rerio; Hamilton, 1822) constituye hoy en da, el modelo animal vertebrado acutico por excelencia para la gentica, embriologa, ecologa, reproduccin y otras ramas de la ciencia. Varios rasgos inherentes de su biologa los hacen ideales para ser utilizados como Biosensores de la contaminacin ambiental como son: viven en grandes grupos de hasta 6 individuos por litro y en poco espacio en acuarios acondicionados a temperaturas a 26 C. Es el pez ms resistente y ms fcil de criar entre los ovparos sin muchos requisitos estrictos en cuanto a su mantenimiento y alimentacin. Obtienen la madurez sexual a los 3 a 4 meses. Son fciles de sexar. Es fcil hacerlos desovar y producen alrededor de 300 a 400 embriones. Sus embriones son transparentes y se desarrollan completamente en 72 horas (Rocha et al., 2002). Adems, poseen glbulos rojos sanguneos nucleados (con ADN) a diferencia de los mamferos que son anucleados (Sprague et al., 2001; Hill, 2004; McHugh, 2001). Y un aspecto importante es que permiten realizar estudios alomtricos, es decir sus resultados al ser un vertebrado es extrapolable a los humanos (Lo que le suceda al ncleo o al embrin del pez cebra, le suceder lo mismo al del humano).

Por lo tanto, por las caractersticas biolgicas y fisiolgicas ptimas, el presente proyecto propone al pez cebra como una especie dulceacucola para ser utilizada como bioindicador en ensayos toxicolgicos de diversos contaminantes mineros del agua.

MATERIALES Y MTODOS

La presente investigacin se desarroll entre enero y noviembre del ao 2012. Los peces fueron seleccionados del stock de Danio rerio pertenecientes al laboratorio de Mejora Gentica y Reproduccin Animal de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica de la Universidad Nacional Federico Villarreal, ubicado en Calle ro Chepn s/n Cuadra No. 1, El Agustino, Lima, Per.

Ubicacin geogrfica y toma de muestras de agua a lo largo de la Cuenca del ro Ramis (Puno, Per)

Las muestras colectadas fueron (Figura N 1): Muestra 1 (M1): Microcuenca del Ro Taraco (Distrito de Taraco Puente rumbo a Chupa) (Latitud: 1420'44., Longitud: ).

Muestra 2 (M2): Microcuenca del Ro San Antn (Distrito San Antn) (Latitud: , Longitud: ).

Muestra 3 (M3): Microcuenca del Ro Crucero (Latitud: 1420'44.32"S, Longitud: 70 0'57.76"O).

Muestra 4 (M4): Ro Ramis (Distrito de Ananea) (Latitud: 1440'25.91"S, Longitud: 6931'43.35"O).

Muestra 5 (M5): Laguna Lunar de Oro (Distrito de Ananea) (Latitud: 1438'7.57"S, Longitud: 6926'18.91"O).

Materiales

5 muestras de agua de relave (M1, M2, M3, M4 y M5) 48 Peces Cebra adulto (Danio rerio) 2 acuarios de 40 litros 2 Termostatos de 40 Watts 45 envases plstico de 1 litro Alimento seco importado de la marca SERA Microscopio Bilocular Plan Acromtico con cmara digital incorporada

Refrigeradora Compresora de aire Solucin de Giemsa al 10% Lminas portaobjetos Jarra Couplins Medicamentos varios Metanol absoluto Agua mineral no gasificada Agua destilada

Procesamiento de muestras

El presente estudio requiri de una muestra total de 48 peces adulto cebra (Danio rerio), estos aclimatados en 2 acuarios de 40 litros a temperatura controlada de 26C con termostatos de 40W que servir como componente de un sistema de control simple que abre o cierra un circuito elctrico en funcin de la temperatura y una compresora de aire que oxigen constantemente los acuarios.

Se aliment ad libitum con alimento seco importados de la marca SERA para la manutencin de los individuos analizados.

Cada muestra de agua fue fraccionada en 3 volmenes (1X, 1/2X y 1/4X) complementndose con agua mineral no gasificada para obtener un volumen total de 200 mL por envaso plstico, a diferentes tiempos de exposicin (24, 48 y 72 horas) con un control de agua mineral no gasificada. Se expuso cada individuo ante cada volumen por cada tiempo de exposicin de la muestra de agua del ro Ramis.

Del universo analizado se realiz el conteo directo de los glbulos rojos afectados observndose diferentes tipos de MN por cada una de las fracciones de volmenes obtenidos por muestra. Posterior al conteo de MN se evalu estadsticamente las muestras de los diferentes tipos de MN presentes en los eritrocitos de la sangre perifrica del pez cebra (Danio rerio) ante la accin de los agentes genotxicos presentes en las muestras de agua de la zona minera de Ro Ramis (Departamento de Puno) sobre los eritrocitos de la sangre perifrica del pez cebra (Danio rerio).

Se consider como dao genotxico positivo la presencia de un micronucleo por eritrocito (MN1), 2 micronucleos por eritrocitos (MN2), ncleo en forma arrionada (MN3), con membrana nuclear rota (MN4) o con ncleo fragmentado (MN5) (Tabla N 1).

Tabla N 1. Tipos de microncleos producidos por dao genotxico sobre los glbulos rojos en el pez Cebra (Danio rerio) Clula con MN1 Clula con MN2 Clulas con MN3 Clulas con MN4 Clulas con MN5

Obtencin de Microncleos

Se desarrollaron los siguientes pasos: 1. Cada pez cebra expuesto a cada volumen por muestra para cada tiempo de control se sacrific realizando un corte en la parte anterior del mismo, entre el oprculo y las aletas pectorales con la finalidad de obtener la sangre perifrica (Figura N 2); 2. Se colect la sangre perifrica colocando una gota de sangre en un extremo de la lmina e inmediatamente se realiz el frotis extendiendo la sangre en la lmina portaobjetos (Figura N 3); 3. Se dej secar el portaobjeto con el frotis correspondiente para cada muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos (Figura N 4); 4. Se fijaron las muestras sumergindolas por 15 minutos en metanol absoluto refrigerado (4C), luego se procedi a retirarlas y dejarlas secar durante 15

minutos a temperatura ambiente (Figura N 5); 5. Luego las muestras se colorearon con GIEMSA al 10% durante 8 minutos (Figura N 6); 6. Seguido las muestras se lavaron superficialmente con agua destilada para retirar el exceso de colorante y se dej secar por una hora a temperatura ambiente (Figura N 7 y Figura N 8); 7. Por ltimo se procedi a la observacin microscpica de las muestras para el conteo final, utilizando objetivos de 400X (Figura N 9) y 1000X (Figura N 10) en esta ltima observacin se le agreg aceite de inmersin a la muestra; 8.

RESULTADOS Las siguientes tablas muestran el nmero total de MN contabilizados a diferentes tempos de exposicin al la muestras de agua procedentes del ro Ramis. La Tabla N 2 muestra el nmero total de eritrocitos con dao genotxico y los tipos de MN presentes en ellos a las 24 h.

Tabla N 2. Tipos de MN producidos por dao genotxico sobre los eritrocitos en el pez cebra (Danio rerio) a las 24 horas.
Muestras M1 (1/4) M1 (1/2) M1 M2 (1/4) M2 (1/2) M2 M3 (1/4) M3 (1/2) M3 M4 (1/4) M4 (1/2) M4 M5 (1/4) M5 (1/2) M5 Control Tipos de MN obtenidos a 24 h N.N. MN 1 MN 2 MN 3 MN 4 94 0 0 0 4 92 0 0 0 8 88 0 0 2 8 98 1 0 0 0 93 0 1 1 3 92 0 0 3 1 95 2 0 1 2 94 0 0 0 3 No se observaron eritrocitos integros 96 0 0 0 4 77 0 0 0 15 No se observaron eritrocitos 89 0 0 0 8 No se observaron eritrocitos integros Pez muerto antes de las 24 h 100 0 0 0 0 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100 100 0 100 0 0 100

MN 5 2 0 2 1 2 4 0 3 0 8 3

N.N. = No hay presencia de microncleos MN1 = 1 MN por eritrocito MN2 = 2 MN por eritrocito MN3 = ncleo en forma arrionada MN4 = membrana nuclear rota MN5 = ncleo fragmentado

La Tabla N 3 muestra el nmero total de eritrocitos con dao genotxico y los tipos de MN presentes en ellos a las 48 h.

Tabla N 3. Tipos de MN producidos por dao genotxico sobre los eritrocitos en el pez Cebra (Danio rerio) a las 48 horas.
Muestras M1 (1/4) M1 (1/2) M1 M2 (1/4) M2 (1/2) M2 M3 (1/4) M3 (1/2) M3 M4 (1/4) M4 (1/2) M4 M5 (1/4) M5 (1/2) M5 Control Tipos de MN obtenidos a 48 h MN 1 MN 2 MN 3 MN 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 3 0 0 0 2 0 1 0 0 1 4 0 0 1 1 0 0 0 2 0 1 0 0 0 1 3 1 0 0 1 0 0 1 2 0 0 2 1 Pez muerto antes de las 24 h 0 0 0 0 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 100

N.N. 98 100 100 98 97 98 98 95 99 97 96 98 96 97 100

MN 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

N.N. = No hay presencia de microncleos MN1 = 1 MN por eritrocito MN2 = 2 MN por eritrocito MN3 = ncleo en forma arrionada MN4 = membrana nuclear rota MN5 = ncleo fragmentado

La Tabla N 4 muestra el nmero total de eritrocitos con dao genotxico y los tipos de MN presentes en ellos a las 72 horas.

Tabla N 4. Tipos de MN producidos por dao genotxico sobre los eritrocitos en el pez cebra (Danio rerio) a las 72 h
Muestras M1 (1/4) M1 (1/2) M1 M2 (1/4) M2 (1/2) M2 M3 (1/4) M3 (1/2) M3 M4 (1/4) M4 (1/2) M4 M5 (1/4) M5 (1/2) M5 Control Tipos de MN obtenidos a 72 h MN 1 MN 2 MN 3 MN 4 2 0 3 0 1 0 1 0 0 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 No se observaron eritrocitos Pez muerto antes de las 24 h 100 0 0 0 0 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 0 100

N.N. 95 98 100 97 98 100 98 100 99 97 97 100 98

MN 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

N.N. = No hay presencia de microncleos MN1 = 1 MN por eritrocito MN2 = 2 MN por eritrocito MN3 = ncleo en forma arrionada MN4 = membrana nuclear rota MN5 = ncleo fragmentado

Para la muestra 1, a una concentracin normal de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ hasta 8 clulas con ncleos membrana nuclear rota (Tipo IV), hasta 2 clulas con ncleo fragmentados (Tipo V) y 2 clulas ncleo arrionado (Tipo III). Siendo negativo para los tipos I y II. (Figura N11).

Para la muestra 2, a una concentracin de 1/2 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ hasta 2 clulas con 1 MN (Tipo I), hasta 3 clulas con membrana nuclear rota (Tipo IV), y 2 clulas con ncleos fragmentados (Tipo V), y slo 1 clulas con ncleo arrionado, y negativo para las clulas con 2 MN (Tipo II). (Figura N12)

Para la muestra 3, a una concentracin de 1/2 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 0 a 4 clulas con 1 MN (Tipo I), de 1 a 3 clulas con ncleo arrionado (Tipo III), de 0 a 3 MN tipo III y IV. Y negativo para el tipo II. (Figura N13).

Para la muestra 4, a una concentracin de 1/2 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 3 a 15 clulas con membrana nuclear rota (Tipo IV) y entre 0 a 8 clulas con ncleo arrionado (Tipo III). Siendo negativos los dems tipos de MN. (Figura N14).

Para la muestra 5, a una concentracin de 1/4 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 1 a 3 clulas con ncleos fragmentados (Tipo V), 2 a 8 clulas con membrana nuclear rota (Tipo IV) y entre 0 a 2 clulas con 1 MN (Tipo I). Y ninguna clula con 2 MN (Tipo II), ni ncleo arrionado (Tipo III). (Figura N15)

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

Las investigaciones relacionadas con el tema de la genotoxicidad adquieren cada vez mayor importancia a nivel local, nacional y mundial, debido al creciente deterioro del ambiente al que se encuentra expuesto por las diferentes actividades del hombre moderno (Thomann, 1982). El uso de los ensayos de genotoxicidad en el pez cebra propuesto en ste proyecto, es el primer paso que asegure la toma de medidas de bioseguridad apropiadas, y permita realizar los anlisis y la gestin de riesgos a priori en el componente biolgico ante un determinado contaminante del agua (Agencia AUPEC, 1998; Acta Toxicolgica Argentina, 2007; ACGIH. 2010).

En el ao 2012 por Resolucin Ministerial N 225-2012-MINAM el Ministerio del Ambiente aprob el nuevo Plan de Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y Lmites Mximos Permisibles (LMP) para el perodo 2012-2013 para el Per. Donde se realiza una corporacin o revisin de nuevos ECA priorizados para Agua en lo que respecta a los aceites y grasas, cianuro, cloruros, nitratos, nitritos, nitrgeno amoniacal, slidos totales en suspensin, sulfatos, sulfuros, fosfatos, fosforo total, antimonio, arsnico, cadmio, manganeso, mercurio, nquel, termotolerantes y organolpticos. As mismo, incorpora como novedad a la norma, la elaboracin del ECA para agua subterrnea que antes slo exista para aguas supeficiales. Para los LMP relacionados al agua, en el sector minero se deber hacer una revisin del LMP de las emisiones de las actividades mineras y metalrgicas. Para el sector industrial se deber elaborar los LMP de los efluentes y emisiones para industria petroqumica intermedia y avanzada; para la industria de la imprenta, para las actividades del subsector industria y para la industria siderrgica. Para el sector agricultura se deber elaborar los LMP de los efluentes de las actividades agroindustriales, tales como camales y plantas de beneficio. Y para el sector vivienda se ha incorporado la elaboracin de LMP de efluentes de plantas desalinizadoras. De este modo, actualmente la legislacin y normatividad peruana actual estn siendo revisadas y actualizadas en sus Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y sus Lmites Mximos Permisibles (LMP) para que estn acorde a los estndares internacionales y se evale primero la seguridad biolgica de todo tipo de producto potencialmente peligroso.

Por lo expuesto, la implementacin de la nueva normatividad apunta a muy corto plazo al uso de nuevos bioindicadores ambientales, tanto en animales como en plantas, para la determinacin de los contaminantes del agua en territorio peruano. Los cuales sern

utilizados como una nueva herramienta de biomonitoreo para complementar los nuevos ECAs y LMPs a implementarse transversalmente en los estudios de impacto ambiental en diferentes sectores de inters. Estos bioindicadores debern ser elegidos por su rpida reproduccin en pequeos espacios que permita tener grandes stock de organismos para diversos ensayos y repeticiones, y que no representen varias semanas o meses de anlisis, que sean econmicos en su crianza, y que se posea un amplio conocimiento de su biologa para su facilidad de manejo laboratorial y ser adaptables a diversos laboratorios para lograr su replicacin. A nivel de bioensayos laboratoriales en el Per, se ha recomendado el uso de los siguientes organismos invertebrados: los crustceos Artemia sp. y Daphnia magna, el insecto Chironomus calligraphus y el anlido Paragrellus redivivus. Y el uso de los siguientes organismos vertebrados: el pez Cebra (Danio rerio), la Trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y el ratn (Mus musculus). Y en vegetales el uso de la cebolla (Allium cepa), la haba (Phaseolus sp.) y la microalga Chrollela sp.

La aplicacin del ensayo de microncleos est siendo utilizada para el monitoreo de la contaminacin de los ambientes acuticos junto con un biocontrol para la deteccin de la genotoxicidad, Teniendo como material biolgico a los eritrocitos nucleados (presencia de ADN nuclear) de la sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio) se detect el dao celular en forma directa por microscopia permitiendo evaluar rpidamente (24 a 72 horas) los efectos nocivos de un contaminante acucola de inters que otros ensayos no pueden hacerlo. Es un primer paso para alertar con el tiempo el padecer mutaciones, alteraciones cromosmicas, desarrollar malformaciones embrionarias o fetales y causar finalmente la mortalidad en un ambiente acutico contaminado con metales pesados.

Se concluye lo siguiente:

Para la muestra del ro Taraco (M1) se observ el mayor efecto genotxico (12%) sobre los glbulos rojos del pez cebra (Danio rerio) en el volumen de X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN de 2% y hasta 5%, respectivamente. Para la muestra del ro San Antn (M2) se observ el mayor efecto genotxico (8%) sobre los glbulos rojos del pez cebra (Danio rerio) en el volumen de X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN de hasta 3%, en ambos casos.

Para la muestra del ro Crucero (M3) se observ el mayor efecto genotxico (6%) sobre los glbulos rojos del pez cebra (Danio rerio) en el volumen de 1/2X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN de 4% y hasta 2%, respectivamente. Para la muestra de Pampilla (M4) se observ el mayor efecto genotxico (23%) sobre los glbulos rojos del pez cebra (Danio rerio) en el volumen de 1/2X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN hasta 3%, en ambos casos. Para la muestra de la laguna Lunar de Oro (M5) se observ el mayor efecto genotxico (11%) sobre los glbulos rojos del pez cebra (Danio rerio) en el volumen de X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN de 3% y hasta 2%, respectivamente. A exposiciones de 24 o 48 horas el dao genotxico sobre los glbulos rojos del pez Cebra sigui el siguiente orden creciente: M5>M4>M3>M2>M1. Por lo que la tendencia en el ro Ramis es de presentar ms dao genotxico a medida que se avanza ro arriba hacia la zona de minera informal presente a lo largo de la cuenca estudiada.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Figura N 1: Ubicacin de las cinco zonas de muestreo a lo largo del ro Ramis en el Departamento de Puno (Mapa diseado de Google Earth).

Figura N 2: Sacrificio del pez cebra

Figura N 3: Frotis de la sangre perifrica

Figura N 4: Secado de lminas con sangre

Figura N 5: Fijacin de muestras en metanol frio

Figura N 6: Coloracin de la muestra.

Figura N 7: Lavado de las muestras con agua destilada.

Figura N 8: Secado de las muestras coloreadas.

Figura N 9: Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento (Control).

Figura N 10: Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)

Figura N 11: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M1

Figura N 12: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M2

Figura N 13: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M3

Figura N 14: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M4

Figura N 15: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M5